Matériels
1. Matériels biologiques
Tout au long de travail, les pommes utilisées appartiennent à l’espèce Malus
domestica, variété Golden à l’origine de deux parcelles Bois l’Abbé et rétuzière à
stade de développement zéro et un mois après la récolte. Ces pommes ont été traitées
avec le fluorure de sodium comme antioxydant afin d’inhiber l’activité de polyphénol
oxydase et conservées à -20 °C.
2. Produits chimiques:
Polyéthylènglycol 12%, bisulfite de sodium 0.2 et β mercaptéthanol% (empêche
l’oxydation, réticulation S-S), CaCl2 (conservateur), PVP (inhibiteur protéase),
protéase inhibitor Cocktail servent à l’extraction des enzymes et pNPGal, pNPGlu,
pNPxyl et Na2Co3 pour le dosage.
Méthodes biochimiques
1. Extraction des enzymes :
10 g de parenchyme coupés en petit morceaux sont broyés au Polytron à 4 °C en
présence de 10 mL de polyéthylènglycol 12% (PEG 4000, MERCK) dissout dans une
solution de bisulfite de sodium 0.2% (SIGMA). Les broyats sont recueillis dans un
tube à centrifuger de 12 mL, ensuite centrifugés pendant 40 min à 4 °C et 33900 g
(SIGMA 3K30). On effectue 3 lavages au bisulfite de sodium en séparant à chaque
fois le surnageant et le culot après centrifugation. Le culot lavé est incubé sous
agitation 1 h à 4 °C dans 10 mL de tampon acétate 100 mM ph 5.2, 2% v/v β
mercaptéthanol, 100 Mm NaCl, 5% w/v PVP, 10 mM CaCl 2 et 1% protéase inhibitor
Cocktail. Le mélange est centrifugé à 33900 g pendant 30 min. Ensuite, 4 lavages
sont effectués par le tampon acétate de sodium 100 mM/CaCl 2 50 mM. Les
surnageants sont récupérés et conservés à 4 °C.
2. Dosage des activités galactosidases (ROUAU et al., 1986)
Principe de la méthode : l’hydrolyse de la liaison entre le résidu osidiques et le
groupement aryle du ρnitrophénol donne, en milieu alcalin, une coloration jaune dont
la DO est mesurée à 400 nm au spectrophotomètre. (Ɛ pNPGal à 400 nm = 18350 10-6
ml/[Link]-1).
Protocole de dosage: 100 µL de la solution enzymatique (d1/5) avec 100 µL pNPGal
sont incubés 20 min à 40 °C. Ensuite 600 µL de Na 2Co3 sont ajoutés .Dans les
blancs, ajout de tous les composés du milieu réactionnel dans l’ordre suivant :
Na2CO3, enzyme, substrat. Transfère les solutions dans des cuves en plastique pour
mesurer la DO à 400 nm (pNPGal) ou 410 nm (oNP).
Protocole de dosage pour la lecture en plaque : transvaser 0.25 mL de chaque tube
dans les puits ELISA pour mesurer la DO à 405 nm.
3. Dosage Protéines solubles
Principe de la méthode : le Bleu de Coomassie est un colorant capable de se fixer aux
protéines, pour former un complexe coloré. Pour un rapport approprié de réactif et de
protéines, la DO lue à 595 nm varie linéairement avec la concentration en protéines,
Protocole de dosage :
Gamme Sérum Albumine Bovine (SAB): préparation des solutions BSA de
concentration différentes (1, 2,5, 5, 7,5 et 10 µg/mL), lecture de DO à 600 nm
dont le but de tracer la gamme d’étalonnage et donc exprimer le taux de
protéines.
Dosage des protéines (microdosage)
0.5 mL de solution de protéines (extrait enzymatique concentré) avec 0.5 mL de
réactif, agiter et attendre 10 min puis lire la DO à 600 nm.
µg/mL= DO/pente*dilution
3. Dosage HPLC
Principe de la méthode :
Principe : La chromatographie est une méthode séparative qui permet l’identification et le
dosage des différents composés d’un mélange.
Les constituants du mélange injecté se déplacent tous moins vite que la phase mobile et que
leurs vitesses de déplacement sont différentes. Ils sont ainsi élués de la colonne les uns après
les autres et donc séparés. Un détecteur placé à la sortie de la colonne couplé à un enregistreur
permet d'obtenir un tracé appelé chromatogramme. En effet, il dirige sur un enregistreur un
signal constant appelé ligne de base en présence du fluide porteur seul ; au passage de chaque
soluté séparé il conduit dans le temps à l'enregistrement d'un pic.
Les échantillons sont analysées à une phase stationnaire c’est la colonne C18 et une phase
mobile, un débit 0,5 ml/mn ; Volume injecté 1 mL et un détecteur à 30 °C.
Dosage de l’activité transférase
Protocole de dosage :
Milieu réactionnel : donneur + accepteur (monomère + dimère).
Inactiver l’enzyme 10 min à 100 °C puis on ajoute un mélange de monomère et dimère de
même concentration et en fin une dilution 1/10.
250 µL d’enzyme avec 250 µL de la mélange, incuber à 40 °C pendant 2, 4, 6, 10 et 15 min
puis dilution 1/10. Incuber les tubes de 2,4, 6, 10 et 20 min à 100 °C pendant 10 min, filtrer
(0.45 µm) dans les Vials et injecter au HPLC
4. Dosage HPEC:
Principe de la méthode :
La chromatographie échangeuse d’anions à haute performance (HPAEC) Dionex
analytique permet de séparer sélectivement des oses, des oligosaccharides neutres et
acides sur colonne échangeuse d’anions de type CarboPA200 en milieu basique 80%
d’eau et 20% de la soude et à haute pression.
Protocole de dosage :
Milieu réactionnel : donneur + accepteur (monomère + dimère).
Inactiver l’enzyme 10 min à 100°C puis on ajoute un mélange de monomère et dimère de
même concentration et en fin une dilution 1/10.
250 µL d’enzyme avec 250 µL de la mélange, incuber à 40 °C pendant 2, 4, 6, 10 et 15
min puis dilution 1/10. Incuber les tubes de 2,4, 6, 10 et 20 min à 100 °C pendant 10 min,
filtrer (0.45 µm) dans les Vials et injecter au HPLC .