Master sciences et techniques : chimie des molécules bioactifs

(CMBA)

Rapport de travaux pratique

Etude phytochimique et activité

antioxydante présent dans les déchets de
grenade

Réalisé par :

- Khiar fatima zahra

Encadré par :

- Pr . Nourddine Idrissi Kandri

Année universitaire : 2023/2024

 Liste de figures

Figure 1: Extraction par fusion ...............................................................................................5

Figure 2: Extraction par décoction ..........................................................................................6
Figure 3: Extraction par maceration ........................................................................................6
Figure 4 : Extraction par expression à froid.............................................................................7
Figure 5 : Extraction par distillation à vapeur..........................................................................7
Figure 6: Extraction par solvant ..............................................................................................8
Figure 7 : Extraction par CO2 supercritique ............................................................................8
Figure 8 : chromatographie sur colonne ..................................................................................9
Figure 9 : extraction ultrasonique ............................................................................................9
Figure 10 : extraction par soxhlet .......................................................................................... 10
Figure 11: Plante de grenade ................................................................................................. 11
Figure 12 : courbe d’étalonnage de la catéchine .................................................................... 25
Figure 13: courbe d’étalonnage d’AG ................................................................................... 25

Liste des tableaux

Tableau 1 : listes des produits chimiques .............................................................................. 12

Tableau 2: la concentration massique de l’extrait éthanoïque ................................................ 22
Tableau 3 : résultats de criblage phytochimique de l’extrait des déchets de grenade .............. 23
Tableau 4: Quantité des polyphénols et des tanins condensés dans l’extrait des déchets de
grenade ................................................................................................................................. 26
 Table de matière

Introduction……………………………………………………………………………………………………………………………………..1
Etude biblioghraphique……………………………………………………………………………………………………………………..2

1. Différentes méthodes d’extraction des principes actifs dans les plantes : ...................................2
1.1 Définition : ..........................................................................................................................2
1.1.1 Extraction : ..................................................................................................................2
1.1.2 Principes actifs :...........................................................................................................2
1.2 Techniques d’extraction des principes actifs des plantes :.....................................................5
1.3 Identification botanique de l’espèce végétale étudié (grenade) : ......................................... 10
1.4 Description botanique : ...................................................................................................... 11
Partie expérimentale ........................................................................................................................ 12
2 Matériels : ................................................................................................................................ 12
2.1 Matériels utilisés : ............................................................................................................. 12
3 Méthodes : ................................................................................................................................ 12
3.1 Extraction solide-liquide des composés phénoliques par la méthode soxhlet : ..................... 12
3.1.1 principe de ce méthode :............................................................................................. 13
3.1.2 Mode opératoire : ....................................................................................................... 13
3.1.3 Calcul du rendement : ................................................................................................ 14
3.2 Criblage phytochimique préliminaire : ............................................................................... 14
3.2.1 Les composés réducteurs : ......................................................................................... 14
3.2.2 les polyphénols : ........................................................................................................ 14
3.2.3 Les tanins : ................................................................................................................ 15
3.2.4 Les flavonoïdes .......................................................................................................... 15
3.2.5 Les terpénoides : ........................................................................................................ 16
3.2.6 Les stérols et les polyterpènes :....................................................................................... 16
3.2.7 Les coumarines : ........................................................................................................ 17
3.2.8 Les alcaloïdes : .......................................................................................................... 17
3.2.9 Les quinones libre ou combinées................................................................................ 18
3.2.10 Les saponosides : ....................................................................................................... 18
3.3 Analyse quantitative et activité antioxydante des composés phénoliques : ........................... 18
3.3.1 Dosage des polyphénols totaux : ................................................................................ 18
3.3.2 Dosage des tanins condensés ..................................................................................... 19
 3.4 Activité antioxydants : piégeage du radical libre DDPH ( 2 ,2-diphényle-1- picrylhydrazyl :
20
résultats et discussion…………………………………………………………………………………………………………………22
4 Extraction par soxhlet : ............................................................................................................ 22
5 Criblage phytochimique : ......................................................................................................... 22
6 Analyse quantitative des polyphénols et flavonoïdes :................................................................ 24
7 Activité antioxydants : .............................................................................................................. 25
Conclusion………………………………………………………………………………………………………………………………………27
Introduction :
Les plantes peuvent être considérées comme des bibliothèques de petites molécules de
métabolites secondaires et des composés organiques avec une diversité structurale qui,
autrement, ne pourrait pas être disponibles dans un laboratoire de synthèse chimique.

Cependant, l’ingestion de ces métabolites secondaires sous forme de polyphénols, contenus

dans les fruits (exemple grenade) et les légumes pourrait permettre à notre organisme de
renforcer ses moyens de défense contre les processus d’oxydation qui menacent
quotidiennement nos cellules.

L'extraction des polyphénols est un processus utilisé pour isoler ces composés chimiques
présents dans diverses sources végétales, tels que les fruits, les légumes, le thé, etc. Les
polyphénols sont des composés bioactifs qui ont été associés à de nombreux bienfaits pour la
santé en raison de leurs propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires.

La solubilité des polyphénols peut varier en fonction de leur structure chimique, de la source
végétale à partir de laquelle ils sont extraits et des conditions environnementales telles que la
température et le pH. En général, les polyphénols sont souvent plus solubles dans des solvants
organiques tels que l'éthanol, le méthanol, l'acétone et l'éthylacétate, mais ils peuvent
également être solubles dans l'eau, surtout s'ils contiennent des groupes hydrophiles.

La grenade (Punica granatum) est un fruit qui est riche en antioxydants, principalement des
polyphénols tels que les anthocyanes, les ellagitanins et les acides ellagiques.

Dans ces travaux pratiques , nous allons extraire les composes phénoliques à partir de
déchets de grenade , un criblage phytochimique pour mettre en évidence la présence des
différents familles phytochimiques puis doser la quantité de ces composes à l’aide de
différentes technique telles que la spectrophotométrie UV visible ou les dosages
volumétriques .

1
 Etude bibliographique

1. Différentes méthodes d’extraction des principes actifs dans les plantes :

1.1 Définition :

1.1.1 Extraction :
L'extraction est un procédé de séparation en en chimie de laboratoire qui consiste à
extraire une espèce chimique, c'est-à-dire prélever une ou plusieurs espèces
chimiques d'un mélange solide ou liquide.

1.1.2 Principes actifs :

Les plantes contiennent une variété de composés chimiques actifs qui sont :

 Les métabolites primaires : sont des composés organiques essentiels impliqués dans
les processus métaboliques fondamentaux nécessaires à la croissance, au
développement et à la reproduction des plantes. Ces métabolites sont généralement
produits en grandes quantités et sont essentiels à la survie de la plante. Voici quelques-
uns des métabolites primaires des plantes :

 Glucides :

Glucose et Fructose : Ces monosaccharides sont des constituants fondamentaux des glucides.

Saccharose : Un disaccharide formé de glucose et de fructose, transporté dans toute la plante

pour fournir de l'énergie.

Amylose et Amylopectine : Formes de stockage de glucose sous forme d'amidon dans les
organes de réserve.

 Acides aminés :

Alanine, Leucine, Glycine, etc. : Les acides aminés sont les unités de base des protéines,
essentielles à la croissance et au développement.

Glutamine, Asparagine, etc. : Certains acides aminés servent également de transporteurs

d'azote.

2
  Acides nucléiques :

ADN (Acide désoxyribonucléique) et ARN (Acide ribonucléique) : Les acides nucléiques

sont impliqués dans le stockage et la transmission de l'information génétique.

 Lipides :

Triacylglycérols : Les lipides de stockage, souvent sous forme de graisses, stockent l'énergie.

Phospholipides : Constituants des membranes cellulaires.

 Nucléotides :

ATP (Adénosine triphosphate), GTP (Guanosine triphosphate), etc. : Les nucléotides sont des
transporteurs d'énergie essentiels pour de nombreuses réactions cellulaires.

 Composés du cycle de l'acide citrique :

Citrate, Isocitrate, alpha-cétoglutarate, Succinate, Malate, Oxaloacétate : Ces composés sont

impliqués dans le métabolisme énergétique (cycle de Krebs).

 Chlorophylles :

Chlorophylle a et b : Ces pigments verts sont cruciaux pour la photosynthèse, la conversion de

l'énergie lumineuse en énergie chimique.

 Glycolyse et Gluconéogenèse :

Glycéraldéhyde-3-phosphate, Pyruvate, Fructose-6-phosphate, etc. : Ces métabolites sont

impliqués dans la production d'énergie par la glycolyse et la gluconéogenèse.

 Glutathion :

Un antioxydant important qui protège les cellules contre les dommages oxydatifs.

 Ces métabolites primaires jouent un rôle central dans le fonctionnement cellulaire et la

survie des plantes. Ils sont essentiels pour la croissance, la reproduction et la réponse
aux stress environnementaux.

 Les métabolites secondaires : sont des composés organiques produits en plus petites
quantités par rapport aux métabolites primaires. Contrairement aux métabolites

3
 primaires, ils ne sont pas essentiels pour la croissance et le développement immédiats
de la plante, mais ils peuvent jouer un rôle important dans la défense contre les
herbivores, les pathogènes, les compétiteurs ou dans l'interaction avec
l'environnement. Voici quelques exemples de métabolites secondaires des plantes :
 Alcaloïdes :

Morphine : Présente dans le pavot à opium, elle a des propriétés analgésiques.

Nicotine : Trouvée dans le tabac, elle agit comme un insecticide naturel.

Quinine : Utilisée pour traiter le paludisme, elle est extraite du quinquina.

 Terpénoïdes :

Huiles essentielles : Composées de terpènes, elles sont responsables des arômes et des odeurs
des plantes.

Caroténoïdes : Pigments responsables des couleurs orange et jaune dans les fruits et légumes.

 Phénols :

Flavonoïdes : Antioxydants présents dans de nombreux fruits, légumes et thés, contiennent :

Quercétine : A des propriétés antioxydantes.

Anthocyanes : Responsables des couleurs vives dans de nombreux fruits et fleurs.

Tannins :

annins hydrolysables : Ont des propriétés antioxydantes.

Tannins condensés : Contribuent à la résistance contre les herbivores en interférant avec la

digestion.

 Coumarines :

Scopoletin : A des propriétés antifongiques et peut être impliqué dans la défense contre les
pathogènes.

 Isothiocyanates :

Glucosinolates (choux) : Aident à la défense contre les herbivores.

4
  Phytostérols :

β-Sitostérol : Impliqué dans la structure membranaire et a des propriétés anti-inflammatoires.

 Saponines :

Ginsénosides (ginseng) : Ont des propriétés adaptogènes et peuvent stimuler le système

immunitaire.

 Cannabinoides :

THC (tétrahydrocannabinol), CBD (cannabidiol) (cannabis) : Ont des effets psychoactifs et

médicinaux.

 Ces métabolites secondaires jouent un rôle essentiel dans l'adaptation des plantes à
leur environnement et peuvent avoir des applications médicinales, nutritionnelles et
industrielles. Il est important de noter que la présence et la diversité des métabolites
secondaires peuvent varier considérablement entre les espèces de plantes et même au
sein d'une même espèce en fonction de facteurs environnementaux.

1.2 Techniques d’extraction des principes actifs des plantes :

L'extraction des principes actifs des plantes est une étape cruciale dans la production de
médicaments, de compléments alimentaires, d'huiles essentielles, de parfums et d'autres
produits dérivés. Il existe plusieurs techniques d'extraction des principes actifs des plantes,
chacune adaptée à différents types de composés et à diverses applications. Voici quelques-
unes des techniques d'extraction couramment utilisées :

Infusion :

La plante est immergée dans de l'eau chaude, généralement à des températures en dessous de
l'ébullition, pour extraire des composés hydrosolubles tels que les flavonoïdes. ( voir la figure
suivante) :

Figure 1: Extraction par fusion

5
Décoction :

Des parties de plantes plus dures, comme les racines ou l'écorce, sont bouillies dans de l'eau
pour extraire des composés moins solubles.

Figure 2: Extraction par décoction

Maceration :

La plante est trempée dans un solvant (eau, alcool, huile, etc.) pendant une période prolongée
pour permettre l'extraction des composés actifs. Cette méthode est souvent utilisée pour
obtenir des extraits huileux.

Figure 3: Extraction par maceration

6
Expression à Froid :

Cette technique est couramment utilisée pour extraire les huiles essentielles des écorces
d'agrumes. Elle implique l'utilisation d'une presse pour presser les huiles sans chauffer le
matériau.

Figure 4 : Extraction par expression à froid

Distillation à la Vapeur :

Principalement utilisée pour extraire les huiles essentielles. La vapeur d'eau passe à travers la
plante, entraînant les composés volatils, qui sont ensuite condensés en liquide.

Figure 5 : Extraction par distillation à vapeur

Extraction par Solvant :

7
Les solvants tels que l'éthanol, le méthanol, ou l'hexane sont utilisés pour dissoudre les
composés actifs de la plante. Cette méthode est particulièrement efficace pour extraire une
large gamme de composés, mais nécessite une étape supplémentaire pour éliminer le solvant.

Figure 6: Extraction par solvant

CO2 Supercritique :

Le dioxyde de carbone à l'état supercritique est utilisé comme solvant pour extraire les
principes actifs. Cette méthode est respectueuse de l'environnement et permet une extraction
sélective, mais elle peut nécessiter un équipement coûteux.

Figure 7 : Extraction par CO2 supercritique

Chromatographie sur colonne :

8
Cette technique est utilisée pour séparer et purifier les composés extraits. Elle est souvent
utilisée en combinaison avec d'autres méthodes d'extraction pour isoler des composés
spécifiques.

Figure 8 : chromatographie sur colonne

Extraction Assistée par Micro-ondes (MAE) :

Les micro-ondes sont utilisées pour chauffer le solvant, accélérant ainsi le processus
d'extraction. Cela permet une extraction plus rapide et peut améliorer le rendement.

Ultrasons :

Les ultrasons sont utilisés pour créer des ondes de pression qui aident à rompre les parois
cellulaires de la plante, facilitant ainsi l'extraction des composés actifs.

Figure 9 : extraction ultrasonique

L’extraction par Soxhlet:

L'extraction par Soxhlet est une méthode classique d'extraction utilisée en chimie pour
extraire des composés d'une substance solide. Elle est souvent utilisée pour extraire des

9
composés organiques à partir de matrices solides telles que des échantillons végétaux, des
graisses, des polymères, etc.

Figure 10 : extraction par soxhlet

 Le choix de la méthode d'extraction dépend du type de composés recherchés, des

propriétés physiques de la plante, des objectifs spécifiques de l'extraction, et des
contraintes économiques. Il est important de noter que certaines méthodes peuvent
altérer la composition chimique des extraits, et la sélection de la méthode appropriée
doit être soigneusement évaluée en fonction des besoins spécifiques de l'application.

1.3 Identification botanique de l’espèce végétale étudié (grenade) :

o Place dans la systématique :
Régne : Plantae
Division : Magnoliophyta
Classe : Magnoliopsida
Ordre : Myrtales
Familes : Punicaceae
Genre : Punica
Espèce : Punica granatum

10
1.4 Description botanique :
La grenade (Punica granatum) est un fruit originaire de la région indo-iranienne, largement
cultivé dans de nombreuses régions du monde pour ses propriétés gustatives et ses bienfaits
pour la santé.

Figure 11: Plante de grenade

11
 Partie expérimentale

2 Matériels :

2.1 Matériels utilisés :

Tableau 1 : listes des produits chimiques

Produit chimique Formule brute

Les déchets de grenade
Ethanol C2H6O
Sulfate de cuivre CuSO4
Tartrate de sodium et de potassium KNaC4H4O4,4H2O
Hydroxyde de sodium NaOH
Chlorure ferrique FeCl3
Copeau de magnésium Mg
Acide sulfurique concentré H2SO4
Chlorure d’hydrogène HCl
Carbonate de sodium Na2Co3
Acide gallique C7H6O5
Dpph /méthanol C18H12N5O6
Anhydride acétique C4H6O3
Vanilline C8H8O3
Chloroforme CHCl3

3 Méthodes :

3.1 Extraction solide-liquide des composés phénoliques par la méthode soxhlet :

dans ce travail on a utilisée la méthode de soxhlet pour faire extraire les composes
phénoliques a l’aide d’un solvant organique (éthanol).

12
3.1.1 principe de ce méthode :
Quand le solvant contenu dans le ballon est chauffé à sa température d'ébullition, les vapeurs
passent par le tube adducteur, se condensent dans le réfrigérant et retombent à chaud sur
l'échantillon contenu dans la cartouche se trouvant dans le corps de l' extracteur . Le solvant
condensé s'accumule dans l'extracteur jusqu'à atteindre le sommet du tube-siphon, qui
provoque alors le retour du liquide dans le ballon, accompagné des substances extraites. Après
un certain nombre de cycles, le contenu du solvant dans le ballon s'enrichit en composés
solubles. Le solvant continue de s'évaporer et les substances extraites restent dans le ballon.

3.1.2 Mode opératoire :

• Tarer une cartouche pour soxhlet

• Peser avec précision de 5 g d'échantillon séché et broyé

• Mettre l'échantillon dans la cartouche et boucher avec du coton pour éviter le reflux

• Placer la cartouche avec son contenu dans l'extracteur (le bord supérieur doit être au dessus
du niveau du siphon

• Introduire 200 ml d'éthanol dans le ballon à col rodé de 250 ml

• Installer l'extracteur sur le ballon et mettre le tout au-dessous du réfrigérant

• Faire circulaire l'eau dans les réfrigérants ,

• Allumer les plaques chauffantes .

• laisser extraction pendant une durée assez suffisante jusqu'à ce que le solvant contenu dans
le siphon devienne incolore et propre ( 5 à 12 h )

. • arrêter l’ébullition et retirer la cartouche soigneusement sans perdre les particules de

l’échantillon et vider l’éther que contient l’extracteur 3.1.3 Determination de la concentration
massique

• Mesureur avec haute précision 3 ml d'extrait

. • Introduire dans un bécher préalablement taré à l'aide d'une balance de précision (

Incertitude ; ± 0.0001 g ) ; • Placer le bêcher et son contenu dans l'étuve chauffée à 50 °C .

• Laisser l'évaporation du solvant pendant 12 h ;

13
• Peser le bêcher après évaporation de solvant d'extraction .

• Répéter l'essai à trois reprises. La concentration massique ( Cm ) d'extrait éthanoïque est

obtenue comme suit :

Cm= M₂ - M₁ / V

Où : mi est la masse du bécher vide (g), m2 est la masse du bécher après séchage à l'étuve , V
est le volume prélevé .

3.1.3 Calcul du rendement :

R(%) = m /m0 x 100

R (%) : Rendement exprimé en %.

m: Masse en gramme de l’extrait sec obtenu

m0 : Masse en gramme du matériel végétal à traite

3.2 Criblage phytochimique préliminaire :

Le screening phytochimique est un moyen pour mettre en évidence la présence de groupes de
familles chimiques présentes dans un extrait donné. Les tests de caractérisation sont basés en
partie sur l'analyse qualitative, soit sur la formation de complexes insolubles en utilisant les
réactions de précipitation, soit sur la formation de complexes colorés , en utilisant les
réactions de colration.

3.2.1 Les composés réducteurs :

Mode opératoire :

Mettre 1 mL d'extrait phénolique dans un tube à essai, Ajouter 0,5 mL de Liqueur de Fehling
A et B ,Chauffer le tube à essai à l'aide d'un bain marie à 100 °C . Un test positif est indiqué
par l’apparition d’un précipité de couleur rouge brique Solution A : 2,5 g de sulfate de cuivre
( CuSO4 ) dans 50 ml d'eau distillée ( solution saturée ) Solution B : 10 g de sel de Seignette
((tartrate de sodium et de potassium , KNaC.H.O64H₂0 ) et 7 g d'hydroxyde de sodium
(NaOH) dans 50 ml d'eau distillée .

3.2.2 les polyphénols :

Mode opératoire :

14
Prélever 2 mL de chaque extrait, ajouter une goutte de solution alcoolique de chlorure ferrique
à 2 %. Le chlorure ferrique provoque en présence de dérivés polyphénoliques l'apparition
d'une coloration bleu noirâtre ou verte plus ou moins foncée.

 Réaction des phénols avec chlorure ferrique :

3.2.3 Les tanins :

Mode opératoire :

Les tanins catéchiques sont identifiés par le réactif de STIASNY ( Formol 30 % , HCI
concentré : 1 / 0,5 ) : Evaporer à sec 5 mL de chaque extrait , Ajouter 15 mL du réactif de
STIASNY au résidu, Maintenir le mélange au bain-marie à 80°C pendant 30 min.
L'observation d'un précipité en gros flocons décrit les tanins catéchiques.

 réaction des tannin avec formol :

3.2.4 Les flavonoïdes

Mode opératoire :

Pour mettre en évidence les flavonoïdes, la réaction dite "la cyanidine" a été utilisée.
Évaporer à sec 2 mL de chaque extrait , disperser le résidu dans 5 mL d'alcool

15
 chlorhydrique dilué 2 fois, ajouter 2 à 3 copeaux de magnésium, il y a un dégagement
de chaleur puis une coloration rose-orangée ou violacée, ajouter sur le mélange 3
gouttes d'alcool isoamylique pour intensifier cette coloration qui confirme la présence
de flavonoïdes

 réaction de la cyanidine :

3.2.5 Les terpénoides :

Mode opératoire :

Mélanger 1 mL de chloroforme, 1,5 mL de H₂SO4 concentrée et 2,5 mL d'extraits.

La présence des terpénoides est révélée par l'apparition de deux phases et une couleur
marron en interphase.

 Réaction de l’identification des terpénoide :

3.2.6 Les stérols et les polyterpènes :

Mode opératoire :

16
 Evaporer à sec 5 mL de chaque extrait , dissoudre à chaud le résidu dans 1 mL
d'anhydride acétique,ajouter 0,5 mL d'acide sulfurique concentré au triturât .
L'apparition, à l'interphase, d'un anneau pourpre et violet, virant au bleu puis au vert.
indique une réaction positive.

3.2.7 Les coumarines :

Mode opératoire :

A 1 mL de chaque extrait , ajouter 1 mL de l'eau chaude , répartir le mélange en deux parties

égales : la première représente un témoin et la deuxième est traitée avec 0,5 mL de NH4OH
à 10 %. L'examen est réalisé sous la lumière ultraviolette et l'apparition d'une fluorescence
intense révèle la présence de coumarines.

3.2.8 Les alcaloïdes :

Mode opératoires :

Ajouter 2,5 mL d'HCI à 1 % à 0,1 mL d'extrait, incuber le mélange au bain-marie pendant

10 min. La solution obtenue est divisée en deux parties . Ajouter à l'une le réactif de Mayer
et à l'autre le réactif de Wagner . L'apparition d'un précipité blanc ou brun révèle la présence
d'alcaloïdes.

Réactif de Mayer : Dissoudre 1.358g d'HgCl2 dans 60 mL d'eau distillée puis 5g de KI

dans 10 mL d'eau distillée . Mélanger les deux solutions et ajuster le volume total à 100mL

. Réactif de Wagner : Dans 75 mL d'eau distillée , dissoudre 2g de KI et 1.27g de 12. Le

volume obtenu est ajusté à 100 mL avec l'eau distillée.

 réaction de Wagner avec les alcaloïdes :

I2 + I- I-3

17
3.2.9 Les quinones libre ou combinées

Mode opératoire :

Prélever un volume de 1 mL de chaque extrait , ajouter quelques gouttes de NaOH à

1% . L'apparition d'une couleur qui vire au jaune , rouge ou violet indique la présence
des quinones libres .

3.2.10 Les saponosides :

Mode opératoire :

Ajouter 1 mL d'eau distillée à 2 mL de chaque extrait, agiter fortement et pendant 3 minutes

la solution, la présence des Saponosides est confirmée par l'apparition d'une mousse qui
persiste durant 15 minutes. Le test est considéré comme positif si l'épaisseur de la mousse
dépasse 1 cm .

3.3 Analyse quantitative et activité antioxydante des composés phénoliques :

3.3.1 Dosage des polyphénols totaux :

 Principe :

Le dosage des polyphénols totaux par la méthode du Folin - Ciocalteu a été décrit par
Singleton et Rossi en 1965. Depuis, son utilisation s'est largement désignée pour
caractériser les extraits végétaux. Le réactif de Folin - Ciocalteu est un acide de couleur
jaune constitué par un mélange d'acide phosphotungstique ( H₂PW12040 ) . Il est réduit
lors de l'oxydation des phénols, en un mélange d'oxydes bleus de tungstène et de molybdène
qui absorbe fortement à une longueur d'onde de 765 nm. L'intensité de la couleur est
proportionnelle à la quantité de polyphénols présents dans les extraits végétaux.

 Mode opératoire :

Dans un bécher :

Verser 100 µl d'extrait

Ajouter 500 μl de réactif de Folin Ciocalteu (réduit 10 fois dans l'eau distillée)
Ajouter 6 ml d'eau distillée

18
Laisser reposer 5 min .
Ajouter 1 ml de carbonate de sodium ( Na2CO ) ) à 20 %
Incuber le mélange réactionnel pendant 1 heure à température ambiante
Mesurer l'absorbance à 765 nm .
Une courbe d'étalonnage standard de l'acide gallique à 2mg /ml est utilisée afin de
quantifier les polyphénols totaux. (La solution d'acide gallique est utilisée comme
standard). Les résultats sont exprimés en mg d'équivalents d'acide gallique (EAG) par
gramme d'échantillon sec)
Reprendre en trois essais.
3.3.2 Dosage des tanins condensés
 Principe
Les quantités de tanins condensés sont estimées en utilisant la vanilline. En milieu acide , les
tanins condensés se dépolymérisent par réaction avec la vanilline , se transforment en
anthocyanidols ( complexe ) de couleur rouge ( Figure3 ) mesurable par spectrophotomètre

 réaction des tannins condensés avec le vanilline

 Mode opératoire :

19
 - Prélever 50 μl d'extrait méthanolque à (C=1mg/ml)

- Ajouter 3 ml d'une solution vanilline à 4 % (dans le méthanol)

- Ajouter 1.5 ml de l'acide chlorhydrique concentré HCI

- Conserver les mélanges pendant 15 min dans l'obscurité à la température ambiante

- Mesurer l'absorbance à λ= 500 nm.

L'étalonnage est effectué, comme décrit précédemment à l’aide d’une solution mère de
catéchine et les résultats sont exprimés en mg d'équivalent catéchine (EC) par
grammed'échantillon sec (dw).

3.4 Activité antioxydants : piégeage du radical libre DDPH ( 2 ,2-diphényle-1-

picrylhydrazyl :

 Principe :

Le pouvoir anti - radicalaire ou l' effet « scavenger » sur le radical 2,2 - diphényl
1picrylhydrazyl ( DPPH ) est une méthode qui est initialement utilisée pour déterminer les
donneurs de protons dans les composés phénoliques . Le DPPH est un radical libre stable
violet en solution , il présente une absorbance caractéristique dans un intervalle compris
entre 512 et 517 nm , cette couleur disparait rapidement lorsque le DPPH est réduit en
diphényle picryl hydrazine par un composé à propriété antiradicalaire , entrainant ainsi l'
apparition d'une coloration jaune pâle. L'intensité de la couleur est proportionnelle à la
capacité des antioxydants présents dans le milieu à donner des protons. La figure
suivante montre le mécanisme de réduction du radical DDPH :

 Mode opératoire :

- Mettre 75 μL de la solution d'extrait de l'échantillon de 50 à 1mg/ml.

- Ajouter 3 mL de 6,1 x 105 M DPPH/Méthanol.

- Incubateur à 20°C pendant 1 heure dans l'obscurité.

- La diminution de l'absorbance à 515 nm est enregistrée en utilisant le méthanol

comme contrôle et la solution de DPPH/méthanol comme blanc.

- L'acide ascorbique est utilisé comme un antioxydant de référence, une solution mère de

20
0,05mg/ml est préparée, cette solution subira des dilutions pour obtenir des
concentrations finales.

 L’activité antioxydante est estimée selon l’équation suivante :

AA= ( Absc – Abst ) /Absc × 100

Ou AA est l'activité antioxydante : Absc , est l'absorbance du blanc et Abst ,

est l'absorbance des échantillons.

21
 Résultats et discussion

4 Extraction par soxhlet :

Tableau 2: la concentration massique de l’extrait éthanoïque

La masse du bécher après La concentration massique (g /L)

La masse du bécher vide (g)
séchage à l’étuve (g)

m4= 34,9745 m4= 35,0273 Cm4= 10,56

m5= 29,0791 m5= 29,1393 Cm5= 12,04

m6= 34,6555 m6= 34,7096 Cm6= 10,82

 la concentration massique moyenne :

Cm (Moyenne) = Cm4 + Cm5 + Cm6 / 3

Cm (Moyenne) = 11,14 g/L

 Rendement :

Le résultat obtenu de rendement de l’extrait éthanoïque de R % = 42,24, c’est un rendement

très important.

5 Criblage phytochimique :
Les résultats de criblage phytochimique de l’extrait des déchets de grenade sont reportés

dans le tableau 3, les résultats montre la présence des polyphénols dans l’extrait des

déchets des grenade par l’apparition d’un coloration bleu noirâtre et l’absence d’autre

molécules les déchets de grenade.

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 Tableau 3 : résultats de criblage phytochimique de l’extrait des déchets de grenade

Molécules testé Observation Test positive ou négative

Les composés réducteurs Absence d’un précipité -

rouge
brique
Les polyphénols Présense d’une coloration +
Bleu noirâtre

Les tanins Absence d’un précipité en -

gros flocons

Les flavonoïdes Absence de coloration rose- -

orangé ou violacé
Les terpénoides Absence de couleur -
marron en interphase

Les stérols et les polyterpénes Absence d’un anneau -

pourpre et violet

Les coumarines Absence d’une fluorescence -

intense
Les alcaloïdes Absence d’un précipité -
blanc ou brun

Les quinones Absence de couleur vire au -

jaune, rouge ou violet

Les saponosides Absence d’une mousse qui -

persiste

23
6 Analyse quantitative des polyphénols et flavonoïdes :
La détermination de la teneur en polyphénols totaux des extrait a été réalisée selon la
méthode de Folin-Ciocalteu. La courbe d’étalonnage montre une linéarité de l’absorbance
en fonction des concentrations (Fig 12). La teneur en polyphénols de l’extrait a été
exprimée en équivalent microgramme d’acide gallique(AG) par g d’échantillon et
déterminées par l’équation : y = 0,9553 x +0,1795 avec R2 = 0,9922. Où x :Teneur en
polyphénols, y: Absorbance et R2: coefficient de corrélation.

Le dosage des Tanins condensés a été exprimée en microgramme d'équivalent de catéchine

par gramme d’échantillon sec l’extrait (fig13 ). Les taux des tanins condensé de l’extrait a
été obtenu à partir de la courbe d’étalonnage qui suit l’équation : y = 0,0009x + 0,2399
avec R² = 0,9553. Où x:Teneur en tanins condensés, y:Absorbance et R 2 : coefficient de
corrélation.

L’acide ascorbique est utilisé comme un antioxydant de référence, une solution mère de
0,005 mg/ml est préparée, cette solution subira des dilutions pour obtenir des
concentrations finales.

L’activité antioxydante est estimé selon l’equation suivante :

AA = (Absc- AbSt)/ Absc*100

Ou AA est l’activité antioxydante ; Absc est l’absorbance du blanc et Abst est

l’absorbance des échantillons.

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7 Activité antioxydants :

Figure
Figure 12 : 12 : courbe
courbe d’étalonnage
d’étalonnage de ladecatéchine
la catéchine

Figure
Figure13:
13courbe d’étalonnage
: courbe d’AG
d’étalonnage d’AG

25
 Tableau 4: Quantité des polyphénols et des tanins condensés dans l’extrait des déchets de
grenade

Matériel végétal Extrait Phénols totaux mg Tanins condensés mg

(EAG)/g (EC) /g

Déchets des feuilles du Ethanol 53,85 6 ,29

cardon

 Activité antioxydants :
AA= (0 ,313-0,09)/0 ,313 × 100
AA = 71,24 %

L’extrait des déchets des feuilles du cardon est montre un pouvoir antioxydant plus important

pour un concentration massique de 11,14 g /L.

26
Conclusion :

Les plantes aromatiques et médicinales constituent une source inépuisable d’antioxydants

naturels qui reste encore sous exploitée dans le domaine médicale et dans l’industrie
pharmaceutique, sachant que les antioxydants sembleraient intervenir dans la prévention de
plusieurs pathologies plus ou moins graves, provoquée par le stress oxydatif. Le développement
de nouveaux médicaments à base d’antioxydants d’origine naturelle doit être à l’ordre de jour,
vu la non-innocuité des antioxydants de synthèse.

L’extraction des principes actifs des déchets de grenade a été réalisé par la méthode de
soxhlet par l’éthanol afin de déterminer le rendement.

L’extrait des déchets de grenade est montré un pouvoir antioxydant très important et les

résultats est révélée plus riche en polyphénols .

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