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Traitement des eaux usées et dénitrification

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Traitement des eaux usées dans les filtres plantés à

écoulement vertical : Etude dynamique de l’azote dans

les étapes du procédé et des limitations de la
dénitrification
Kévin Maciejewski

To cite this version:

Kévin Maciejewski. Traitement des eaux usées dans les filtres plantés à écoulement vertical : Etude
dynamique de l’azote dans les étapes du procédé et des limitations de la dénitrification. Ingénierie de
l’environnement. Université de Lyon, 2022. Français. �NNT : 2022LYSEI064�. �tel-03937206�

HAL Id: tel-03937206

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Submitted on 13 Jan 2023

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abroad, or from public or private research centers. publics ou privés.
N° d’ordre NNT : 2022LYSEI064

THESE de DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE LYON

opérée au sein de
L’Institut National des Sciences Appliquées de Lyon

Ecole Doctorale N° 206

Ecole doctorale de Chimie de Lyon

Discipline de doctorat : Environnement

Soutenue publiquement le 12/07/2022, par :

Kévin Maciejewski

Traitement des eaux usées dans les

filtres plantés à écoulement vertical.
Etude dynamique de l’azote dans les
étapes du procédé et des limitations de
la dénitrification

Devant le jury composé de :

Rousseau, Diederik Professeur – Univ. Ghent Rapporteur

Andrès, Yves Professeur - IMT Atlantique Rapporteur
Delolme, Cécile Directrice de recherche – ENTPE Examinatrice
García, Joan Professeur – Univ. Polytechnique de Catalogne Examinateur
Mendret, Julie Maître de conférences – IEM Examinatrice
Gourdon, Rémy Professeur – INSA Lyon Directeur de thèse
Gautier, Mathieu Maître de conférences – INSA Lyon Co-Encadrant
Molle, Pascal Directeur de recherche – INRAE Co-Encadrant
Michel, Philippe Gérant de la société SCIRPE Invité
Cantarel, Amélie Maître de conférences – Univ. Lyon Invitée
Jame, Patrick Ingénieur de recherche – ISA Lyon Invité

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© [K. Maciejewski], [2022], INSA Lyon, tous droits réservés
DEPARTEMENT FEDORA – INSA LYON - ECOLES DOCTORALES
SIGLE ECOLE DOCTORALE NOM ET COORDONNEES DU RESPONSABLE

CHIMIE DE LYON M. Stéphane DANIELE

CHIMIE [Link] C2P2-CPE LYON-UMR
[Link] Sec. : Renée EL 5265Bâtiment F308, BP 2077
MELHEM Bât. Blaise 43 Boulevard du 11 novembre 1918
PASCAL, 3e étage 69616 Villeurbanne
secretariat@[Link] directeur@[Link]
ÉLECTRONIQUE, ÉLECTROTECHNIQUE, M. Philippe DELACHARTRE
E.E.A. AUTOMATIQUE INSA LYON
[Link] Laboratoire CREATIS
Sec. : Stéphanie CAUVIN Bâtiment Blaise Pascal, 7 avenue Jean Capelle
Bâtiment Direction INSA Lyon 69621 Villeurbanne CEDEX
Tél : [Link].70 Tél : [Link].63
[Link]@[Link]
[Link]@[Link]
ÉVOLUTION, ÉCOSYSTÈME, Mme Sandrine CHARLES
E2M2 MICROBIOLOGIE, MODÉLISATION Université Claude Bernard Lyon 1
[Link] UFR Biosciences
Sec. : Bénédicte LANZA Bâtiment Mendel
Bât. Atrium, UCB Lyon 43, boulevard du 11 Novembre 1918
1Tél : [Link].62 69622 Villeurbanne CEDEX
secretariat.e2m2@[Link] [Link]@[Link]
INTERDISCIPLINAIRE SCIENCES-SANTÉ Mme Sylvie RICARD-BLUM
EDISS [Link] Institut de Chimie et Biochimie Moléculaires et Supramoléculaires
Sec. : Bénédicte LANZA (ICBMS) - UMR 5246 CNRS - Université Lyon 1
Bât. Atrium, UCB Lyon Bâtiment Raulin - 2ème étage Nord
1Tél : [Link].62 43 Boulevard du 11 novembre 1918
[Link]@[Link] 69622 Villeurbanne Cedex
Tél : +33(0)4 72 44 82 32
[Link]-blum@[Link]
INFORMATIQUE ET MATHÉMATIQUES M. Hamamache KHEDDOUCI
INFOMAT [Link] Université Claude Bernard Lyon 1
HS Sec. : Renée EL MELHEM Bât. Nautibus
Bât. Blaise PASCAL, 3e étage 43, Boulevard du 11 novembre 1918
Tél : [Link].46 69 622 Villeurbanne Cedex France
infomaths@[Link] Tél : [Link].69
[Link]@[Link]
MATÉRIAUX DE LYON M. Stéphane
Matéria [Link] BENAYOUN Ecole
ux [Link] Sec. : Yann DE Centrale de Lyon
ORDENANA Tél : Laboratoire LTDS
[Link].44 36 avenue Guy de
[Link]-ordenana@[Link] Collongue 69134 Ecully
CEDEX
Tél : [Link].37
[Link]@[Link]
MÉCANIQUE, ÉNERGÉTIQUE, M. Jocelyn BONJOUR
MEGA GÉNIE CIVIL, ACOUSTIQUE INSA Lyon
[Link] Laboratoire CETHIL
Sec. : Stéphanie Bâtiment Sadi-
CAUVIN Tél : Carnot 9, rue de la
[Link].70 Physique
Bâtiment Direction INSA 69621 Villeurbanne CEDEX
Lyonmega@[Link] [Link]@[Link]
ScSo* M. Christian MONTES
ScSo [Link] Université Lumière Lyon
Sec. : Mélina FAVETON 286 Rue Pasteur
INSA : J.Y. 69365 Lyon CEDEX 07
TOUSSAINT Tél : [Link]@[Link]
[Link].79
[Link]@[Link]

*ScSo : Histoire, Géographie, Aménagement, Urbanisme, Archéologie, Science politique, Sociologie, Anthropologie

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Les filtres plantés de roseaux à écoulement vertical ont connu un essor considérable en
France lors des 20 dernières années. Les enjeux aujourd’hui sont de mieux maitriser les
performances de ces systèmes et d’optimiser le traitement de l’azote et du phosphore. Pour
répondre à ces objectifs, des variantes aux systèmes classiques ont vu le jour, consistant
notamment à immerger le fond des filtres pour instaurer des zones d’anoxie et / ou à intégrer
à la chaine de traitement des procédés favorisant l’oxydation (lit bactérien, aération forcée).
Les travaux présentés ici portent sur un procédé appelé AZOE® dont les deux principales
modifications par rapport au système de base sont l’immersion partielle des filtres plantés de
roseaux et l’ajout d’un lit bactérien en tête de filière. Les objectifs de ces travaux sont
d’approfondir la compréhension des mécanismes de traitement de l’azote sur cette filière, en
particulier le lien entre carbone et azote, ainsi que de tester de possibles optimisations. Les
travaux ont été menés à plusieurs échelles, combinant l’exploitation de données de terrain à
l’échelle réelle à des essais expérimentaux à l’échelle pilote et de manière plus marginale en
laboratoire. Une attention particulière a été porté aux le développement de méthodologie
analytique adaptée aux particularités de ces systèmes.

Les résultats obtenus ont permis de mettre en évidence que dans ces procédés, la
charge carbonée est dégradée jusqu’à 50% sur le lit bactérien, tandis que la nitrification peut
atteindre 25% dans certains cas. Le lit bactérien dégrade la charge carbonée préférentiellement
à la charge ammoniacale. Le premier étage de filtre planté contribue à la nitrification à hauteur
de 75% et à la dénitrification à hauteur de 60%. En conditions normales, les performances du
second étage s’avèrent plus faibles (20% et 5% pour la nitrification et la dénitrification
respectivement). L’ensemble des travaux ont permis de confirmer que le manque de carbone
organique sur le second étage était le principal facteur limitant de la dénitrification et de mieux
quantifier l’évolution du ratio carbone : azote tout au long de la filière de traitement.

Un des apports de cette thèse a consisté à adapter et/ou développer des approches
analytiques spécifiques pour améliorer la compréhension des procédés. Tout d’abord une
approche isotopique a été développée en complément d’un traçage hydraulique pour
appréhender la dynamique du comportement de l’azote au cours d’une période d’alimentation

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du système. Un traçage à l’ammonium marqué a permis de mettre en évidence la réactivité de
l’azote avec les médias filtrant et de suivre dans le temps le déplacement et les transformations
d’une bâchée. Les pilotes expérimentaux ont été équipés d’une installation spécifique
permettant le prélèvement de matériaux filtrants sur lesquels les activités enzymatiques de
nitrification et de dénitrification de chaque étage ont été mesurés avec une précision d’environ
5 cm au sein des horizons des milieux poreux.

Dans une dernière phase destinée à optimiser ces systèmes au regard des limites
identifiées, deux stratégies d’apport de carbone organique ont été évaluées pour lever les
carences en carbone limitant la dénitrification sur le second étage. La dérivation d’une
proportion d’effluent brut vers le second étage a été testée à l’échelle pilote, couplée à la
mesure des potentiels microbiens de nitrification et de dénitrification permettant une
cartographie fine des horizons impliquées dans le traitement de l’azote en comparaison d’un
fonctionnement sans dérivation. Enfin, dans une démarche prospective, des essais de
laboratoire ont porté sur le choix et l’étude de 7 matériaux biosourcés dont les volumes et les
méthodes d’apport sur le second étage sont discutés.

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Vertical flow treatment wetlands have experienced considerable growth in France over the
last 20 years. The challenge today is to better control the performance of these systems and to
optimise the treatment of nitrogen and phosphorus. To meet these objectives, variants to the
classic systems have been developed, consisting in particular of immersing the bottom of the
filters to create anoxic zones and/or integrating processes that promote oxidation (trickling
filter, forced aeration) into the treatment chain. The work presented here concerns a system
called AZOE® whose two main modifications in relation to the basic system are the partial
immersion of the reed filters and the addition of a trickling filter at the head of the system. The
objectives of this work are to deepen the understanding of the nitrogen treatment mechanisms
in this system, in particular the link between carbon and nitrogen, and to test possible
optimisations. The work was carried out on several scales, combining the exploitation of field
data on a real scale with experimental tests on a pilot scale and, more marginally, in the
laboratory. Particular attention was paid to the development of analytical methodology
adapted to the particularities of these systems.

The results obtained have shown that in these processes, the carbon load is degraded by
up to 50% on the trickling filter, while nitrification can reach 25% in certain cases. The trickling
filter degrades the carbon load preferentially to the ammonia load. The first stage contributes
75% to nitrification and 60% to denitrification. Under normal conditions, the performance of
the second stage is lower (20% and 5% for nitrification and denitrification respectively). The
work as a whole confirmed that the lack of organic carbon on the second stage was the main
limiting factor for denitrification and enabled us to better quantify the evolution of the carbon
: nitrogen ratio throughout the treatment process.

One of the contributions of this thesis was to adapt and/or develop specific analytical
approaches to improve the understanding of the processes. Firstly, an isotopic approach was
developed in addition to hydraulic tracing to understand the dynamics of nitrogen behaviour
during a system feed period. A tracing with labelled ammonium made it possible to highlight
the reactivity of the nitrogen with the filter media and to follow the displacement and
transformations of a batch over time. The experimental pilots were equipped with a specific

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installation allowing the sampling of filtering materials on which nitrification and denitrification
enzyme activity analyses were carried out to provide information of each filter stage with a
precision of about 5 cm within the horizons of the porous media.

In a final phase designed to optimise these systems with regard to the identified limitations,
two organic carbon supply strategies were evaluated to overcome the carbon deficiencies
limiting denitrification on the second stage. The diversion of a proportion of raw effluent to the
second stage was tested on a pilot scale, coupled with the measurement of microbial
nitrification and denitrification potentials, allowing a fine mapping of the horizons involved in
nitrogen treatment in comparison with operation without diversion. Finally, in a prospective
approach, laboratory tests were carried out on the choice and study of 7 materials whose
volumes and methods of input to the second stage are discussed.

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Articles scientifiques publiés dans une revue à comité de lecture :

S. Kharitonov, N. Shchegolkova, A. Alexandrova, A. Saynchuk, P. Michel, K. Maciejewski, M.
Gautier, R. Gourdon, M. Semenov, G. Krasnov. Taxonomic diversity of Fungi and Bacteria in
AZOE-NP® vertical flow constructed wetlands. Water (2022)
K. Maciejewski, M. Gautier, B. Kim, P. Michel, R. Gourdon. Effect of trickling filter on carbon and
nitrogen removal in vertical flow treatment wetlands: A full-scale investigation. Journal of
Environmental Management (2021).
C.M. Trein, C. Banc, K. Maciejewski, A.d.M Motta, R. Gourdon, P. Molle, M. Gautier, M. von
Sperling. French vertical flow treatment wetlands in a subtropical climate: Characterization of
the organic deposit layer and comparison with systems in France. Science of the Total
Environment (2020).

Communications orales en congrès international :

C.M. Trein, C. Banc, K. Maciejewski, M. Gautier, M. von Sperling. Caracterização da fração
orgânica da camada de depósito de lodo na primeira etapa de um Sistema Francês em operação
no Brasil. V Conferência Panamericana de Sistemas Wetlands para Tratamento e
Melhoramento da Qualidade da Água / 5º Simpósio Brasileiro sobre Aplicação de Wetlands
Construídos no Tratamento de Águas Residuárias, Apr 2021, Florianopolis, Brazil
K. Maciejewski, M. Gautier, M. Kania, C. Banc, P. Michel, P. Molle, R. Gourdon. Challenges in
nitrogen removal in French vertical flow constructed wetlands. 8th international symposium on
wetlands pollutants dynamics and control. 17 au 21 Juin 2019 à Aarhus, Danemark.
K. Maciejewski, B. Kim, M. Kania, M. Gautier, P. Michel, R. Gourdon. Comparison of nutriments
removals of different types of French vertical flow constructed wetlands. 19th IWA international
conference on diffuse pollution and eutrophication. 29 Octobre 2019 à Jeju, Corée du Sud.

Communications orales en congrès national :

K. Maciejewski, M. Gautier, P. Michel, C. Banc, R. Gourdon. Rôle du carbone organique dans le
cycle de l’azote : application aux filtres plantés de roseaux à écoulement vertical. 99ème congrès
de l’Astee. 9 au 11 juin 2020 à Lyon, France.

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Posters :
K. Maciejewski, M. Gautier, X. Saupin, E. Bonjour, B. Kim, P. Michel, P. Molle, R. Gourdon. In
depth insight of nitrogen removal in french VFCW with various configurations. 9th international
symposium on wetlands pollutants dynamics and control. 13 au 17 Septembre 2021 à Vienne,
K. Maciejewski, M. Gautier, C. Banc, B. Kim, M. Kania, R. Gourdon. Récupérer les ressources de
l’eau par traitement par filtres plantés de roseaux du déchet à la ressource. 17eme congrès de
la Société Française de Génies des Procédés. 15 au 17 octobre 2019 à Nantes, France. Prix du
meilleur poster.

Séminaires :
K. Maciejewski, M. Gautier, P. Michel, R. Gourdon. Optimization of nitrification/denitrification
phases in constructed wetlands. Research on the ecological LID design factors with pollutant
removal mechanisms considering microorganism and plants, PHC STAR 2019, INSA Lyon –
Kongju University joint seminar, Mar 2019, Lyon, France

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Français Signification Anglais

DCO Demande Chimique en Oxygène COD

DBO5 Demande Biochimique en Oxygène pendant 5 jours BOD5

COT Carbone Organique Total TOC

NTK Azote Total Kjeldahl NTK

NGL Azote Global TN

- Constructed /Treatment Wetland CW/TW

FPR Filtre Planté de Roseaux -

LB Lit bactérien, Trickling filter TF

MES Matière en suspension TSS

MO Matière Organique OM

UV Ultraviolet UV

- Horizontal Flow Constructed/Treatment Wetlands HFCW/HFTW

- Vertical Flow Constructed/Treatment Wetlands VFCW/VFTW

DEEP Déchets Eaux Environnement Pollutions -

AE Analyser élémentaire -

IRMS Spectrométrie de masse à rapport isotopique IRMS

EH Equivalant habitant pe

Eh Potentiel d’oxydo-réduction ORP

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Aérobie : Organisme vivant dont la voie métabolique de production d’énergie

peut utiliser le dioxygène (O2) comme accepteur d’électrons.

Ammonification : Désigne le processus qui transforme l’azote organique en azote

inorganique (NH4+) par une action biologique

Anabolisme : Ensemble de réactions enzymatiques de biosynthèse de

macromolécules ou de leurs précurseurs. Ces réactions nécessitent un
apport d’énergie.

Anaérobie : Organisme vivant dont son métabolisme se développe en absence

d’oxygène (O2).

Anoxie : Désigne la diminution ou absence d’oxygène dissous biodisponible

dans le milieu (sol, sédiments, eau, atmosphère).

Autotrophes : Un organisme capable de synthétiser lui-même les matières

organiques qui le composent à partir d’éléments minéraux

Catabolisme : Ensemble de réactions chimiques ou enzymatiques de dégradation de

macromolécules organique ou inorganiques en molécules de faible
taille. Ce processus de dégradation génère de l’énergie.

Dénitrification : Le processus de réduction biologique des nitrates en d’azote gazeux

en absence d’oxygène.

Hétérotrophes : Espèces qui prélèvent dans le milieu extérieur les substances

organiques dont elles ont besoin, ne pouvant pas effectuer lui-même
la synthèse de ses éléments

Métabolisme : Ensemble des transformations moléculaires et énergétiques qui se

déroulent de manière ininterrompue au sein de cellules ou organismes
vivantes au cours des phénomènes de synthèse et de dégradation
organique (anabolisme et catabolisme).

Nitrification : Oxydation de l’azote ammoniacal successivement en nitrites puis en

nitrates, en présence d’oxygène.

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Avant tout chose, merci à ma grande famille unie et aimante qui m’a offert la chance et la
force de réaliser mes projets. Vous mesurez le chemin parcouru et à quel point rien n’était
gagné d’avance. J’espère que vous mesurez seulement que tout cela n’est possible que grâce
à vous.

Il me reste encore l’excitation de ma première rencontre avec le laboratoire et l’impatience

de travailler avec vous tous qui aviez l’air absolument cools ! Tout comme la chaleur du
« bureau » qui aura tout arrangé pour que je m’y sente bien. Merci à vous Helen, Valentine,
Rémy, Camille et Julie, c’était avec joie que je suis venu vous rejoindre chaque matin. J’ai
toujours eu la drôle de sensation de vivre des moments privilégiés dont je savais sur l’instant
qu’il fallait profiter. Je n’oublie pas Adi, Anaëlle, Amin, Damien, Jérémie, Manon, Mathis,
Maxime, Nathalie, Richard, Rodolphe, Violetta, Wen et tous les autres qui êtes fantastiques, à
croire que ce laboratoire n’attire que des personnes drôles et bienveillantes. Il y a évidemment
une place particulière pour Boram pour son aide, son soutien, tous ces moments à nous mais
aussi pour ces quelques jours en Corée qu’on ne peut oublier. Plus que tout autre chose, j’ai
apprécié travailler avec vous tous qui attachez une grande importance aux relations humaines.
Mathieu et Rémy vous êtes parfaits pour ça, vous étiez le duo parfait au moment parfait. C’est
avec grand plaisir que je continuerai à travailler avec vous de près ou de loin. Je veux aussi
chaleureusement remercier Didier et Olivier qui ont facilité mon séjour au hall expérimental de
la Feyssine. Merci à Lucia qui m’a encouragé à m’investir dans l’aventure, et tendrement
accompagné pendant plusieurs années.

Merci pour le soutien de l’entreprise SCIRPE représentée par Philippe et Marie et la

confiance qu’ils m’ont toujours accordé. Merci à mes collègues géniaux : Caroline, Brieuc, Marc,
Guillaume, Jean-Luc, Théophile, Philippe et l’atelier. Mention spéciale pour Cassandre qui a
participé à la séance camping dans une station d’épuration.

Y por último, Diana, tú eres la que ha iluminado el final de esta tesis y has contribuido al
esfuerzo cuando más importaba. Ya que has soportado lo peor de lo que puedo ser, no tengo
duda de que ahora pasaremos a lo mejor de lo que podemos ser.

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Je vous remercie tous infiniment de m’avoir accompagné et de continuer à le faire. Je garde
pour moi la vision de vous voir tous réunis dans l’amphithéâtre le jour de la soutenance. Voici,
à l’image d’un véritable travail collaboratif scientifique la répartition officielle des tâches de ce
manuscrit afin de témoigner de son incroyable effort collectif.

Official Thesis Credit Author Statement:

Mathieu G., Rémy G.: Kind Management, Great supervision & Amazing conference memories
giving. Philippe M.: Kind Management & Confidence giving. Boram K.: Scientific supervision,
Conferences support & Unforgettable harbour discussion. Patrick J., Amélie C.: Exciting scientific
collaboration & Valuable motivation assistance. Camille B.: Unusual scientific collaboration,
Cherries picking, Trot’ riding & outstanding friendship making. Julie F: (un)scientific brainstorms
on dangerously falling board, funniest emotional support. Rémy B.: Beer brewing chemistry
debate & Thesis tension evacuation by tchoukball. Helen C.: Organization help, Spanish
teaching & Providing internship to my future lover. Valentine G.: Office emotional balance
ensuring & Discreetly telling the garage door is open. Maxime B.: Squash backhands teaching
to release the pressure. Lab’s friends: Unlimited coffee break participation & good mood
providing. Aoun’s, Doum’s, Roub’s, Toun’s, Youn’s: Emotional support, ski bagarre riding,
Understanding the real groove of African love song & Providing intense friendship. Corinne J.,
David J.: Mental coaching for self-improvement & making a place for me in the family. Thomas
E., Théo M.: English supervision, De-dramatize any situations by laughing & Providing intense
friendship. Mum and Dad: Making and educating myself, Projects and life dreams assistance &
Pretending to understand why I did a PhD. Papy, Mamie: Initiation to wetlands through fishing
teaching & Kindergarten to high school transportations. Emilie B., and Remi F.: Amazing
constructed wetlands drawing & providing moral comfort through fondue savoyarde. Lucile B.,
Charley: Showing that real success is only measured by human qualities. Nieces and Nephews:
Providing real laboratory help & Providing real breaks from sciences by letting me play with
them. Jean Phi R.: Helping to popularise my thesis subject, Sharpening my political convictions
& Enlarge the family with his lovely tribe. Isabelle B., Catherine B.: PhD defense hypoglycaemia
checking & Making the family even cooler. Copain: Helping to put the importance of life into
perspective through the joy of grazing grass. John Mayer, Mark Knopfler : Huge energy
transmission through guitar playing. Diana A.R.: Writing & manuscript layout, Salsa dancing,
Emotional supervision & Unconditional love sharing.

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TABLES DES MATIERES
Résumé............................................................................................................................................. 5
Abstract ............................................................................................................................................ 7
Communications scientifiques ........................................................................................................ 9
Listes de abréviations .................................................................................................................... 11
Glossaire......................................................................................................................................... 13
Tables des matières ....................................................................................................................... 16
Liste de tableaux ............................................................................................................................ 18
Liste de figures ............................................................................................................................... 19
Introduction ................................................................................................................................... 23
Chapitre 1 : Etude bibliographique............................................................................................... 27
1.1 Eaux usées domestiques en France .............................................................................. 29
1.2 L’azote dans les eaux usées ........................................................................................... 34
1.3 Le traitement par filtres plantés de roseaux ................................................................ 50
1.4 Le procédé AZOE et les technologies associées ........................................................... 57
Chapitre 2 : Matériels et méthodes.............................................................................................. 65
2.1 Campagnes d’échantillonnage pour le suivi de terrain ................................................ 67
2.2 Travaux à l’échelle pilote ............................................................................................... 69
2.2 Méthodes analytiques ................................................................................................... 76
2.3 Suivi isotopique .............................................................................................................. 79
2.4 Suivi microbiologique à l’échelle pilote ........................................................................ 82
Chapitre 3 : Résultats et discussions ............................................................................................ 87
3.1 Exploitation de données de terrain de station filtres plantés de roseaux classiques et
Azoe® 91
3.2 Etude à long terme du système à l’échelle pilote et de l’influence des variations de
charges...................................................................................................................................... 117
3.3 Etude de la dynamique du système AZOE® par traçage hydraulique et isotopique 141
3.4 Etude de l’activité de nitrification et de dénitrification au regard d’une optimisation
du système par ajout de carbone par dérivation d’effluent brute........................................ 167

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3.5 Détermination du potentiel de matériaux biosourcés pour compenser les carences en
carbone organique de la dénitrification hétérotrophe .......................................................... 195
Chapitre 4 : Conclusion générale ................................................................................................ 215
4.1 Rôle du lit bactérien ..................................................................................................... 217
4.2 Cartographie en profondeur des étages de filtration ................................................ 218
4.3 Dynamique de l’azote dans le système AZOE-N® ....................................................... 219
4.4 Relation entre carbone et azote .................................................................................. 220
4.5 Solutions d’optimisation .............................................................................................. 221
4.6 Modifications opérationnelles ..................................................................................... 222
4.7 Mise en application des travaux de thèse à Trans-la-Forêt ....................................... 223
4.8 Maitrise de l’épuration de l’azote dans un contexte global ...................................... 223
Perspectives ................................................................................................................................. 225
Bibliographies .............................................................................................................................. 227
Annexes ........................................................................................................................................ 238

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LISTE DE TABLEAUX
Tableau 1.1-1 Caractéristiques moyennes des eaux usées domestiques en milieu rural en
petites collectivités (inférieures à 2000 équivalent habitants). D’après les données de
Mercoiret, 2009. ............................................................................................................................ 30
Tableau 1.2-1 tableau récapitulatif des processus biologiques impliquées dans le cycle de
l’azote et les facteurs environnementaux associés ..................................................................... 49
Tableau 1.3-1 Comparaison du dimensionnement et des performances d’abattement des
polluants pour les systèmes végétalisés classiques, hybrides ou optimisés .............................. 56
Tableau 1.4-1 Référencement des différentes variantes du système AZOE, leur objectif de
traitement, ainsi que leur occurrence. ......................................................................................... 60
Tableau 1.4-2 Equations usuelles de l’abattement du carbone et de l’ammonium sur un lit
bactérien (Henrich and Marggraff, 2013). ................................................................................... 63
Tableau 2.1-1 Caractéristiques des stations de traitement des eaux usées domestiques de la
campagne de prélèvement de Février 2019 ................................................................................ 68
Tableau 2.2-1Caractéristiques techniques et de dimensionnement du pilote de la Feyssine de
type AZOE-N................................................................................................................................... 73
Tableau 2.2-2 Méthodes de prélèvement pour chaque point du pilote .................................... 76
Tableau 2.3-1 Protocole, appareillage et références des analyses ............................................ 77
Tableau 3.1-1 Overview on the VF TW treatment plants selected for the study ...................... 99
Tableau 3.2-1 Mean values (in bold) and standard deviations (in italics) of the parameters
monitored in the wastewater at different levels of the treatment line in autumn and spring
respectively. (COD = Chemical Oxygen Demand; TOC = Total Organic Content; TKN = Total
Kjeldahl Nitrogen; TSS = Total Suspended Solids.)..................................................................... 127
Tableau 3.4-1 : Average removal rates observed in the pilot system over the 45 days of
operation under conventional operating mode ........................................................................ 179
Tableau 3.4-2 : Average Input / output CODd, N-NH4 and TN concentrations and corresponding
removal rates recorded in the pilot-scale systems operated under conventional conditions as
compared to step-feeding conditions with bypass flows of 10 or 20% of the feed volumetric
flow. .............................................................................................................................................. 186

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LISTE DE FIGURES
Figure 1.1-1 : Historique de la réglementation européenne et nationale sur le traitement
collectif des eaux usées domestiques .......................................................................................... 31
Figure 1.1-2 : Cartographie des zones sensibles en France métropolitaine (hors Corse). ........ 32
Figure 1.1-3 : Proportion des systèmes de traitement des petites collectivités en France
(inférieur à 4000 EH) en nombre de station (gauche) et fréquence cumulée de l’installation de
système filtres plantés de roseaux au cours des dernières décennies (droite). Données 2021
issues du ministère du développement durable. ........................................................................ 33
Figure 1.2-1 : Représentation des eaux usées brutes en milieu rural. (Basé sur les données de :
Zawilski et Brzezińska, 2008, El-Sheikh et al., 2016).................................................................... 34
Figure 1.2-2 : Diagramme des réductions successives nécessaires à la dénitrification classique
hétérotrophe complète, avec les enzymes et gènes associés .................................................... 42
Figure 1.2-3 : Schéma des voies métaboliques de l’azote dans un système végétalisé. Fortement
inspiré et adapté de l’excellente figure de Hallin et al., 2018..................................................... 46
Figure 1.2-4 : Illustration des limites planétaires (dont le flux biogéochimique de l’azote) telles
qu’actualisé par Steffen et al., 2017. ............................................................................................ 47
Figure 1.3-1 : Schéma d’un filtre planté de roseaux à écoulement hydraulique horizontal
(Crédits Schéma : E. Bon) .............................................................................................................. 51
Figure 1.3-2 : Schéma d’un filtre planté de roseaux à écoulement hydraulique vertical. (Crédits
schéma : E. Bon) ............................................................................................................................ 52
Figure 1.4-1 : Photographie aérienne d’une station AZOE dans la commune de CIEL (Crédits
photo : B. Cédat) ............................................................................................................................ 57
Figure 1.4-2 : Nombre de station répartie par tranche d’EH (A) et évolution du nombre de
station Azoé au cours du temps (B). Données SCIRPE. ............................................................... 58
Figure 1.4-3 : Carte de la répartition géographique du procédé AZOE différencié par type en
France métropolitaine. .................................................................................................................. 59
Figure 1.4-4 :Synoptique de la filière AZOE-NP ........................................................................... 61
Figure 1.4-5 : Schéma d’un lit bactérien en coupe ...................................................................... 62
Figure 1.4-6 : Elimination de l’azote par filtres plantés de roseaux à écoulement vertical et
immersion partielle (Kim, 2014) ................................................................................................... 64
Figure 2.2-1 : IMAGE aérienne du site de la station de la Feyssine et du hall de recherche. ... 69
Figure 2.2-2 : Photographies de la serre, des pilotes et du laboratoire d’analyse du hall
expérimental de la Feyssine .......................................................................................................... 70

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Figure 2.2-3 : Schéma du pilote de la Feyssine de type AZOE-N ................................................ 71
Figure 2.2-4 : Phases d’alimentation et de repos du lit bactérien et des deux étages de filtration
de l’installation pilote pour une semaine type ............................................................................ 75
Figure 2.3-1 :Concentrations en ammoniums et nitrates dans la solution mère et après passage
sur les résines échangeuses d’ions. Les barres d’erreur représentent les écarts-types des
réplicats réalisés. ........................................................................................................................... 80
Figure 2.3-2 : Photographie du montage utilisée pour réaliser les séparations, ici sur résine
Onguard II Na. Les échantillons traités sont recueillis dans les erlenmeyers à droite. ............. 81
Figure 2.4-1 : Schéma du montage de la carotte et de son fourreau en place dans le massif
filtrant (ici sur le premier étage du pilote) ................................................................................... 82
Figure 2.4-2 : A gauche, photographie de la carotte interne après ouverture le 28 avril 2021. A
droite, photographie des flacons Plasma après division de la carotte en horizons. ................. 83
Figure 3.1-1 : Schematic description of the classical French VFTW system and the AZOE systems
........................................................................................................................................................ 98
Figure 3.1-2 : Distribution of pH and COD, BOD5, TSS, TKN, and ammonium concentrations in
influent wastewaters from the whole data set of all monitoring campaigns .......................... 102
Figure 3.1-3 :Comparative Input / Output (I/O) removal rates of COD, BOD5, TSS, TKN and TN
in the Classical French (red), 1-stage AZOE (blue) and 2-stage AZOE (yellow) systems. For each
system, middle lines within boxplot are median values. Dot colour represents the water
temperature (°C). ........................................................................................................................ 104
Figure 3.1-4 :COD and TKN removal rates of the total system, TU1 and TU2 for classical, 1-stage
AZOE and 2-stage AZOE configurations. See Figure 3.1-1 for definitions of TU1 and TU2. Bars
represent the standard deviation. .............................................................................................. 106
Figure 3.1-5 : Removal efficiencies of BOD5, COD, TKN and NO3- of the 2-stage AZOE system
on a mass load basis. Blue and pink circles show the respective contributions of TU1 and TU2.
See fig. 1 for TU definitions. ........................................................................................................ 108
Figure 3.1-6 : Conceptual framework of carbon and nitrogen removal pathways on 2-stages
AZOE ............................................................................................................................................. 110
Figure 3.2-1 :Set-up of experimental pilot-scale AZOE system of 6-person equivalent in the
Feyssine experimental hall .......................................................................................................... 123
Figure 3.2-2 :Top - Raw wastewater concentration for carbon, nitrogen and particular
parameters represented for both sessions (black line represents the median value). Bottom:
wastewater temperature recorded at inlet of the system during spring and autumn sampling
sessions. ....................................................................................................................................... 126
Figure 3.2-3 : Input/output overall removal rates of various parameters recorded on the pilot-
scale AZOE system in autumn and spring. ................................................................................. 129

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Figure 3.2-4 : Input/output daily performances of various parameters achieved in the aerobic
trickling filter alone...................................................................................................................... 130
Figure 3.2-5 :Respective contributions of the successive steps of treatment in the pilot-scale
system in autumn (top) and spring (bottom)............................................................................. 132
Figure 3.2-6 :Average (bold black lines), min and max data (thin lines) of weekly online
monitoring of nitrates (top), ammonium (middle) and nitrates + ammonium concentrations
(bottom, in blue and red ink, respectively) at the outlets of first-stage filter (left) and second-
stage filter (right) during the autumn period ............................................................................. 133
Figure 3.2-7 :Average (bold black lines), min and max data (thin lines) of weekly online
monitoring of nitrates (top), ammonium (middle) and nitrates + ammonium concentrations
(bottom, in blue and red ink, respectively) at the outlets of first-stage filter (left) and second-
stage filter (right) during the spring period ............................................................................... 134
Figure 3.2-8 : Online monitoring of ORP within the saturated zone (depth 5 cm) of first-stage
filter (top) and second-stage filter (bottom) for autumn (solid brown) and spring (dashed green)
sessions during the successive feed (white background and rest (grey background) phases in
the spring period. Data are expressed with the hydrogen standard electrode correction. .... 136
Figure 3.2-9 :Carbon/nitrates ratio and denitrification performances one the first (green dots)
and second (yellow dots) stages of filtration. ............................................................................ 138
Figure 3.2-10 :Schematic representation of the behaviour of dissolved nitrogen on this pilot
...................................................................................................................................................... 139
Figure 3.3-1 :Pilot scale characteristics of an AZOE system designed for 6 persons equivalent
(Maciejewski et al., 2022b) ......................................................................................................... 147
Figure 3.3-2 :Diagram of the sampling protocol, sample preparation on ion exchange columns
and isotope analysis during labelled ammonium tracing. ......................................................... 151
Figure 3.3-3 : Mean concentration at various sampling point on the pilot with standard
deviation from punctual sampling during the isotopic tracking ............................................... 153
Figure 3.3-4 :Ammonium and nitrates measurements during the feeding period of the isotopic
tracking at the outlet of the first stage (above) and second stage (below). Vertical dashed lines
show the batch feeding dynamic every two hours.................................................................... 154
Figure 3.3-5 :AminoG acid tracking recovery (left) and concentration measurements (right) of
partially saturated first and second filtration stages in a vertical flow treatment wetland at pilot
scale.............................................................................................................................................. 156
Figure 3.3-6 :Isotopic measurement of 15N abundance on the total nitrogen at the TF, first
stage and second stage outlet versus time after the system has been fed with the zero labelled
batch. ........................................................................................................................................... 157

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Figure 3.3-7 :: Isotopic measurement of 15N/14N in ammonium and nitrates at the TF, first stage
and second stage outlet versus time after the system has been fed with the zero labelled batch
Isotopic ratios. ............................................................................................................................. 159
Figure 3.4-1 : Pilot-scale characteristics and experiments set-up AZOE system is composed of
a trickling filter and two partially saturated constructed wetlands. ......................................... 175
Figure 3.4-2 : Daily pollutants concentrations measured along the AZOE-N pilot process line in
a conventional operating mode.................................................................................................. 180
Figure 3.4-3 : Nitrification Enzyme Activity (NEA) and Denitrification Enzyme Activity (DEA) in
the first (above) and second (below). Displayed errors bars are analytics errors. .................. 184
Figure 3.4-4 : Treated and applied NH4+ and NO3- load on the second stage of filtration in
conventional operating mode (blue triangles) and with 10% (yellow dots) or 20% step-feeding
ratios (green squares). ................................................................................................................ 187
Figure 3.4-5 : Depth profiles of denitrification potentials in the second TW filter stage under
conventional vs step-feeding conditions with 20% bypass flow............................................... 188
Figure 3.4-6 : Depth profiles of microbial denitrification potentials expressed in µg N-N2 or N-
N2O per g of stage medium as recorded in the first stage filter and the second stage filter under
conventional or step-feeding conditions with 20% bypass flow. ............................................. 190
Figure 3.5-1 :Photographie des matériaux utilisés (sauf boues) après broyage. De gauche à
droite et de haut en bas : paillis de chanvre, rafles de maïs, roseaux frais, pailles, roseaux d’hiver
et BRF. .......................................................................................................................................... 203
Figure 3.5-2 : Masse de carbone organique total cumulée et normalisée par gramme de
matériau en fonction de l’évolution du rapport liquide/solide. ............................................... 207
Figure 3.5-3 : Masse de d’azote Kjeldahl cumulée et normalisée par gramme de matériau en
fonction de l’évolution du rapport liquide/solide...................................................................... 208
Figure 3.5-4 : Rapports moyens de COT/NTK dans les lixiviats du test de lixiviation pour les 7
matériaux testés. ......................................................................................................................... 209
Figure 4.2-1 : Schéma conceptuel des mécanismes de traitement en carbone, azote et
phosphore en fonction de l’avancée du traitement sur la filière AZOE. .................................. 219

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L’utilisation de filtres plantés de roseaux pour l’assainissement des eaux usées domestiques
et agricoles en milieu rural a connu un essor important ces 30 dernières années. A ce jour, plus
de 5000 stations sont installées en France. Les coûts d’installation et d’exploitation mesurés, la
relative autonomie de fonctionnement, la bonne intégration paysagère, la robustesse des
systèmes et les performances de traitement sont parmi les raisons du succès de ces procédés
de traitement. La grande majorité des systèmes en France sont conçus sur la base de deux
étages de filtration successifs remplis de matériaux filtrants et plantés en leur surface par des
macrophytes, généralement Phragmites australis. Le sens d’écoulement hydraulique est
vertical et l’eau à traiter s’écoule librement dans un massif filtrant non-saturé. Cette
configuration classique porte le nom de « système français » et est très bien adaptée à la
rétention de la matière particulaire, à la minéralisation de la matière organique et à la
nitrification de l’ammonium (Molle et al., 2005 ; Paing et Voisin, 2005).

Les filtres plantés de roseaux connaissent désormais une nouvelle phase de développement
dont les objectifs sont d’optimiser le traitement des eaux usées sur les paramètres du
phosphore et de l’azote total, et de réduire l’emprise au sol globale des stations de traitement.
Cette évolution doit néanmoins conserver les qualités de robustesse et les coûts abordables de
la filière. Sur la base du système classique, de nouvelles variantes ont été développées
notamment avec l’immersion partielle des filtres pour favoriser des conditions de
dénitrification. Parmi elles on distingue également des procédés intégrants en complément la
circulation de l’effluent sur un lit bactérien (Kim et al., 2014 ; Stefanakis et al., 2021) et plus
récemment des systèmes à aération passive ou forcée (Foladori et al., 2013).

Le procédé étudié dans ces travaux de thèse est composé de deux étages successifs de
filtration auxquels s’ajoute l’utilisation d’un lit bactérien aérobie en tête de station apportant
dans des conditions d’aération passive une forte minéralisation de la charge carbonée, voire la
nitrification partielle de l’ammonium (Henrich and Marggraff, 2013), et permettant ainsi de
réduire la surface des filtres plantés et ainsi de limiter l’empreinte au sol des stations. Ce
système, connu sous le nom de AZOE®, présente une gamme de variantes sur cette base. Il a

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été développé par l’entreprise SCIRPE et couvert par plusieurs brevets (FR2900921A1 ;
EP1857419A1 ; WO201215026A2). Il conserve le fonctionnement global du système français
classique avec ses deux étages de filtration à écoulement hydraulique vertical offrant une large
surface de filtration et permettant le développement d’une couche de boues sur le premier
étage (Kania et al., 2019). Au besoin une variante AZOE-P® est proposée pour le traitement du
phosphore par l’ajout de chlorure ferrique après traitement sur lit bactrien (Kim et al., 2015).
Enfin la variante AZOE-N® propose une immersion partielle du fond des filtres favorisant des
conditions d’anoxie et assurant le traitement de l’azote total.

L’un des objectifs prioritaires de ces solutions de traitement est de diminuer les rejets
d’azote largement présents dans les eaux usées sous forme d’ammonium et d’azote organique.
Le cycle de l’azote s’avère relativement complexe. D’une part car cet élément peut prendre de
nombreuses formes, liquide ou gazeuse, et d’autre part car il existe de nombreuses voies
physiques et biologiques permettant de passer d’une forme à une autre. Outre la contribution
aux phénomènes d’eutrophisation notamment à travers le rejet possible de nitrates, une
attention de plus en plus importante est portée aux formes d’azote émises sous forme gazeuse
en raison du fort pouvoir de réchauffement global du protoxyde d’azote N2O. Plus globalement,
la gestion du flux biogéochimique de l’azote a été établie comme l’une des limites planétaires
par Rockström et al. (2009). Cette limite est considérée aujourd’hui comme dépassée
(Rockstrom et al., 2015). L’état des eaux douces est également une des limites planétaires, dont
des auteurs viennent de mettre en évidence également un dépassement.

En raison de la présence d’azote en forte quantités dans les eaux usées domestiques, les
enjeux sont de taille pour les filières de traitement des eaux. L’assainissement de l’azote issu
d’effluents domestiques consiste principalement en la transformation biologique de l’azote
organique et ammoniacal en nitrates, puis des nitrates en azote gazeux sous la forme N2 (ou,
plus marginalement et selon les conditions opératoires, en N2O)

Les objectifs de cette thèse sont (i) de mieux comprendre les processus impliqués dans le
traitement de l’azote et (2) de rechercher les modes opératoires pouvant améliorer lorsque
nécessaire le traitement de l’azote total sur la filière AZOE®. L’approche suivie est
pluridisciplinaire, mobilisant des techniques physico-chimiques, microbiologiques et chimiques
(isotopiques) qui se sont nourries de deux collaborations scientifiques avec des laboratoires
extérieurs. Ces approches ont permis d’investiguer le système d’étude sous des prismes
24

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complémentaires et de croiser les informations pour en affiner notre connaissance. Le fil
conducteur de ces travaux était de mieux maitriser l’épuration de l’azote afin d’être en capacité
d’adapter les projets futurs en améliorant les performances épuratoires pour répondre aux
critères de rejets en zones sensibles et d’évolution des réglementations. Dans un contexte de
croissance de réutilisation des eaux traitées, cette étude doit aussi pouvoir donner des
éléments de réponse pour permettre des rejets maîtrisés de formes d’azote adaptées pour les
usages. Les résultats de ces travaux doivent permettre d’accompagner la filière à mieux
répondre aux enjeux environnementaux actuels.

Ce manuscrit est constitué de quatre chapitres classiques : une synthèse bibliographique,

un chapitre « matériels et méthodes », un chapitre « résultats et discussion » suivi d’une
discussion générale de conclusion.

Tout d’abord sous la forme d’un premier article un ensemble de données à l’échelle
terrain d’installations en fonctionnement sont présentés. Par un bilan complet sur 29 stations,
ce travail permet un état des lieux des fonctionnements globaux des différents systèmes
(procédés classiques, procédés AZOE à 2 étages, et à un unique étage pour la première fois).
Cela permet de comparer les systèmes, notamment en termes de performance, et d’identifier
des premières limites et donc les leviers à lever.

Dans un second article, l’ensemble de la filière AZOE-N (lit bactérien et les deux étages
de filtres plantés) a été reproduite à l’échelle pilote et fait l’objet d’un suivi particulier pour
mieux identifier le fonctionnement global et plus notamment le rôle de chaque compartiment
dans le traitement du carbone et de l’azote. Les objectifs étaient notamment de mieux
comprendre la contribution de chaque unité dans la performance des systèmes et les limites
rencontrées.

Dans un troisième article, la dynamique des systèmes AZOE-N à l’échelle d’une période
d’alimentation a été étudiée en proposant une approche combinée d’analyses physico-
chimiques, notamment en continu, couplée à des mesures de traçage hydraulique et de traçage
isotopique à l’ammonium marqué 15N. Outre l’apport de connaissances sur le système, ce
travail avait pour objectif de développer une méthodologie d’investigation isotopique adaptée
aux particularités de ces procédés.

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Ces trois premiers articles suggèrent que la relation carbone/azote est au cœur des
possibilités d’optimisation du procédé. Les deux derniers articles traitent alors directement de
la manière de contrôler la dénitrification en gérant les carences en carbone. Deux aspects ont
été envisagés à différentes échelles d’investigation : la dérivation de 10 ou 20 % des effluents
bruts tout d’abord, appelé le step-feeding, évaluée à l’échelle pilote et l’ajout de matériaux
biosourcés à l’échelle de laboratoire.

Un quatrième article de suivi de la filière AZOE-N à l’échelle pilote avec l’utilisation de step-
feeding a été comparé aux résultats sans la dérivation de l’effluent. La particularité de ce travail
est de proposer une approche microbiologique via la mesure de l’activité enzymatique de
nitrification et dénitrification avant et après utilisation du step-feeding. Une cartographie fine
des deux étages de traitement sur toute la profondeur est réalisée et permet de mieux décrire
les potentialités de traitement.

Enfin dans un 5ème article, 7 matériaux biosourcés ont été choisis et testés à l’échelle du
laboratoire afin de déterminer leur potentiel d’apport de carbone organique. L’objectif était
d’identifier les meilleurs matériaux disponibles pour pallier aux carences en carbone dans
certaines unités de traitement, tout en garantissant un ajout d’azote limité. La partie mise en
œuvre n’a pas été présenté dans ce travail.

L’ensemble des résultats est discuté dans un dernier chapitre de discussion générale qui se
termine sur les perspectives associées à ces travaux.

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1.1 EAUX USEES DOMESTIQUES EN FRANCE
1.1.1 CARACTÉRISATION DES EAUX USÉES DOMESTIQUES

Le terme « eaux usées » désigne l’ensemble des effluents aqueux rejetés par les activités
humaines domestiques, agricoles ou industrielles. Quelle que soit l’activité qui génère ces
effluents, leurs caractéristiques imposent généralement qu’ils soient traités avant rejet dans le
milieu récepteur afin de minimiser leurs impacts. Les eaux usées domestiques, générées par
les ménages, sont composées d’eaux vannes issues des toilettes avec une importante fraction
particulaire et d’eaux grises issues des cuisines et salles de bain qui contiennent notamment
des détergents, savons et lessives. Leurs caractéristiques dépendent des pratiques et habitudes
de vie des habitants. On constate cependant que les eaux-usées domestiques rurales
présentent des caractéristiques similaires (Mercoiret, 2009) dont les valeurs moyennes sont
présentées dans le tableau 1.1-1. La nature des polluants qu’elles renferment est semblable,
ainsi que les proportions entre ces polluants. Les paramètres usuels pour décrire la composition
des eaux usées domestiques sont :

Demande Chimique en Oxygène (DCO) : Mesure la quantité de dioxygène consommée pour

oxyder les espèces organiques et minérales présentes dans un volume unitaire de l’effluent
considéré, que ces espèces soient biodégradables ou non. La DCO s’exprime en mg02.L1.

Demande Biologique en Oxygène sur 5 jours (DBO5) : Mesure la quantité de dioxygène

consommée en 5 jours à 20°C pour dégrader microbiologiquement la charge organique
biodégradable. La DBO5 s’exprime en mg02.L-1.

Matière En Suspension (MES) : Désigne la fraction particulaire insoluble des eaux usées. Les
MES s’exprime en mg.L-1.

Azote ammoniacal ou ion ammonium (NH4+) : Désigne la forme la plus réduite de l’azote, qui
se partage en ammoniac (NH3) et ammonium (NH4+) en fonction du pH d’effluent. L’azote
ammoniacal s’exprime en mg N.L-1.

Azote Kjeldahl (TKN) : Désigne l’ensemble des formes réduites de l’azote, c’est-à-dire l’azote
organique, l’ammonium (NH4+) et l’ammoniac (NH3). Le TKN s’exprime en mg de N.L-1.

Azote nitrique (NO3-) : Désigne la forme la plus oxydée de l’azote, les nitrates. La
concentration en NO3- s’exprime en mg.L-1 ou en mg N.L-1

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Azote Total (TN) : Désigne l’azote sous toutes ses formes organiques et minérales dans
l’effluent. L’azote total est la somme de l’azote Kjeldahl, des nitrates et des nitrites, et
s’exprime en mg N.L1.

Phosphore Total (Pt) : Désigne le phosphore sous toutes ses formes dans l’effluent analysé.
Le Ptot s’exprime en mg P.L-1.

TABLEAU 1.1-1 CARACTERISTIQUES MOYENNES DES EAUX USEES DOMESTIQUES EN MILIEU RURAL EN PETITES
COLLECTIVITES (INFERIEURES A 2000 EQUIVALENT HABITANTS). D’APRES LES DONNEES DE MERCOIRET, 2009.

DBO5 DCO MES TKN N-NH4+ TN Ptot DBO5/TN

Unités mg.L-1 mg.L-1 mg.L-1 mg.L-1 mg.L-1 mg.L-1 mg.L-1

Moyenne 265,0 645,7 288,1 67,3 54,9 72,6 9,4 3,9

Borne
570,0 1341,3 696,0 123,1 98,3 122,6 18,4
supérieure

Borne
39,0 122,0 53,0 14,1 12,0 20,2 2,0
inférieure

Enfin, il convient d’introduire la notion d’équivalent habitant (EH) très utilisée dans le
domaine du traitement des eaux usées. Il s’agit d’une unité de mesure qui représente la
pollution émise par une personne et par jour, et qui permet d’évaluer la capacité de traitement
d’une station d’épuration. A titre d’exemple, 1 EH équivaut à 60g de DBO5/jour.

1.1.2 CADRE RÉGLEMENTAIRE

L’assainissement collectif en France est soumis au droit européen et national. A ce jour,

le dernier arrêté paru sur l’assainissement collectif des eaux usées est l’arrêté du 31 Juillet
2021. Cet arrêté est la dernière version d’une série de mises à jour de l’arrêté du 22 Juin 2007
qui abrogea de précédents textes. La chronologie de la règlementation est représentée par la
figure 1.1-1.

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FIGURE 1.1-1 : HISTORIQUE DE LA REGLEMENTATION EUROPEENNE ET NATIONALE SUR LE TRAITEMENT COLLECTIF
DES EAUX USEES DOMESTIQUES

La réglementation fixe les garanties de rejets en termes de performances ou de

concentrations maximales de polluants dans l’effluent traité. Les seuils de rejet sont également
fonction de la capacité de la station d’épuration (débit des rejets) et du milieu récepteur (zones
sensibles ou non). La figure 1.1-2 représente les secteurs hydrographiques définis ou non
comme zones sensibles à l’eutrophisation et s’il est ainsi question d’un traitement plus
rigoureux de l’azote et du phosphore.

Les seuils limites de rejet à respecter dépendent de la taille de l’unité de traitement

▪ Capacité inférieure à 2000 EH : DBO5 = 35 mg02.L-1 ou 60% ; COD = 200 mg02.L-1 ou 60

% ; MES = 50%
▪ Capacité supérieure à 2000 EH : DBO5 = 25 mg02.L-1 ou 80% ; COD = 125 mg02.L-1 ou 75
% ; MES = 35 mg. L-1 ou 90 %

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Seules les stations d’épuration d’une capacité supérieure à 10000 EH sont théoriquement
soumises à un traitement sur l’azote et le phosphore, en plus des garanties à atteindre sur le
COD, DBO5 et MES d’une capacité supérieure à 2000 EH.

▪ Capacité supérieure à 10 000 EH : Azote Total = 15 mg.l ou 70 %, Phosphore Total = 2

mg.l ou 80 %
▪ Capacité supérieure à 100 000 EH : Azote Total = 10 mg.l ou 70 %, Phosphore Total = 1
mg.l ou 80 %
Depuis 2020, la réutilisation des eaux traitées est encadrée par un texte européen du 25 mai
2020.

FIGURE 1.1-2 : CARTOGRAPHIE DES ZONES SENSIBLES EN FRANCE METROPOLITAINE (HORS CORSE).

1.1.3 LES PROCÉDÉS D’ÉPURATION EN FRANCE

D’une manière générale, ces procédés visent à réduire la charge en carbone, azote et
phosphore des eaux usées afin d’atténuer notamment le risque d’eutrophisation du milieu
récepteur. De plus, plutôt qu’un retour direct au milieu naturel en rejetant les eaux traitées
dans un cours d’eau ou par infiltration, leur valorisation en les réutilisant pour l’agriculture est
aussi largement étudiée (Haruvy N., 1997 ; Kivaisi A., 2001).

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Les procédés de traitement sont nombreux et possèdent tous des avantages et
inconvénients qui leur sont propres, et les rendent plus ou moins adaptés au type d’effluent à
traiter. Les critères retenus pour le choix d’un système sont généralement les coûts
d’investissement et d’exploitation, les performances de traitement, l’intégration paysagère,
l’emprise au sol.

Les stations de traitement des effluents domestiques en petites collectivités (taille

inférieure à 4000 EH) représentent 88,2 % du nombre total de stations installées en France.
Parmi celles-ci les systèmes les plus fréquemment utilisés sont les boues activés (31,4% des
stations), les filtres plantés de roseaux (22,6%) et les lagunes bien qu’elles tendent à être
remplacées par d’autres systèmes plus performants (19,7%).

FIGURE 1.1-3 : PROPORTION DES SYSTEMES DE TRAITEMENT DES PETITES COLLECTIVITES EN FRANCE (INFERIEUR A
4000 EH) EN NOMBRE DE STATION (GAUCHE) ET FREQUENCE CUMULEE DE L’INSTALLATION DE SYSTEME FILTRES
PLANTES DE ROSEAUX AU COURS DES DERNIERES DECENNIES (DROITE). DONNEES 2021 ISSUES DU MINISTERE DU
DEVELOPPEMENT DURABLE.

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1.2.1 L’AZOTE DANS LES EAUX USEES DOMESTIQUES

L’azote des eaux usées est d’origine humaine via les fèces et l’urine. Dans les urines
elles-mêmes, 75% du N est sous la forme d’urée ou d’acide urique (Henze, 1992). Dans les
fécès, l’azote organique est présent dans une grande variété de composés tels que les acides
aminés, les pyrimidines, et les purines (Kadlec and Wallace, 2009). L’urée est rapidement
hydrolysée sous l’action microbienne à pH neutre, ce qui explique la teneur importante d’azote
sous la forme ammoniacale dans les eaux usées domestiques rurales et urbaines lorsqu’elles
parviennent à la station de traitement. La part d’azote ammoniacal en entrée de stations de
traitement a été estimée à 60% (Kadlec and Wallace, 2009) ou 70% (Zawilski et Brzezińska,
2008).

Il est généralement considéré que l’azote des eaux usées brutes en entrée de station et
après avoir transité par les réseaux d’assainissement est principalement sous formes
ammoniacale (de l’ordre de 70 %) et organiques (de l’ordre de 30 %) sans plus de précision, ce
qui correspond à l’azote Kjeldahl. Toutefois, certains auteurs se sont intéressés à
compartimenter et quantifier les différentes formes de l’azote organique, généralement dans
un objectif de modélisation (Zawilski et Brzezińska, 2008, El-Sheikh et al., 2016). La figure 1.2-
1 représente la composition moyenne des formes azotées des eaux usées brutes en milieu
rural.

FIGURE 1.2-1 : REPRESENTATION DES EAUX USEES BRUTES EN MILIEU RURAL. (BASE SUR LES DONNEES DE :
ZAWILSKI ET BRZEZINSKA, 2008, EL-SHEIKH ET AL., 2016)

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1.2.2 CYCLE CLASSIQUE DE L’AZOTE DANS LES EAUX USEES ET LEURS TRAITEMENTS

1.2.3 AMMONIFICATION

L’ammonification est la conversion de l’azote organique en ammonium. Elle est le

résultat d’une série d’étapes de transformation réalisée par des micro-organismes qui en tirent
de l’énergie. C’est donc l’une des premières transformations que subit l’azote dans les eaux
usées, dont la presque totalité de l’azote organique est considérée comme convertible en azote
ammoniacal (Kadlec and Knight, 1996).

L’ammonification est rapide et est favorisée par la température croissante (Amlinger et

al., 2003 ; Lee et al., 2009). Le pH optimal de l’ammonification se situe entre 6,5 et 8,5 (Saeed
and Sun, 2012). D’une manière générale, l’ammonification ne pose pas de contraintes
particulières pour le traitement des eaux usées de par sa cinétique rapide.

Volatilisation de l’azote ammoniacal :

L’azote ammoniacal se distribue en fonction du pH et de la température entre ses

formes ionisées NH4+ (ion ammonium, soluble et peu volatil) et non-ionisée NH3 (ammoniac
très volatil) (Kadlec and Wallace, 1996). Le pKa de cet équilibre est égal à 9,2, indiquant donc
que la forme ionisée est majoritaire à 99% à pH neutre. La forte prédominance des ions
ammonium dans les eaux usées s’explique donc par leur pH neutre et leur température
moyenne (15 à 25°C). Dans de telles conditions la perte d’azote par volatilisation de l’ammoniac
est considérée comme faible (Vymazal, 2007).

1.2.4 NITRIFICATION

La nitrification est l’oxydation biologique de l’ammonium en nitrates. Elle s’effectue en

conditions aérobies en deux étapes successives réalisées par des micro-organismes
chimiolithotrophes. La première étape nommée nitritation est la conversion de l’ammonium
en nitrite par des bactéries autotrophes (AOB : Ammonium Oxydizing Bacteria) et des archées
(AOA : Ammonium Oxydizing Archea) qui tirent de cette transformation l’énergie nécessaire
pour leur croissance, et utilisent le carbone inorganique pour synthétiser leur matériel
cellulaire. La seconde étape, nommée la nitratation, est l’oxydation bactérienne des nitrites en
nitrates (NOB : Nitrites Oxydizing Bacteria) (Cáceres et al., 2018).

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Première étape : oxydation de l’ammonium par les AOB et AOA

Lors de l’oxydation de l’ammonium en nitrites par les AOB, l’ammonium est

premièrement oxydé en hydroxylamine (NH2OH) via la synthèse de l’enzyme ammonia
monooxygénase (AMO) codée par le gène amoA qui est la séquence génétique permettant
d’identifier la présence de nitrifiants dans un sol. L’hydroxylamine est ensuite oxydée en nitrites
via l’enzyme l’HydroxylAmine oxydoréductase (HAO) (Levy-Booth et al., 2014). La nitritation des
AOA diffère sensiblement de celle des AOB au regard de la synthèse des protéines impliquées
dans le processus, bien que les deux groupes aient en commun le gène amoA (Holmes et
al.,2018). Bien que ces deux groupes AOB et AOA soient tous deux présents dans la grande
majorité des écosystèmes, la proportion de l’un par rapport à l’autre varie fortement selon les
conditions du milieu, notamment le pH et la disponibilité en ammonium. Les AOA sont
généralement dominants dans des environnements acides et relativement pauvres en
ammonium (Holmes et al., 2018). Les AOB sont donc plutôt majoritaires dans les eaux usées
riches en ammonium. Parmi les AOB, les genres principaux sont Nitrosomonas, Nitrosococcus
et Nitrosospira.

La variation d’enthalpie libre standard à pH 7 de la réaction d’oxydation de l’ammonium

en nitrites ΔG°’ est de - 275 kJ/mol NH3 (Daims et al., 2015) :

Equation de réaction (Lee et al., 2009) :

NH4+ + 1.5O2 → NO2- + H2O + 2H+

Seconde étape : Oxydation des nitrites par les NOB

L’oxydation des nitrites en nitrates est réalisée par des bactéries pour leur besoin
énergétique. L’enzyme responsable de ce processus biologique est la nitrite oxydoreductase
(NOR) qui a été identifiée chez diverses groupes d’autotrophes, mais aussi parfois chez des
hétérotrophes (Ableliovich et al., 2006) Ces bactéries sont retrouvées dans une large diversité
d’environnements, parmi lesquels les eaux usées. Parmi les NOB, les genres principaux sont
Nitrobacter, Nitrospira et Nitrococcus (Holmes et al., 2018).

Gain d’énergie associé l’oxydation de nitrites en nitrates - (Daims et al., 2015) :

ΔG°’ = - 74 kJ/mol NO2

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NO2- + 0.5O2 → NO3-

Réaction globale de Nitrification

La nitrification dans sa globalité comprend classiquement deux étapes d’oxydation

successives par les AOB/AOA et par les NOB et suggère donc que pour parvenir à une
nitrification complète ces deux groupes cohabitent dans le même environnement et qu’ils
puissent s’exprimer. D’une manière générale, la nitrification nécessite un environnement aéré
puisque l’oxygène est utilisé comme accepteur final d’électrons. Sur la base des équations des
deux étapes d’oxydation précédentes, l’équation globale de la nitrification devient (Vymazal,
2007) :

NH4+ + 2 O2 → NO3- + 2 H+ + H2O

La nitrification est réalisée en large part par des micro-organismes autotrophes qui
utilisent les carbonates pour leur croissance cellulaire. En prenant en compte cette croissance
cellulaire, l’équation globale de la nitrification peut être écrite tel que (Green et al., 1998) :

NH4+ + 1.86 O2 +1.98 HCO3 → 0.020 C5H7NO2 + 0.98 NO3- + 1.88 H2CO3 +1.04 H2O

Le gain d’énergie associé l’oxydation de l’ammonium en nitrates est de ΔG°’ = - 349 kJ/mol NH3

[Link] F ACTEURS D ’ INFLUENCE

La nitrification est influencée par divers facteurs dont les principaux sont : la température, la
disponibilité en oxygène, le pH et l’alcalinité (Vymazal, 2007).

La température :
La gamme de température optimale de la nitrification varie dans la littérature, mais
reste globalement contenu entre 25 et 40 °C (Vymazal, 2007 ; Saeed and Sun, 2012). Il semble
aussi que la température optimale dépende du climat et du sol étudiés. De fait, la température
optimale dans les milieux tropicaux est généralement supérieure à celle observée dans les
climats tempérés (Sharawat, 2008). Toutefois d’une manière générale, les vitesses de

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nitrification diminuent dès lors que la température devient supérieure ou inférieure à cette
gamme.

La disponibilité en oxygène :
La nitrification est un processus biologique très demandeur en oxygène, qui nécessite
de 4.2 à 4.5 mg02 pour l’oxydation complète en nitrate d’un milligramme d’ammonium (Saeed
and Sun, 2012). De plus, la concentration en oxygène dissous n’affecte pas de la même manière
les communautés AOB et NOB. Des teneurs limitantes en oxygène dissous favorisent
l’accumulation des nitrites (Jianlong and Ming, 2004 ; Millot, 2017). Une concentration en
oxygène dissous supérieure à 1,5 mgO2.l-1 est considérée comme nécessaire pour permettre la
nitrification complète.

Le pH :
D’une manière générale, les valeurs optimales de pH se situent entre 7.5 et 8.5 (Jiménez et
al., 2011 ; Le et al., 2019). Des conditions acides (pH > 5.5) sont généralement considérées
comme défavorables à la nitrification (Lee et al., 2009). Ceci s’explique par plusieurs raisons :

o Un pH acide déplace l’équilibre acide/base de NH4+/NH3 en faveur NH4+ (pKa = 9.2), ce

qui limite la disponibilité du substrat NH3 pour les communautés nitrifiantes AOB lors
de l’oxydation de l’ammoniac en hydroxylamine (De Boer and Kowalchuk, 2001 ;
Biesterfeld et al., 2003) ;
o De la même manière, un pH acide déplace l’équilibre acide/base de HNO2/NO2- (pKa =
3.3) vers la forme HNO2. Or, le substrat des communautés NOB s’avère être
préférentiellement le NO2- (Jiménez et al., 2011).

Toutefois depuis le début des années 2000, de nouvelles études invitent à élargir notre
manière de considérer la nitrification et l’influence du pH pour les autotrophes AOB et NOB. Il
a été observé dans des environnements acides (pH ≃3) des cinétiques de nitrification égales à
celles observées en conditions neutres. Les micro-organismes capables de réaliser la
nitrification à pH acide appartiennent aux communautés nitrifiantes hétérotrophes dont la
croissance cellulaire n’est pas affectée par le manque de substrat azoté (De Boer and
Kowalchuk, 2001), notamment par des AOA qui ont été identifiés comme actifs et bien plus
adaptés que les AOB dans ces environnements acides (Li et al., 2018).

L’alcalinité :

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Les organismes autotrophes sont capables d’utiliser le carbone inorganique dissous pour
leur propre croissance cellulaire. Pour l’oxydation d’1 mg d’ammonium, la valeur de la
consommation de CaCO3 (« alcalinité ») varie entre 7.02 mg (Biesterfeld et al., 2003 ; Lee et al.,
2009) et 7.14 mg (Saeed and Sun, 2012). Ainsi l’alcalinité de l’eau serait un facteur d’influence
important car elle permet :

o De limiter par effet tampon la chute du pH due à la nitrification, et de garantir la

disponibilité du substrat pour les microorganismes nitrifiants (AOB et NOB) ;
o De satisfaire les besoins en carbone inorganique pour la croissance cellulaire des
autotrophes.

De fait, Biesterfeld et al., (2003) ont proposé une plage de 40 à 45 mg/l de CaCO3 comme seuil
d’alcalinité en dessous duquel les cinétiques de nitrification sont significativement plus faibles.

1.2.5 DÉNITRIFICATION HÉTÉROTROPHE

Les nitrates produits par nitrification peuvent être réduits selon deux voies
métaboliques principales : en ammonium par DNRA (Dissimilatory Nitrate Reduction to
Ammonium) ou en diazote par dénitrification. La dénitrification est une forme de respiration
réalisée par des micro-organismes hétérotrophes anaérobies facultatifs qui peuvent utiliser les
nitrates comme accepteur final d’électrons lorsque l’oxygène dissous n’est pas disponible en
quantité suffisante pour la respiration aérobie (Kadlec and Wallace, 2009). La dénitrification
totale, en diazote, est le résultat d’une succession de réductions catalysées par 7 enzymes
principales (Jones et al., 2008) :

NO3- → NO2-→ NO → N2O → N2

La plupart des micro-organismes dénitrifiants ne possède pas toutes les enzymes

indispensables à la réduction totale des nitrates en diazote. La séquence complète de réduction
est réalisée par une coopération de bactéries, mais aussi d’archées d’une grande diversité
(Holmes et al., 2019).

[Link] M ICROBIOLOGIE DE LA DÉNITRIFICATION HÉTÉROTROPHE

Réduction des NO3- en NO2- :

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Les nitrates sont réduits en nitrites par l’activation de l’enzyme nitrates réductases NAS,
NAR et NAP. Les gènes narG et napA sont généralement ceux recherchés pour les études
portant sur cette étape réductive (Levy-Booth et al., 2014)

Réduction des NO2-en NO :

La réduction des nitrites en monoxyde d’azote est une étape fondamentale car l’azote
passe d’un état soluble à gazeux. Cette étape est catalysée par deux enzymes, la Cd1 nitrite
réductase et la Cu nitrite réductase respectivement codée par les gènes nirS et nirK. Ces deux
enzymes, dont la fonction est identique, diffèrent totalement par leur structure et les bactéries
ne possèdent toujours qu’une seule des deux enzymes (Philippot et al., 2007).

Bien qu’encore peu comprise, la réponse aux facteurs environnementaux semble

différente selon que les communautés portent le gènes nirS ou nirK (Wang et al., 2020 ; Sun
and Jiang, 2022).

Réduction du NO en N2O :

La réduction du monoxyde d’azote en protoxyde d’azote est catalysée par deux

enzymes différentes : l’oxyde nitrique réductase et la quinol oxyde nitrique réductase,
respectivement codées par les gènes norB et qnorB (Philippot et al., 2007).

Réduction du N2O en N2 :

Enfin, la réduction du protoxyde d’azote en diazote est catalysée par l’oxyde nitreux réductase,
codée par le gène nosZ.

Comme développé ci-dessus, la dénitrification est généralement représentée comme

une succession de réductions qui mène à la libération de N2. Cette vision est en réalité biaisée
car dans de nombreux écosystèmes la dénitrification ne parvient à son terme et il en résulte
une libération de l’azote sous forme N2O. Le N2O est un gaz à effet de serre dont le potentiel
de réchauffement est plus de 300 fois supérieur à celui du CO2. On estime que les deux tiers
des émissions de N2O proviennent d’environnements terrestres (Hallin et al., 2018). Dès lors,
dans un contexte global de réchauffement climatique, les raisons pour lesquelles la
dénitrification demeure incomplète est un sujet d’intérêt majeur et encore trop peu compris.

Philippot et al., (2011) suggère que l’une des raisons de la libération de N2O est
génétique : Une partie des dénitrifiants ne possèdent tout simplement pas le gène nosZ et sont

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donc incapables de synthétiser l’enzyme oxyde nitreux réductase permettant la réduction du
N2O en N2. Si ces bactéries agissent comme des producteurs de N2O, il existe d’autres
communautés qui ne sont dotées que de nosZ et agissent comme un puit de N2O qu’elles
réduisent en N2 (Domeignoz-Horta et al., 2017). Toutefois, la réponse de ces groupes aux
paramètres environnementaux est très peu comprise. Domeignoz-Horta et al., (2017) ont ainsi
mis en évidence que la nature même du sol joue un rôle important sur l’équilibre entre
producteurs et réducteurs de N2O. En outre, un pH acide et une température froide auront
tendance à augmenter le rapport N2O : N2 (Simek and Cooper, 2002 ; Philippot et al., 2007 ;
Philippot et al., 2011), ainsi que la présence d’oxygène dissous en station de traitement (Tallec
et al., 2008, Glass et al., 2012), ou encore la faible disponibilité du carbone organique (Chen et
al., 2019). En conclusion, il n’existe pas de consensus clair permettant d’expliquer les variations
d’émission N20 : N2 d’un environnement à l’autre.

Réaction globale de dénitrification :

En prenant le glucose comme source de carbone organique nécessaire à la croissance

cellulaire des communautés dénitrifiantes hétérotrophes, l’équation globale de la
dénitrification s’écrit comme suit (Kadlec and Wallace, 2009) :

NO3- + 0.208 C6H12O6 → 0.5 N2 + 1.25 CO2 + 0.75H20 + OH-

L’intégralité de la séquence de réductions de la dénitrification classique hétérotrophe est

présentée par la figure 1.2-2.

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FIGURE 1.2-2 : DIAGRAMME DES REDUCTIONS SUCCESSIVES NECESSAIRES A LA DENITRIFICATION CLASSIQUE
HETEROTROPHE COMPLETE, AVEC LES ENZYMES ET GENES ASSOCIES

[Link] F ACTEURS D ’ INFLUENCE

Les principaux facteurs d’influence de la dénitrification sont : la température, la

disponibilité en oxygène, le pH et la disponibilité en carbone organique.

La température :
La gamme de température optimale pour la dénitrification se situe entre 15 et 30 °C
(Lee et al., 2019). De la même manière que pour la nitrification, la dénitrification reste possible
à des températures inférieures ou supérieures à cette gamme, mais les vitesses sont plus
lentes. La limite de température en dessous de laquelle la nitrification, tout en restant possible
se réalise très lentement est généralement de 5°C (Kadlec and Wallace, 2009).

Le pH :
Une gamme de pH entre 6 et 8 convient à la dénitrification (Vymazal, 2007). Toutefois,
la dénitrification a déjà été observée à des pH plus acides. Il est possible que le pH n’affecte pas
directement le processus enzymatique mais plutôt la disponibilité du carbone. Enfin, une

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diminution du pH s’accompagne d’une augmentation de la proportion en N2O : N2 libérée
(Simek and Cooper, 2002).

La concentration en oxygène dissous

La dénitrification, réalisée par des micro-organismes anaérobies facultatifs, est un
processus anaérobie très sensible à la présence d’oxygène dissous dans le milieu.
Théoriquement, la présence d’oxygène devrait inhiber le processus. Pourtant il n’existe pas de
réel consensus sur le seuil limite en oxygène dissous (Millot, 2017; Kadlec and Wallace, 2009).
La limite proposée dans la littérature est de l’ordre de 0.3 à 0.5 mgO2/l (Saeed and Sun, 2012).
En réalité, il est possible que des micro zones anoxiques au sein des sols oxygénés permettent
une dénitrification (McKenney et al., 2001).

Des valeurs de potentiel redox comprises entre -100 et + 300 mV permettent théoriquement
la dénitrification (Tanner et al., 2002 ; Kadlec and Wallace, 2009).

La disponibilité en carbone organique :

La dénitrification exige la présence de substrats organiques biodisponibles dont
l’oxydation bactérienne fournit les électrons nécessaires à la réduction de l’azote, ainsi que les
besoins nutritifs (C, N, etc.) nécessaires à la croissance cellulaire des hétérotrophes. Il a été
estimé que 3,02g de matière organique sont nécessaires à la réduction d’1g de nitrates (Kadlec
and Wallace, 2009). Un rapport C/N en dessous de ce rapport conduit à une dénitrification
incomplète (Rocher et al., 2015).

La disponibilité en carbone organique est identifiée comme un paramètre clé pour

contrôler la dénitrification dans les systèmes de traitement des eaux usées (Wu et al., 2014).
Afin de maîtriser les carences, différentes stratégies sont proposées dans la littérature :

o Un apport externe direct de carbone organique solide ou liquide (Zhang et al., 2016 ;
Chang et al., 2019) ;
o L’incorporation des matériaux filtrant naturellement riches en carbone organique
(Saeed and Sun, 2011) ;
o La dérivation de l’effluent brute au rapport C/N élevé vers les zones en carences
(Stefanakis et al., 2011 ; Al-Wahaibi et al., 2021).

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Le traitement des eaux usées utilise principalement la description du cycle de l’azote

par les voies métaboliques dites « classiques » : ammonification, nitrification autotrophe,
dénitrification hétérotrophe. C’est une vision simplifiée et pratique pour décrire les systèmes
de traitement. Toutefois, les voies métaboliques « alternatives » sont de plus en plus étudiées
et leur connaissance peut permettre une gestion plus fine des procédés.

[Link] DNRA: D ISSIMILATORY N ITRATE R EDUCTION A MMONIA

La réduction des nitrates n’a pas nécessairement comme produit final le N2O ou N2 gazeux.
Elle peut conduire à la production de NH4+. Cette voie est appelée la DNRA et se fait
parallèlement à la dénitrification hétérotrophe. La proportion de nitrates réduit par DNRA dans
les sols est mal connue. La voie DNRA semble favorisée par un haut rapport carbone : azote
(Kadlec and Wallace, 2009 ; Holmes et al., 2019), conditions rarement satisfaites dans le
traitement des eaux usées. Comme pour la dénitrification, la DNRA est réalisée par une très
large diversité de microorganismes. Elle s’effectue en deux étapes de réduction :

o Les nitrates en nitrites, par la periplasmic nitrate reductase codée par les gènes nap /
nar à l’image de la dénitrification classique ;
o Les nitrites en ammonium par le cytochrome c nitrite réductases, encodée par le gène
nrf

[Link] ANAMOX: ANAEROBIC AMMONIA OXIDATION

L’ANAMOX est l’oxydation de l’ammonium par les nitrites, dont le produit final est le N2.
Moins demandeuse en énergie que la nitrification aérobie de l’ammonium en nitrates suivie de
la dénitrification anaérobie des nitrates en N2, cette voie métabolique a reçu beaucoup
d’attention puisqu’elle permet le traitement de l’azote total en diminuant les coûts
d’exploitation. Dans un premier temps, les nitrites sont réduits en NO par la nitrite reductase
(NirS). Le NO ainsi formé est combiné au NH3 pour former l’hydrazine (N2H4) via l’hydrazine
synthase. L’hydrazine est ensuite oxydée en N2 via l’hydrazine hydrogénase. La diversité connue
à ce jour des micro-organismes capables de l’ANAMOX est relativement restreinte : 19 espèces
de bactéries ont été reportées. Toutes ces espèces appartiennent à phylum Planctomycetes
(Holmes et al., 2019).

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L’équation de l’ANAMOX en prenant en compte la croissance cellulaire est (Kadlec and Wallace,
2009) :

NH3 + 0.85 O2 → 0.44 N2 + 0.11 NO3- + 1.43 H2O + 0.14 H+

[Link] S YNTHESE DU CYCLE DE L ’ AZOTE DANS LES EAUX USEES

Les spéciations de l’azote dans un système végétalisé sont nombreuses et les

transformations biologiques variées. Les voies métaboliques associées sont portées par une
grande diversité de micro-organismes dont les bactéries et les archées. Toutes ces réactions
sont catalysées par des une ou plusieurs enzymes dont la fonction est identique, et qui sont
partagées par une diversité plus ou moins importante de micro-organismes. Les facteurs
environnementaux tels tel que le pH, la disponibilité en substrat et la concentration en oxygène
dissous favorisent ou défavorisent certains groupes capables d’une même réaction. La figure
1.2-3 représente les principales voies métaboliques pour un système végétalisé. La fixation de
l’azote gazeux sous la forme N2 en azote organique n’a pas été mentionnée précédemment car
elle ne contribue pas à l’épuration des eaux usées. Toutefois, ce processus biologique permet
de refermer le cycle de l’azote. La fixation est réalisée par certaines espèces de bactéries
diazotrophes en symbioses avec des végétaux et quelques légumineuses, qui transforment
l’azote gazeux en une forme organique (Levy-Booth et al., 2014).

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FIGURE 1.2-3 : SCHEMA DES VOIES METABOLIQUES DE L’AZOTE DANS UN SYSTEME VEGETALISE. FORTEMENT
INSPIRE ET ADAPTE DE L’EXCELLENTE FIGURE DE HALLIN ET AL., 2018.

1.2.7 LES ENJEUX ENVIRONNEMENT DU TRAITEMENT DE L’AZOTE

Comme discuté dans les paragraphes précédents, les spéciations de l’azote sont
multiples et les transformations biologiques nombreuses et complexes. Par conséquent, la
nature des enjeux environnementaux associée à ces différentes formes azotées est diverse.
Cette section tend donc à faire un tour d’horizon des enjeux principaux liés à l’azote dans les
milieux naturels et de discuter comment les transformations de l’azote issues du traitement
des eaux usées peuvent y être reliées.

[Link] L A NOTION DE LIMITE PLANETAIRE ET LE FLUX BIOGEOCHIMIQUE

En 2009, un consortium de chercheurs introduit la notion de limite planétaire

(Rockström et al., 2009) comme étant le seuil à ne pas dépasser pour ne pas altérer
irrémédiablement les conditions favorables à un environnement durable et un écosystème sûr.
Ce concept a notamment pour but d’identifier des équilibres physiques ou biologiques que
l’activité humaine tend à briser. Les auteurs identifient 9 limitent planétaires (figure 1.2-4) et
parmi celles-ci figure le flux biogéochimique de l’azote. Les modifications liées au cycle de
l’azote interviennent via la conversion du diazote gazeux (N2) en de formes beaucoup plus

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actives via l’industrie ou l’agriculture principalement. On retrouve parmi ces formes plus actives
principalement l’ammonium mais aussi les nitrates et l’azote organique. L’impact
environnementaux de ces formes peut alors prendre diverses formes : eutrophisation en milieu
aquatique (lacs, rivières ou environnements côtier), pollution en nitrates des nappes
phréatiques ou encore émission de N2O. Le concept de limites planétaires prend en compte
une estimation de l’ampleur des déséquilibres qui sont périodiquement réévalués pour rendre
compte des améliorations ou des détériorations (Steffen et al., 2015). L’assainissement des
eaux usées joue donc un rôle de premier plan par le traitement de l’azote qui consiste en réalité
à transformer l’azote vers des formes moins réactives.

FIGURE 1.2-4 : ILLUSTRATION DES LIMITES PLANETAIRES (DONT LE FLUX BIOGEOCHIMIQUE DE L’AZOTE) TELLES
QU’ACTUALISE PAR STEFFEN ET AL., 2017.

[Link] C ONTRIBUTION À L ’ EFFET DE SERRE

La libération dans l’atmosphère d’azote gazeux sous la forme N2O est un cas particulier
des « nouveaux » enjeux environnementaux de l’azote. Cette forme de l’azote est un puissant
gaz à effet de serre dont le pouvoir de réchauffement global (RPG) est 310 fois supérieur à celui
du CO2 pour une masse équivalente (ADEME). Les sources principales de N2O sont industrielles,
et agricoles via les phénomènes de dénitrification dans les sols cultivés. Le traitement des eaux

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usées est aussi directement concerné par cette problématique car la réduction des nitrates
passe par la dénitrification.

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TABLEAU 1.2-1 TABLEAU RECAPITULATIF DES PROCESSUS BIOLOGIQUES IMPLIQUEES DANS LE CYCLE DE L’AZOTE ET LES FACTEURS ENVIRONNEMENTAUX ASSOCIES

Processus biologique Equations Description Facteurs environnementaux

o Favorisée par des zones oxygénées
Ammonification Azote Organique → NH4+ Biologique : gain d’énergie o Température élevée
o Large diversité de bactéries et d’archées o pH entre 6.5 et 8.5

NH4+ + 2 O2 → NO3- + 2 H+ + H2O o Favorisée par une concentration en oxygène

Nitrification totale Oxydation biologique : Gain d’énergie
dissous supérieure à 1,5 mgO2/L

Communautés autotrophes : AOB et AOA

o pH neutre ou légèrement alcalin.
Nitritation NH4+ + 1.5O2 → NO2- + H2O + 2H+ En deux étapes successives avec intermédiaire par
o pH acide favorise AOA
NH2OH

Nitratation NO2- + 0.5O2 → NO3- Communautés autotrophes : NOB o pH neutre

4 étapes de réduction successives pour une o Favorisée par des zones anoxiques
dénitrification complète o Température optimale de 15 à 30 °C
Réalisée par une large diversité de bactéries et o pH neutre et alcalin. Possible aussi avec pH
NO3- → NO2-→ NO → N2O → N2 d’archées qui possèdent une ou plusieurs enzymes acide
Dénitrification hétérotrophe
clés o Disponibilité en carbone organique
Ne parvient pas toujours au N2 et reste bloqué au o La présence d’O2, et la faible disponibilité en
N2O carbone organique favorisent la libération de
N2O

NH3 + 0.85 O2 → 0.44 N2 + 0.11 NO3- + 1.43 Oxydation biologique de l’ammonium par les o Nécessite la coexistence de nitrites et
ANNAMOX nitrites : d’ammonium
H2O + 0.14 H+
o 2 étapes pour parvenir au N2

Favorisée lorsque le rapport carbone organique /

DNRA NO3- → NO2-→ NH4+ Réduction des nitrates en ammonium
azote est élevé

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1.3 LE TRAITEMENT PAR FILTRES PLANTES DE ROSEAUX
1.3.1 GÉNÉRALITÉS

Les filtres plantés de roseaux, désignés en anglais par « constructed wetland » ou

« treatment wetland », sont utilisés depuis les années 1960. A ce jour, on dénombre environ
5000 stations collectives sur le territoire français selon les données publiques d’eau France,
2019 représentants une capacité d’environ 2 000 000 EH. Largement plébiscité en France, ce
système est utilisé dans le monde entier et peut s’adapter à des climats froids et tropicaux avec
des performances de traitement variables (Lombard-Latune et al., 2018 ; Varma et al., 2021).

Le procédé de traitement par filtres plantés de roseaux est un système extensif,

majoritairement utilisé dans les zones rurales. Leur domaine d’utilisation se situent entre une
vingtaine d’équivalent habitant et plus difficilement au-delà de 4000 EH (Kim et al., 2014). Le
système est constitué d’un ou de plusieurs filtres en série, isolés du sol par une membrane en
géotextile et remplis de matériaux poreux à granulométries variables à travers lesquels
s’écoulent les eaux usées à traiter. Les eaux à traiter ne nécessitent pas de prétraitement
particulier si ce n’est un dégrillage afin de prévenir tout colmatage ou dommage sur les
éventuels systèmes de pompage. Ces filtres sont plantés à leur surface avec une végétation de
type macrophytes qui peut varier selon les climats et les régions du monde mais qui ont tous
pour propriétés d’avoir un réseau racinaire dense afin de faciliter l’écoulement hydraulique. Le
traitement des eaux usées se fait donc par filtration physique par le massif filtrant qui retient
les matières en suspension, et par traitement biologique par les microorganismes
naturellement présent dans les eaux usées (Kadlec et Wallace, 2009).

Il est possible de distinguer deux principales familles de filtres plantés de roseaux qui
diffèrent notamment par le sens d’écoulement hydraulique à travers le massif filtrant : les
systèmes à écoulement horizontal et les systèmes à écoulement vertical.

[Link] F ILTRES À ÉCOULEMENT HORIZONTAL

Dans un filtre planté de roseaux à écoulement horizontal (HFTW : Horizontal Flow

Treatment Wetland), les eaux usées traversent latéralement le massif filtrant à travers une zone
saturée maintenue artificiellement (Figure 1.3-1). En plus des conditions anaérobies qui
règnent dans la zone saturée, les rhizomes des macrophytes plantés garantissent des
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conditions aérobies en surface (Vymazal, 2007 ; Vymazal, 2014). En France, ce système n’est
pas très utilisé, à l’inverse de son homologue à flux hydraulique vertical qui est largement
plébiscité.

FIGURE 1.3-1 : SCHEMA D’UN FILTRE PLANTE DE ROSEAUX A ECOULEMENT HYDRAULIQUE HORIZONTAL (CREDITS
SCHEMA : E. BON)

[Link] F ILTRES A ECOULEMENT VERTICAL

Le système à écoulement vertical est très largement utilisé en France, ce qui lui vaut
l’appellation couramment utilisée de « French system ». Il possède l’avantage d’augmenter
grandement la surface de filtration par rapport à son homologue horizontal et est
classiquement dimensionné sur une base de 2 à 2,5 m²/EH. Il est composé de deux étages
successifs de filtration, généralement non saturés pour assurer le traitement de la charge
carbonée et ammoniacale.

Ce système fonctionne par bâchées. C’est-à-dire qu’il ne traite pas les eaux usées en
continue comme elles arrivent sur la station d’épuration mais les retient dans un ouvrage de

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bâchée conçues à cet effet et les libèrent sur l’étage de filtration lorsque le volume adéquat est
atteint. Ceci permet d’alimenter l’étage avec un débit optimal permettant la bonne répartition
des eaux sur toute la surface de traitement (Molle et al., 2005)

FIGURE 1.3-2 : SCHEMA D’UN FILTRE PLANTE DE ROSEAUX A ECOULEMENT HYDRAULIQUE VERTICAL. (CREDITS
SCHEMA : E. BON)

Le premier étage de filtration reçoit un effluent chargé en particules qui sont retenues
et s’accumulent à la surface du filtre, générant ainsi une couche de boue de surface. Cette
couche de boue s’accroît avec le temps et participe ainsi au traitement (Molle, 2014 ; Kania et
al., 2018). Pour garantir un fonctionnement optimal cette couche de boue nécessite d’alterner
des périodes d’alimentation et de repos.

Le premier étage de filtration est divisé en cellules de surface égale, généralement au

nombre de 3. Ces cellules sont successivement alimentées pendant une période de 5 à 7 jours.
Ainsi, après avoir été alimentée, une cellule est au repos alors que les cellules voisines vont être
alimentées tour à tour. Le deuxième étage est quant à lui divisé en deux cellules et est soumis
à la même dynamique. La gestion des périodes d’alimentation/repos est primordiale pour le

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bon fonctionnement du système, notamment pour assurer la bonne évolution et maturation
des boues de surface du premier étage.

1.3.2 MECANISMES D’EPURATION DANS UN SYSTEME VERTICAL

[Link] R ÔLE DES MACROPHYTES

En France, il est d’usage de planter les filtres avec des macrophytes de type Phragmites
Australis, mais il est tout à fait possible d’adapter l’espèce au climat. Lombard-Latune et al,
(2017) ont notamment identifié les variétés de plantes les plus adaptées aux climats tropicaux.

Quelle que soit la variété, les macrophytes jouent un rôle important pour prévenir le
colmatage en surface. La densité du système racinaire permet de stabiliser la surface, de
contribuer à une filtration efficace et de protéger le filtre des températures les plus basses (Brix,
1997). De plus, la rhizosphère offre une importance surface de contact pour les micro-
organismes et un transfert vers les zones inférieures. En revanche, l’assimilation de l’azote par
les végétaux joue un rôle relativement mineur dans le traitement global du système.

[Link] R OLE DE LA COUCHE DE DEPOT DE SURFACE

Le premier étage de filtration reçoit un effluent brut et chargé en matières particulaires.

Il se forme alors un dépôt de surface dont la croissance est estimée à 1 cm par an. Le dépôt est
curé lorsque l’épaisseur devient trop importante et perturbe le bon fonctionnement du filtre
(environ 15 cm). Ceci constitue la principale maintenance du système, mais la fréquence reste
relativement faible.

La nature de la couche de boues et sa contribution au bon fonctionnement du filtre a

été étudiée (Kania et al., 2018 ; Kania, 2018). Elle permet notamment d’homogénéiser la
répartition des eaux usées sur toute la surface du filtre et participe à la rétention physique par
filtration des matières en suspension. L’alternance des phase d’alimentation/repos est
primordiale pour les boues car cela permet une bonne évolution des boues dans le temps. De
plus, la matière organique retenue sur le dépôt de surface est oxydé tandis que l’ammonium
adsorbé est nitrifié.

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Les filtres plantés de roseaux classiques sont totalement insaturés. Par conséquent, le
traitement de l’azote est limité à l’ammonification – nitrification sur un système classique.
L’azote entre dans le système de traitement sous la forme organique dissous ou particulaire et
ammoniacale. Le dépôt de surface contribue donc directement à la rétention de l’azote
particulaire et à l’adsorption de l’ammonium. Les conditions d’oxygénation sont suffisantes
pour assurer les besoins en oxygène des communautés nitrifiantes au sein des deux étages de
filtration. Il a été démontré l’importante contribution du second étage dans le processus de
nitrification (Molle et al., 2005 ; Maciejewski et al., 2021).

1.3.3 PROCÉDÉS DÉRIVÉS DU VFCW

Le succès des filtres plantés de roseaux « classiques » à écoulement horizontal et vertical

repose sur leur fiabilité, leur faible coût de construction et de maintenance et leur performance
de traitement convenable. Toutefois, la recherche et les industriels s’intéressent à mettre au
point de nouveaux systèmes hybrides ou optimisés pour pallier aux limites principales des
systèmes dits classiques. Les améliorations recherchées sont :

o La réduction de l’emprise au sol, notamment pour rendre les systèmes végétalisés

compétitifs sur les marchés portant sur des stations de plus grandes tailles (1500 à 2500
EH) ;
o L’amélioration du traitement des eaux usées, notamment le traitement de l’azote total
en promouvant la dénitrification
o L’adaptabilité à des effluents atypiques d’origine agricole et industrielle.

[Link] S YSTÈMES HYBRIDES

Une manière de tirer avantage des deux systèmes classiques, c’est-à-dire à flux hydraulique
horizontal et vertical, est de les combiner en série :

o En traitant les effluents bruts sur un système vertical pour bénéficier de ses qualités de
rétention de la matière particulaire et d’oxygénation, puis en alimentant un système

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horizontal saturé. Ce système, abrégé VFnsat + HFsat dans le tableau 1.3-1, est l’une des
configurations hybrides les plus populaires (Molle et al., 2008 ; Vymazal et al., 2013) ;
o En traitant les effluents en premier lieu sur un filtre horizontal, puis en alimentant un
filtre vertical (Vymazal et al., 2013). Ce système est abrégé HFsat + VFnsat
o En combinant plus de 2 étages soit écoulement vertical ou horinzontal.

[Link] S YSTÈME TIDAL

Le procédé tidal tend à reproduire un cycle de marée avec des phases d’immersion
(saturée), puis des phases d’oxygénation (non saturé). Il fonctionne grâce à un système
d’alimentation et de siphonage piloté afin de caler les temps de marnage souhaités Toutefois,
ce système reste relativement marginal et demeure généralement à la phase de pilote (Wu et
al., 2014)

[Link] S YSTÈMES À AÉRATION OPTIMISÉE

Les systèmes aérés représentent un nouveau genre du traitement des eaux par filière
végétalisée. Ces systèmes sont généralement basés sur un filtre planté à écoulement
hydraulique vertical, dont le fond est partiellement saturé en eau par un siphon. Des drains
d’aération sont disposés dans le filtre et fonctionnent de manière intermittente et pilotée pour
générer une alternance de phase aérobique et anaérobique dans la zone saturée. La gestion de
l’oxygénation du filtre permet notamment d’affiner le traitement de l’azote en contrôlant l’un
des facteurs principaux de la nitrification et de la dénitrification Parmi les avantages l’azote
total peut alors être traité, et l’emprise au sol diminuée (Folidari et al., 2013)

[Link] C OMPARATIF DES PERFORMANCES DES DIFFERENTS SYSTEMES

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TABLEAU 1.3-1 COMPARAISON DU DIMENSIONNEMENT ET DES PERFORMANCES D’ABATTEMENT DES POLLUANTS POUR LES SYSTEMES VEGETALISES CLASSIQUES, HYBRIDES OU
OPTIMISES

Dimensionnement Performances (%) Références

Type
m²/EH DCO DBO5 MES NTK NH4+ TN (n = nombre stations)

VFnsat + VFnsat 2 à 2,5 m²/EH 91 ± 3 - 95 ± 2 85 ± 5 Molle et al., 2005 (n = 80)

92 (min = 82 ; 98 (min = 97 ; 96 (min = 90 ; 91 (min = 66; max Paing and Voisin, 2005 (n
VFnsat + VFnsat 2 à 2,3 m²/EH
max = 98) max = 99,7) max = 99,6) = 98) = 20)

Maciejewski et al., 2022

VFnsat + VFnsat 2 à 2,5 m²/EH 91 ± 4 97± 3 95 ± 7 94 ± 2 21 ± 12
(n= 7)

Vymazal, 2005
HFsat 5 m²/EH 75 85 83 - 48 35
( < 79)

min = 51 min = 55 min = 32 min = 14 min = 29 Vymazal, 2013

VFnsat + HFsat - -
max = 94 max = 96 max = 99 max = 91 max = 78 (n = 19)

min = 77 min = 78 min = 81 min = 64 min = 33 Vymazal, 2013

HFsat + VFnsat - -
max = 95 max = 95 max = 98 max = 85 max = 80 (n = 7)

Système Tidal 80 82 78 - 58 - Sun et al., 2006 (n=1)

VF (recirculation Foladori et al., 2013 (n =

1,5 m²/EH 91* - 97* 82* 78* 75*
+ aération) 1)

VF aération +
- 96 - - - 97 - Fan et al., 2013 (n=1)
HFsat

nsat = étage non saturé ; sat = étage saturé ; *calculé via les données de la source

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1.4 LE PROCEDE AZOE ET LES TECHNOLOGIES ASSOCIEES
Le procédé AZOE, développé par l’entreprise SCIRPE, est un système de type filtres plantés
de roseaux à écoulement vertical associé à un lit bactérien placé en tête de filière (figure 1.3-
1). L’association de ces deux technologies a été imaginée dans un premier temps afin d’adapter
la capacité de traitement des eaux usées en milieu rural aux variations de charges saisonnières
due à l’activité viticole. Le lit bactérien devait ainsi servir de variable d’ajustement en
intensifiant son utilisation lors des périodes de fortes charges. Ainsi, la première station AZOE
a ainsi été mise en fonctionnement en 2004 dans la commune de Vercia, Jura. Depuis, cette
solution a été généralisée et fait l’objet des brevets français et européens suivants :
EP1857419A1, WO201215026A2

FIGURE 1.4-1 : PHOTOGRAPHIE AERIENNE D’UNE STATION AZOE DANS LA COMMUNE DE CIEL (CREDITS PHOTO : B.
CEDAT)

En réalité, le lit bactérien ne sert plus seulement à s’adapter aux variations de charge
saisonnière mais est devenu un élément de traitement permanent. En procédant ainsi, le
dimensionnement des deux étages de filtres plantés de roseaux qui l’accompagnent a été
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réduit de 2 à 1,3 m²/EH rendant la filière plus compacte. La réduction de l’emprise au sol
permet ainsi à l’entreprise SCIRPE de se positionner sur la réalisation de stations de plus grande
capacité, jusqu’à 2500 EH. En outre, la présence du lit bactérien bénéficie aux performances
épuratoires du système en favorisant le traitement de l’azote total par la mise en place de zones
saturées dans les deux étages de filtres plantés de roseaux, et par en garantissant des
conditions adéquates à la rétention du phosphore après traitement physico-chimique.

1.4.1 UTILISATION EN FRANCE

Le nombre de réalisation du procédé AZOE est de 70 en France métropolitaine. Il n’existe à ce

jour aucune réalisation hors du territoire national.

FIGURE 1.4-2 : NOMBRE DE STATION REPARTIE PAR TRANCHE D’EH (A) ET EVOLUTION DU NOMBRE DE STATION
AZOE AU COURS DU TEMPS (B). DONNEES SCIRPE.

Le procédé AZOE a connu un réel développement au début des années 2010 avec une
augmentation importante du nombre annuel de réalisations. On note notamment l’apparition
d’une variante à un seule étage de filtration du procédé AZOE dès 2015 et qui semble devenir
une solution viable pour l’entreprise. Bien qu’exceptionnellement utilisé pour des stations
inférieures à 200 EH, ce procédé couvre une large gamme de capacité comme le montre la
figure 1.3-2.

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FIGURE 1.4-3 : CARTE DE LA REPARTITION GEOGRAPHIQUE DU PROCEDE AZOE DIFFERENCIE PAR TYPE EN FRANCE
METROPOLITAINE.

La majeure partie des stations du procédé sont réparties dans l’Est de la France. La
couleur des points de la figure 1.4.3 indique si les stations sont dimensionnées afin de réaliser
la nitrification (blanc), la nitrification et la dénitrification (bleu), la nitrification et le phosphore
(jaune), ou tous les traitements (vert). Cette carte met en avant la malléabilité du procédé afin
de s’adapter à des exigences de rejets plus ou moins strictes.

1.4.2 FONCTIONNEMENT DU PROCÉDÉ

Le procédé AZOE sous-entend l’utilisation d’un lit bactérien en début de chaine de

traitement et son association à la technologie filtres plantés de roseaux à écoulement vertical
(figure 1.4-4). Historiquement, le nombre d’étage de filtration était de deux. Bien que cette
configuration reste majoritaire, l’abandon du second étage de filtration semble se dessiner
comme une stratégie de minimisation de l’emprise au sol et des coûts de construction. Le
procédé AZOE peut se décliner en 4 variantes afin de s’adapter aux objectifs de traitement.
Toutes ces variantes peuvent fonctionner avec un unique étage de filtration ou deux étages.

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TABLEAU 1.4-1 REFERENCEMENT DES DIFFERENTES VARIANTES DU SYSTEME AZOE, LEUR OBJECTIF DE
TRAITEMENT, AINSI QUE LEUR OCCURRENCE.

Lit Saturation Traitement

Variante Objectif Occurrence
Bactérien Filtres Phosphore

AZOE Nitrification OUI NON NON 20

Nitrification
AZOE-N OUI OUI NON 8
Dénitrification

Nitrification
AZOE-P OUI NON OUI 7
Déphosphatation

Nitrification
AZOE-NP Dénitrification OUI OUI OUI 35
Déphosphatation

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[Link] T ECHNOLOGIE DU LIT BACTERIEN

Les lits bactériens figurent parmi les techniques de traitement des eaux usées urbaines
qui ont été largement utilisées en Europe, notamment le Royaume-Uni, la France et
l’Allemagne avant d’être progressivement remplacés par les procédés de boues activées
(Racault, 1996). Ce procédé repose sur la circulation de l’effluent à traiter à travers un ouvrage
contenant un garnissage sur lequel peut se fixer la biomasse responsable de l’épuration.

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L’alimentation en eaux usées se fait par le sommet à l’aide d’un bras rotatif percé. De ce fait la
forme d’un lit bactérien est habituellement circulaire, ou encore polygonale pour faciliter le
génie civil.

FIGURE 1.4-5 : SCHEMA D’UN LIT BACTERIEN EN COUPE

La nature du garnissage peut-être tout-à-fait diverse et a beaucoup évolué avec le

temps (Lekang and Kleppe, 1999). D’un garnissage libre dans l’ouvrage (matériaux granulaires
divers) les lits bactériens ont progressivement été équipés de garnissage plastique organisé
dont l’enchevêtrement permet de maximiser la surface développée. Le matériau doit aussi
faciliter le transfert d’oxygène au sein du lit bactérien afin de permettre un traitement aérobie.
Ainsi le lit bactérien est un ouvrage de traitement à trois phases : la phase liquide (effluent à
traiter) qui ruissèle à travers le garnissage, la phase solide sur laquelle se fixe la biomasse
épuratrice, et la phase gazeuse dont la circulation permet la bonne oxygénation de la biomasse.
Ainsi le matériau de garnissage doit avoir une grande surface spécifique pour optimiser le
contact entre les eaux à traiter et la biomasse, mais aussi une grande macroporosité afin
d’éviter le colmatage et de garantir une bonne aération (Daigger and Boltz, 2011).

La biomasse fixée sur le garnissage croît sous forme de biofilm et finit par se détacher
sous la contrainte de cisaillement due au ruissèlement. Dans de bonnes conditions de
fonctionnement, la croissance du biofilm est assez rapide pour garantir la présence de
biomasse malgré le détachement. La biomasse détachée est évacuée et participe ainsi au flux
particulaire qui sera reçu par le premier étage de filtre et retenue à sa surface.

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Les lits bactériens sont utilisés afin d’abattre la charge carbonée, et dans de plus rares
cas de réaliser la nitrification. D’une manière générale, l’épuration de la charge carbonée,
représentée par la DBO5, d’un lit bactérien peut-être approchée via l’équation de Veltz, tandis
que la nitrification peut être approchée par l’équation de Gujer et Boller (Henrich and
Marggraff, 2013) :

TABLEAU 1.4-2 EQUATIONS USUELLES DE L’ABATTEMENT DU CARBONE ET DE L’AMMONIUM SUR UN LIT

BACTERIEN (HENRICH AND MARGGRAFF, 2013).

Abattement du Carbone Abattement de l’ammonium

𝐶𝑖𝑛 𝑘 ∗ 𝐴𝑠 ∗ 𝐷 ∗ 𝜃 (𝑇−20)
ln =
𝐶𝑜𝑢𝑡 𝑄𝑠 𝑛

Cin et Cout - les concentrations d’entrée et

de sortie (mgDBO5/l)
As - surface spécifique du garnissage
(m2/m3) JN,MAX – Taux de nitrification maximum
D - profondeur de garnissage (m) (gN/m²/jour)
SN,i et SN,e – Concentration entrante et sortant
Qs - charge hydraulique (m3/m2/h)
en ammonium
Θ - coefficient de correction de
température
n - coefficient hydraulique
k - le coefficient cinétique

[Link] I MMERSION PARTIELLE DES FILTRES

La dénitrification est indispensable pour parvenir à l’élimination complète de l’azote.

Dans ce cas, des zones saturées dans le fond des filtres peuvent être mises en place pour
promouvoir l’anaérobiose (Silviera et al. 2015, Kim et al., 2015). La figure 1.4.6, met en évidence
l’implication de la zone non saturée et de la couche de boues de surface dans le processus de
nitrification et de la zone saturée dans le processus de dénitrification.

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FIGURE 1.4-6 : ELIMINATION DE L’AZOTE PAR FILTRES PLANTES DE ROSEAUX A ECOULEMENT VERTICAL ET
IMMERSION PARTIELLE (KIM, 2014)

[Link] T RAITEMENT DU PHOSPHORE SUR AZOE

Sur le système AZOE, le phosphore est traité par précipitation par voie physico-chimique.
Le coagulant utilisé est le chlorure ferrique qui est ajouté en aval du traitement sur le lit
bactérien. Après passage sur lit bactérien, l’effluent contenant le phosphore particulaire est
envoyé sur le premier étage. Les boues de surface contribuent donc à la rétention du
phosphore. Le phosphore particulaire des boues s’avère stable dans les conditions normales de
fonctionnement du système, et le relargage n’est observé qu’en cas d’épisode anoxique intense
(Kim, 2014 ; Kim et al., 2015)

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2.1 CAMPAGNES D’ECHANTILLONNAGE POUR LE SUIVI DE TERRAIN
Une campagne de terrain a été menée en février 2019 pour suivre le fonctionnement de
deux stations classiques à écoulement vertical (stations de Saint-Boil et Sainte-Hélène) et deux
stations de type AZOE-NP (stations de Saint-Désert et Cormatin). Le but de ces suivis était de
caractériser les performances de traitement et notamment la contribution respective des
différentes étapes du procédé.

Les caractéristiques générales des sites sélectionnés sont présentées dans le tableau 2.1-1.
La campagne s’est déroulée sur une période d’une semaine afin de procéder à des
échantillonnages 24h des eaux brutes en entrée des stations, et des eaux traitées en sortie du
premier étage et en sortie du second étage. Un échantillon dit « 24h » est représentatif de la
composition moyenne de l’eau au point de prélèvement sur une journée entière de
fonctionnement. Il est composé d’un mélange de 24 prélèvements horaires dont le volume est
proportionnel au débit volumique horaire en entrée de station au moment du prélèvement.
Les échantillons, conservés à 4°C, ont été analysés dans les 24h après prélèvement pour les
paramètres suivants : DCO, TOC, matières en suspension, ammonium, nitrates, azote total et
phosphore total.

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TABLEAU 2.1-1 CARACTERISTIQUES DES STATIONS DE TRAITEMENT DES EAUX USEES DOMESTIQUES DE LA
CAMPAGNE DE PRELEVEMENT DE FEVRIER 2019

Station Localisation Type de système EH Configuration

Classique 2 étages non

Saint-Boil Saône-et-Loire 500
Flux hydraulique vertical saturés

Classique 2 étages non

Sainte-Hélène Saône-et-Loire 400
Flux hydraulique vertical saturés

2 étages
AZOE-NP
Cormatin Saône-et-Loire 1000 partiellement
Flux hydraulique vertical
saturés

2 étages
AZOE-NP
Saint-Désert Saône-et-Loire 1300 partiellement
Flux hydraulique vertical
saturés

Outre ces prélèvements d’eaux usées effectués à différentes étapes de traitement, d’autres
échantillons ont été prélevés par la « Soil Science Faculty » et l’« Institute of Water Problems »
de Moscou pour réaliser des analyses microbiologiques dans le cadre d’un programme de
collaboration scientifique avec ces partenaires. Les prélèvements réalisés ont porté sur le
biofilm du lit bactérien, sur la couche de boues de surface du premier étage et à différents
horizons des deux étages de filtration. Les communautés microbiennes ont été identifiées et
leur diversité analysée par biologie moléculaire afin de comparer ces paramètres aux
différentes étapes du traitement.

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2.2 TRAVAUX A L’ECHELLE PILOTE
2.2.1 HALL EXPERIMENTAL DE LA FEYSSINE

Une grande partie du travail expérimental de la thèse a été réalisée à l’échelle pilote.
Les pilotes utilisés sont localisés au sein du hall expérimental de la Feyssine, à Villeurbanne. Ce
hall appartient à la société AquaLyon (SUEZ) qui en a confié la gestion à l’Institut National de la
Recherche Agricole et de l’Environnement (INRAe) de Lyon. Ce site de recherche est alimenté
en continu par la station d’épuration de type boues activées d’AquaLyon qui traite les effluents
urbains du nord Lyonnais avec une capacité nominale de 300 000 EH. Différents types d’eaux
usées ou partiellement traitées sont distribués en continu au hall expérimental. Les projets de
recherche du hall expérimental bénéficient donc d’effluents réels en alimentation permanente
(figure 2.2-1). Dans le cadre de cette thèse, l’effluent utilisé pour alimenter l’installation pilote
a été de type eaux usées dégrillées.

FIGURE 2.2-1 : IMAGE AERIENNE DU SITE DE LA STATION DE LA FEYSSINE ET DU HALL DE RECHERCHE.

L’installation pilote est placée dans la serre du hall expérimental afin d’apporter l’éclairage
naturel nécessaire aux roseaux (Figure 2.2-2). La serre est équipée d’un système de ventilation
automatisé qui s’active lorsque la température dépasse les 25°C. Le hall expérimental est
équipé d’un laboratoire d’analyses de routine qui permet d’effectuer sur place la plupart des
mesures nécessaires au suivi du pilote sans avoir à transporter ou conserver les échantillons.

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Les appareils suivants ont été utilisés pour la préparation et l’analyses des échantillons de suivi
du pilote :

o Un spectrophotomètre pour l’analyse de microkit;

o Une microbalance, une étuve et le matériel de filtration de type Buchner pour la
détermination du taux de matières en suspension ;
o Micropipettes pour pipetages de précision ;
o Sonde pH et redox.

FIGURE 2.2-2 : PHOTOGRAPHIES DE LA SERRE, DES PILOTES ET DU LABORATOIRE D’ANALYSE DU HALL

EXPERIMENTAL DE LA FEYSSINE

2.2.2 CARACTERISTIQUES DU PILOTE

L’installation pilote est conçue comme un modèle réduit d’une station AZOE-N, tel que
représentée à la figure 2.2-3. Elle est composée, dans le sens du traitement, d’un lit bactérien
et de deux étages successifs de filtres plantés de roseaux partiellement saturés en eau.
L’installation a une capacité de traitement de 6 équivalents habitant. Ses caractéristiques
techniques et de dimensionnement sont regroupées dans le tableau 2.2-1.

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FIGURE 2.2-3 : SCHEMA DU PILOTE DE LA FEYSSINE DE TYPE AZOE-N

L’alimentation de l’installation se fait via le lit bactérien à l’aide d’une pompe péristaltique.
Les eaux brutes alimentent le réservoir du lit bactérien à un débit constant de 30 litres par
heure, soit 720 litres par jour d’eaux brutes dégrillées. Ce réservoir, d’une hauteur de 25 cm,
est équipé d’une sonde de pression permettant de mesurer la hauteur d’eau pour déclencher
l’alimentation du lit bactérien. Un automate permet de réguler le débit de la pompe de
circulation des eaux usées du lit bactérien, d’asservir son déclenchement à la hauteur d’eau
dans le réservoir, et de gérer une électrovanne qui oriente le flux soit vers le lit bactérien (phase
de traitement sur LB), soit vers le premier étage de filtration. La routine de l’automate est
paramétrée comme suit :

o De 0 à 12 cm la pompe de recirculation est à l’arrêt et le réservoir se remplit à un débit

constant de 30 litres par heure (0,03 m3/h) ;
o De 12 à 20 cm la pompe de recirculation est en marche pour alimenter le lit bactérien
à un débit volumique de 0,45 m3/h. L’alimentation du lit bactérien se fait en distribuant
l’effluent de manière uniforme à la surface du garnissage grâce à un système de rampe
percée.
o A 20 cm, correspondant à 60 L d’eau dans le réservoir, l’électrovanne oriente le volume
d’eaux traitées par le lit bactérien vers le premier étage et vide en 4 minutes les 60 L du
réservoir à un débit de pompe de 0,9 m3/h.

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En procédant ainsi, le taux de recirculation des eaux usées sur le garnissage du lit bactérien est
de 200%. Le lit bactérien est alimenté continuellement 24h/24 et 7j / 7, sauf périodes d’arrêt
pour maintenance.

L’alimentation sur un filtre planté de roseaux à écoulement vertical se fait par bâchées,
correspondant à un volume donné de solution déversé en un court instant à la surface du filtre.
Pour ce faire, un ouvrage de bâchée, placé en amont des filtres, se remplit jusqu’au volume
souhaité et libère ensuite la bâchée rapidement soit de manière gravitaire soit par un système
de pompage. Dans le cas présent, le réservoir du lit bactérien fait office d’ouvrage de bâchée
du premier étage. Le volume des bâchées est donc de 60 L. L’alimentation par bâchées permet
de répartir le volume sur toute la surface du filtre avant que l’eau ne s’infiltre, favorisant ainsi
l’écoulement uniforme au travers de l’ensemble du volume du filtre. La période entre chaque
bâchée, permette à l’eau de traverser le massif filtrant et à la zone superficielle du lit d’être
aérée au contact de l’atmosphère. Cette période, de l’ordre de 2h, correspond au temps
nécessaire pour remplir le volume de bâchée (60L du réservoir du lit bactérien)

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TABLEAU 2.2-1 CARACTERISTIQUES TECHNIQUES ET DE DIMENSIONNEMENT DU PILOTE DE LA FEYSSINE DE TYPE
AZOE-N.

Elément Paramètres Valeurs

Capacité de traitement 6 Equivalents Habitant

Filière totale
Volume de traitement journalier 720 Litres

Volume du réservoir 60 Litres

Section du lit 0,15 m²

Lit bactérien Hauteur du lit de garnissage 180 cm

Type de garnissage Structure plastique alvéolé

Surface spécifique du garnissage 200 m²/m3

Débit d’apport de la bâchée 0,9 m3/h

Débit volumique d’alimentation Une bâchée de 60L toutes les

2h, soit 0,72 m3/j
Hauteur d’eau surfacique journalière
0,36 m/m²/jour

Surface de filtration 2 m²

Hauteur de garnissage 0,75 m

Premier étage
Boues de surfaces 0,05 m

2/4 RL – Couche de filtration 0,35 m

4/10 RL – Couche intermédiaire 0,20 m

10/20 RL – Couche de drainage 0,10 m

Hauteur de la zone saturée en eau 0,35 m soit 280 L

Temps de rétention hydraulique théorique 9,2 heures

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Hauteur d’eau surfacique journalière 0,36 m/m²/jour

Surface de filtration 2 m²

Hauteur de garnissage 0,70 m

Second
1/4 RL – Couche de filtration 0,45 m
étage
2/4 RL – Couche intermédiaire 0,15 m

10/20 RL – Couche de drainage 0,10 m

Hauteur de la zone saturée en eau 0,40 m soit 320 L

Temps de rétention hydraulique théorique 10,5 heures

Contrairement à une station de filtres plantés classique ou Azoe en vraie grandeur, le

filtre du pilote n’est pas divisé en cellules hydrauliques distinctes permettant d’alterner phase
d’alimentation et de repos, mais d’une unique cellule. Pour maintenir l’alternance alimentation
/ repos propre au fonctionnement des filtres plantés de roseaux à écoulement vertical, chaque
filtre du pilote est alimenté suivant une séquence hebdomadaire de 56 heures d’alimentation
suivies de 112 heures de repos, correspondant au rapport 1/3 d’alimentation : 2/3 repos.

2.2.2 SUIVI DE L’INSTALLATION

L’organisation type d’une semaine de fonctionnement du pilote est indiquée à la Fig.

2.2-4. Dans la mesure du possible, chaque semaine d’essai est divisée de telle manière que la
période d’alimentation débute le mardi matin à 9h et se termine le jeudi à 17h. Cette
organisation permet d’utiliser les fins de semaine pour les phases de repos.

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FIGURE 2.2-4 : PHASES D’ALIMENTATION ET DE REPOS DU LIT BACTERIEN ET DES DEUX ETAGES DE FILTRATION DE
L’INSTALLATION PILOTE POUR UNE SEMAINE TYPE

Les points de prélèvements possibles sur le pilote dans le sens du traitement sont :

o A - Eaux brutes dégrillées

o B - Eaux traitées par le lit bactérien
o C - Eaux de la zone saturée du premier étage
o D - Eaux traitées par le premier étage
o E - Eaux de la zone saturée du second étage
o F - Eaux traitées de sortie de station

L’échantillonnage a été réalisé mélangeant 3 échantillons ponctuels issus de bâchées

successives dans des contenants en PEHD de 500 mL. Les méthodes de prélèvement de chaque
point sont présentées dans le tableau 2.2-2.

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TABLEAU 2.2-2 METHODES DE PRELEVEMENT POUR CHAQUE POINT DU PILOTE

Méthode Points Occurrence

Mélange de plusieurs A, B – toujours 1 échantillon par jour

prélèvements ponctuels D, F – lorsque le préleveur composé de 3
journaliers 24h est défaillant prélèvements ponctuels

Prélèvement ponctuel par 1 échantillon par semaine

pompe péristaltique à faible C et E ou besoin spécifique à une
débit campagne

Dès le prélèvement réalisé, les échantillons sont entreposés à 4°C et analysés dans les 24h. Ils
sont congelés s’ils doivent être analysés au-delà de ce délai.

2.2 METHODES ANALYTIQUES

2.2.1 PROTOCOLE DE MESURE DES PARAMETRES SUIVIS

Le tableau 2.3-1 présente et détaille toutes les analyses lors des campagnes de prélèvement et
du suivi pilote au laboratoire de la Feyssine et au laboratoire de DEEP.

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TABLEAU 2.2-1 PROTOCOLE, APPAREILLAGE ET REFERENCES DES ANALYSES

Analyses Description Appareillage Références

Demande Chimique L’échantillon est oxydé en milieu acide par une solution de dichromate de potassium. Spectrophotomètre NF-T 90-101, 1988
en Oxygène (DCO) La DCO est calculée par dosage colorimétrique du dichromate de potassium réduit. HACH modèle 2010 ISO 15705

Carbone Organique Carbone Total (CT) : Mesure du CO2 par oxydation du carbone total et combustion dans Analyseur de carbone AFNOR NF EN
Total (COT) un four à 680 °C. Calcul du carbone organique (COT = TC – TIC). Shimadzu Modèle 1484,(1997)
TOC-L

Matières En Filtration de l’échantillon brute et homogénéisé sur un filtre borosilicaté via un système Etuve séchage UM400 AFNOR, 2005
Suspension (MES) de type Buchner. Séchage à l’étuve à 105°C jusqu’à 14h. Memmert

Ammonium (NH4+) Les ions ammoniums réagissent avec les ions hypochloreux et salicyliques et donnent Spectrophotomètre AFNOR, 2005
une coloration bleue indophénol HACH modèle 2010

Azote Kjeldahl (NTK) Transformation de l’azote organique en azote ammoniacal en 3 étapes : minéralisation, Minéralisateur AFNOR NF EN
distillation à la vapeur et titration. Digestor 2020 Foss, 25663, 1994
analyseur Kjeltec 2200 ISO 5663
Dosage par spectrophotométrie.
Foss

Les ions de nitrate et nitrite sont séparées par chromatographie ionique en phase HPLC(Chromatographi ISO 10304- 1 & 2
Nitrates (NO3-) liquide par l’application d’une résine échangeuse d’ions comme phase stationnaire. La e Liquide Ionique (1996)
détection s’effectue par un détecteur de conductivité et la conductivité détectée est Haute Performance)
Nitrites (NO2-) AFNOR NF T 90-
reliée au temps. ICS5000+, Thermo 042
Scientific

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Le pilote est équipé de sondes en acquisition continue :

o Sonde Ammonium et Nitrates de type VARION 700 IQ de la marque WTW en sortie du

premier et du second étage de filtration. L’acquisition se fait à un pas de temps de 1
minute via un enregistreur.
o Sonde ORP dans les zones saturées du premier et du second étage via des fourreaux
plantés horizontalement dans le massif filtrant. L’acquisition se fait à un pas de temps
de 1 minute via un enregistreur.

Contrôle des sondes Ammonium et Nitrates :

Les sondes continues nécessitent un entretien régulier pour éviter les dérives
instrumentales. Il a été observé que ces sondes sont d’autant plus fiables que l’effluent est dilué
et prétraité. Afin de suivre le bon fonctionnement des sondes, les mesures acquises par les
sondes ont été systématiquement comparées à celles faites par les méthodes classiques
lorsque disponibles.

Correction des sondes ORP :

Les sondes redox sont vérifiées régulièrement pour corriger une éventuelle dérive. Les
valeurs sont exprimées par rapport à l’électrode standard à hydrogène, par ajout de + 214 mV
aux données délivrées par les sondes qui utilisent une électrode de référence au chlorure
d’argent.

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Un suivi isotopique de l’azote a été réalisé en collaboration avec le laboratoire

isotopique de l’Institut des Sciences Analytiques de Lyon (ISA). Les essais réalisés ont consisté
à introduire sous forme d’ammonium de l’azote 15N dans une bâchée d’alimentation et à suivre
ensuite le rapport isotopique 15N / 14N à tous les points de prélèvement et durant toute la
période d’alimentation du pilote.

La bâchée « Zéro » enrichie en 15N est constituée en dissolvant de l’ammonium marqué

15N à 99% (Sigma – Aldrich, pureté à 99%) dans 60 litres d’eaux brutes dégrillées fraiches pour
atteindre un enrichissemnet 15N / 14N de 4.6%, alors que le taux naturel est de 0.36 % dans les
eaux usées de la Feyssine. Le suivi isotopique du ratio δ 15N / 14N est réalisé sur les points de
prélèvement en aval pendant la phase d’alimentation, soit 56h. Durant cette période toutes les
bâchées ont été prélevées en sortie du lit bactérien, en sortie du premier étage et du second
étage, y compris pendant les deux périodes nocturnes d’alimentation. Les échantillons ont été
congelés dans les 24h après prélèvement. Les mesures isotopiques ont ensuite été effectuées
par le laboratoire isotopique de l’Institut des Sciences Analytiques de Lyon (ISA), à la fois de
manière globale et de manière ciblée sur l’ammonium et les nitrates.

En parallèle du suivi isotopique, la routine d’analyse du pilote a été poursuivie (cf : protocole
des paramètres suivis).

2.3.2 PROTOCOLE DE PREPARATION DES ECHANTILLONS EN VUE DES ANALYSES

ISOTOPIQUES

La mesure du rapport 15N étant réalisée par un AE-IRMS, les échantillons doivent satisfaire deux
conditions pour être analysés :

o La forme azotée (ammonium ou nitrate) doit être isolée au préalable, ce qui implique
une séparation anions/cations sur l’échantillon dissous ;
o L’échantillon doit être sous forme de résidu solide.

En conséquence, un protocole spécifique a été élaboré et suivi.

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Après décongélation, les échantillons sont filtrés à 0,45 µm grâce à des filtres seringue
SATORIUS puis traités sur micro-colonnes échangeuses d’ions non spécifiques aux ammoniums,
ni aux nitrates. Le principe est le suivant :

o Piégeage des cations (dont les ions ammonium) sur une cartouche DIONEX Onguard II
Na+ de 1 ml. On collecte en sortie de colonne une solution dépourvue d’ions ammonium
dans laquelle l’azote dissous est sous la forme nitrates.
o Piégeage des anions (dont les ions nitrate) sur une cartouche DIONEX Onguard II A de 1
mL. On collecte en sortie de colonne une solution dépourvue d’ions nitrate et dans
laquelle l’azote dissous est sous la forme ammonium.

Afin de s’assurer du piégeage total des ions ciblés, des tests préliminaires ont été réalisés
(Figure 2.4-1)

Ammonium Nitrates
40
Concentration en mgN/l

35
30
25
20
15
10
5
0
Solution mère Onguard II NA Onguard II A

FIGURE 2.3-1 : CONCENTRATIONS EN AMMONIUMS ET NITRATES DANS LA SOLUTION MERE ET APRES PASSAGE
SUR LES RESINES ECHANGEUSES D’IONS. LES BARRES D’ERREUR REPRESENTENT LES ECARTS-TYPES DES REPLICATS
REALISES.

Les cartouches ont été lavées à l’eau distillée, et préparées avec l’échantillon à traiter
(conditionnement). Le volume d’échantillon passée sur une cartouche est compris entre 40 et
50 ml. Un pousse seringue a été utilisée pour garantir un flux lent et constant. La figure 2.4-2
montre le montage utilisé pour réaliser les séparations.

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FIGURE 2.3-2 : PHOTOGRAPHIE DU MONTAGE UTILISEE POUR REALISER LES SEPARATIONS, ICI SUR RESINE
ONGUARD II NA. LES ECHANTILLONS TRAITES SONT RECUEILLIS DANS LES ERLENMEYERS A DROITE.

Collecte du résidu des échantillons :

Une fois la séparation réalisée, chaque solution est congelée dans des flacons coniques
de 50 ml puis lyophilisée. Il a été vérifié que la lyophilisation n’a pas induit de perte
d’ammonium ni de nitrates. Les résidus solides ainsi obtenus ont alors été transférés au
laboratoire isotopique de l’ISA pour mesure du 15N par AE-IRMS.

2.3.3 PRINCIPE DE L’AE - IRMS

L’analyseur élémentaire couplé à un spectromètre de masse à rapport isotopique (AE-

IRMS) permet de mesurer des rapports entre différents isotopes, plus précisément le rapport
14N/15N dans le cas présent.

L’échantillon sous forme solide, broyée finement et disposé dans une fine capsule en
étain est converti en gaz élémentaire par combustion suivie d’une réduction à haute
température. Après purification et déshydratation, les éléments gazeux sont séparés et leurs
concentrations mesurées. Ils sont ensuite introduits dans l’IRMS via un gaz vecteur (Hélium).
Après ionisation, les ions sont séparés selon leur masse via un champ magnétique et leur
abondance est mesurée par des cages de Faraday.

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2.4 SUIVI MICROBIOLOGIQUE A L’ECHELLE PILOTE
2.4.1 PROTOCOLE GLOBAL

Le suivi des essais pilotes a été complété par des analyses microbiologiques menées en
collaboration avec l’unité de recherche en écologie microbienne de l’université de Lyon 1.

Objectif : Déterminer le potentiel de nitrification et de dénitrification de la biomasse

microbienne présente à différents horizons du massif filtrant des deux étages du pilote

Des préleveurs ont été spécifiquement conçus pour échantillonner toute la hauteur du
massif filtrant de chacun des deux étages du pilote sans avoir à déstructurer le milieu filtrant.
Un préleveur se présente sous la forme d’une carotte de 4 cm de diamètre introduite dans un
fourreau d’un diamètre très légèrement supérieur. Celui-ci est placé à demeure dans le média
filtrant lors du remplissage des filtres, de manière inclinée pour éviter qu’il n’entraine un
écoulement préférentiel vertical au sein du filtre (Figure 2.5-1). La carotte interne peut-être
introduite et retirée de son fourreau sans pour autant déstructurer le massif filtrant.

FIGURE 2.4-1 : SCHEMA DU MONTAGE DE LA CAROTTE ET DE SON FOURREAU EN PLACE DANS LE MASSIF
FILTRANT (ICI SUR LE PREMIER ETAGE DU PILOTE)

Une fois retirée du fourreau, la carotte interne peut s’ouvrir en deux dans le sens de la
longueur, et ainsi être remplie du même garnissage que celui du pilote (graviers ou sables).
Placée dans le fourreau à l’intérieur du pilote pendant plusieurs semaines d’exploitation du
pilote, les matériaux qui la composent servent alors de support à la biomasse épuratrice. Le

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fourreau et le carotteur interne sont percées pour permettre aux eaux usées de s’écouler au
travers de manière verticale. Les carottes internes ont été relevées à deux reprises pour
analyses microbiologiques :

o Après les essais en fonctionnement normal du pilote (le 28 avril 2021) ;

o Après les essais sur l’ajout carboné par step-feeding sur le second étage (le 10 Octobre
2021).

La carotte interne est ouverte et divisée en horizons de 5 cm (Figure 2.5-2). Les matériaux
de chaque horizon sont pesés et collectés dans des flacons type Plasma pour l’analyse du
potentiel de nitrification et de dénitrification.

FIGURE 2.4-2 : A GAUCHE, PHOTOGRAPHIE DE LA CAROTTE INTERNE APRES OUVERTURE LE 28 AVRIL 2021. A
DROITE, PHOTOGRAPHIE DES FLACONS PLASMA APRES DIVISION DE LA CAROTTE EN HORIZONS.

Les mesures de nitrification et dénitrification ont été réalisées par l’unité de recherche en
écologie microbienne.

2.4.2 PRINCIPE DE LA MESURE D’ACTIVITE ENZYMATIQUE DE NITRIFICATION

Une masse de sédiment est incubée dans une solution de (NH4)2SO4 et d’eau distillée
dans un flacon plasma. Les flacons sont placés dans un four à 28°C équipé d’un système de
mélange rotatif. Un millilitre est prélevé à 2, 4, 6, 8 et 10h d’incubation, filtré à 0,2 µm et les
concentrations en NO2- et NO3- sont mesurées par colorimétrie (smartchem 200, KPM

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analytics 92390 Villeneuve-la-Garenne France). Le potentiel s’exprime en µgN-NO2- + NO3-
/heure/gramme de sol sec (Cantarel et al., 2020).

2.4.3 PRINCIPE DE LA MESURE D’ACTIVITE ENZYMATIQUE DE LA DENITRIFICATION

Une masse d’échantillon est placé dans un flacon plasma fermé hermétiquement.
L’atmosphère est remplacée par 90% d’hélium et 10% d’acétylène pour obtenir des conditions
anaérobiques et inhibitrice de l’enzyme impliquée dans la réduction du N2O en N2. Une solution
contenant du KNO3, du glucose et de l’acide glutamique dilués dans l’eau distillée est introduite
dans le flacon à l’aide d’une seringue en quantité suffisante pour ne pas être limitante à la
dénitrification. Les flacons sont incubés à 28°C pendant 8h. Après deux heures, le N2O est
mesurée toutes les heures par chromatographie gazeuse (µGC R3000, SRA Instrument, Marcy
L’Etoile, France) afin de suivre son accumulation dans le flacon. Le potentiel de dénitrification
est exprimé en µgN-N2O/gramme de sédiment sec/heure (Cantarel et al., 2020).

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La première section 3.1 de ce chapitre résultats et discussions présente les travaux

ayant pour but d’enrichir les connaissances des processus d’épuration impliquées dans le
traitement des eaux usées sur le système AZOE. L’utilisation de données récoltées à échelle
réelle par l’intermédiaire de campagnes de terrain ou de bilans internes à l’entreprise SCIRPE
réalisés par des organismes indépendants, a donné lieu à la publication d’un article à comité de
lecture :

“Effect of trickling filter on carbon and nitrogen removal in vertical flow treatment wetlands: A
full-scale investigation”

Cet article donne donc un aperçu global du fonctionnement et des performances de 29

stations d’épuration à filtres plantés de roseaux sur une période de 13 ans. L’article couvre
plusieurs systèmes de traitement : classique à deux étages ; AZOE-N à deux étages et AZOE-N
à un unique étage. Parmi les jeux de données, certains possèdent un point de prélèvement
intermédiaire entre le premier et le second étage de manière à séparer les performances entre
les différents éléments qui composent le système. L’axe choisi à travers cet article est de
souligner les modifications des processus de traitement du carbone et de l’azote, particulaire
ou dissous par l’ajout du lit bactérien en tête de filière.

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3.1 EXPLOITATION DE DONNEES DE TERRAIN DE STATION FILTRES
PLANTES DE ROSEAUX CLASSIQUES ET AZOE®

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EFFECT OF TRICKLING FILTER ON CARBON AND NITROGEN REMOVAL IN VERTICAL FLOW TREATMENT
WETLANDS: A FULL-SCALE INVESTIGATION

K. Maciejewskia,b, M. Gautiera, B. Kima, P. Michelb, R. Gourdona

aUniv Lyon, INSA Lyon, DEEP, EA7429, 69621 Villeurbanne, France
bSCIRPE, Society of Design and Production Engineering for Wastewater Purification, 5
Allée Alban Vistel, 69110 Sainte Foy Lès Lyon, France

Abstract:
Vertical Flow Treatment Wetland (VF-TW) systems achieve high efficiencies in terms of carbon
related parameters removals from domestic wastewaters. Nitrogen removal is also efficient but
optimisations are still needed. This article reports and discusses experimental data collected
from 24-hour monitoring campaigns of 29 full-scale VF-TWs, having different configurations
and operation time up to 13 years. All monitored systems gathered 1 or 2 stage(s) of
unsaturated or partially saturated VF-TW. Additionally, some of those included an aerobic
biological Tricking Filter (TF) prior to TW stage(s). Results firstly showed that the
implementation of a TF improved TSS, COD and BOD5 removal rates in the monitored systems.
Regarding nitrogen removal, the association of TF with one stage of partially saturated vertical
TW was found to achieve around 79% of nitrification in average and up to 92% in some cases.
In the configurations where TF was associated to 2 successive stages of TW, almost all total
nitrogen removal by nitrification / denitrification was achieved at the outlet of the first-stage
TW. The contribution of the second-stage TW in denitrification was found very low due to
limited availability of organic carbon to support heterotrophic denitrification. Specific solutions
to enhance the contribution of the second stage in the denitrification process are discussed.

Keywords: VF-TW, Domestic wastewater, Trickling filter, Nitrogen removal

Highlights:
• Field monitoring data from different 29 treatment wetland are discussed
• Implementation of trickling filter improved all treatment efficiencies
• Carbon depletion was identified in 2nd-treatment wetland stage
• Operating conditions should be optimized to enhance denitrification in 2nd-stage

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European Union has enforced strict environmental regulations (European directive

2000/60/CE) based on threshold limits on both carbon and suspended solids discharges from
domestic wastewater treatment plants. Stringent N and P limits are also set for discharges into
sensitive water bodies. Consequently, the implementation of more efficient treatment
processes is necessary to comply with the environmental policy.

In this context, treatment wetlands (TW) have proved particularly well adapted to the
treatment of domestic, agricultural, and occasionally industrial wastewaters, in rural areas
(Vymazal, 2014; Kim et al., 2014). High efficiencies, low energy consumption and maintenance,
along with a very good landscape integration, have made this technology the preferred solution
in France for small communities below 2000 inhabitants (Paing and Voisin, 2005; Morvannou
et al., 2015). One of particularities of the so-called French system is that filters are fed with
unsettled raw wastewaters in a vertical flow mode. Suspended solids retention therefore
induces the formation of a deposit layer at the surface of the first-stage TW filter. This layer has
been shown to contribute very significantly to the global treatment efficiency (Kania et al.,
2019a). Due to its lower permeability than the one of raw filter media, the deposit layer also
favours the good special distribution of the influent on filter surfaces during the feeding periods
(Molle, 2014; Kania et al., 2019b).

Total nitrogen removal from wastewater mainly occurs via two successive microbial
processes (Kadlec and Wallace, 2009) namely aerobic oxidation of N-NH4+ and N-org
(nitrification) followed by anoxic reduction of N-NO3- (denitrification). Nitrogen in domestic
wastewaters is mostly present in forms of ammonia and organic molecules (peptides, proteins,
DNA, etc.). Organic nitrogen is hydrolysed from particulate organic matters (POM) or soluble
polymers into amino-acids which are used in microbial anabolisms or further hydrolysed into
ammonia or nitrates depending on the environmental conditions (Saeed and Sun, 2012).

Under aerobic conditions, ammonia is oxidized into nitrites by ammonia-oxidizing bacteria

(AOB) such as Nitrosomonas sp. and further oxidized into nitrates by nitrite-oxidizing bacteria
(NOB) such as Nitrobacter sp. These bacteria are strictly aerobic autotrophs. They use
carbonates as a source of carbon to synthetize their cellular material and support their growth
(Green et al., 1998).

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Denitrification is conducted under anoxic conditions by heterotrophic bacteria which
use nitrates (NO3-) as a final electron-acceptors and convert them into gaseous N2 via several
intermediates such as nitrites (Wallenstein et al., 2006; Sirivedhin and Gray, 2006). Denitrifiers
require organic carbon as an electron-donor and as a substrate to support their growth (Kadlec
and Wallace, 2009). Biodegradable organic substrates must therefore be available at
sufficiently high concentrations in the medium (Rocher et al., 2015). Other factors of influence
include high Hydraulic Retention Time (HRT), anoxic conditions, near-to-neutral pH (Grießmeier
et al., 2019; Saeed and Sun 2012). Mesophilic temperature in the range of 25°C are usually
considered as optimal for both nitrifying and denitrifying microbial communities (Lee et al.,
2009).

A certain number of technical modifications to the “French system” have been

proposed and used to optimize treatment performance and reduce environmental footprint,
while maintaining the advantages of the process (landscape integration, affordable cost,
reasonable energy consumption). These modifications include for example the combination of
horizontal and vertical flow TW stages (Molle et al., 2008), the use of Zeolite filter media (Millot
et al., 2016), or the recirculation on a single TW stage (Silviera et al., 2015). Forced aeration has
also been implemented using for example an air pump-drain system within the saturated area
for both vertical (Foladori et al., 2013) and horizontal (Nivala et al., 2007) flow TW. Increased
oxygen transfer can also be achieved by the use of an aerobic biological trickling filter (TF) as a
first treatment step (Kim et al., 2014). In this specific case, aeration of the TWs is provided in
the form of dissolved O2 within the influent flow. Recently, TF associated with various
configurations of TW has shown interest (Akratos et al., 2020; Stefanakis et al., 2019, Vucinic
et al., 2013).

The AZOE process, patented by the French company SCIRPE (patents EP1857419; FR
0651656; FR 1153754), includes, among other complements, the implementation of an aerobic
TF as a first treatment step. The objective is to contribute to the removal of the organic load,
initiate the nitrification process and oxidize the raw influent before it is transferred to the TW
filter stages. One of advantages of this design is to reduce the ground footprint surface from 2
m².PE-1 (Person Equivalent) down to 1 - 1.5 m².PE-1.

The system is well established with more than 50 treatment units in operation mostly
in Eastern France. Several pilot-scale to full-scale investigations have been published on the
95

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characteristics and performance of the system (Kania et al., 2018; Kania et al., 2019b; Kim et
al., 2014; Kim et al., 2015a; Kim et al., 2015b). However, to our knowledge, no full-scale
research has yet been published on N removal and its limitation in such systems.

In the present study, 29 full-scale AZOE and classical French VF-TW plants were
monitored for overall inlet-outlet treatment efficiencies in terms of C and N. The respective
contributions of the successive treatment steps were also investigated by conducting analyses
at intermediate levels of the treatment line of the selected treatment plants. One of the
objectives was to assess limitations observed in N removal, in order to test possible adaptations
of operating conditions that may improve treatment efficiencies.

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[Link] G ENERAL DESCRIPTION OF STUDIED SYSTEMS

The classical VF-TW, also called “French VF system”, comprises two successive TW
stages planted with reeds and fed in a vertical flow mode. The influent wastewater is firstly
screened to remove coarse particles larger than 20 to 30 mm. The first TW stage is divided into
3 hydraulically independent cells which are alternatively fed by batches for one week each and
rested for 2 weeks while other cells are fed. The second TW stage comprises 2 cells which are
fed and rested every other week. Feeding is designed at a flow rate above 0.6 m3.m-2.h-1 to
ensure a good water distribution through the whole surface of cells (Molle et al., 2005).

The AZOE system combines the classical French VF-TW treatment stages described above with
following additional processes or operations:

a) A first treatment on an aerobic TF with adjustable recirculation rate. Aerobic TF has

proven very efficient in carbon oxidation and may contribute also to nitrification. The
bioreactor is packed with a plastic crossflow media having a specific surface ranging
from 100 to 150 m2/m3. The growth of biofilm on the surface of packing media
increases the cellular density in the bioreactor as compared to suspended system
(Daigger and Boltz, 2011). Wastewater influent is uniformly sprinkled over the top of
the reactor and trickles downward trough the packing media to drainpipes. Aeration
occurs via natural circulation of air through media. Previous studies suggested a
significant but variable contribution of the trickling filter to total nitrogen removal,
ranging from 15 to 50% (Kim et al., 2014).
b) A syphon system at the outlet of each TW stage allows to adjust the depth of their
water saturated zone to regulate the nitrification/denitrification balance between oxic
conditions in the top unsaturated part and anoxic conditions in the lower saturated
part.

c) Addition of ferric chloride into outlet effluent from the TF is conducted in some of
selected treatment plants for phosphorus retention (Kim et al., 2015).

Some of the AZOE treatment plants monitored here were designed with one single
stage of TW instead of 2, with a shallow saturated zone. This modification was used to make
the system even more compact with a footprint as low as 1 m²/pe, while maintaining still good

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performance. Figure 3.1-1 summarizes technical design characteristics of VF-TWs and AZOE
systems in monitored 29 full-scale treatment units.

FIGURE 3.1-1 : SCHEMATIC DESCRIPTION OF THE CLASSICAL FRENCH VFTW SYSTEM AND THE AZOE SYSTEMS

[Link] P ROCESS CONFIGURATIONS OF SELECTED TREATMENT PLANTS AND DESIGN OF MONITORING

CAMPAIGNS

Table 3.1-1 gathers general information on 29 wastewater treatment plants monitored

in this study, all located in France, mostly in the eastern part of the country. As shown in Figure
1, their configurations differed from each other by (i) the presence or not of an aerobic TF, (ii)
the number of TW filter stages (1 or 2) and (iii) the levels of water-saturation in each stage filter.

Each treatment plant was monitored between 1 to 4 times by collecting and analyzing
wastewater samples from (i) the inlet of the plant, (ii) the outlet of the 1st TW stage, (iii) the
outlet of the 2nd TW stage. Inlet and outlet were systematically analyzed in all campaigns, while
the outlet of the 1st TW stage was analyzed only in some of the campaigns as indicated in Table
1. In such cases, the overall treatment line was approached as 2 successive treatment units (TU)
as shown in Fig. 1. Depending on the system, the TU comprised following operations:

- In the classical French system:

TU 1 = unsaturated 1st-stage TW
TU 2 = unsaturated 2nd-stage TW

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- In the 2-stage AZOE system:
TU1 = aerobic TF + partially saturated 1st-stage TW
TU2 = partially saturated 2nd-stage TW
- In the 1-stage AZOE system:
TU1 = aerobic TF + partially saturated 1st-stage TW
TU2 = None

TABLEAU 3.1-1 OVERVIEW ON THE VF TW TREATMENT PLANTS SELECTED FOR THE STUDY

Location Sizing (m² per PE)

Nominal
(year of System
PE 1st 2nd Nb of With inter.
implementation) Total
stage stage campaigns data*

Arbecey (2018) 300 2.5 1.5 1 1

Sainte-Hélène (2006) 400 2 1.3 0.7 1 Yes (1)

Bagé-la-Ville (2007) 920 2.4 1.55 0.85 2

Classical
Soncourt-sur-Marne VFCW
450 2.4 1.5 0.9 1
(2014) system

Saint-André de Boegé
630 2 1.3 0.7 1
(2004)

Saint-Boil (2018) 500 2.5 1.5 1 1 Yes (1)

Villemotier (2008) 350 2 1.3 0.7 1

Trans-la-Forêt (2013) 450 1.5 1 0.5 4 Yes (4)

Ciel (2017) 1200 1.4 0.85 0.55 1

Petit-Noir (2012) 1500 1.5 1 0.5 2

Reillane (2013) AZOE - 2 1950 1.5 1 0.5 2

Stages
Lavernay (2018) 1080 1.5 1.1 0.4 1

Saint-Michel-
1200 1.45 0.9 0.55 1
l’Observatoire (2016)

Saint-Luperce (2012) 1300 1.3 0.85 0.45 4

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Saint-Désert (2015) 1000 1.5 1 0.5 4 Yes (2)

Vercia (2004) 600 2 1 1 1 Yes (1)

Cormatin (2015) 1000 1.5 1 0.5 3 Yes (2)

Thoard (2013) 800 1.1 1.1 - 4

Pouligney-Lousans
1000 1.1 1.1 - 1
(2014)

Corcelles-les-Citeaux
1250 1 1 - 1
(2019)

Cras-sur-Reyssouze
AZOE - 1 1125 1 1 - 2
(2016)
Stage
Curtafond (2016) 700 1 1 - 1

Dauphin (2016) 1083 1.1 1 - 1

Masserac (2017) 770 1 1 - 1

Marlieux (2019) 1250 1 1 - 1

Ventrol (2017) 188 1 1 - 1

*Indicates campaign including data in between first and second stage. If not, only input and output data are
available

[Link] A NALYTICAL METHODS

All wastewater samples were collected using 24h flow-proportional samplers, were
transported to the laboratory at 4°C and analyzed within a maximum of 24h. All analyses were
done in triplicates following French standard methods (AFNOR, 2005). The following
parameters were analysed: Total Suspended Solids (TSS), Chemical Oxygen Demand (COD),
five-day Biochemical Oxygen Demand (BOD5), Total Kjeldahl Nitrogen (TKN), ammonium (N-
NH4+), and nitrate (N-NO3-).

[Link] E XPLOITATION OF MONITORING DATA

100

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Analytical results were used to determine in each system (1-stage AZOE, 2-stage AZOE and
classical systems respectively) and for each variable:

- The overall inlet-outlet removal rates relative to the reduction of concentrations and mass
flows

- The contribution of each TU relative to its inlet-outlet reduction of concentrations and

mass flows

Treatment efficiencies were calculated as the average overall percentages of removal of the
considered parameters of wastewater quality between the inlet and the outlet of the treatment
plants. Nitrification and denitrification were represented by the TKN and TN removal rates,
respectively.

[Link] S TATISTICAL ANALYSIS

The respective efficiencies of the overall treatment systems or the TU were compared
by Wilcoxon-Mann-Whitney statistical method. Ranking hypotheses were considered true if p-
value was smaller than 0.05. All statistical calculations were done using R software.

101

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[Link] C HARACTERISTICS OF INFLUENT WASTEWATERS

Figure 3.1-2 gathers, for all monitoring campaigns on selected 29 treatment plants, the
influent wastewaters characteristics; pH and concentrations of COD, BOD5, TSS, TKN and NH4+.
The average concentrations were found quite typical of raw domestic wastewaters
compositions from communities below 2000-person equivalent in France (Mercoiret, 2010).
pH values were globally close to neutrality or slightly alkaline. All treatment plants selected for
the study were therefore fed with typical domestic wastewaters of rural and semi-rural areas
in France.

FIGURE 3.1-2 : DISTRIBUTION OF PH AND COD, BOD5, TSS, TKN, AND AMMONIUM CONCENTRATIONS IN INFLUENT
WASTEWATERS FROM THE WHOLE DATA SET OF ALL MONITORING CAMPAIGNS

[Link] O VERALL TREATMENT EFFICIENCIES

The whole data set gathered from all monitoring campaigns was firstly used to compare
treatment efficiencies (by removal rates, Figure 3) between classical French, 1-stage AZOE and
2-stage AZOE systems (Table 1).

It can be observed that COD and BOD5 removal rates were all above 85% and 90%
respectively, revealing high treatment efficiencies regardless of the process configuration.
These observations were in accordance with previously published studies conducted on
classical French VF-TWs (Paing and Voisin, 2005; Molle, 2005; Morvannou et al., 2015).
Suspended solids were efficiently removed (removal rate above 85%) due to their retention by
102

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filtration through the surface sludge layer mostly composed of fine particles below 100 µm
(Kania et al., 2018) and through the fine gravels bed below. Single-stage and 2-stage AZOE
configurations exhibited very similar TSS input/output removal rates, indicating that a single
stage of filtration was sufficient to remove suspended solids from domestic wastewaters. TSS
removal rates were the same in classical French and AZOE systems, revealing that the
suspended solids released from the TF operation were retained to the same extent as those of
the raw wastewater influents.

On the other hand, TKN removal (nitrification) was strongly affected by process
configurations, particularly the presence or not of a second TW stage. The 2-stage processes
(classical French system and 2-Stage AZOE) exhibited high and stable TKN inlet-outlet removal
rates, respectively 94 and 95%, whereas the 1-stage AZOE system showed a TKN removal rate
of 86%. These results showed that the second TW stage provided significant contribution to
the nitrification process (p = 0,001). O2 availability was therefore sufficiently high to allow the
microbial oxidation of ammonia and organic forms of N, both within the aerobic TF and in the
unsaturated zones of the 1st and 2nd TW stages.

103

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FIGURE 3.1-3 :COMPARATIVE INPUT / OUTPUT (I/O) REMOVAL RATES OF COD, BOD5, TSS, TKN AND TN IN THE
CLASSICAL FRENCH (RED), 1-STAGE AZOE (BLUE) AND 2-STAGE AZOE (YELLOW) SYSTEMS. FOR EACH SYSTEM,
MIDDLE LINES WITHIN BOXPLOT ARE MEDIAN VALUES. DOT COLOUR REPRESENTS THE WATER TEMPERATURE (°C).

Denitrification demands anoxic conditions which, can be observed only in the water-
saturated anoxic zones of the monitored TW filters. Strong differences were observed on TN
removal between Classical VFCW, 1-stage AZOE and 2-stage AZOE systems with 21, 55, and
75% removal rates, respectively. The low performance of the classical French system
configuration in TN removal (Figure 3.1-3) was attributed to the absence of water-saturated
zone in either stage of TW filters (Kim et al., 2015a). AZOE process configurations allowed
higher TN removal rates thanks to the presence of anoxic conditions within saturated zones of
the first and/or second filter stage (Kim et al., 2014). TN removal rates in 2-stage AZOE system
(73%) were higher than in 1-stage AZOE system (52%) (p = 0,004), suggesting the contribution
of the second TW stage in the denitrification process. However, the variability of the data within
each individual treatment plant was much higher for TN than other parameters, particularly in
the single stage system since this configuration was not designed to operate denitrification.
Even in the 2-stage AZOE system, specifically designed for denitrification, the results of TN

104

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removal from each individual TU were much more variable than those of carbon removals.
Water temperatures during the monitoring campaigns ranged between 5,5 and 24,5 °C as
illustrated by the colours of the dots in Figure 4. Although it can be expected that low
temperatures reduced treatment efficiencies due to lower microbial kinetics, it can be seen
that temperatures cannot fully explain the variability of the data.

[Link] C ONTRIBUTION OF THE TREATMENT OPERATIONS TO C AND N REMOVALS IN CLASSICAL AND

AZOE SYSTEMS

Depending on the considered system, the treatment line was composed of a succession
of different processes and operations. These operations were approached here as “treatment
units” (TU) as shown in Figure 1 and discussed in the “Materials and Methods” section.

Figure 3.1-4 compares for each type of system the contributions of TUs in terms of the
percentage of reduction of the concentrations of the monitored variables. The contribution of
the second-stage filter (TU2) to COD removal was around 5.5% and 1.5% in the classical VF-TW
and 2-stage AZOE systems respectively. This was marginal as compared to the contribution of
TU1 in the classical system (83.5%) and the 2-stage AZOE system (92%).

In contrast, it was observed in the classical VF-TW system that most of the nitrification
process occurred in the second-stage filter (TU2) with 69 ± 4.9% TKN removal vs. only 20 ± 9%
in the first-stage filter (TU1). These observations confirmed the role of the second-stage filter
in the classical VF-TW as previously reported (Morvannou et al. 2015, and Molle 2005).

In the 2-stage AZOE system however, the contribution of TU2 (second-stage filter) to
nitrification was smaller than in the classical system with 11 ± 6% of TKN removal. Nitrification
was found to occur mostly in TU1 (77% TKN removal). This observation was attributed to effects
of the aerobic biological TF in AZOE systems which contributed not only to organic carbon
removal but also to nitrification (TKN removal).

TN removal remains very low or null for both classical VFCW TU which is consistent as
the system does not provide anaerobic conditions while the 1-stage AZOE still allows the
removal of 52%. In the 2-stage AZOE system, TN removal is largely performed by TU 1 which
implies relatively poor denitrification activity in the second stage.

105

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FIGURE 3.1-4 :COD AND TKN REMOVAL RATES OF THE TOTAL SYSTEM, TU1 AND TU2 FOR CLASSICAL, 1-STAGE
AZOE AND 2-STAGE AZOE CONFIGURATIONS. SEE FIGURE 3.1-1 FOR DEFINITIONS OF TU1 AND TU2. BARS
REPRESENT THE STANDARD DEVIATION.

[Link] M ASS LOADS REDUCTION EFFICIENCIES IN 2- STAGE AZOE® SYSTEMS

The monitored parameters in this study included volumetric data of wastewater flows
treated in the selected treatment plants. Combined with analysed concentrations, the
treatment efficiencies were calculated in terms of daily mass loads reductions. Results are
shown in Figure 5 where removed loads were plotted for each variable as a function of applied
loads. The respective contributions of TU1 (aerobic TF + 1st-stage TW filter) and TU2 (second-
stage TW filter) are compared.

Figure 3.1-5 confirmed very high efficiencies of COD and BOD5 removals in all monitored
treatment plants. The mass removal rates of COD and BOD loads reached 90% for TU1 alone.
Only a few percent of COD and BOD5 input loads were released into the output effluents.
Nitrification was found quite efficient in most of the campaigns and most of monitored
treatment plants, with a mass removal rate of TKN above 75%. The contribution of the 2nd-

106

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stage filter to nitrification was low but significant. The second stage was shown to act as a
safeguard “polishing” stage to guarantee high treatment efficiencies.

In the 2-stage AZOE system, denitrification recorded in TU1 ranged between 75 and
95% of TN mass removal (excepted for one isolated result at 40%). Since denitrification may
occur only under anoxic conditions, this observation showed that the water-saturated zone at
the bottom of the first-stage TW filter allowed to install anoxic conditions for an efficient
denitrification of at least 75% of TN removal.

The rest of denitrification occurred in the second stage filter where excess nitrates from
the first stage along with nitrates produced by TKN oxidation within the unsaturated upper
zone of the 2nd-stage filter were reduced within the saturated anoxic zone. The residual nitrates
load was however significant in the outlet of the second stage, indicating that denitrification in
the second stage was not efficient enough, suggesting a limitation of the process. This
observation suggested perspectives of improvement of the systems by optimizing the second-
stage filter contribution.

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FIGURE 3.1-5 : REMOVAL EFFICIENCIES OF BOD5, COD, TKN AND NO3- OF THE 2-STAGE AZOE SYSTEM ON A MASS
LOAD BASIS. BLUE AND PINK CIRCLES SHOW THE RESPECTIVE CONTRIBUTIONS OF TU1 AND TU2. SEE FIG. 1 FOR TU
DEFINITIONS.

[Link] T OTAL NITROGEN REMOVAL AND LIMITATIONS TO DENITRIFICATION

Results from the monitoring campaigns revealed that the denitrification process was
incomplete in all treatment systems studied. Output nitrates concentrations ranging between
6 and 39 mg/l N-NO3- were recorded although most factors were favourable to a higher
denitrification rate. Hydraulic retention time was adjusted to 1.2 days by setting to 50 cm the
depth of the water-saturated zone in both stages. This hydraulic retention time was considered
as favourable (Morvannou et al, 2017). This mode of operation also allowed the installation of

108

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anoxic conditions in the lower parts of the TW filters, which was favourable to denitrification.
Finally, pH ranging from 7.2 to 8.2 was also favourable to nitrification and denitrification
processes (Šimek and Cooper, 2002).

The BOD5/N-NO3- mass ratio was not favourable however in the second-stage TW filters
of all monitored systems. It ranged between 0.05 and 1.5 (with an average of 0.62) whereas
values between 2.5 and 3 are usually considered as optimal for heterotrophic denitrification
(Rocher et al., 2015). This situation was a consequence of the high oxidation of the carbon load
done in treatment unit TU1 (aerobic TF + 1st-stage TW filter). The second-stage filter acted as a
polishing stage for nitrification in the upper part, but denitrification in the lower saturated part
was limited by the poor availability of biodegradable organic substrates.

Carbon supply in the form of simple substrates such as methanol, glucose or acetate
(Saeed and sun, 2012) can be considered as a corrective action to improve denitrification.
Another solution, probably cheaper and more sustainable, would be to use locally available
biowaste materials (Van Oostrom and Russel, 1994; Wen et al., 2010). The amounts needed,
the type of substrates and the modalities of addition should be carefully determined to
completely consume the amounts of carbon added and avoid residual COD concentrations in
the effluent. Diverting a fraction of raw influent to feed the second stage may also be a possible
and simple approach. Previous published studies done on a hybrid VF-HF TW system showed
that this approach allowed to improve total nitrogen removal by 31 to 50% (Torrijos et al. 2017).
Other studies at larger scales also gave encouraging results (Nivala et al., 2019, Al-Wahaibi et
al., 2021).

This approach could be implemented on 2-stage AZOE systems by diverting raw

wastewater from pumping station 1 to pumping station 2 (Figure 3.1-1) to supply
biodegradable organic substrates to the 2nd TW and thereby enhance its denitrification rate.
Figure 3.1-6 illustrates the fate of carbon and nitrogen in the treatment line of 2-stages AZOE
systems, and highlights the possible operational conditions to optimize nitrification –
denitrification processes. In this configuration, the saturation level of the TWs and the
recirculation rate on the TF should be adjusted to allow the highest reachable performance.

109

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FIGURE 3.1-6 : CONCEPTUAL FRAMEWORK OF CARBON AND NITROGEN REMOVAL PATHWAYS ON 2-STAGES AZOE

3.1.4 CONCLUSION

The present study reports and discusses results collected over a period of time of 13
years from several monitoring campaigns of 29 full-scale operating TW wastewater treatment
plants in France. Clear inter-relationships were evidenced in the performance of carbon and
nitrogen removals in 1-stage and 2-stage VF-TW combined with a first treatment operation on
aerobic biological TF.

Overall removal rates of COD, BOD5 and TSS were very high in all monitored systems.
They were slightly lower in the classical French systems than in AZOE systems where the TF
provided a strong contribution.

Nitrogen dynamics in AZOE systems differed as compared to classical systems. The

implementation of an aerobic TF as a first treatment stage in AZOE systems increased
nitrification. More than 75% of input TKN load was nitrified within TU1. The second-stage filter

110

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contributed furthermore to the nitrification. The water saturation of lower parts of TW filters
was favourable to denitrification. It was observed however that denitrification was relatively
high in the first stage-filter but quite limited in the second-stage filter although both filters were
saturated at the same depth.

Analyses of the evolution of the C/N ratio in the wastewater along the process line
revealed a lack of carbon in the second-stage filter, underlining this parameter as the major
cause of the low denitrification observed within the second-stage filter which can be improved
for optimizing this treatment unit.

CREDIT AUTHOR STATEMENT

Kevin Maciejewski: Conceptualization, Methodology, Data Curation, Writing – Original Draft.
Mathieu Gautier: Conceptualization, Methodology, Writing – Review & Editing, Supervision.
Boram Kim: Conceptualization, Methodology, Data Curation, Writing – Review & Editing.
Philippe Michel: Writing – Review & Editing. Rémy Gourdon: Conceptualization, Writing –
Review & Editing, Supervision

ACKNOWLEDGEMENTS
This work was realized within the Graduate School H2O’Lyon (ANR-17-EURE-0018) and the
Université de Lyon (UdL), as part of the programme "Investissements d'Avenir " of the French
national agency for research (Agence Nationale de la Recherche, ANR). The authors would like
to thank the SCIRPE Company and CIFRE (Conventions Industrielles de Formation par la
REcherche) for funding this research project.

111

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Ces travaux se sont basés sur l’exploitation de données de 29 bilans de stations classiques et
AZOE-N à un ou deux étages de filtration à écoulement vertical. Ces travaux ont permis de
renforcer les connaissances sur ces systèmes. Tout d’abord les performances en termes
d’abattement de MES sont toutes supérieures à 95%. Ce résultat, déjà largement montré par
la communauté scientifique, met clairement en évidence le rôle du milieu poreux dans la
rétention des matières particulaires dans les systèmes français, et plus notamment le rôle du
1er étage qui voit l’accumulation d’une couche de boues de surface.

Les principaux points à retenir sont les suivants :

Tous les systèmes étudiés dans cet article fonctionnent avec un flux hydraulique vertical.
Le premier étage joue un rôle considérable puisqu’il retient la matière particulaire en formant
à son sommet une couche de boues de surface. Les performances sur les MES sont toutes
supérieures à 95% ;

La présence du lit bactérien en tête de traitement dans le système AZOE permet d’abattre
la quasi-totalité du carbone et de réaliser 80% de la nitrification avant que l’effluent ne soit
traité sur le second étage ;

Le second étage joue un rôle de polissage de la nitrification et sécurise la filière en cas de

dysfonctionnement ;

Le premier étage contribue très largement à la dénitrification dans sa zone saturée. Malgré
la présence de nitrates et d’une zone saturée, les performances de dénitrification oscillent à
des valeurs limitées entre 5 et 10% au niveau du second étage ;

Le potentiel du second étage semble largement sous exploité. Le principal levier de

l’optimisation de la filière AZOE en termes de performances sur l’azote passe par l’amélioration
du rôle du second étage, notamment à travers l’augmentation des performances.

113

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En s’intéressant aux résultats de stations en fonctionnement, le paragraphe précédent

a clairement mis en avant les performances de stations du procédé AZOE-N spécifiquement
conçu pour le traitement de l’azote. Ces travaux, résultant de bilans 24h sur stations en
fonctionnement, ont clairement montré les bonnes performances globales des systèmes AZOE-
N étudiées. Cependant afin de mieux maîtriser les rejets d’azote dans des milieux récepteurs
très sensibles, voire d’optimiser ces teneurs en azote dans ces objectifs de réutilisation des
eaux usées, des compléments s’avèrent nécessaires. L’un des objectifs est de mieux
comprendre quelles limites présente ces systèmes afin de pouvoir y faire face le cas échéant.

Cette partie inclut 2 articles, présentés dans les paragraphes 3.2 et 3.3 suivants, qui se base
pour le 1er sur un suivi pilote sur un temps long à travers une démarche expérimentale basée
sur des échantillonnages et des analyses physico-chimiques classiques. Le 2nd article s’est
intéressé à une séquence plus courte pour mieux comprendre la dynamique de l’azote au sein
du système, notamment à travers le développement d’une approche analytique par méthode
isotopique.

“Effect of organic load variation in a domestic wastewater treatment system combining an

aerobic trickling filter and two successive partially saturated vertical flow treatment wetland
filters”
Cet article analyse des données de suivi ponctuel et continu d’une expérimentation pilote
au sein de laquelle l’ensemble de la filière AZOE-N a été reproduite, à savoir le lit bactérien, le
1er et le 2nd étage. A travers ce suivi dans le temps, deux conditions saisonnières différentes ont
pu être distinguées, à savoir l’automne et le printemps. La charge organique journalière
printanière est supérieure à celle d’automne et permet d’étudier l’influence de cette charge
sur les performances globales.

“Pilot-scale Investigation of the fate of ammonium in Vertical-Flow Treatment Wetland Using

15N/14N isotope ratio monitoring “

Cet article propose de croiser les informations issues d’un traçage hydraulique
conventionnel par traceur fluorescent avec un traçage isotopique par l’ajout d’ammonium
marqué sur toute la filière. La partie isotopique a fait l’objet d’un développement analytique en
collaboration avec l’équipe isotopie de l’Institut des Sciences Analytiques de Lyon.

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3.2 ETUDE A LONG TERME DU SYSTEME A L’ECHELLE PILOTE ET DE
L’INFLUENCE DES VARIATIONS DE CHARGES

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EFFECTS OF ORGANIC LOAD VARIATION IN A DOMESTIC WASTEWATER TREATMENT SYSTEM
COMBINING AN AEROBIC TRICKLING FILTER AND TWO SUCCESSIVE PARTIALLY SATURATED
VERTICAL FLOW TREATMENT WETLAND FILTERS.
K. Maciejewskia,b, M. Gautiera, B. Kima, P. Michelb, P. Mollec, R. Gourdona
a
Univ Lyon, INSA Lyon, DEEP, EA7429, 69621 Villeurbanne, France
b
SCIRPE, Society of Design and Production Engineering for Wastewater Purification, 5 Allée Alban Vistel,
69110 Sainte Foy Lès Lyon, France
c
Institut national de recherche pour l’agriculture et l’environnement (Inrae) - UE Reversaal,
Villeurbanne, France

Abstract
AZOE processes are patented technologies for the treatment of domestic wastewaters from
small communities. They associate an aerobic trickling filter (TF) and two successive partially
saturated vertical flow treatment wetlands (TW) filters planted with reeds. A pilot-scale AZOE
system was constructed and operated on real domestic wastewaters to investigate the
contribution of each treatment stage (TF, 1st and second TW filters) to the removal of Chemical
Oxygen Demand, Total Suspended Solids and nitrogen. The effect of organic load variation
induced by seasonal parameters was also investigated by monitoring the system under the
same operating conditions in autumn and spring. Results showed that the trickling filter
removed about half of the organic load regardless of the season. Online monitoring of
ammonium and nitrate concentrations at the outlets of the first and second TW filter stages
clearly showed the flow of nitrates produced in the first filter and transferred to the second
one. Nitrification rate was found to be lower however when the feed organic load was higher.
The first filter stage showed strong contributions both to nitrification and denitrification,
respectively 79 and 41% in autumn and 54 and 48% in spring, due to the alternance of oxic and
anoxic conditions in its unsaturated and saturated zones respectively. The contribution of the
second TW filter was low but this stage revealed the capacity to adapt to increasing feed loads,
thereby acting as a buffer polishing treatment to maintain low output concentrations. The lack
of carbon was assumed as a most limiting factor to denitrification on the second stage.

Highlights
TF performance variability strongly influences first stage nitrogen removal
First stage filter achieves most of the denitrification
A peak of nitrates concentration is observed at first stage outlet shortly after feeding
Second stage filter guarantees high COD and TKN removal rates

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Organic carbon availability in second-stage filter is the main limitation to denitrification
Keywords
Constructed wetland, Wastewater Treatment, Trickling filter, Nitrogen treatment, Carbon to
Nitrogen ratio

3.2.1 INTRODUCTION

Over the last 30 years, constructed wetlands (CWs) have been implemented very
successfully worldwide with different process designs and under various climatic conditions
(Varma et al., 2021). Appreciated for their good integration to rural landscape, their low
operating and management costs and their high treatment performance, CWs are reliable
alternatives to intensive systems for domestic wastewater treatment in rural area. Constructed
wetland can either be unsaturated or saturated, with horizontal or vertical hydraulic. More
occasionally, hybrid systems are also used (Vymazal, 2013). In France, VFCWs are by far
predominant in practice. They contribute to the treatment of around 2% of the overall volumes
of wastewater treated, and even up to 10 % in townships and rural areas of less than 4000
Person Equivalent (Eau France, 2019). The regular VFCW system most widely used in France is
fed directly with screened but unsettled wastewaters and consists of two successive
unsaturated filtration stages, alternately fed for 3.5 days and rested for 1 week. Under these
operational conditions, the system guarantees a quasi-quantitative retention of suspended
solids and good oxidizing conditions which allow high mineralization rates of organic load and
strong nitrification of nitrogen load (Molle et al., 2005; Paing and Voisin, 2005). This system,
known as the classical French system, has been the basis to many innovations driven by the
need to make the system more compact and improve phosphorus and total nitrogen removals.
The treatment design allowing to remove efficiently total nitrogen must firstly provide well
aerated and oxidising conditions for the nitrification process and the oxidation of organic
nitrogen, followed by anoxic conditions for denitrification. Denitrification results from microbial
activities and is favoured by many factors such as very low dissolved oxygen concentrations, a
close to neutral pH, relatively high hydraulic retention times and a sufficient availability of
biodegradable organic substrates (Lee et al., 2009; Kadlec and Wallace, 2009, Faulwetter et al.,
2009).

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The required succession of oxic and anoxic conditions can be achieved by modifying the
process design and mode of operation of the regular VFCW system. Particularly, water
saturation of the lower part of the filters has been designed to implement oxic conditions within
the upper part followed by anoxic conditions in the lower part (Kim et al., 2015; Silviera et al.,
2015, Kraiem et al., 2021). Using such a configuration, other adaptations were further
developed to enhance total nitrogen removal rates, such as correcting organic carbon
deficiencies to heterotrophic denitrifying communities through the addition of organic carbon
of various natures and origins (Wu et al., 2014; Nivala et al., 2019; Wang et al., 2020; Al-Wahaibi
et al., 2021;). Other process adaptations were also proposed such as forced aeration and
recirculation of wastewater through the partially saturated filters to promote nitrification and
denitrification simultaneously (Foladori et al., 2013, Boog et al., 2014). Finally, the
implementation of pre-treatment operations, such as on an aerobic trickling filter (TF), was also
proposed and used to improve treatment efficiency (Henrich and Marggraff, 2013; Vucinic et
al., 2012; Kim et al., 2014; Stefanakis et al., 2019; Akratos et al., 2020). An aerobic TF is system
where the water to be treated percolates through a solid porous media having a high surface
area and sufficient porosity to allow a microbial biofilm to grow on its surface, while the
percolation regime leaves enough porosity to allow natural aeration (Daigger and Boltz, 2011).

The AZOE system (patents EP1857419; FR 0651656; FR 1153754) is a combination of an

aerobic TF pre-treatment operation followed by two successive partially saturated filtration
stages planted with reeds. The system is being used in more than 50 plants in France with an
average treatment capacity around 800 - 1200 Person Equivalent (PE). In addition to reducing
the treatment footprint from 2 to 1.5m²/PE, this system allows for the capture of phosphorus
by ferric chloride addition into the outlet effluent of the TF (Kim et al., 2014; Kim et al., 2016),
as well as quasi total nitrification and 74% denitrification (Maciejewski et al., 2022). Despite
these previous studies, an in-depth investigation was missing to better understand the
respective role and/or limit of each step in the treatment chain and investigate way of
improvement.

A pilot –scale AZOE system comprising the TF and the two partially saturated filtration
stages was used in this study. It was fed permanently with real domestic wastewaters and
monitored in the objective to investigate nitrogen removal processes, more particularly the

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influences of the organic carbon/nitrogen ratio and the TF pre-treatment. To achieve this goal,
ORP, nitrates and ammonium probes were used to monitor online the system.

3.2.2 MATERIALS AND METHODS

[Link] S ET - UP OF PILOT - SCALE DEVICE

A pilot-scale treatment unit with a treatment capacity of 6 Person-Equivalent was

constructed according to the design of a full AZOE®-N system. The experimental set-up
comprised an aerobic trickling filter of 1.60 m high and 0.24 m² surface and two successive
vertical-flow - filtration stages having a respective surface of 2 m², a depth of 0.7 m and a
volume of 1.4 m3. The TF is filled with a polypropylene cross pack whose volumetric surface
area is 150 m²/m3. The filter-stages were designed in a similar manner as in full-scale treatment
units. They were filled with different layers of sand and gravels as shown in figure 1 and planted
with Phragmites Australis. Before planting reeds, the first-stage filter was covered with a thin
layer (5 cm thick) of organic deposits collected from a full-scale VFCW unit.

The pilot-scale device was installed in a greenhouse at the Feyssine Experimental Hall,
Villeurbanne, France. The experimental hall was connected to the AquaLyon 400 000 pe
activated sludge wastewater treatment plant and continuously fed with freshly screened
unsettled raw wastewater.

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FIGURE 3.2-1 :SET-UP OF EXPERIMENTAL PILOT-SCALE AZOE SYSTEM OF 6-PERSON EQUIVALENT IN THE FEYSSINE
EXPERIMENTAL HALL

[Link] O PERATING CONDITIONS

Raw wastewater was pumped into a feed tank reservoir at a constant rate of 25 litres
per hour, so the daily volume treated on the pilot is 600 L. The trickling filter was operated
discontinuously in a batch feeding mode. Every two hours, a batch of 60 L of raw wastewater
pumped from the feeding reservoir was sprinkled in 30 minutes at the surface of the trickling
filter with a flow rate of [Link]-1. The recirculation percentage is therefore 200%, and the
hydraulic load is 0.37 m3.m-2.h-1. The first-stage filter was then fed by spreading the batch
volume of the outlet effluent from the TF. Inlet wastewater flow rate was maintained at 0.6
m3.h-1. The first and second filtration stages were saturated to a depth of 0.3 and 0.4m
respectively, using syphons as shown in Fig. 3.2-1. The effluent from the first-stage filter was
collected and the second-stage filter was then fed in the same manner as the first filter. Both
filter stages were composed of a unique cell. The sequential feeding regime of 1 week feeding
followed by two weeks resting used in full-scale treatment units was applied here with the same
ratio but on shorter periods of time. The filters were fed for 56 hours of a week and rested for
112 hours of a week. During the resting periods, the outlet effluent from the TF was discarded.
Experiments were conducted and monitored over two different periods of time, respectively in

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autumn 2020 (October 28 to December 18) and spring 2021 (1 April 1st to May 8th) with a winter
break in January and February when the temperature were too low. The pilot was put back into
operation in early March.

[Link] A NALYTICAL METHODS

Wastewater samples were collected during the feeding periods from the following
points: (i) raw-wastewater at the system inlet, (ii) TF outlet, (iii) first-stage filter outlet, and (iv)
second-stage filter outlet. Each sample is a mixture of 3 samples taken at regular intervals
during the day to obtain a more accurate representation of an operating day. Occasionally,
wastewater samples were also taken from the top of the saturated zones in both filter stages
using a thin piezometer installed within the filters. All samples were immediately analysed for
pH, then refrigerated and stored for a maximum of 24h before the other analyses. Samples
were frozen if longer storage time was needed. All parameters were analysed following French
standard methods (AFNOR, 2005): Chemical Oxygen Demand (COD), Total Suspended Solids
(TSS), ammonium (NH4+), nitrates (NO3-), nitrites (NO2-), Total Kjeldahl Nitrogen (TKN), Total
Nitrogen (TN). Total Organic Carbon (TOC) was analysed by a TOC-Analyzer Shimadzu TOC-L
Model. Ultraviolet was measured with a spectrophotometer Shimadzu 2450.

[Link] O NLINE DATA ACQUISITION

Nitrates and ammonium concentrations and ORP were monitored online every minute.
On line monitoring of nitrates and ammonium concentrations were done at the outlet of the
TF and outlets of the first and second filtration stages respectively, using VARION PLUS NO3
and VARION PLUS NH4 probes purchased from WTW. A total of 4 ORP probes were installed at
the top and the bottom of both stages of filtration using sheaths placed horizontally to limit
possible preferential flows. All data were stored into a central of acquisition. ORP, nitrates and
ammonium probes were routinely checked and deviation to standard control was calculated.

[Link] S TATISTICAL TREATMENT

Analytical data were treated using R software and statistical methods.

Performance ratios were calculated using equation 1 for the different variables [X] monitored

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Applied and treated nitrates load on specific stage of treatment include the input of nitrates
from nitrification of ammonium, using the equation 2:

(2) Applied mNO3-stage x = mNO3- in, stage x + (NH4+ in, stage x – NH4+ out, stage x)

Wilcoxon-Mann-Whitney statistical method was used to compare data series to each other,
where hypothesis was considered true if p-value remained lower than 0,05.

3.2.3 RESULTS AND DISCUSSION

[Link] R AW WASTEWATER CHARACTERISATION

The input concentrations of carbon, nitrogen and total suspended solids for the two
periods studied are shown in figure 3.2-2. Generally, the input effluents of the spring session
are more concentrated, especially in COD (p = 0.04). This can be explained by a lower dilution
of the wastewater in spring by rainwater. The daily volume of water to be treated on the pilot
is identical for both periods, therefore the daily organic load to be treated is higher in spring
than in autumn. The impact of this difference in input load is significant, especially on the TF
where the applied organic load is a parameter of primary importance on the treatment
performance. Based on the average input concentrations in Table 1 (BOD5 conversion = 0.73
CODd), the applied organic load in autumn is 2.00 kgBOD5/m3/day, and 2.65 in spring.

The evolution of the inlet wastewater temperature over the monitored periods of time
is shown in Fig. 3.2-2 for the spring and autumn periods respectively. The temperature
fluctuated between 10 and 20°C in both seasons, and globally similar regardless of the season.
It was observed however that temperatures recorded in autumn were more often below than
above those recorded in spring. Autumn and spring are temperate and relatively mild seasons
in the region where the study was done (Lyon, in the south east of France), and the greenhouse
where the equipment was installed also helped regulate the room temperature.

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FIGURE 3.2-2 :TOP - RAW WASTEWATER CONCENTRATION FOR CARBON, NITROGEN AND PARTICULAR
PARAMETERS REPRESENTED FOR BOTH SESSIONS (BLACK LINE REPRESENTS THE MEDIAN VALUE). BOTTOM:
WASTEWATER TEMPERATURE RECORDED AT INLET OF THE SYSTEM DURING SPRING AND AUTUMN SAMPLING
SESSIONS.

The mean values of the physicochemical data recorded in the study are shown in Table
3.2-1 for each respective seasonal period of investigation. Although differences were observed
in the pH of wastewaters at the different sampling points, the general trend ranged between
neutral and slightly alkaline. The strongest evolution of pH in the treatment line was a decrease
of 0.5 unit between the inlet and outlet of the trickling filter. Even if this difference is relatively
low, a pH difference could have consequence during contact of the effluent with sludge deposit
at the top of the first stage in term of carbon release in the rest of the system (Kania et al.,
2019, et Banc et al., 2022).

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TABLEAU 3.2-1 MEAN VALUES (IN BOLD) AND STANDARD DEVIATIONS (IN ITALICS) OF THE PARAMETERS
MONITORED IN THE WASTEWATER AT DIFFERENT LEVELS OF THE TREATMENT LINE IN AUTUMN AND SPRING
RESPECTIVELY. (COD = CHEMICAL OXYGEN DEMAND; TOC = TOTAL ORGANIC CONTENT; TKN = TOTAL KJELDAHL
NITROGEN; TSS = TOTAL SUSPENDED SOLIDS.)

Period Sampling point CODd TOC N_NH4+ N_NO3- TN TKN TSS pH

Autumn Influent 175.1 88.2 73.6 15.1 53.0 9.5 0.0 0.0 68.9 11.3 68.9 11.3 166.3 85.2 8.01 0.21

Autumn TF-Out 78.4 42.5 34.8 7.3 30.3 7.5 10.3 7.0 51.3 12.9 41.1 10.3 159.5 68.4 7.53 0.32

Autumn 1-Stage-Out 23.1 13.4 20.3 2.0 6.4 3.5 20.2 8.5 30.7 10.2 10.5 4.8 8.9 7.0 7.19 0.09

Autumn Effluent 11.1 16.0 15.1 2.6 2.3 2.0 24.8 4.9 29.2 5.3 4.4 2.8 6.0 6.2 7.44 0.46

Autumn Overall treatment rate 93.5 5.0 78.7 5.6 95.7 3.7 - 56.7 10.3 93.4 4.1 96.4 3.9 -

Spring Influent 231.2 80.3 66.5 35.5 57.3 15.0 0.1 0.4 79.0 12.4 78.9 12.5 284.3 42.1 7.82 0.07

Spring TF-Out 120.0 55.7 26.7 2.3 39.9 14.0 3.0 1.9 64.0 23.0 61.3 23.8 296.7 31.2 7.37 0.13

Spring 1-Stage-Out 40.9 12.2 12.5 3.9 18.2 3.1 12.7 7.9 35.6 9.7 22.8 3.6 25.7 13.7 7.15 0.06

Spring Effluent 17.1 14.3 8.7 2.3 5.3 2.1 18.1 10.7 26.1 10.8 8.0 3.4 3.5 1.9 7.24 0.05

Spring Overall treatment rate 90.1 9.0 84.3 7.3 89.9 5.1 - 66.5 12.8 89.4 5.1 99.2 0.7 -

[Link] T REATMENT EFFICIENCIES OF THE SYSTEM

O VERALL EFFICIENCIES

Overall efficiencies were calculated as the differences between the concentrations of

each parameter at the inlet and outlet of the whole treatment system, expressed in % of inlet
concentrations. Average overall removal rates calculated over each seasonal period are given
in Table 3.2-1. Figure 3.2-3 illustrates the results by showing the daily average removal rates in
green ink for the spring period and brown ink for autumn. The input/output performance of
the two series is not significantly different despite the differences in incoming pollutant load.

A very high (97.5 ± 3.3 %) and relatively stable removal rate was observed for Total
Suspended Solids (TSS) regardless of the season. The physical mechanism of filtration was very
efficient throughout the study to capture the suspended solids at the surface of the porous
media of the filters, thereby increasing the thickness of the sludge deposits layer. The same
evolution was observed in full-scale VFCW units (Kim et al., 2013; Kania et al., 2018) and the
important role of the surface sludge deposits layer was already documented (Kania et al., 2019;
Molle 2014).
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Overall treatment of organic load was followed by organic-carbon related parameters
monitored at the inlet and outlet of the whole system. Fig. 2 shows that the removal rates were
high to very high for all monitored parameters, with CODd removal rates, confirming the
efficiencies reported previously for full-scale similar systems (Maciejewski et al., 2022). The
presence of well aerated zones in the system such as in the aerobic TF and the unsaturated
upper parts of the 2 filter stages, were very favourable to the oxidation of organic carbon into
CO2. These conditions also allowed a high nitrification rate as shown here by the removal rate
of Kjeldahl Nitrogen reaching 91.4 ± 4.9 %. Total nitrogen removal was however lower (mean
values of 61.6 %) and also much more variable (± 12.5%) than the other parameters. Anoxic
conditions within the saturated lower part of the filters allowed the reduction of nitrates
(denitrification) to occur in the pilot-scale system, but the overall efficiency was not as good as
for the other parameters, suggesting that some factors limited the process. Other published
studies also reported limited denitrification rates in full-scale VFCW units, which were
attributed to the difficulty of maintaining optimal conditions notably the availability of organic
carbon at sufficient concentrations and the effective implementation of anoxic zones in the
treatment stages (Sirivedhin et al., 2006; Wu et al., 2014). The average nitrogen removal rate
recorded here at the pilot-scale (61.6 ± 12.5%) was slightly lower than reported in full-scale
AZOE systems respectively 71% and 74% (Kim et al., 2014; Maciejewski et al., 2022) and this
parameter was the most variable both at the pilot and full scales.

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FIGURE 3.2-3 : INPUT/OUTPUT OVERALL REMOVAL RATES OF VARIOUS PARAMETERS RECORDED ON THE PILOT-
SCALE AZOE SYSTEM IN AUTUMN AND SPRING.

I NFLUENCE OF THE TRICKLING FILTER PERFORMANCE

The specific efficiency of the aerobic trickling filter was calculated from the differences
between the inlet and outlet concentrations of each parameter. Experimental results revealed
different efficiencies according to the season as shown in Fig. 3. It was found that the effect of
the variation of organic load relative to the season was statistically significant for ammonium
(p = 0.03) and TKN (p = 0.01) removals but not for COD removal (p = 0.16). Nitrification was
more affected by the input load seasonal variation than the carbon load removal. In both
seasons, ammonification and nitrification were initiated in the TF where the conditions are
favourable. Nitrification performances have already been reported in the literature (Ledang
and Kleppe, 1999, Wang et al., 2015). A drop of 0.5 pH unit was observed in the wastewater
between the inlet and the outlet of the TF which can be explained by the alkalinity consumed
by the reaction of nitrification (Kadlec and Wallace, 2009). Surprisingly, total nitrogen removal
was observed in the TF (figure 3.2-3), suggesting that denitrification occurred although the
conditions within the TK are rather oxidative. One possible assumption could be that
denitrification actually occurred in the feed tank reservoir where inlet wastewater was stored
before feeding the TF. Redox potentials as low as -200 mV/EHN were recorder in this tank
reactor (see figure 3.2-1).

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FIGURE 3.2-4 : INPUT/OUTPUT DAILY PERFORMANCES OF VARIOUS PARAMETERS ACHIEVED IN THE AEROBIC
TRICKLING FILTER ALONE.

The respective contributions of the successive treatment steps to the removal rates of
the different parameters are illustrated in figure 3.2-4 for each respective season. Results
obtained in autumn and in spring were found very similar, indicating that the seasonal effect
was quite limited. However, some differences were considered relevant to discussion.

In particular, it was observed that the contributions of TF were stronger for lower inlet
than for higher ones. The interesting finding here was that the decreased contributions of the
TF in spring as compared to autumn were almost systematically compensated by increased
contributions of either the first filter stage, regarding particularly carbon removal, and/or the
second filter stage regarding particularly nitrogen removal. Altogether, the overall treatment
efficiencies of the entire system were very close in the 2 seasons for all the parameters.

The contribution to carbon removal of the 1st filter stage, and to a smaller extent the
2nd filter, occurred mostly via retention by filtration at the surface of the organic deposit, and
subsequent oxidation of the organic matter by heterotrophic aerobic microorganisms in
contact with air. Organic carbon was also consumed anaerobically within the unsaturated, oxic
upper part of the filter media and finally by heterotrophic denitrifiers within the saturated,
anoxic lower part of the filters. Based on the ration of 3.02gCOD to denitrify 1g of nitrate

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(Kadlec and Wallace, 2009), the consumption of organic carbon represented by the CODd for
denitrification over the whole treatment pathway represents was calculated to 73 mgO2 per
day. The remaining dissolved and particulate carbon is consumed by the unsaturated upper
parts and the trickling filter. The first filter stage was also found to play a significant role in
nitrogen removal (figure 3.2-5) by nitrification and denitrification. The association of TF and
first filter stage was already reported in full-scale studies to provide the major contribution to
nitrogen removal (Maciejewski et al., 2022). The present study underlined that most of the
contribution was provided by the TF.

The 2nd filter stage provides the lowest contributions of all the successive steps of the
system. This can be explained by the fact that it is the last step of the treatment system and
therefore the most readily degradable fractions of the wastewater constituents have already
been degraded and removed from the effluent they are fed with. This situation creates a
relative depletion of degradable organic substrates, resulting in a limited efficiency of the
heterotrophic denitrification.

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FIGURE 3.2-5 :RESPECTIVE CONTRIBUTIONS OF THE SUCCESSIVE STEPS OF TREATMENT IN THE PILOT-SCALE
SYSTEM IN AUTUMN (TOP) AND SPRING (BOTTOM)

[Link] D YNAMICS OF NITROGEN FATE WITHIN THE SUCCESSIVE FILTER STAGES

Figures 3.2-6 and 3.2-7 show the evolutions of ammonium and nitrate concentrations
at the outlets of first- and second-stage filters during the feeding periods. It can be observed
that ammonium concentrations were relatively stable over both periods. However, the spring
values were around 10 mgN.L-1 higher than those monitored in autumn, indicating that
nitrification activity was better in autumn. The same observation was made on the trickling
filter as discussed above.

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FIGURE 3.2-6 :AVERAGE (BOLD BLACK LINES), MIN AND MAX DATA (THIN LINES) OF WEEKLY ONLINE MONITORING
OF NITRATES (TOP), AMMONIUM (MIDDLE) AND NITRATES + AMMONIUM CONCENTRATIONS (BOTTOM, IN BLUE
AND RED INK, RESPECTIVELY) AT THE OUTLETS OF FIRST-STAGE FILTER (LEFT) AND SECOND-STAGE FILTER (RIGHT)
DURING THE AUTUMN PERIOD

Unlike ammonium, nitrate concentrations were observed to vary significantly over each
of the monitoring periods (Figures 3.2-6 and 3.2-7). They increased rapidly over the first half
day of feeding at the outlet of the first filter, then decreased progressively within the following
2 days until they reached a concentration close to the level recorded before feeding. This
pattern of evolution was attributed to the succession of feeding and resting periods. During
each feeding period, a part of ammonia was retained within the filter by adsorption onto the
first filter media and organic matter. This stock of ammonia was then nitrified at least partly
during the following resting period, within the unsaturated oxic upper part of the first filter
where the conditions were favourable to nitrification (Molle, 2014). Subsequently, the next
feeding period induced a flush from the first filter of the nitrates thus produced during the
preceding resting period, explaining the peak of nitrates concentration observed over the first
half day at the outlet of the first filter (figure 3.2-6 and 3.2-7). After this peak, nitrates
133

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concentrations decreased progressively down to their initial level in the feed, respectively 20
mg/L with a strong variability in autumn (figure 3.2-6) and 5 mg/L with a very small variability
in spring (figure 3.2-7).

FIGURE 3.2-7 :AVERAGE (BOLD BLACK LINES), MIN AND MAX DATA (THIN LINES) OF WEEKLY ONLINE MONITORING
OF NITRATES (TOP), AMMONIUM (MIDDLE) AND NITRATES + AMMONIUM CONCENTRATIONS (BOTTOM, IN BLUE
AND RED INK, RESPECTIVELY) AT THE OUTLETS OF FIRST-STAGE FILTER (LEFT) AND SECOND-STAGE FILTER (RIGHT)
DURING THE SPRING PERIOD

Regarding the contributions of the second-stage filter, figures 3.2-6 and 3.2-7 showed
that ammonium concentrations were divided by 2 to 4 between the outlet of first filter and
that of the second filter. Ammonium concentrations at the second filter outlet were stable and
low to very low, especially in spring. In addition, the recorded data showed a relatively small
variability. The second- filter was therefore shown to provide a strong and reliable polishing
contribution to the nitrification efficiency of the system. The patterns of evolution of nitrates
concentrations at the second filter outlet were similar in autumn and in spring, both

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qualitatively and quantitatively. Nitrates concentrations increased slowly over the first 0.5 to 1
day up to 30-40 mg/L, remained relatively constant for 0.5 to 1 day, then decreased down to a
level close to initial concentrations recorded before feeding, i.e. close to 20 mg/L regardless of
the season. Quantitatively, the spring period seems to be slightly more favourable to
denitrification than the autumn period (respectively 4.2 and 0.5 [Link]-1). However,
whatever the season, the denitrification part of the second stage remains low compared to the
rest of the treatment line and the outlet second stage nitrate pattern observed during the
feeding phase is the result of what comes out of the first stage.

Bottom Figures 3.2-6 and 3.2-7 show the nitrogen distribution at the outlet of the two
filtration stages. Once the nitrate peak has passed, it is interesting to note that the profiles of
the two seasons are quite similar with regard to the general dynamics and the value of total
dissolved nitrogen towards which they tend (about 25 mgN.l-1) almost entirely in the form of
nitrate. While the second stage does not significantly lower the total nitrogen value and seems
limited in achieving denitrification, it does play a role in securing the nitrification of the system.

Figure 3.2-8 shows the ORP profile monitored at a depth of 5 cm of the saturated zones
of the first and second filters over the successive feed and rest phases in the spring period. In
the first filter, sharp increases were observed during the feeding periods, followed by sharp
drops when feeding was stopped. This observation was attributed to the fact that during the
feeding period the saturated area is constantly renewed by well aerated water from the oxygen
transfer in the upper part unsaturated of the filter and the trickling filter. When feeding was
stopped, oxygen was rapidly consumed within the saturated part of the first filter through
microbial oxidation processes of organic substrates and ammonia (nitrification). Consequently,
the oxygen and the ORP drop quickly after the resting period starts. ORP values ranged between
-300 mV during the resting periods to 0 mV during the feed periods. The conditions in the
saturated zone of the first filter were therefore favourable to denitrification (Tanner et al, 2002)

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FIGURE 3.2-8 : ONLINE MONITORING OF ORP WITHIN THE SATURATED ZONE (DEPTH 5 CM) OF FIRST-STAGE FILTER
(TOP) AND SECOND-STAGE FILTER (BOTTOM) FOR AUTUMN (SOLID BROWN) AND SPRING (DASHED GREEN)
SESSIONS DURING THE SUCCESSIVE FEED (WHITE BACKGROUND AND REST (GREY BACKGROUND) PHASES IN THE
SPRING PERIOD. DATA ARE EXPRESSED WITH THE HYDROGEN STANDARD ELECTRODE CORRECTION.

The ORP profile observed at the second filter outlet was much more erratic than in the
first filter. The feed influent received by the second filter was much less oxic and stable than
that of the first filter. The effects of the feed on the ORP were therefore lower and more
variable within the second filter, probably explaining the more erratic profile. ORP values
ranged between 0 and + 400 mv during the feeding periods.

[Link] R EMOVAL LOAD RATES

By plotting the applied and treated daily mass load expressed per unit area, figure 3.2-
9 provides complementary information to the sole contribution based on the concentrations
as it informs on the actual removal potential of the treatment stages. The colours point of figure
3.2-9 representing the first stage and the second stage, respectively in dark green and yellow,
compares the removal behaviour of the two steps according to the pollutants of interest (COD,
TKN, NH4+ and NO3-). Based on the equations of linear regression, the COD performances of
the first stage are moderately higher than the second stage (coefficient: 0,71 against 0,5).

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FIGURE 3.2-9 : APPLIED LOAD VS TREATED DAILY LOAD FOR COD, TKN, NH4 AND NO3. FIRST AND SECOND STAGES
ARE REPRESENTED BY COLOUR POINT, RESPECTIVELY GREEN AND YELLOW. CONFIDENCE INTERVAL OF LINEAR
REGRESSION ARE SHOWN BY THE GREY AREA AND SET TO 0.95.

For nitrogen, there is on one hand the high NTK and NH4+ removal rates and low data
variability highlighting the well oxidizing-conditions of the unsaturated on both stages where
nitrification is homogeneously performed. On the other hand, despite correct nitrates removal
rates on the first stage, the very high variability on both stages suggests that denitrification is
not well managed. The variability of nitrate removal data is also a consequence of grab sampling
and therefore reflects the evolution of nitrogen processing during a feeding period. Moreover,
the denitrification in the second stage remains limited in spite of the saturated area. Indeed,
the denitrification is dependant of several conditions as the ORP, the retention time, the
temperature, the pH, the availability of organic carbon (Lee et al., 2009, Kadlec and Wallace,
2009). In this study temperature, ORP and pH is maintained relatively constant. Moreover,
retention time did not change during the whole experiment, so the availability of organic
carbon seems to be the dominant factor controlling denitrification.

[Link] C/N RATIO

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Figure 3.2-10 represents the correlation between carbon / nitrates (calculated as the
input nitrates added to the nitrified ammonium on the stage) ratio. A theorical ratio of 3.02 g
of COD to denitrify 1 g of nitrate (Kadlec and Wallace, 2009) must be satisfied to achieved great
total nitrogen removal. This ratio is barely reached in the system, especially for the second
stage of treatment were the values remain around 1.2 and leads to lower denitrification
performances. Moreover, this ratio shows an important variability in the system and indicates
that carbon availability is not the only factor involved with denitrification performances.

FIGURE 3.2-10 :CARBON/NITRATES RATIO AND DENITRIFICATION PERFORMANCES ONE THE FIRST (GREEN DOTS)
AND SECOND (YELLOW DOTS) STAGES OF FILTRATION.

Theoretically, a carbon input on the second stage could have a positive effect on
denitrification as it is presented in the figure 3.2-11. Although the raw wastewater
carbon/nitrogen ratio of this study is lower than usually reported in the literature (BOD5/TKN =
4.2 and COD/TKN = 9.7: Paing and Voisin, 2005) and therefore not as favourable as it could be,
the step feeding solution seems to be suitable to improve the second stage performances and
has never been tested on this system. A step-feeding strategy has already been pointed out in
many studies to overcome the carbon deficiency (Nivala et al., 2019; Wang et al., 2020; Al-
Wahaibi et al., 2021) where the by-passed volume ranged between 10 to 30%.

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FIGURE 3.2-11 :SCHEMATIC REPRESENTATION OF THE BEHAVIOUR OF DISSOLVED NITROGEN ON THIS PILOT

3.2.4 CONCLUSION

The presence of the TF allows the treatment of 40 to 50% of the carbon load and, under
good operating conditions, initiates the ammoniacal oxidation. Under these conditions, the
implementation of a saturated area in the first stage of filtration allows 61% removal of total
nitrogen. A single-stage AZOE version is then possible and provides good purification
performances on carbon and Kjeldahl nitrogen, while reducing the land area as it was already
demonstrated (Maciejewski et al., 2021). However, the presence of a second stage is an
advantage for several reasons:

• It contributes to the polishing of the wastewater treatment for Carbon and TKN;
• It helps to compensate the TF and/or the first stage of filtration variation of
performances due to input organic load fluctuation, and provides a safety function on
the treatment;
• Its denitrification potential could be greatly increased by the supply of organic carbon.

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This study provides a detailed view of the behaviour of carbon and nitrogen in a
unsaturated/saturated vertical flow constructed wetland associated with a TF. The main
findings are as follows:

• The TF allows the removal of half the carbon load, and significantly initiates nitrification
when in correct operational conditions;
• The operation of the first stage in terms of nitrification is dependent on the input
organic load and is initiated when the organic load is primarily consumed;
• Most of the denitrification takes place in the saturated zone of the first filter stage;
• The second stage of filtration plays an even more important role when TF removal
performances are variable;
• The second stage of filtration could be optional, and the AZOE system would perform
as a TF associated with a single stage of filtration with low or none saturated area. In
that case, it should be designed without TN removal target or eventually easy to reach.
• To achieve more stringent total nitrogen discharge levels, dosed additions of carbon
in the second stage appear to be a viable solution

CREDIT AUTHORS STATEMENT

Kevin Maciejewski: Conceptualization, Methodology, Data Curation, Writing – Original Draft.
Mathieu Gautier: Conceptualization, Methodology, Writing – Review & Editing, Supervision.
Boram Kim: Conceptualization, Methodology, Data Curation, Writing – Review & Editing.
Philippe Michel: Writing – Review & Editing. Pascal Molle: Conceptualization, Writing – Review
& Editing, Supervision. Rémy Gourdon: Conceptualization, Writing – Review & Editing,
Supervision

ACKNOWLEDGEMENTS
The authors are grateful to the INRAE for providing access to the Feyssine facilities, metrology
equipement and technical assistance. This work was realized within the Graduate School
H2O’Lyon (ANR-17-EURE-0018) and the Université de Lyon (UdL), as part of the programme
"Investissements d'Avenir " of the French national agency for research (Agence Nationale de la
Recherche, ANR). The authors would like to thank the SCIRPE Company and CIFRE (Conventions
Industrielles de Formation par la REcherche) for funding this research project.

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3.3 ETUDE DE LA DYNAMIQUE DU SYSTEME AZOE® PAR TRAÇAGE
HYDRAULIQUE ET ISOTOPIQUE

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PILOT-SCALE INVESTIGATION OF THE FATE OF AMMONIUM IN VERTICAL-FLOW TREATMENT WETLAND USING 15N/14N
ISOTOPE RATIO MONITORING

K. Maciejewskia,b, M. Gautiera, X. Saupinc, E. Bonjourc, A. Anchisic, B, Kima, P. Michelb, P. Molled,

P. Jamec, R. Gourdona

aUniv Lyon, INSA Lyon, DEEP, EA7429, 69621 Villeurbanne, France

bSCIRPE, Sainte Foy-Lès-Lyon, France,
cUniv Lyon, CNRS, UCBL 1, ISA, UMR 5280, 5 rue de la Doua, 69100 Villeurbanne, France
dINRAE, UR REVERSAAL, 69625, Villeurbanne, France
Abstract :
Vertical flow wetlands are systems with efficient carbon and nitrogen removal performance.
These systems have their own dynamics with feeding and resting periods that have an impact
on the treatment. In order to achieve an improved nitrogen treatment, the behaviour of the
system during the feeding phases needs to be better predicted. This study proposes to combine
two tracing approaches, hydraulic and isotopic, to explore the adsorption, retention,
transformation and migration of nitrogen within a 6 pe pilot plant. Isotopic tracing was carried
out using 15N ammonium spiked at 4.6%. Isotopic abundance measurements on the total
nitrogen, ammonia and nitrate fractions were carried out throughout the feeding period at a
frequency of 2 hours. The main result is that nitrogen in both its ammonium and nitrate forms
has a residence time much higher than the hydraulic residence time highlighting the high
reactivity of nitrogen with the filter media. The isotope tracing method provides a complex and
robust monitoring of nitrogen over time.

Keywords: Treatment wetland, Hydraulic tracking, Isotope labelled monitoring, 15N stable
ammonium isotope, nitrogen behaviour
Highlights:

• A pilot scale vertical flow treatment wetland was investigated during a feeding scale
period of time;
• Fluorescence tracing was performed in order to assess the hydraulic behaviour;
• Stable isotopic tracing was developed to evaluate the specific behaviour of nitrogen;
• Comparison between tracing methods highlight the high reactivity of filter media with
nitrogen.
• Monitoring of biological transformations of nitrogen by isotopic approach

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The treatment of domestic wastewater in rural areas by treatment wetland (TW) has
considerably grown in the last recent years as it meets the treatment requirements for carbon,
nitrogen and phosphorus while being affordable in terms of installation and running costs for
small communities (Paing and Voisin, 2005, Molle, 2005). From a process point of view, there
are sub-groups of TWs that differ according to the direction of hydraulic flow, i.e. horizontal or
vertical (Vymazal, 2007), but also the number of filtration stages and their arrangement. In
France, the two-stage unsaturated vertical flow system is particularly popular with more than
5000 plants installed to date (Forquet, 2019). TWs are now entering an era of optimisation that
includes the treatment of total nitrogen by denitrification and the reduction surface catchment.

Based on the classic vertical flow treatment wetland (VFTW), more sophisticated
variants have been developed such as the use of forced aeration (Foladori et al., 2013), or the
AZOE process studied in the research which exploits the combination of a trickling filter (TF)
and VFTW (Kim et al., 2014). The use of a TF at the head of the filter guarantees good
oxygenation conditions for the degradation of carbon in an aerobic environment. The effluent
treated on the TF is then pumped onto the surface of the first filter stage where a surface
deposit layer is formed by retention of the particulate matter (Kania et al., 2019). Oxygenation
condition in the upper part of the filter also allows nitrification of ammonium to nitrate which
is then reduced within the anoxic water-saturated zone at the bottom of the filter. This system
has shown good removal performance on COD (95%), Kjeldahl nitrogen (86%), and up to 73%
of total nitrogen (Kim et al., 2014; Maciejewski et al., 2022a). However, total nitrogen removal
remains a challenge in VFTWs (Wu et al., 2014). Hydraulic dynamics is an important issue in.
Each filter stage is divided into 2 or 3 hydraulically independent cells, which are individually fed
with wastewater one after the other, usually over one week, while the other cells are resting.
Each cell therefore undergoes successive periods of feeding and resting. Resting plays a crucial
role in the ageing of the surface sludge deposits (Kania et al., 2019). Furthermore, the
wastewater is not fed continuously to a cell but using a succession of batches, which represents
a volume of wastewater rapidly spread on the surface of the filter. Previous studies have
already reported the use of fluorescent tracers selected to investigate the characteristics of the
hydraulic flow in such systems. (Hadley and Kadlec, 2007; Giraldi et al., 2009).

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Combined information on (i) the patterns of hydraulic flows through the filter media
and (ii) and the biotransformation of organic and inorganic forms of nitrogen are key issues to
optimise nitrogen treatment. The evolutions of 15N / 14N isotopic ratio within each pool of N
species also provides a powerful insight to the dynamics of nitrogen in the system. This
approach has already been used to investigate the fate of nitrogen and other nutrients, in
natural environments (Tobias et al., 2001; Pistocchi et al., 2017) and even more specifically in
treatment wetlands (Morse and Bernardt (2000); Reinhardt et al., 2006).

A first approach of the isotopic investigations is to record small variations in the natural
isotopic distribution of the selected elements, related to biological or chemical
transformations. This phenomenon, known as Isotopic fractionation, is due to the chemical
species bearing the heavy isotope which are transformed more slowly than those bearing the
light isotope. The proportion of heavy isotope is thereby increased in the initial substrate
whereas it decreases in the product of transformation (Sebilot, 2003). This principle has already
been applied to investigate denitrification in Treatment Wetlands by following the increase of
15N / 14N ratio in nitrates. (Lund et al., 2000). The authors pointed out the difficulty of applying
this technique in a non-natural environment because the diversity of transformations makes
interpretation more complex. A second approach is to use a stable isotope as a tracer. The
principle is to spike a solution containing initially a substrate at a natural isotopic distribution
with a substrate bearing only one of the isotopes. This modifies drastically the isotopic ratio of
the substrate in the considered solution. (Jahangir et al., 2020). When using the spiked solution
as a tracer in a treatment system the effect of isotopic fractionation on the evolution of the
isotopic ratio during the migration of the tracer in the system then becomes negligible as
compared to the effect of dispersion of the spiked solution within the solution at the natural
isotopic ratio. In this study, stable isotope 15N was used as a tracer in the form of 15N-NH3. The
natural abundance of 15N relative to 14N is 0.36%. The objective of the study was to monitor the
transfer of nitrogen through a pilot-scale treatment chain and the transfer of 15N isotope from
spiked substrate 15N –NH3 to nitrates present initially at the natural ratio of 0.37%. In parallel,
the characteristics of hydraulic flow was determined by fluorescence tracing.

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[Link] P ILOT SCALE EQUIPMENT

Experiments were conducted at the Feyssine INRAE experimental facilities in Lyon, France. The
experimental hall is connected to the nearby municipal wastewater treatment plant and
receives real domestic wastewater. The pilot-scale equipment was installed in a greenhouse
equipped with a ventilation system within the experimental hall premises. The pilot setup is
illustrated in Figure 3.3-1. The system was constructed as a 6-person equivalent treatment line
according to the patented AZOE-N process setup designed by SCIRPE company. It combined a
succession of treatment stages consisting in an aerobic biological trickling filter (TF), and 2
vertical flow Treatment Wetland Filter stages (TWF) planted with reeds. The trickling filter (TF)
was filled with a polypropylene cross pack medium with a specific surface area of 150 m²/m3.
Treatment Wetlands Filters (TWF) were filled over a depth of 0.60m with granular filter media
disposed in layers from coarse grain size in the bottom (gravels) to fine grain size at the surface
(sand) as detailed in a previous paper (Kim et al., 2015). The first TWF stage was covered with
a 5-cm thick sludge layer sampled from a full-scale AZOE treatment wetland. Both TWF stages
were planted with Phragmites Australis at a density of 10 plants/m². Treatment wetlands filters
were saturated with water in their bottom parts on a depth of 0.30 and 0.35m in the first and
second stages respectively.

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FIGURE 3.3-1 :PILOT SCALE CHARACTERISTICS OF AN AZOE SYSTEM DESIGNED FOR 6 PERSONS EQUIVALENT
(MACIEJEWSKI ET AL., 2022B)

[Link] O PERATING CONDITIONS

Unlike the TF which was fed in a non-stop mode (except for maintenance), the TW filters
were operated in a sequential feed and rest mode to mimic the operation of full-scale units
where the TW filters are fed for one week and rested for two weeks. However, in order to
shorten the experimental phases in the pilot system, the sequence was designed on a weekly
basis by the alternation of 56 h of feeding followed by 112 hours resting.

Within each feeding period, the system was operated in a batch mode and the TW
stages were fed every 2 hours with batches of 60L. Inlet wastewater was firstly pumped into a
60 L reservoir placed below the TF. Meanwhile, a recirculation pump was used to inject the
feed wastewater from the tank through the TF in a closed loop mode at a flowrate of 0.5 L/min.
When the tank was filled to 60 L, the TF recirculation pump was stopped and the whole volume
of the tank was rapidly transferred as a batch to the surface of the first TWF stage at a high
flowrate close to 17 L/min. Due to the limited permeability of the top surface of the TW filters,
the 60 L batches formed a layer over the whole surface and then percolated in a uniform
manner through the filter medium. The outlet effluent from the first TW stage was collected

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into a reservoir. When a volume of 60L was collected, if was transferred as a batch to the top
surface of the second TW stage at a high flowrate close to 17 L/min. The batch volume
temporarily accumulated as a layer at the surface of the filter, then percolated in a uniform
manner through the filter medium.

[Link] A NALYTICAL METHODS

The system was monitored by analysing wastewater at successive points along the pilot line: (i)
inlet feed wastewater, (ii) TF outlet, (iii) first stage filter outlet, and (iv) system outlet. Online
VARION PLUS NH4 and VARION PLUS NO3 probes (WTW) were positioned at levels (iii) and (iv)
for continuous monitoring of ammonia and nitrate concentrations.

In addition to online monitoring, wastewater samples were regularly taken from the 4 sampling
points and analysed for Chemical Oxygen Demand (CODd), Total Suspended Solids (TSS),
ammonium (NH4+), nitrates (NO3-), nitrites (NO2-), Total Kjeldahl Nitrogen (TKN), Total Nitrogen
(TN). Total Organic Carbon (TOC). Most samples were refrigerated and stored at 4°C for a
maximum of 24h prior to be analysed. Samples for isotopic analyses were frozen because a
longer storage period was required to transport the samples to the analytical laboratory. All
chemical parameters were analysed following French standard methods (AFNOR, 2005).

[Link] H YDRAULIC TRACER METHODOLOGY

Hydraulic tracing was carried out on each of the TWF stages independently using AminoG
acid as a tracer. A mass of 1.2 and 1.8g of AminoG acid was diluted in 60 L and introduced into
the first and second filtration stages respectively in the form of a pulse during the first batch of
tracing. The pilot was operated in a conventional manner as described in the previous section.
In each assay, tracer concentration at the outlet of the considered filter was followed by online
monitoring by fluorescence probe. In parallel, outlet volumetric flow was measured over time
using a pressure sensor installed in a collection tank at the outlet of each filter stage. Tracer
monitoring was continued until when fluorescence values in the outflow was back to its natural
level (i.e. 28 and 36 hours for the first and second filter stages respectively). A calibration curve
is used to convert the signal intensity into a concentration. The mass is calculated from the
concentration and volumetric flow data.

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The tracer recovery was calculated using the equation (1):
𝑚
𝑇𝑟𝑒𝑐𝑜𝑣𝑒𝑟𝑦 (%) = 𝑚 𝑡𝑟𝑎𝑐𝑒𝑟 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 × 100 (1)
𝑡𝑟𝑎𝑐𝑒𝑟 𝑖𝑛𝑖𝑡𝑖𝑎𝑙

The nominal hydraulic residence time (HRTn) in both TWF stages were calculated using the
equation (2), where V was the volume of the saturated zone in each filter (m3), and Q the
volumetric flow (m3/day):

𝑉𝑠𝑎𝑡𝑢𝑟𝑎𝑡𝑒𝑑 𝑎𝑟𝑒𝑎 ∗𝑃𝑜𝑟𝑜𝑠𝑖𝑡𝑦

𝐻𝑅𝑇𝑛 = 𝑄

[Link] I SOTOPIC TRACER METHODOLOGY

Isotope tracing was carried out. A tracer batch volume was prepared by spiking a volume
of 60L of feed wastewater, taken at an initial total N concentration of 60 mg/L and a natural
isotopic abundance of 0.364% (see below) completed with a mass of 180 mg of Sigma Aldrich
15NH 15N. The resulting isotopic abundance of 15N in the tracer batch volume
4Cl enriched at 98%

was therefore determined at 4.6%15N. This tracer batch volume was used to feed the
experimental system previously described in substitution to a regular feed batch volume.

Prior to and following the injection of the spiked feed batch into the experimental system,
the system was fed every 2 hours by regular feed batches containing a natural isotopic
distribution of 0.364%. The proportion of 15N in the spiked batch volume was therefore
modified as the batch volume progressed along the treatment line. Two mechanisms induced
the observed evolution. The first mechanism was the dispersion of the 15N enriched batch
volume in the solution at natural isotopic distribution present in the system before and after
spiking. The dispersive flow would result in a decrease of the isotopic distribution. The second
mechanism determined was the isotopic fractionation resulting from the transformation of
ammonia into nitrates. The chemical species bearing the heavy isotope are transformed more
slowly than those bearing the light isotope (Sibillot, 2003). This phenomenon would increase
the proportion of 15N in the substrate (ammonia) and decrease it in the product (nitrates).
However, it was calculated using equation 3 that a transformation of ammonium would result
in a negligible change in 15N proportion in NH4+ compared to spiked value. This effect was
therefore considered negligible as compared to the dilution effects under our experimental
conditions. Equation 3 gives the variation of 15N/14N expressed in δ (‰) due to a specific

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enrichment factor ε (-21 ‰ for nitrification) in relation with the concentration of the substrate
(ammonium in this case) in the initial and final state.
𝐶
𝛿𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 = 𝛿𝑖𝑛𝑖𝑡𝑖𝑎𝑙 − 𝜀 ∗ ln( 𝐶𝑖𝑛𝑖𝑡𝑖𝑎𝑙 ) (3)
𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙

Conversion from isotopic abundance expressed from R (%) to δ (‰) is given by equation 4
where Rstandard is the international isotopic reference, the natural abundance of nitrogen in the
atmosphere.

(𝑅𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 − 𝑅𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟𝑑 )
δ𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 (‰) = × 1000 (4)
𝑅𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟𝑑

S AMPLES PREPARATION

Samples were defrosted and split into 3 fractions as illustrated in Figure 3.3-2. Fraction
1 was freeze-dried and the solid residues obtained were used to measure globally 14N/15N ratio
in all the forms of N present in the samples with no further treatment. Fractions 2 and 3 were
purified on 0.45µm filters, and the collected solutions were eluted through 1cm3 Dionex ion
exchange cartriges to separate anions from cations. The solution issued from fraction 2 was
eluted through a cationic cartridge (Dionex OnGuard II Na, 1 cc) used to retain cations and
subsequently analyse 14N/15N in NO3-. The solution recovered from fraction 3 was eluted on an
anionic cartridge (Dionex OnGuard II 1, 1 cc) used to retain anions and subsequently analyse
14N/15N in NH4+. The anionic and cationic solutions were freeze-dried to obtain solid residue
which were used for isotopic analyses. The anionic and cationic ion exchange cartridges were
tested and the efficiency of separation of nitrates from ammonium ions was found round 99%.

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FIGURE 3.3-2 :DIAGRAM OF THE SAMPLING PROTOCOL, SAMPLE PREPARATION ON ION EXCHANGE COLUMNS AND
ISOTOPE ANALYSIS DURING LABELLED AMMONIUM TRACING.

I SOTOPIC RATIO ANALYSIS

Analyses were performed on homogenized freeze-dried soil residues obtained as

indicated above. An amount of sample between 400 and 600 µg was weighed, with precision
on a microbalance, and placed in a tin capsule (5 x 9 mm). The isotopic value of each sample is
obtained by an Elemental Analyser (Thermo Scientific FLASH HT) coupled to an Isotopic Ratio
Mass Spectrometer (Thermo Scientific DELTA V) EA-IRMS. Sample drop in a unit combustion
maintained at 950°c in a flow of helium and oxygen followed by a copper reduced glass tube
hold at 650°c. The nitrogen of the sample is firstly oxidised in nitrogen oxides prior to be
converted into elemental gases (N2) on the copper before to be introduced into the isotope
ratio mass spectrometer. The determination of the isotopic composition (15N/14N) was done
using the signals collected on cup for mass 28 (14N14N), 29 (15N14N) and 30 (15N15N) of the IRMS.
Standard samples are measured every eight samples to check the lack of non-instrumental drift
and blank was analysed. Analytical results from isotopic analyses were obtained as R defined as
the mass % of 15N in the overall pool of N present in the samples. The uncertainty was evaluated
at +/- 0.02%, in absolute, for the 15N/14N (%) results.

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[Link] PHYSICAL - CHEMICAL MONITORING

P OLLUTANTS BEHAVIOUR ALONG TREATMENT LINE

The overall operation of the AZOE system has been described in previous full-scale (Kim
et al., 2014) and pilot-scale studies (Kim et al., 2015, Maciejewski et al., 2022b). The physico-
chemical results shown in figure 3 were collected during the week when the injection of the
60L-spiked tracer batch was done. The biological aerobic TF used as a first stage of treatment
allowed to degrade up to 40% the inlet organic load. TSS concentration was practically
unaffected by the TF, probably because the porosity of the bed was high enough to let most
suspended solids from the feed migrate through the TF. The suspended solids were however
almost quantitatively retained by filtration at the surface of the first TW stage as previously
reported (Kim et al., 2015; Kania et al., 2018). This resulted in a drastic drop of the average TSS
concentration from 263 mg/L at the inlet to 31 mg/L at the outlet of the first TWF stage.
Nitrification also occurred slightly in the TF as shown by the nitrates concentration of 3.5 mg/L
measured at the TF outlet whereas no nitrates were analysed at the input of the TF. The
predominance of organic carbon (275 mg/L) in the TF relative to ammonium concentrations
(57 mg/L) installed conditions which were thermodynamically much more in favour of the
oxidation of organic substrates regarding ammonia. The first TW stage contributed much more
significantly to nitrification and also denitrification and thereby reduced ammonia
concentrations close to 68 %. The second TWF stage acted as a polishing treatment stage for
nitrification and contributed to the reduction of the total nitrogen concentration from 35 to 20
mg/L. These results were similar to those recorded on the system in previous assays, indicating
that the experimental system was in a stable state, thereby validating the conditions for the
tracing investigations.

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FIGURE 3.3-3 : MEAN CONCENTRATION AT VARIOUS SAMPLING POINT ON THE PILOT WITH STANDARD DEVIATION
FROM PUNCTUAL SAMPLING DURING THE ISOTOPIC TRACKING

O NLINE MEASUREMENTS OF NITRATES AND AMMONIUM

Results of online monitoring of ammonium and nitrate concentrations using specific probes
installed at the outlet of the first and second stages are shown in Figure 3.3-4.

Ammonium concentrations at the outlet of the first filter stage decreased slightly from
25 to 18 mgN-NH4+/L over the first 36 h then increased progressively to ca. 20 mgN-NH4+/L.
Overall, it remained relatively constant around 20 mgN-NH4+/L over the 2 days of monitoring.
In contrast, the concentration of nitrates increased sharply from 0 to 34 mgN-NO3-/L over the
first 12 hours, remained around 34 mgN-NO3-/L for 3-4 hours, and then decreased regularly
down to below 10 mgN-NO3-/L from hour 16 to 48. This observation was typical of the dynamics
of nitrogen in the system as reported in other studies (Morvannou et al., 2013). During the
feeding period, ammonium ions coming from the feed wastewater were partly retained by
adsorption onto the fine granular medium of the upper and unsaturated part of the filter.
During the following resting period, nitrifying bacteria oxidized sorbed ammonia into nitrates
using O2 gas available in the porosity of the upper part of the filter. Then when the next feeding
period was started, nitrates were leached to the bottom of the filter, resulting in the sharp
increase of concentration observed in the first 12 hours of feeding. Denitrification occurred in
the saturated lower part of the filter during the entire feeding period, allowing the reduction
of the nitrate concentration.

Ammonia and nitrates concentrations profiles recorded at the outlet of the second TW
stage were relatively similar, but more attenuated regarding those observed in the first filter

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stage. Ammonia concentration was found to increase very progressively from a few mgN-
NH4+/L to close to 10 mgN-NH4+/L in a period of 30h. Then it remained relatively constant below
10 mgN-NH4+/L Nitrates concentration fluctuated in the same range on concentrations as in
the first filter stage (0-30 mgN-NH4+/L) but more smoothly. The leaching of nitrates produced
during the preceding resting period from the oxidation of ammonia accumulated during the
preceding feeding period was recorded over 28 h in the second filter stage against 12 h in the
first filter stage.

In both filter stages however, very low and even decreasing nitrates concentrations
were recorded in the first 5 to 8 hours of feeding. This observation was attributed to the
denitrification that occurred in the anoxic, bottom parts of the TW during the preceding resting
period. As indicated in the materials and methods section, the resting periods were set to last
twice as long as the feeding periods (112 h and 56 h respectively) allowing denitrification to be
achieved almost completely.

FIGURE 3.3-4 :AMMONIUM AND NITRATES MEASUREMENTS DURING THE FEEDING PERIOD OF THE ISOTOPIC
TRACKING AT THE OUTLET OF THE FIRST STAGE (ABOVE) AND SECOND STAGE (BELOW). VERTICAL DASHED LINES
SHOW THE BATCH FEEDING DYNAMIC EVERY TWO HOURS.

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Both TW stages were composed of an upper unsaturated zone with free vertical flow
and low hydraulic residence time, and a lower saturated zone with higher hydraulic residence
time where dispersion occurred via diffusion and convection through the porous medium. The
average hydraulic residences times HRT in the saturated parts were calculated for both TWF
stages considering the respective depth of water saturation in each filter and a porosity of 0.35
in the saturated zone of the first filter stage composed of gravels and 0.40 in the saturated zone
of the second filter stage composed of sand. Estimated HRT were 7 hours for the first filter
stage and 9.3 hours for the second filter stage where the saturated zone is deeper (0.35 m) that
in the first filter (0.3 m).

Results of hydraulic tracing are shown in Figure 3.3-4 for the first and second TW stages
respectively. It can be observed that in the first filter stage, about 20% of the mass of the tracer
was collected within 3.5 h corresponding to ½ of the hydraulic residence time in the saturated
zone. This indicated the presence of preferential flows through the filter. About 60% of the
tracer was collected within one hydraulic residence time (7 h). It took about 2 HRT (14h) to
collect 90% of the tracer and 3 HRT to collect 95%, indicating that the hydraulic flow within the
first filter was poorly dispersive. In the second filter stage made of finer porous medium, almost
no tracer was collected until 6 hours, i.e. more than ½ HRT, and only about 10% of the tracer
was collected in 1 HRT (9.3 h). These results indicated very little preferential flow path. About
75% of the tracer was collected within 2 HRT and more than 95% in 3 HRT, revealing poorly
dispersive conditions.

The time required to recover 50% of the tracer is more than twice as long as that of the
first stage with 13 hours. The measured tracer concentration peaks at the first batch on the
first stage and then decreases steadily, while the curve for the second stage is bell-shaped and
peaks at 12 hours after the start of tracing. A gamma function with simultaneous adjustment
of tracer N and t by minimisation of the error function (Kadlec and Wallace, 2009) was used in
both steps to calculate the mean residence time and effective volume. The mean residence
time are 6.2 and 13.41 respectively for the first and second stage, while the effective volumes
are 68 and 97%. It is likely that the difference of nature of filtering sediments within both stages
is responsible for observed flow differences in particular because the capillarity of the sand in
the unsaturated zone of the latter significantly increases the volume of water contained. The
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time required for the restitution of 90% of the tracer is 24 hours in the second stage, i.e. almost
double that of the first stage.

FIGURE 3.3-5 :AMINOG ACID TRACKING RECOVERY (LEFT) AND CONCENTRATION MEASUREMENTS (RIGHT) OF
PARTIALLY SATURATED FIRST AND SECOND FILTRATION STAGES IN A VERTICAL FLOW TREATMENT WETLAND AT
PILOT SCALE.

[Link] I SOTOPIC TRACKING

T OTAL LABELLED NITROGEN DISTRIBUTION DURING THE FEEDING PERIOD

Figure 3.3-6 shows the evolutions of the isotopic distribution 15N/14N in the total pool
of nitrogen (all forms included) measured along the treatment line and after the introduction
of a 60L batch volume of feed wastewater spiked with 15N-ammonia at an initial isotopic ratio
of 4.6%. All the 15N/14N values recorded were above 0.364%, which is the natural abundance of

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15N found in the environment. Figure 3.3-6 therefore shows how the 15N-ammonia, spiked at
4.6 % in the feed batch, was progressively diluted in the system with the medium containing N
at the natural abundance of 0.364% as the feed batch volume progressed in time along the
treatment line.

FIGURE 3.3-6 :ISOTOPIC MEASUREMENT OF 15N ABUNDANCE ON THE TOTAL NITROGEN AT THE TF, FIRST STAGE
AND SECOND STAGE OUTLET VERSUS TIME AFTER THE SYSTEM HAS BEEN FED WITH THE ZERO LABELLED BATCH.

The highest value was measured at 1.37% at the outlet of the TF after the initial batch
enriched in 15N/14N at 4.6% was treated. Without any dilution of the labelled nitrogen from the
first batch by naturally abundant nitrogen, the TF output value should have been identical to
the input value, i.e. 4.6%, as the isotopic fractionation due to nitrification in the TF is considered
negligible (see materials and methods). The difference in 15N/14N between the inlet and outlet
of the initial batch on the TF was explained by the dilution of the labelled nitrogen by natural
nitrogen already present in the TF in the form of detached biomass. The 15N/14N ratio measured
at the TF outlet then decreased to 0.54% at the second batch indicating the retention of 15N
species in the TF while all the wastewater volume of the first batch was theoretically pumped
out to the first stage. By the third batch however, after about 6 hours of treatment, the
presence of labelled nitrogen was no longer detected since the ratio was close to the natural
value. Nitrogen was therefore very poorly retained within the TF what is expected given the
operation of the TF. 15N above the natural ratio was detected at the outlet of the first stage at
6 hours, corresponding to the third batch. It reached a maximum around 0.6 % at 10 h and then
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gradually decreased by dilution with natural N in the following feed batches. 15N/14N ratio
remained however above the natural ratio over more than 40h, despite the dilution with
several successive feed batch volumes. The detection of 15N takes longer than that of
fluorescence, clearly showed that nitrogen was therefore significantly retained within the first
filter stage, probably by sorption as compared with the non-interactive hydraulic tracer
discussed above.

D ISSOLVED NITROGEN FORMS DISTRIBUTION

Figure 3.3-7 shows the evolutions of the isotopic distribution 15N/14N in the pool of
nitrogen obtained after filtration (corresponding mostly to ammonium and nitrates). It was
measured along the treatment line after the introduction of a 60L batch volume of feed
wastewater spiked with 15N-ammonia at an initial isotopic ratio of 4.6%.

The profiles of 15N/14N ratios evolutions measured at the TF outlet were similar for NH4+
and NO3- over the entire feeding period. Spiked ammonia was partly nitrified in the TF. Since
the initial isotopic ratio was very high in the feed batch, the effect of isotopic fractionation by
the process of nitrification was negligible. Nitrates were therefore produced at an isotopic ratio
very close to the ratio of the substrate ammonia, which explained the similarities of the 2
curves, and also validated the robustness of the methodology developed here.

The peak of the labelled ammonium is reached after 6 hours at the outlet of the first
stage with a value of 0.562% for the 15N/14N ratio. Once this peak is reached the 15N/14N value
of ammonium gradually decreases. This is caused by the labelled ammonium retained on the
first stage and diluted by natural ammonium from the system and from the new batches
without addition of tracer. At the outlet of the second stage the 15N abundance is
corresponding to the natural value (0.36 %) for 30 hours after the beginning of the tracing and
increases slightly after 30 hours to reach 0.4 % at 40 hours. The low concentration of
ammonium in the treated water made the method difficult to implement because very little
nitrogen was detected after purification of the nitrates on ion exchange columns. The nitrate-
specific 15N/14N curve highlights the creation of nitrates on the TF and first stage and their
migration through the system. The presence of nitrates at the outlet of the first stage
throughout the feeding period is the consequence of the nitrification of the labelled ammonium
retained in the unsaturated zone as already described in the physico-chemical monitoring of

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this study. This tracing underlines the specific dynamics of ammonium treatment in VFTW and
in particular the adsorption role of the filtering mass. The value of the first batch at the outlet
of the second stage is however difficult to explain because the tracer could not propagate so
quickly in the system. In fact, this point may be the consequence of a handling error and should
not be subject to an interpretation.

FIGURE 3.3-7 :: ISOTOPIC MEASUREMENT OF 15N/14N IN AMMONIUM AND NITRATES AT THE TF, FIRST STAGE AND
SECOND STAGE OUTLET VERSUS TIME AFTER THE SYSTEM HAS BEEN FED WITH THE ZERO LABELLED BATCH
ISOTOPIC RATIOS.

I SOTOPIC MEASUREMENT IN SLUDGE DEPOSIT

Surface sludge deposits were sampled from the sludge layer of the first stage between
each batch, and analysed for 15N / 14N isotopic ratio, to assess if any change appears over the
duration of the assays. Results were found to be almost constant with a mean value of 0.376%

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and a standard deviation of +/- 0.002%. This level was very close to the natural distribution,
indicating no enrichment of the sludge was observed.

[Link] G ENERAL DISCUSSION

The feasibility of the isotope tracing method by adding labelled ammonium into a
complex system was demonstrated in this study. In parallel, the realisation of a fluorescence
tracing allows to extract and interpret the behaviour of nitrogen in the context of hydraulic
dynamics. With regard to hydraulic dynamics, the two filtration stages behave in their own way,
with an average residence time that is more than twice as long in the second stage than in the
first stage (13 hours versus 6.2 hours respectively). The nature of the materials making up these
two stages is notably at the origin of these distinct behaviours. Indeed, the saturation volume
of the second stage is probably underestimated because the unsaturated part composed of
sand probably retains a large proportion of water, which has the effect of increasing the
saturation volume. By means of these two methods, it was shown that the residence time of
nitrogen is higher than the hydraulic residence time due to the retention of nitrogen on the
filter by adsorption on the filter materials. The behaviour of labelled ammonium on the first
stage is remarkable as it clearly shows its transfer from the TF to the first stage, its long
retention and its dilution by the input of nitrogen of natural isotopic abundance via the input
of new batches. Meanwhile, the presence of marked nitrates at the outlet of the first stage
throughout the feeding period is the consequence of the retention/nitrification of the marked
ammonium on the first stage. This selected method can be adapted to monitor other natural
or wastewater treatment systems and a real scale.

3.3.4 CONCLUSION

The joint use of hydraulic tracing by fluorescence and isotopic tracing by ammonium
15N enriched to 4.6% makes it possible to trace the fate of a particular nutrient with regard to
the hydraulic dynamics of the system studied. The overall behaviour of nitrogen appears to be
linked to the hydraulic behaviour. However, the longer residence time of the nitrogen in the
system clearly highlights the interaction of the nutrients with the system studied and in
particular with the filter packing. It was shown that ammonium is retained more than 10 hours

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in the TW than hydraulic retention time. Isotope tracing via 15N/14N monitoring of ammonium
and nitrate allows the notion of nitrogen transformation to be addressed. Finally, the isotope
tracing method used appears to be robust and could be applied to other natural or anthropized
systems.

CREDIT AUTHORS STATEMENT

Kevin Maciejewski: Conceptualization, Methodology, Data Curation, Writing – Original Draft.
Mathieu Gautier: Conceptualization, Methodology, Writing – Review & Editing, Supervision.
Xavier Saupin: Methodology, Writing – Review & Editing. Erik Bonjour: Methodology, Writing –
Review & Editing. Anthony Anchisi: Methodology, Writing – Review & Editing. Boram Kim:
Conceptualization, Methodology. Philippe Michel: Writing – Review & Editing. Pascal Molle:
Conceptualization, Writing – Review & Editing, Supervision. Patrick Jame: Conceptualization,
Writing – Review & Editing, Supervision. Rémy Gourdon: Conceptualization, Writing – Review
& Editing, Supervision

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Ces deux articles précédents ont en commun de suivre le procédé AZOE® complet à l’échelle
pilote.

Une première approche a été de suivre le comportement du système au cours de

successions de semaines de fonctionnement et de repos au cours de deux saisons différentes :
automne et printemps. Les différences observées entre les deux saisons sont notamment dues
à la qualité de l’effluent d’entrée. Au printemps, l’effluent est plus concentré et la charge
organique entrante est supérieure à celle de l’automne.

De manière globale le fonctionnement du pilote rejoint celui du procédé à l’échelle

réelle en termes de performances globales entrée/sortie sur la DCO et les paramètres AZOE.
Toutefois, les essais pilotes permettent de procédé à un échantillonnage en sortie du lit
bactérien. L’un des enseignements majeurs est que le lit bactérien dégrade prioritairement la
charge carbonée par rapport à la charge ammoniacale.

Les données continues de nitrates et d’ammonium révèle très clairement un

comportement propre au système avec un pic de nitrates important 10 heures après la remise
en route de l’alimentation. Ce pic est attribué à un lessivage des nitrates provenant de la
nitrification de l’ammonium piégé lors de la phase de repos.

Malgré la présence de nitrates sur le second étage, la dénitrification ne dépasse pas

10% et pourrait être améliorée par l’ajout de carbone organique.

La seconde approche a été de mettre en place un suivi isotopique via l’utilisation d’une
première bâchée d’ammonium marqué. Ce protocole met en évidence le devenir
(transformation et migration) d’un lot initial d’azote à travers le système. Le principal résultat
est le temps de résidence très long de l’ammonium sur le premier étage (48 heures) soulignant
son interaction forte entre le media filtrant.

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Sur la base des conclusions de la première partie du manuscrit visant à approfondir les
connaissances du systèmes AZOE-N, Les deux prochaines sections ont pour objectif d’explorer
les possibilités et la faisabilité d’améliorer l’épuration de l’azote. A ce titre la dénitrification au
sein du second étage de filtration est au cœur de la problématique de cette partie. Il est
notamment question de déterminer la meilleure manière de palier aux carences en carbone
organique sur cette ultime étape du traitement recevant des effluents riches en nitrates mais
appauvris en carbone organique par les étapes de traitement précédentes.

“Influence of organic carbon addition by step feeding in a vertical flow treatment wetland on
removal performance, microbiology and nitrogen end product by denitrification”

Dans un premier temps, la possibilité d’utiliser les effluents d’entrée de station comme
source de carbone organique a été testée à l’échelle pilote. Cette stratégie, appelée « step-
feeding » repose sur le principe de considérer les effluents d’entrée comme une source illimité
de carbone afin de rétablir le rapport carbone/azote sur le second étage à un seuil acceptable
pour la dénitrification. Cet article a été réalisé en collaboration avec l’UMR 5557 Ecologie
Microbienne de Lyon afin de caractériser le potentiel de nitrification et de dénitrification à
différents horizons des étages de filtrations.

« Faisabilité d’apport de carbone organique par biodéchets valorisables »

Dans un second temps, la possibilité de valoriser des déchets organiques riches en

carbone a été envisagée. Ces matériaux « biosourcés » auraient pour finalité d’enrichir les
effluents du second étage de traitement. Ce chapitre vise à définir à l’échelle laboratoire quels
seraient les matériaux biosourcés au plus fort potentiel d’optimisation de la dénitrification. Le
choix des matériaux, leur potentiel au regard du relargage en carbone organique total et en
azote, et la faisabilité de la solution sont discutés.

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3.4 ETUDE DE L’ACTIVITE DE NITRIFICATION ET DE DENITRIFICATION AU REGARD
D’UNE OPTIMISATION DU SYSTEME PAR AJOUT DE CARBONE PAR DERIVATION
D’EFFLUENT BRUTE

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INFLUENCE OF ORGANIC CARBON ADDITION BY STEP FEEDING IN A VERTICAL FLOW TREATMENT
WETLAND ON REMOVAL PERFORMANCE, MICROBIOLOGY AND NITROGEN END PRODUCT BY
DENITRIFICATION
K. Maciejewskia,b, M. Gautiera, A. Cantareld, J. Gervaixd, B. Kima, P. Michelb, P. Mollec, A.
Richaumed, R. Gourdona
a
Univ Lyon, INSA Lyon, DEEP, EA7429, 69621 Villeurbanne, France
b
SCIRPE, Society of Design and Production Engineering for Wastewater Purification, 5 Allée Alban Vistel,
69110 Sainte Foy Lès Lyon, France
c
Institut national de rechercher pour l’agriculture et l’environnement (Inrae) - UE Reversaal,
Villeurbanne, France
d
CNRS, UMR 5557, Microbial Ecology Centre, Université Lyon 1, Villeurbanne, France

Abstract

A pilot-scale wastewater treatment system composed of an aerobic trickling filter (TF)

associated with a vertical flow treatment wetland (VFTW) was used to investigate global
nitrogen treatment from real domestic wastewater in the objective to define operational
conditions to improve denitrification under conditions of limited organic carbon availability.
The pilot system was operated under conventional and modified conditions and nitrogen
removal rates compared. The modified conditions, classically referred to as “step feeding”,
consisted in diverting a fraction of the inlet wastewater flow to bypass the TF and feed the
anoxic zones of the VFTW. The compartment receiving the diverted feed flow was rich in
nitrates but poor in organic carbon. On line analyses were performed to monitor the treatment
under the different operating conditions. Wastewater samples were also regularly taken every
5 cm from the top surface to the bottom of the 80cm-deep VFTW porous medium. They were
analyzed for several physico-chemical parameters and treated to measure the microbial
potentials of nitrification and denitrification to N2O or N2. Results showed that the step-feeding
does not significantly improve total nitrogen removal rates but has a strong effect on the
denitrification enzyme activities. The highest microbial potentials were analyzed within the
porous medium close to the interface between the saturated and unsaturated zones. Potential
N2O emissions were found higher in the upper zone of the stage as compared to the saturated
lower zone.

Keywords

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Treatment wetland; nitrogen removal; N2O emission; step-feeding; denitrification potential

Highlights

• Nitrification and denitrification potentials were measured along the depth of treatment
wetlands
• The highest nitrification and denitrification potentials were found around the top of the
saturated zone
• Denitrification was not enhanced by spiking the stage medium with inlet wastewater
• N2/N2O was studied in a global warming context
• By-passed CODd/TN ratio is a predominant factor in step-feeding management

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The removal of organic and inorganic forms of nitrogen from domestic wastewaters is
necessary with respect to environmental protection issues and in the perspective of re-using
the treated water in several applications. The approach remains however a technological
challenge due to the many possible states of oxidation of nitrogen and the numerous microbial
processes involved in its treatment. Nitrogen occurs in domestic wastewaters both in the
suspended solids under organic forms and in the aqueous solution under organic and inorganic
forms. The most reduced inorganic form, ammonia (NH3), is hydrosoluble and ecotoxic to many
hydrosystems. The most oxidized form, nitrate (NO3-) is also very hydrosoluble and contributes
to eutrophication when released into natural hydrosystems. Under reductive conditions,
gaseous species may also be formed such as nitrous oxide N2O(g) which exhibits a high global
warming potential (Forster et al., 2007, IPCC 2001; Martínez-Espinosa et al., 2020). Finally, the
redox neutral inorganic form N2(g) is the most environmentally friendly form of nitrogen since
this inert gas is largely predominant in the Earth atmosphere. The strategies developed for
nitrogen treatment therefore aim at converting as much as possible nitrogen into N2(g).

The most classical pattern followed to implement this strategy in domestic wastewater
treatments consists in the oxidation of ammonia (NH4+) and organic forms into nitrate, followed
by the reduction of nitrate into N2. The first step, called nitrification, occurs under aerobic
conditions following two successive reactions (Holmes et al., 2019). The first reaction, called
nitritation, is the oxidation of ammonium into nitrite by autotrophic bacteria (AOB: Ammonium
Oxydizing Bacteria) and archaea (AOA: Ammonium Oxydizing Archea). The second reaction,
called nitration, is the oxidation of nitrite into nitrate by Nitrites Oxydizing Bacteria (NOB) (Levy-
Booth et al., 2014; Cáceres et al., 2017). Total denitrification to N2(g) is the result of a
succession of reductions catalysed by 7 main enzymes (Jones et al., 2008). The complete
reduction sequence requires the cooperation of bacteria and archaea of great diversity (Holmes
et al., 2019). Denitrifying microorganisms oxidize available carbon sources to reduce nitrates as
a final electrons acceptor. It is considered that a molar COD/N ratio around 3 is needed in
practice to allow complete denitrification (Kadlec and Wallace, 2009). The environmental
factors known to favour denitrification are anaerobic conditions, organic carbon availability and
mesophilic temperature (Lee et al., 2009). Most denitrifiers do not possess however all the
enzymes required for the complete reduction of nitrate to N2. Incomplete denitrification may

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therefore be observed with the release of gaseous N2O(g) (Philippot et al., 2011, Hallin et al.,
2018). This is especially true since, within wetlands, the C:N ratio and temperature seem to be
the dominant factors in N2O emission (Søvik and Kløve, 2007; Maucieri et al., 2017). In contrast,
system configuration has little effect on N2O production (Teiter and Mander, 2005).

Treatment wetlands have proven their efficiency to treat carbon, nitrogen and phosphorus in
domestic wastewaters from rural communities of less than 4000 population-equivalent,
combined with other advantages such as low maintenance costs and good landscape
integration (Molle, 2005; Paing and Voisin, 2005). The principle of treatment wetlands (TWs) is
to circulate the feed wastewater through a porous stage bed made of layers of gravels and sand
of different grain sizes. The top surface of the stage is planted with reeds. Several types of
technical implementations can be found, which differ from each other in (i) the direction of the
hydraulic flow (horizontal or vertical) (Vymazal, 2011; Wu et al., 2015), (ii) the number of
successive filter stages (1 or 2), and (iii) the presence of an anoxic saturated zone. In France,
the most popular system consists of two successive vertical flow unsaturated filter stages which
are currently called French-VFTW (Vertical Flow Treatment Wetland). The system is fed with
unsettled wastewaters spread at the top surface of the stages. Suspended solids are retained
by filtration at the surface of the first stage (Molle, 2014). In limiting the permeability, the
surface sludge deposit layer favours the uniform distribution of the feed wastewater over the
top surface of the stage, thereby allowing a uniform flow of percolation through the stage
medium (Kania et al., 2018, Kania et al., 2019). This surface sludge deposit layer, also called
sludge blanket, also contributes to the performance of the treatment owing to the density,
diversity and activity of its microflora. Efficiencies above 90% are obtained for suspended solids
removal, organic load mineralization, and nitrification (Rousseau et al., 2004; Molle et al.,
2005). However, classical VFTW systems exhibit relatively low denitrification rates due to the
absence of an anoxic zones in the system. To allow denitrification to occur, classical VFTW
systems have been modified to include an anoxic, water-saturated zone within at least one of
the stages (Kim et al., 2014; Silviera et al., 2015).

The AZOE system (patents EP1857419; FR 0651656; FR 1153754) combines a pre-

treatment of the feed wastewater on an aerobic tricking filter, followed by two stages of
partially saturated filters planted with reeds (Kim et al., 2014; Maciejewski et al., 2022). The
trickling filter offers a large surface area for the attachment and growth of an active biofilm. It

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also provides good conditions of aeration for the mineralization of the most readily
biodegradable organic fraction (Kania et al., 2019). These systems constitute an alternative to
aerated systems (Foladori et al., 2014). Aerated condition of the TF may also allow nitrification
to occur (Daigger and Boltz, 2011; Henrich and Maggraff, 2013). The oxidative action of the
aerobic TF is continued and completed in the unsaturated upper parts of the planted stages.
The saturated lower parts provide an alternation of aerobic and anaerobic conditions allowing
nitrogen removal through nitrification/denitrification. However, previous studies have shown
that denitrification in the second filter stage is limited by a lack of available organic carbon. The
proper balance between carbon and nitrogen has been reported as an objective of
improvement in treatment wetland systems by several authors (Sirivedhin and Grey, 2006; Wu
et al., 2014).

Several approaches have been investigated in this purpose. The diversion of a fraction
of the inlet carbon-rich flow to feed nitrate-rich and carbon-depleted areas. This approach,
known as “step-feeding”, was already tested by several authors with several treatment wetland
configurations (Nivala et al., 2019; Al-Wahaibi et al., 2021). Using a laboratory-scale hybrid VF-
HF TW system fed with synthetic wastewaters, Torrijos et al, (2017) diverted up to 50% of the
feed wastewater flow from the VF stage to the HF stage. Using a pilot scale HF system,
Stefanakis et al., (2011) observed that the modification of the distribution of carbon supply
distribution played a key role in TN removal with positive or negative effects depending on the
conditions of implementation. Nivala et al., (2019) tested several step-feeding conditions on a
full-scale two-stage VFTW system and reported that improving denitrification was feasible with
simple modifications. However, deeper studies are needed to better understand the influence
of the C:N ratio of the flow which was diverted and the influence in the microbial activity and
to evaluate possible negative consequences such as the incomplete denitrification leading to
the release of N2O (Janhangir et al., 2016).

This study investigated global nitrogen treatment in VFTW with the objective to
evaluate operational step-feeding conditions to improve denitrification under conditions of
limited organic carbon availability. A pilot-scale wastewater treatment system composed of an
aerobic trickling filter associated with a vertical flow treatment wetland (VFTW) was used. The
experimental system was monitored to map the nitrification and denitrification potentials at

173

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3.4.2 MATERIALS AND METHODS

[Link] S ET - UP OF PILOT - SCALE EQUIPEMENT

Experiments were conducted on a pilot-scale AZOE-N system combining a trickling filter

TF and 2 successive treatment wetlands (TW) stages as shown in Figure 3.4-1. The system was
installed in a ventilated greenhouse of the INRAE experimental platform of La Feyssine close to
Lyon, France. The platform was connected to the nearby municipal wastewater treatment plant
of La Feyssine. All experiments were thereby done with real domestic wastewater. The size of
the pilot system corresponded to a 6-person scaling. The dimensions of the different
equipments are given in figure 3.4-1. The TW stages were filled to a depth of 0.60m by gravels
disposed in layers with grain sizes ranging from coarse in the bottom to fine in the top as details
in previous papers (Kim et al., 2015a, Kim et al., 2015b). The top surface of the first stage filter
was covered with a 5cm-thick layer of sludge deposits taken from a real unit in operation. The
surface of the 2 TW stages was planted with reeds (Phragmites australis) at a density of 10
plants per m². The TF was packed with polypropylene cross pack medium having a specific
surface area of 150 m²/m3. The bottom of the TW stages was saturated with water to a depth
adjusted by a syphon at 30 and 35cm for the first and second stages, respectively.

174

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FIGURE 3.4-1 : PILOT-SCALE CHARACTERISTICS AND EXPERIMENTS SET-UP AZOE SYSTEM IS COMPOSED OF A
TRICKLING FILTER AND TWO PARTIALLY SATURATED CONSTRUCTED WETLANDS.

[Link] O PERATING CONDITIONS

The system was fed through the TF first, followed by the first and second filter stages
successively. Inlet wastewater was pumped by a feed pump at a flowrate of 30 L/h into a 60 L
reservoir placed below the TF. Meanwhile, a recirculation pump was used to circulate the feed
wastewater from the tank through the TF in a closed loop mode at a flowrate of 720 L/day.
When the tank was filled to 60 L, the recirculation pump was stopped and the whole volume of
the tank was rapidly transferred as a batch to the surface of the first stage at a very high
flowrate of 1000 L/hour. Due to the high flowrate of the feed and the limited permeability of
the top surface of the stages, the 60 L volume formed a layer over the whole surface and then
percolated in a uniform manner through the stage medium.

Unlike the TF which was fed in a non-stop mode (except for maintenance), the TW
stages were operated in a sequential feed and rest mode to mimic the operation of full-scale
units where the TW stages are fed for one week and rested for two weeks. However, in order
to shorten the experimental phases in the pilot system, the sequence was designed on a weekly
basis by the alternance of 56h of feeding followed by and 112 hours resting.

In a first experimental phase, the system was operated for about 3 months in the
conventional mode described above. Then in a second phase, step-feeding conditions were

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applied for about 2 months. By-passing was operated using a pump that derived a fraction of
the feed flow from the TF reservoir to the tank between the two TW filter stages (Figure 3.4-
1). By passing flow was firstly set to 10% of the feed hydraulic load in September 2021. Other
assays were then done with a by-pass of 20% in October 2021. Sediment sampling were done
at the very end of the conventional operating phase and the 20% step-feeding phase. Samples
were kept below 4°C before analysis.

[Link] A NALYTICAL MONITORING OF THE PILOT - SCALE SYSTEM

The system was monitored during the feeding periods only. Wastewater was analysed
at 4 steps along the treatment line: (i) inlet feed wastewater, (ii) TF outlet, (iii) TW first stage
filter outlet, and (iv) outlet treated wastewater. Online probes were positioned at levels (iii) and
(iv) for continuous monitoring of ammonia and nitrate concentrations. ORP probes were also
positioned 5 cm below the surface of the saturation area within the TW stages as shown in
Figure 3.4-1.

In addition to online monitoring, wastewater samples were regularly taken from

different points and analyzed for Chemical Oxygen Demand (COD), Total Suspended Solids
(TSS), ammonium (NH4+), nitrates (NO3-), nitrites (NO2-), Total Kjeldahl Nitrogen (TKN), Total
Nitrogen (TN). Total Organic Carbon (TOC). Most samples were refrigerated and stored at 4°C
for a maximum of 24h prior to their analysis. Some samples were frozen when longer storage
time was needed. All parameters were analyzed following French standard methods (AFNOR,
2005).

[Link] S AMPLING OF TW STAGE MEDIA

Non-destructive samplers were designed and placed diagonally with an angle of 45

degrees across the whole depth of gravels in each TW stages during the construction of the
pilot system. These samplers were made of two tubes:

o a perforated rigid PVC outer tube that serves as a sheath

o a perforated inner PVC tube packed with the same stage medium as the 1st stage and
corresponding at the same depth the stage. This tube can be split open lengthwise to sample
and replace the stage medium.

176

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[Link] N ITRIFICATION AND DENITRIFICATION ACTIVITIES

The stage medium extracted from each TW stage as explained in section 2.4 were
sampled every 5 cm from the surface (including sludge deposit on the 1st stage) to the depth
of 50 cm. The bottom 10 cm were discarded due to their too high compaction in the sampler.
Surface sludge deposits were also sampled from several randomly distributed spots of the
surface sludge blanket in the TW first stage filter and homogenised. A fraction of each of the
samples was used to measure humidity and organic matter content and the rest was used for
Nitrification Enzyme Activity (NEA) and Denitrification Enzyme Activity (DEA).

N ITRIFICATION ENZYME ACTIVITY MEASUREMENT

A mass of 3 g of dry equivalent sediment was incubated with a 6 mL of (NH4)2SO4

solution (50µg N-NH4+.g-1dry soil) and distilled water was added in each sample in order to get
a final volume of 30 mL in a Plasma Flask. Flasks were disposed in a stirring oven at 140 rpm
and a temperature of 28°C. After 2, 4, 6, 8 and 10 hours, one millilitre of sediment slurry was
sampled, filtered at 0.2 µm and NO2- and NO3- concentration were measured with a
colorimetric analyzer (Smartchem 200, KPM analytics). In this study, nitrification was expressed
in µg of N g-1 dry soil. hour -1. As nitrite and nitrate measurement was performed the
expression could also be µg of N-NO2- + N-NO3 g-1 dry soil. hour -1. This protocol is based on the
protocol described in Cantarel et al., 2020.

D ENITRIFICATION ENZYME ACTIVITY MEASUREMENT

A mass of 10g (equivalent dry sediment) of fresh soil was placed in a flask sealed
hermetically and filled with 90% helium and 10% acetylene mixture to provide anaerobic
condition and to inhibit the nitrous oxide reductase involved in the final step of denitrification
from N2O to N2. A mixture containing 2 mL of distilled water with KNO3 (50*g N-NO3-. g-1 dry
soil), glucose (500 µ C-glucose.g-1 dry soil), and glutamic acid (500 µg C-glutamic acid. g-1 dry
soil) was added with a syringe to ensure non-limiting amount of substrate to denitrification.
Flasks were incubated at 28°C for 8h. After 2 hours and then every hour N2O accumulation was
measured using a gas chromatograph (µGC R3000, SRA Instrument, Marcy ‘Etoile, France). In
this study, denitrification was expressed in µg of N g-1 dry soil. hour-1. As nitrous oxide

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measurement was performed the expression could also be µg of N-N2O g-1 dry soil. hour -1. This
protocol is based on the protocol described in Cantarel et al., 2020.

To quantify the proportion of end product of denitrification, N2O or N2, this experiment
was performed without the acetylene than inhibit the final reductive step of denitrification. The
difference of N2O accumulation between with and without acetylene provide the amount of
nitrogen whose end product reaches N2.

[Link] D ATA EXPLOITATION

Data were exploited using R software. Performance ratios based on concentrations were
calculated using equation 1 for the different variables [X] monitored

(1) Performance (%) = ([X]in – [X]out) / [X]out * 100

Calculation of nitrates daily load for the second stage includes the nitrates input from
nitrification of ammonium, as given by equation 2:

(2) NO3-applied, second stage = NO3- in, second stage + NH4+ in, second stage – NH4+out, second stage

3.4.3 RESULTS AND DISCUSSION

[Link] I NPUT / OUTPUT TREATMENT PERFORMANCES UNDER CONVENTIONAL OPERATING

CONDITIONS

The concentrations in CODd, TSS, TKN, N-NH3, N-NO3 and TN measured in the
wastewaters at different stages along the treatment line are shown in Figure 3.4-1 for the
operation under conventional operating conditions. Since real wastewaters were used to feed
the system, relatively high fluctuations were observed in the concentrations of each parameter
as shown in Figure 3.4-2. However average concentrations of 203.7 (± 67.1), 209.7 (± 91.8), and
73.9 (± 12.7) for CODd, TSS, and TKN respectively, were found in the same range as in previous
studies where wastewaters from the same treatment plant were used (Silviera et al., 2014, Kim
et al., 2015a). The average removal rates calculated over the operation under conventional
conditions are given in Table 3.4-1. Input/output removal rates as high 97.5% were obtained
for TSS. As also observed in previous studies (Kania et al., 2015), it was observed that, the major

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part of TSS removal occurred by filtration on the first filter stage alone, which achieved here
93.1 ± 5.2 % of overall TSS removal (Figure 3.4-2 and Table 3.4-1). Table 3.4-1 even shows that
suspended solid concentration slightly increased in the trickling filter, probably due to the
release of biofilm fragments. As for the other parameters monitored, high removal rates were
also observed for CODd, N_NH4+ and TKN (92.2 ± 7.3 %, 92.8 ± 5.2 % and 91.4 ± 4.9 %,
respectively). Most of the removal was achieved by the combination of the trickling filter and
the first filter stage (83.1 ± 8.6 %, 77.2 ± 13.4 % and 77.4 ± 10.2 %, respectively). This
observation was attributed to the good oxidation of the organic load and of the reduced forms
of nitrogen in the aerobic trickling filter (Henrich and Marggraff, 2013) and in the upper
unsaturated part of the first filter stage.

TABLEAU 3.4-1 : AVERAGE REMOVAL RATES OBSERVED IN THE PILOT SYSTEM OVER THE 45 DAYS OF OPERATION
UNDER CONVENTIONAL OPERATING MODE

Removal
CODd TSS N_NH4+ TKN TN
performances (%)

TF 49.5 ± 17.1 -1 ± 10.1 41.4 ± 19.9 35.1 ± 27.5 24.8 ± 28.4

TF + 1st stage 83.1 ± 8.6 93.1 ± 5.2 77.2 ± 13.4 77.4 ± 10.2 53.9 ± 16.5

Total system
TF + 1st stage + 2nd 92.2 ± 7.3 97.5 ± 3.4 92.8 ± 5.2 91.4 ± 4.9 61.6 ± 12.4
stage

The trickling filter alone achieved 41.4 ± 19.9 % of nitrification and 35.1 ± 27.5 % of TKN
removal. Table 3.4-1 and Figure 3.4-2 show that N-ammonia and TKN were furthermore
oxidized in the first and second filter stages, yielding to a high overall nitrification rate.

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Nitrates were analysed at the TF outlet at concentrations of 8.0 (±4.1) mg N/L in

average, demonstrating the nitrification activity the trickling filter. However, it was observed
that more N-ammonia was removed in average (23 mg N /L) than N-nitrate was formed. A loss
of nitrogen therefore occurred in the TF treatment stage as confirmed by the decrease in total
nitrogen TN between the inlet and outlet of the trickling filter. These results suggested the
occurrence of denitrification within the TF treatment stage. Although surprising with regard to

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the oxidative conditions in the TF, denitrification may be possible in the buffer recirculation
tank underneath the TF where the presence of organic matter from the feed wastewater,
nitrates from the nitrification process, and low redox level (- 200 mV) may be favourable
conditions. Denitrification may also occur within the depth of the biofilm in the TF where the
availability of O2 may be limited in some areas.

Finally, TN removal (61.6 ± 12.4 %, Table 3.4-1) was not as good as observed for the
other parameters, indicating a limitation in the nitrification/denitrification process.
Denitrification was particularly low in the second filter stage which revealed a very low
contribution to TN removal. There is no significant difference between the first and second
stage of filtration among the principal factors affecting denitrification such as temperature,
oxygen depletion, hydraulic retention time but the availability of organic carbon since CODd/TN
are respectively 1.9 (± 0.4) in the first stage and 1.0 (± 0.3) in the second one. Carbon removal
was very high in the system and the observed limitation of denitrification was mainly attributed
to a lack of organic carbon. Similar observations were previously reported in full scale AZOE
VFTWs (Maciejewski et al., 2022, Kim et al., 2014; Maciejewski et al., 2022a)

[Link] M ICROBIAL NITRIFICATION AND DENITRIFICATION POTENTIALS PROFILES WITHIN THE

TW STAGE MEDIA

Nitrification Enzyme Activity (NEA) and Denitrification Enzyme Activity (DEA) were
measured at different depth within the stage media of each TW stage of the pilot-scale system.
The depth profiles recorded under conventional conditions of operation of the system are
presented in Figure 3.4-3.

Firstly, it can be observed that both NEA and DEA were much lower in the second stage
than in the first one. Figure 3.4-3 shows that NEA recorded in the second stage were all below
1 µg N /g dry sediment and DEA all below 2 µg N /g dry sediment, whereas in the first stage
almost all measurements were above these levels and the recorded maxima were at least 5-
fold higher. Yet, the sediment in the first stage was made of coarser particles that in the second
stage (see Figure 3.4-1) and therefore lower potentials may have been expected in the first
stage instead due to its lower specific surface available for microbial growth per unit mass of
stage medium. The observation revealed that the first stage, despite its coarser particles, was

181

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the siege of a much stronger microbial development that the second stage. This was attributed
to the more favourable environmental conditions found in the first stage under the classical
mode of operation of the system, with higher concentrations of ammonia, nitrates and
available organic substrates that in the second stage.

Figure 3.4-3 also showed that in both stages, the depth profiles recorded below the
surface for NEA and DEA were relatively similar. In the first stage, both NEA and DEA decreased
with depth in the upper part of the unsaturated zone, then increased around the top of the
saturated zone, and finally decreased with depth in the saturated zone. Strong NEA were
therefore logically associated to the unsaturated zone where O2 availability was high enough
to meet the needs of nitrifiers (Kadlec and Wallace, 2009). The highest NEA however were
recorded slightly above the top of the saturated zone where not only O2 was available, but also
the substrates required by the nitrifiers (ie ammonia) were sequentially accumulated after each
introduction of the feed batch volumes. Below that level, the decrease of the NEA with depth
within the saturated zone was attributed to the poor availability of O2, but also to the coarser
particle size of the stage medium in the lower part of the stages.

High DEA were logically rather recorded within the saturated zone, where the saturation
of the medium with water reduced O2 availability and therefore installed anoxic conditions as
suggested by Reilly et al., 2000. The highest DEA were recorded in the first stage at a depth of
30 to 35 cm, i.e. close but below the top of the saturated zone. This depth probably provided
the best conditions to the denitrifiers, by combining anoxic conditions and the sequential
accumulation at a sufficient residence time of substrates needed by the denitrifiers (organic
substrates not yet mineralised and nitrates produced by nitrification in the TF and the upper
part of first stage). Martínez et al., 2018 also reported strong heterotrophic denitrification
activities near the top of the saturated zone in a partially saturated VFTW. Surprisingly in the
second stage, the highest DEA were recorded at a depth of 20 to 25 cm, i.e. close but above
the top of the saturated zone, as it was also observed for the NEA. This observation may be
explained by the finer texture of the medium in the second stage. Water retention may be
increased, allowing anoxic conditions to prevail intermittently even above the top of the
saturated zone. As substrates availability decreased from top to bottom, the best conjunction
of conditions may be found above the top of the saturated zone.

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Finally, the sludge blanket at the surface of the first stage was found to exhibit a strong
DEA but low NEA (figure 3;4-3). This sludge layer was rich in organic matter from the
accumulation of the feed wastewater suspended solids (Kania et al., 2018). Its permeability to
water was much lower than that of the stage media below and it was saturated with water
during the batch feedings operations of the system. Low NEA rates could be explained by the
immobilization of autotrophic organisms due to high carbon content in the sludge, as it has
been shown in natural environment (Leptin et al., 2021). Therefore, despite its direct contact
with the atmosphere, this layer offered anoxic conditions which, combined with the high
availability of organic substrates and nitrates produced by the TF, were favourable to
denitrification.

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FIGURE 3.4-3 : NITRIFICATION ENZYME ACTIVITY (NEA) AND DENITRIFICATION ENZYME ACTIVITY (DEA) IN THE
FIRST (ABOVE) AND SECOND (BELOW). DISPLAYED ERRORS BARS ARE ANALYTICS ERRORS.

[Link] E FFECTS OF STEP - FEEDING CONDITIONS ON THE SYSTEM

E FFECTS OF STEP - FEEDING CONDITIONS ON THE SYSTEM PERFORMANCE

The pilot-scale system operated under conventional conditions achieved high

performance in TSS and COD removals but was much less efficient in TN removal as shown
above (Figure 3.4-2). Due to their very high removal by the trickling filter and especially at the
top of the first TW filter stage, organic substrates were poorly available in the second TW stage
which thereby achieved relatively poor denitrification. The operating conditions were therefore

184

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Figure 3.4-4 shows the input/output balance for N-NH4+ and N-NO3- recorded during
stable conditions of operation of the system under conventional conditions as compared to
step-feeding conditions with bypasses of 10% or 20% of feed flow. Table 3.4-2 compares the
average performance of the system or COD, N-NH4 and TN removal under the different modes
of operation tested. Each mode was tested over several weeks. The transitory periods of time
between 2 modes of operation were not included in the determination of the average
performance of the systems in the corresponding modes (Table 3.4-2) or in the input/output
data of Figure 3.4-4.

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TABLEAU 3.4-2 : AVERAGE INPUT / OUTPUT CODD, N-NH4 AND TN CONCENTRATIONS AND CORRESPONDING
REMOVAL RATES RECORDED IN THE PILOT-SCALE SYSTEMS OPERATED UNDER CONVENTIONAL CONDITIONS AS
COMPARED TO STEP-FEEDING CONDITIONS WITH BYPASS FLOWS OF 10 OR 20% OF THE FEED VOLUMETRIC FLOW.

Pollutants Sampling point Conventional 10%-SF 20%-SF

Input 203.2 ± 67.9 197.1 ± 31.1 192.6 ± 45.6

Inlet 2nd stage* 32.2 ± 13.4 41.2 ± 6.3 64.5 ± 7.9

CODd
Outlet 19.2 ± 12.1 23.5 ± 7.4 26.4 ± 6.9

Global removal (%) 92.2 ± 7.3 87.9 ± 2.2 85.6 ± 4.3

Input 55.1 ± 12.5 51.8 ± 5.7 51.6 ± 11.3

Inlet 2nd stage* 12.3 ± 6.8 6.7 ± 2.9 15.2 ± 3.9

N_NH4+
Outlet 3.8 ± 2.5 1.4 ± 0.8 8.5 ± 4.5

Global removal (%) 92.8 ± 5.2 98.5 ± 1.7 83.7 ± 6.9

Input 73.9 ± 12. 68.9 ± 6.1 70.4 ± 12.5

Inlet 2nd stage* 33.1 ± 10 32.7 ± 2.5 37 ± 5.3

Total
Nitrogen
Outlet 27.7 ± 8.5 26.3 ± 4.7 32.8 ± 2.5

Global removal (%) 61.6 ± 12.4 60.9 ± 9.5 52.1 ± 9.6

CODd/TN Inlet 2nd stage* 0.97 1.26 1.74

*Inlet 2nd stage concentrations are measured after the raw wastewater by-passing for 10% and
20% step-feeding operating mode

In the case of the study and regardless of the proportion of effluent diverted, the use of
step-feeding did not show as significant a positive impact as in the literature (Al-Wahaibi et al.,
2021, Nivala et al., 2019; Wang et al., 2022). The removal rates were not significantly improved

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of even degraded under step-feeding conditions except that of N-NH4+ which was improved
with a bypass flow of 10%, but significantly lowered at 20%.

The probable reason for the relatively low effect of step-feeding on performance
improvement of nitrogen removal observed was that the tested conditions did not improve the
COD/N ratio which remained between 0.97 and 1.74 as shown in Table 2. Our study is therefore
in contrast to the encouraging results of the literature (Nivala et al., 2019, Al-Wahaibi et al.,
2021, Wang et al., 2022) on step-feeding and underlines the importance of the quality of the
input effluent, whose C/N should be as high as possible.

FIGURE 3.4-4 : TREATED AND APPLIED NH4+ AND NO3- LOAD ON THE SECOND STAGE OF FILTRATION IN
CONVENTIONAL OPERATING MODE (BLUE TRIANGLES) AND WITH 10% (YELLOW DOTS) OR 20% STEP-FEEDING
RATIOS (GREEN SQUARES).

E FFECTS OF STEP - FEEDING ON THE DEPTH PROFILES OF NITRIFICATION / DENITRIFICATION ACTIVITIES

However, with regard to the impact on microbiology, these modifications induced

strong changes in the DEA recorded in the second stage medium. Figure 3.4-5 shows that with
a bypass flow of 20%, the DEA were strongly decreased in the upper, unsaturated zone, and in
contrast strongly increased in the lower, saturated zone as compared to the depth profile
recorded under conventional conditions. As discussed above, under conventional conditions
the most favourable condition for dernitriers development are shallower in order to access to

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more substrates percolating from the surface. The highest DEA was observed in the lowest part
of the unsaturated zone. This zone, relatively more oxic than the saturated zone as oxygen from
the atmosphere can diffuse, may suit to falcultative aerobic denitrifiers. Under the step-
feeding conditions, the flow of raw wastewater bypassed to the top surface of the second stage
provided ammonia and organic substrates which percolated through the upper unsaturated
oxic zone. Ammonia was oxidized into nitrates and the nitrates reached the saturated zone.
The denitrifiers therefore developed preferentially in the saturated zone, slightly below the
interface where favourable redox conditions and substrates availability were combined. Then,
the denitrification potential decreased with depth because of the lower substrates availability
and the coarser grain size of the stage medium. The depth profile was therefore globally shifted
down towards the bottom of the stage when step-feedings conditions were operated.

FIGURE 3.4-5 : DEPTH PROFILES OF DENITRIFICATION POTENTIALS IN THE SECOND TW FILTER STAGE UNDER
CONVENTIONAL VS STEP-FEEDING CONDITIONS WITH 20% BYPASS FLOW

188

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Depending on the environmental conditions, denitrification may convert nitrogen to N2

or to N2O. Both forms are gaseous but N2O is at a higher state of oxidation than N2 and its
emission into the atmosphere generates greenhouse effects due to its high global warming
potential of 310 as compared to CO2 (IPCC, 2001). The protocol used to measure DEA allows to
estimate the respective fractions of N-NO3 that may be reduced into N2 or N2O. Figure 3.4-6
shows the depth profiles of the DEA and indicates the possible proportions of N2O and N2
emissions according to the experimental measurements of the activity. The profiles
represented were recorded in the first TW filter stage under conventional conditions of
operation and in the second filter stage under conventional and step-feeding conditions with
20% bypass flow.

Results showed that N2 was the final metabolite produced almost exclusively in most cases. The
DEA profile recorded in the first stage showed N2 as the quasi exclusive final product in most
samples, but significant N2O emission potentials were measured however at the top of the
unsaturated zone and at the very bottom of the saturated zone. N2O emission potentials
measured close to the surface were attributed to the oxic conditions prevailing there. Previous
works have reported that an increase in dissolved oxygen was positively correlated with the
increase of N2O/N2 ratio (Huang, et al., 2011), notably because O2 was reported to strongly
inhibit the Nos enzyme catalysing the reduction of N2O to N2 (Bonin et al., 1989). Some authors
have suggested that low concentrations of organic substrates was one of the parameters
favouring N2O emissions (Itokawa et al., 2001; Huang et al., 2013).

The profile recorded in the second filter stage under conventional conditions revealed
low DEA with extremely low proportions of N2O at any depth. The step-feeding conditions
slightly increased N2O proportions in the unsaturated zone, with a particularly strong effect
close below the top of the saturated zone where N2O accounted for more than 30% of the
denitrification potential. As discussed above at section 3.4, the depth profile of DEA was
globally shifted down towards the bottom of the stage when step-feedings conditions were
operated. The availability of O2 was therefore reduced, which may explain the increased
occurrence of N2O emission potentials induced by the step-feeding conditions. (Huang, et al.,
2011).

189

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DEA should not be considered as predictive evaluations of N2 or N2O emissions. These
measurements revealed however that the microflora associated to the stage medium have
locally the capacity to carry out the corresponding activity. Depending on the operating
conditions of the system, the locations where the most favourable conditions are gathered for
the measured potentials are modified. The results of this study suggested that carbon
availability was not the predominant factor to favour N2O instead of N2 emission potentials. The
strong differences of aeration between the different zones of the dynamic pilot-scale system
used here may explain why the effect of O2 availability was found predominant in our study.

FIGURE 3.4-6 : DEPTH PROFILES OF MICROBIAL DENITRIFICATION POTENTIALS EXPRESSED IN µG N-N2 OR N-N2O
PER G OF STAGE MEDIUM AS RECORDED IN THE FIRST STAGE FILTER AND THE SECOND STAGE FILTER UNDER
CONVENTIONAL OR STEP-FEEDING CONDITIONS WITH 20% BYPASS FLOW.

190

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The objective of this section was to estimate the maximum fluxes of nitrogen possibly
emitted into the atmosphere during the treatment of domestic wastewaters in the use pilot-
scale VFTW system. Analytical results gathered from the monitoring of the system were used
in that purpose. More specifically, an estimation of N2O potential fluxes was performed due to
the strong environmental issues associated to this issue.

The balance of TN concentrations (mg/L) between the input and output of each filter
provided an estimation of the masses of nitrogen (mg) released from the system in the form of
gaseous species per unit volume of wastewater treated in each filter. Considering the daily
hydraulic flows (m3 per day), the daily masses of nitrogen removed (g/day) were calculated.
Using the data shown in Figure 3.4-2, it was calculated that under conventional conditions of
operations, the first and second TW filter stages removed 15 and 4 g N/day, respectively. The
depth profiles of denitrification potentials measured in the first and second stages were then
used to estimate the possible respective contributions of each depth layer of the filters to the
calculated fluxes of nitrogen reduced from nitrates. Then, considering the proportion of N2O
measured in the denitrification potential of each depth layer (Figure 3.4-6), the potential fluxes
of N2O were calculated (in g N2O per day) as the sum of the emissions from each depth layer.
The calculated fluxes were finally divided by the top surface area of the filters to express surface
fluxes in [Link]-1. These calculations allowed to estimate the potential emissions of
N2O from the first TW filter stage at 320 [Link]-1. The emission of N2O thereby
estimated for the first filter accounted for about 4% of the overall flow of nitrogen emitted by
the filter as calculated in the same manner. The major part (close to 85%) of N 2O was emitted
from the depth of 10 to 15 cm.

The potential emissions from the second filter were estimated at 50 [Link]-
1 under conventional conditions and 231 [Link]-1 under step-feeding conditions at
20% bypass flow (most of the production originating from the 30 cm depth layer). Step-feeding
conditions were therefore shown to potentially increase significantly N2O emissions. The
potential N2O emission from the two filters together was 370 [Link]-1 under
conventional conditions, corresponding to an average hourly flow of 15.4 [Link]-1.
191

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These estimations were above the fluxes measured in full-scale TW units, reported in the range
between 0.1 and 110 [Link]-1 (Mander et al., 2003; Søvik and Kløve 2007; Maucieri
et al., 2017). However, considering the hypotheses made in our estimations and the
uncertainties of the experimental on-site measurements, the data obtained may be considered
in the same order of magnitude. Filali et al., 2017 reported peak emissions up to 17 mgN-
[Link]-1 which were recorded periodically but only for very short periods of time. This
estimation allows us to highlight i) the dichotomy in terms of the contribution of the two
different filtration stages ii) the greater contribution to N2O emissions of the upper layers where
a form of aerobics remains iii) the risk of contributing to increase these emissions by a poorly
dosed carbon input

3.4.4 CONCLUSION

In this study the nitrogen treatment performance of a VFTW system combined with a
trickling filter was discussed in relation to the step-feeding strategy without any significant
improvement being observed, in contrast to the literature. The mapping of the nitrification and
denitrification enzyme activity shows a high activity of the micro-organism’s communities on
the horizons near the interface of the saturation zone. N2O emissions are relatively low
compared to N2 but show that the upper horizons with slight oxygenation contribute a large
part. The addition of carbon increases the potential for N2O.

ACKNOWLEDGEMENTS
The authors are grateful to the INRAE for providing access to the Feyssine facilities and technical
assistance. This work was realized within the Graduate School H2O’Lyon (ANR-17-EURE-0018)
and the Université de Lyon (UdL), as part of the programme "Investissements d'Avenir " of the
French national agency for research (Agence Nationale de la Recherche, ANR). The authors
would like to thank the SCIRPE Company and CIFRE (Conventions Industrielles de Formation par
la REcherche) for funding this research project.

CREDIT AUTHORS STATEMENT

Kevin Maciejewski: Conceptualization, Methodology, Data Curation, Writing – Original Draft.
Mathieu Gautier: Conceptualization, Methodology, Writing – Review & Editing, Supervision.

192

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Boram Kim: Writing – Review & Editing. Philippe Michel: Writing – Review & Editing. Pascal
Molle: Writing – Review & Editing, Supervision. Jonathan Gervaix : Methodology, Data Curation,
Writing – Review & Editing. Amélie Cantarel; Conceptualization, Writing – Review, Supervision
Agnès Richaume: Conceptualization, Writing – Review, Supervision Rémy Gourdon:
Conceptualization, Writing – Review & Editing, Supervision

193

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195

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K. Maciejewskia,b, M. Gautiera, P. Michelb, R. Gourdona

aUniv Lyon, INSA Lyon, DEEP, EA7429, 69621 Villeurbanne, France
bSCIRPE, Society of Design and Production Engineering for Wastewater Purification, 5 Allée
Alban Vistel, 69110 Sainte Foy Lès Lyon, France

3.5.1 INTRODUCTION
La dénitrification demeure une étape limitante du traitement des eaux usées dans les
systèmes végétalisés en général. Bien que le procédé AZOE® présente des bons rendements
d’abattement, la dénitrification n’est pas totale et les performances du second étage semblent
pouvoir être améliorées. La carence en carbone organique indispensable aux populations
microbiennes dénitrifiantes hétérotrophes semble être le principal facteur expliquant cette
limitation. Ce phénomène a déjà été documenté dans la littérature scientifique aussi bien pour
les systèmes intensifs qu’extensifs. Une des solutions semble être l’apport de carbone
organique sous une forme soluble très disponible Des alcools simples tels que le méthanol et
l’éthanol (Grabínska-łoniewska et al., 1985 ; Chirstensson et al., 1994), l’acétate (Hallin et al.,
1995) ou le glycérol (Lu et al., 2011) se sont par exemple avérés être des solutions remédier à
ce problème.

Bien qu’efficaces et relativement faciles à doser, les ajouts de solutions de substrats

carbonés nécessitent un certain investissement à l’installation (pompe doseuse, cuve de
stockage) et génèrent des coûts d’exploitation (maintenance, coût des réactifs). De plus la
relative dangerosité de certains de ces réactifs (méthanol et éthanol par exemple) peut poser
des problèmes quant à leur stockage sur le site. Ainsi pour éviter ces contraintes, la faisabilité
d’utiliser des matériaux biosourcés d’origine végétale a été étudiée. En outre, afin de coupler
cette démarche à une approche de valorisation de déchets dans un contexte global d’économie
circulaire, ces matériaux ont été recherchés sous forme de résidus agricoles ou agro-
alimentaires.

197

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[Link] U TILISATION DE LITIERE DE MACROPHYTES

L’utilisation de matériaux biosourcés a déjà été testée sur des systèmes de traitements
végétalisés de configurations diverses. Cette partie présente une synthèse des études publiées
jugées les plus pertinentes. Les références bibliographiques utilisées ainsi que les principaux
résultats sont présentées dans le tableau 3.5-1. La plupart des études menées ont été réalisées
à l’échelle laboratoire ou pilote. Tout d’abord l’utilisation de macrophytes comme source
diffuse de carbone a déjà fait l’objet de plusieurs études et on peut distinguer plusieurs modes
de préparation. Les macrophytes ont par exemple été utilisés en application directe sur le filtre
après un simple broyage (Van Oostrom and Russel., 1994 ; Wen et al., 2010), ou après un
prétraitement à la soude visant à améliorer l’accessibilité de la cellulose par hydrolyse de la
lignine (Wen et al., 2010), ou encore après fermentation anoxique (Fu et al., 2016 ; Zhang et
al., 2016).

Dans une étude plus ancienne, Van Oostrom and Russel (1994) ont créé un tapis de
broyat de feuilles de Glyceria maxima sur un filtre planté à écoulement libre de surface
recevant des effluents chargés en nitrates. Les auteurs ont mis en évidence que la litière de
feuille est la zone du filtre à la plus haute contribution de dénitrification par rapport à une zone
sans litière due à l’importante surface de contact entre l’effluent et une source de carbone. Des
travaux de Wen et al. (2010) ont montré que la litière de broyat Typha latifolia sur un filtre
planté de roseaux à écoulement horizontal a augmenté les performances de réduction des
nitrates de 37% par rapport à un filtre témoin sans complément de carbone. Ces mêmes
auteurs ont comparé la litière avec et sans prétraitement par une macération à la soude. Ils
rapportent que le prétraitement augmente considérablement le rapport carbone/azote de la
litière et la rend plus efficace pour la dénitrification dans la phase initiale de l’expérience (10
premiers jours) tandis que les performances de dénitrification de la litière sans prétraitement
sont meilleures dans la phase finale de l’expérience. L’utilisation d’un broyat solubilisé de Typha
Latifolia après fermentation anoxique s’est avérée positivement corrélée à de meilleures
performances d’épuration de l’azote total (Zhang et al., 2016). Les mesures de la concentration
en nitrates en plusieurs points sur le transect longitudinal du filtre planté à écoulement
horizontal ont montré que la majeure partie de la dénitrification a lieu à proximité du point
d’injection de la source de carbone. De plus, ces auteurs ont clairement mis en évidence une

198

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[Link] U TILISATION DE MATERIAUX EXOGENES AUX ZONES HUMIDES

Outre l’apport de carbone via des broyats de macrophytes, d’autres ajouts de matériaux
ont été étudiés avec des performances variables. Sur un système à écoulement vertical, Shen
et al., (2015) ont étudié l’utilisation de la fécule de maïs en incorporation dans les matériaux de
filtration et observent les plus hauts rendements de dénitrification. Si et al., (2018) ont évalué
le potentiel de plusieurs matériaux différents en mélange avec le garnissage de filtres plantés
de roseaux à écoulement vertical partiellement saturés. Les matériaux utilisés sont des broyats
de pailles de blé, de coton, de granules de butylène de succinates et de journaux en papiers.
Parmi tous ces matériaux, la valorisation de journaux et de foin améliore significativement les
performances de dénitrification (respectivement 67% et 49%) par rapport au contrôle à 15%.

199

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Tableau 3.5-1 : Synthèse de travaux utilisant des matériaux biosourcés dans le but de
promouvoir la dénitrification sur des filières végétalisées

Système étudié Échelle Matériaux utilisés Références

CW à écoulement de Laboratoire Litière de Glyceria maxima Van Oostrom and

surface Russel, 1994

CW à écoulement Laboratoire Typha latifolia (roseaux) Wen et al., 2010

horizontal broyée avec ou sans
prétraitement au NaOH

CW à écoulement Pilote Typha latifolia broyé et Zhang et al., 2016

vertical fermenté

CW à écoulement Pilote Arondo donax et Ponderia Fu et al., 2017

vertical cordata

CW à écoulement Laboratoire Mélange de fécules de maïs et Shen et al., 2015

vertical polycaprolactone incorporé
au garnissage

CW à écoulement Laboratoire Pailles de blés (foin) Si et al., 2018

vertical
Coton

Granules de butylène
succinates

Broyat de journaux

CW à écoulement de Pilote Copeaux de bois (Woodchip) Yuan et al., 2020

surface

L’ajout de copeaux de bois dans les zones d’anoxie de systèmes végétalisés a aussi
montré son efficacité dans le traitement de l’azote total (de 61 sans ajout à 74% avec ajout) par
sa libération de carbone organique mais aussi en créant des conditions d’anoxie propices au
processus (Yuan et al., 2020). Les propriétés de libération de carbone organique dans le temps
des copeaux de bois sont aussi étudiées pour la mise en place de bioréacteur de dénitrification
(Lopez-Ponnada et al., 2017, Brun et al., 2021).

200

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[Link] S ELECTION DES MATÉRIAUX

Le choix des matériaux a été motivé par la possibilité de les utiliser sur diverses stations
de filtres plantés de roseaux à écoulement vertical dont la localisation peut varier, notamment
sur le territoire français. Dans l’idéal il s’agit d’identifier plusieurs matériaux utilisables
moyennant un éventuel prétraitement simple de type broyage. Tester une large variété de
matériaux se distinguant par leur composition biochimique est une démarche scientifique pour
analyser les facteurs d’influence.

Le choix des matériaux a donc été réalisé sur la base de ces conditions (intérêt scientifique et
faisabilité sur site) et la liste des 7 matériaux sélectionnés est présentée dans le tableau 3.5-2.

201

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Tableau 3.5-2 : Description des matériaux sélectionnés pour l’étude de faisabilité de leur
utilisation en tant qu’apport de carbone externe pour stimuler la dénitrification.

Matériaux Code Description

Disponible sur le site de traitement des eaux usées

Roseaux d’été A Parties supérieures des roseaux verts d’été présents en

abondance sur le filtre – Phragmites Australis

Roseaux d’hiver B Parties supérieures des roseaux d’hiver collectés lors du

faucardage - Phragmites Australis

Boues du premier C Les boues contiennent du carbone et le libère

étage progressivement dans le temps. Elles pourraient donc être
redistribuées sur le second étage en petit volume.

Hors du site de traitement des eaux usées

Rafles de maïs D Il s’agit de la partie centrale de l’épi de maïs. Assez dense et

peu ligneux.

Foin E Herbacée sec qui sert à l’alimentation des herbivores. Présent

en grande quantité sur tout le territoire.

Paillis de chanvre F Tige de chanvre broyé utilisé dans le paillage notamment

dans les activités paysagères.

Bois Raméal G Broyat de jeunes rameaux de feuillus. Il s’agit du matériau le

Fragmenté (BRF) plus dense et le plus ligneux de la sélection. Déchets de tailles
de haies.

202

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P RÉPARATION DES ÉCHANTILLONS

Parmi les 7 matériaux testés, 6 d’entre eux nécessitent d’être broyés pour les besoins
pratiques de l’expérimentation et pour augmenter leur surface spécifique. Ces matériaux ont
été passés au broyeur dont le seuil de coupure est de 3 cm afin d’obtenir des granulats grossiers
(figure 3.5-1).

FIGURE 3.5-1 : PHOTOGRAPHIE DES MATERIAUX UTILISES (SAUF BOUES) APRES BROYAGE. DE GAUCHE A DROITE
ET DE HAUT EN BAS : PAILLIS DE CHANVRE, RAFLES DE MAÏS, ROSEAUX FRAIS, PAILLES, ROSEAUX D’HIVER ET BRF.

P ROTOCOLE DE LIXIVIATION

Afin d’étudier le potentiel de libération de substrats carbonés solubles par les matériaux
sélectionnés, des essais de lixiviation ont été réalisés. :

Pour chaque essai, une masse humide de 20g de matériau et un volume de 100mL d’eau
désionisée ont été introduits dans des flacons de 250mL en PEHD, correspondant ainsi à un
rapport Liquide/Solide (L/S) de 5 au début des essais. Tous les essais ont été dupliqués. Le taux
de remplissage des flacons dépend de la masse volumique des matériaux, qui est très différente
notamment entre la boue et les pailles. La masse de 20g a été retenue quel que soit le matériau
203

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car le volume correspondant n’excède alors pas la moitié du volume du flacon. De cette
manière l’immersion des matériaux est toujours complète. Les flacons sont placés sur un
agitateur orbital.

A intervalles de 24h sur une durée totale de 14 jours, la fraction liquide de chaque flacon est
collectée pour analyse et renouvelée par un même volume d’eau. Le rapport L/S cumulé
augmente donc de 5 en début d’essai à une valeur de 35 à 50 en fin d’essai selon le matériau.
Les flacons sont pesés avant et après chaque étape. Une fois l’eau renouvelée, les flacons sont
replacés sur l’agitateur pour un nouveau cycle. Le volume d’eau extrait chaque jour diffère
légèrement pour chaque matériau selon sa capacité de rétention en eau (Tableau 3.5-3). Le
volume d’eau de renouvèlement est identique au volume extrait pour conserver le même
rapport liquide/solide dans les flacons tout au long de l’expérience.

Tableau 3.5-3 : Volume d’eau moyen extrait à chaque prélèvement pour tous les matériaux
testés, et écart-type associés. Les matériaux sont classés selon leur capacité de rétention en
eau

Volume d’eau moyen extrait

Matériaux Masse volumique (kg/m3)
quotidiennement (ml)

Paillis de chanvre 34 (± 19) 100

Foin 42 (± 5) 70

Roseaux d’hiver 43 (± 4) 80

Rafles de maïs 62 (± 4) 380

Roseaux d’été verts 64 (± 19) 110

Bois Raméales 65 (± 6) 200

Fragmentés

Boues du premier 68 (± 22) 1200

étage*

* L’extraction se faisait après décantation et seul le surnageant était extrait.

Analyse des solutions aqueuses collectées (lixiviats) :

204

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Les solutions extraites sont filtrées à 0,45 µm par un système de type Buchner avec pompe à
vide et transférées dans des flacons de 45 mL afin d’analyser les concentrations en carbone
organique total et en azote Kjeldahl à chaque prélèvement.

205

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[Link] L IXIVIATION DU CARBONE ET DE L ’ AZOTE

La figure 3.5-2 représente l’évolution de la masse cumulée de COT solubilisé en fonction
du L/S cumulé pour les 7 matériaux biosourcés. L’allure générale des courbes est similaire pour
tous les matériaux, à savoir une augmentation rapide sur les 3 premiers jours, puis un
ralentissement de l’évolution tendant vers une asymptote horizontale. La masse cumulée de
COT solubilisée lors des premiers renouvèlements de l’eau est très forte, puis l’augmentation
devient progressivement plus lente jusqu’à tendre vers une extraction quasiment nulle. Parmi
tous les matériaux testés, les pailles de blé, rafles de maïs et roseaux verts d’été permettent de
récupérer des quantités de carbone organique les plus importantes avec respectivement 67,3 ;
35.7 et 31,2 mgCOT/gMatériau. De surcroît, il est intéressant de noter que l’allure générale de
la courbe de lixiviation des pailles de blé diffère légèrement de celles des rafles de maïs et des
roseaux verts. En effet, après les premières lixiviations des pailles la solubilisation du carbone
ne parvient pas aussi rapidement à une asymptote que pour les autres matériaux. Ceci signifie
que l’extraction du carbone organique est plus progressive dans les pailles de blés, ce qui
constitue une caractéristique intéressante pour permettre un apport durable de carbone.

Le potentiel d’apport de carbone du bois raméal fragmenté (BRF), du paillis de chanvre

et des roseaux hivernaux apparait faible, tandis que les boues ne libèrent pas assez de carbone
organique pour être intéressantes comme une utilisation spécifique comme ajout de carbone.

La libération d’azote Kjeldahl est représentée à la figure 3.5-3 pour tous les matériaux
étudiés. La tendance globale des courbes est identique à celle du COT, à savoir une libération
importante lors des premiers renouvellements d’eau puis une diminution progressive des
quantités extraites. La masse cumulée d’azote reste bien inférieure à celle du COT. Les roseaux
estivaux et hivernaux libèrent respectivement 6,9 et 3,8 mgNTK/g de matériau, ce qui est la
plus valeur forte enregistrée parmi tous les matériaux testés. A l’inverse, les rafles de maïs
libèrent les plus faibles quantités d’azote avec 0.8 mgNTK/g de matériau.

206

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FIGURE 3.5-2 : MASSE DE CARBONE ORGANIQUE TOTAL CUMULEE ET NORMALISEE PAR GRAMME DE MATERIAU
EN FONCTION DE L’EVOLUTION DU RAPPORT LIQUIDE/SOLIDE.

207

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208

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[Link] R APPORT C ARBONE / A ZOTE
Les matériaux dont le rapport COT/NTK des composés lixiviés est faible sont à proscrire
pour l’application recherchée puisqu’ils rapporteraient une part trop importante d’azote à
oxyder en nitrates, puis à réduire sous forme d’azote gazeux. La figure 3.5-4 présente les
rapports COT/NTK moyens calculés pour tous les matériaux à partir des masses cumulées de C
et de N solubilisées sur la durée des essais.

FIGURE 3.5-4 : RAPPORTS MOYENS DE COT/NTK DANS LES LIXIVIATS DU TEST DE LIXIVIATION POUR LES 7
MATERIAUX TESTES.

Les lixiviats des rafles de maïs et les pailles de blé ont un rapport COT/TKN bien
supérieur aux autres matériaux, respectivement 23,4 et 22,1 tandis que les autres matériaux
n’excèdent pas 10. Les roseaux d’hiver après faucardage ont le plus faible rapport COT/TKN et
sont donc plutôt à éviter.

209

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[Link] M ISE EN APPLICATION EN VRAIE GRANDEUR SUR LA STATION DE T RANS - LA -F ORET
Cette expérimentation a été motivée par la recherche d’une solution d’amélioration de
la dénitrification sur la station d’épuration de type AZOE-NP en fonctionnement dans la
commune de Trans-la-Forêt en Ille-et-Vilaine (35). Cette station de 600 EH reçoit des effluents
chargés en azote avec des pics en azote total allant jusqu’à 120 mgN/L. La limite de 20 mg/L en
azote total garantie dans les effluents traités n’est pas continuellement respectée et la majeure
part de l’azote résiduel est sous la forme de nitrates. Le second étage de traitement de la filière
a été identifié comme l’ouvrage dont les taux de dénitrification pourraient être améliorés par
ajout de carbone.

Une sélection de matériaux a été établie sur la base des expérimentations précédentes.
Les pailles de blé ont le potentiel de libération de carbone le plus important et ce matériau
apparait comme un candidat solide. Les rafles de maïs peuvent permettre un apport de carbone
significatif, sans apporter conjointement d’azote ou très peu et ont l’avantage d’une masse
volumique importante. La masse volumique importante permet en effet de limiter le volume
d’apport sur le filtre pour une masse égale.

Estimation des volumes de matériaux :

A Trans-la-Forêt le débit journalier moyen sur le second étage est de 20 m3/jour et

l’objectif de réduction des nitrates sur le second étage de filtration est de 10 mgN-NO3-/l, soit
0,2 kgN-NO3-/jour. En considérant un rapport DCO : Azote à dénitrifier de 3,02 (Kadlec and
Wallace, 2009), les besoins en DCO à apporter par jour via les matériaux biosourcés seraient de
0,2 * 3,02 = 0,604 kgDCO/jour, soit 0,274 gCOT/jour avec une hypothèse d’un ratio DCO/COT
de 2,2 calculé sur des données terrain d’une station similaire.

Il est nécessaire de définir la manière d’extraire le COT des matériaux et de l’apporter

sur le filtre pour estimer les volumes. La dégradation sur de longues périodes et le
renouvèlement des matériaux sur le filtre est un paramètre d’importance, bien que difficile à
estimer en vraie grandeur à partir des résultats de cette expérience. Un suivi à long terme serait
nécessaire afin de déterminer le temps conduisant à l’épuisement de C soluble des matériaux.

210

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o Risque de réduction de la perméabilité hydraulique comme cela a été observé avec les
parties aériennes de roseaux non broyées à Trans-la-forêt ;

o Accumulation de la partie difficilement dégradable des matériaux en surface du filtre ;

o Surcoût d’entretien pour l’exploitant lors de la répartition des matériaux sur le filtre, de
leur éventuel curage difficile avec les plants de roseaux, et de leur renouvèlement.

D’un point de vue pratique, l’ajout de solutions de fermentation de matériaux biosourcés

(Zhang et al., 2016) semble être plus faisable sur le long terme. En revanche, cette méthode
suggère la mise en place d’une cuve de fermentation/macération d’environ un mètre cube dans
le cas des rafles de maïs et d’une pompe doseuse.

3.5.5 CONCLUSION
Ces travaux ont permis d’identifier que deux des sept matériaux (pailles de blés et rafles
de maïs) pouvaient constituer une alternative comme apport de carbone à la dénitrification.
Les matériaux au plus fort potentiel libèrent du carbone organique de manière régulière dans
le temps et peu d’azote. La masse volumique des matériaux est un avantage certain pour la
faisabilité de la méthode puisque les volumes à apporter sur le filtre s’avèrent moindres, à
l’instar des rafles de maïs par rapport aux pailles de blé. La méthode d’application des
matériaux directement sur le filtre ne semble cependant pas la solution la plus appropriée en
raison des potentiels problèmes de gestion (risque de colmatage, extraction des matériaux,
etc.). Un apport de solution aqueuse de macération des matériaux pourrait s’avérer une
solution d’intérêt qui mériterait d’avantage d’investigations pour le développement, et
moyennant aussi un investissement non négligeable des installations

211

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Cette partie explore plusieurs méthodes d’ajout de carbone sur le second étage de traitement
et en discute la faisabilité de chacune. Les principaux points à retenir sont les suivants :

Le potentiel d’optimisation de la dénitrification hétérotrophe par l’utilisation de matériaux

biosourcés est très inégale entre eux. La rafle de maïs se distingue des autres matériaux par
son apport constant de carbone organique, et son relatif faible volume nécessaire à appliquer
sur le filtre, notamment par rapport au foin ;

Un état de l’art de la littérature souligne le potentiel d’optimisation du step-feeding d’un

point de vue des performances d’abattement de l’azote total, mais aussi opérationnel ;

Les essais microbiologiques de potentiel de nitrification et de dénitrification mettent en

évidence une forte activité dans la zone proche de l’interface de saturation dans des conditions
d’opération normales. Les 10 premiers centimètres de la zone saturée concentrent les plus
forts potentiels de dénitrification ;

Le step-feeding a pour conséquence de déplacer les plus forts potentiels de dénitrification

vers des horizons plus profonds de la zone de saturation ;

Une part non-négligeable de la dénitrification demeure incomplète et résulte en la

formation d’un produit final sous la forme de N2O ;

213

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215

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Les filtres plantés de roseaux ont connu ces 30 dernières années un essor important. En
France, la variante la plus plébiscitée est composée de deux étages non saturés avec un
écoulement hydraulique vertical. Ce système a pour avantage par rapport aux filtres à
écoulement horizontal de maximiser la surface de filtration et de retenir la phase particulaire
tout en limitant le risque de colmatage. Les conditions d’aération nécessaires à la
minéralisation de la matière organique et à l’oxydation de l’azote ammoniacal sont par ailleurs
satisfaites. De fait, ce système est particulièrement bien adapté pour les unités de traitement
de moins de 2000 EH pour lesquelles les exigences réglementaires de performances ciblent la
charge en DCO, DBO5, NTK et MES. Toutefois, la mise en place de mesures réglementaires
localement plus strictes et la réalisation de stations de plus grande capacité ont motivé les
entreprises du secteur de l’assainissement à investir dans la recherche -développement pour
mieux prendre en compte le traitement de l’azote total et du phosphore, ainsi qu’à réduire
l’emprise au sol des stations. Dès lors de nouveaux procédés ont vu le jour, généralement sur
la base du modèle classique. C’est le cas de la gamme des procédés AZOE®.

Le traitement de l’azote total demeure une tâche complexe dès lors qu’il est question de
parvenir à un contrôle précis sur la qualité de l’effluent traité. La raison principale à cela est que
l’azote doit subir une succession de transformations biologiques réalisées dans des conditions
environnementales déterminées, et très différentes selon les formes de l’azote. Ces travaux de
thèse d’inscrivent dans ce contexte de meilleur contrôle de l’épuration de l’azote total avec des
enjeux opérationnels de meilleure protection des milieux récepteurs mais aussi de
développement de solutions de réutilisation des eaux usées. D’un point de vue opérationnel,
ces travaux sont aussi motivés par des problèmes parfois rencontrés sur des stations existantes,
et en particulier le cas de Trans-la-Forêt où l’engagement a été pris auprès de la commune de
réduire la concentration de nitrates en sortie d’environ 5 à 10 mgN/L.

4.1 ROLE DU LIT BACTERIEN

Les rôles du lit bactérien placé en tête de filière de traitement AZOE sont de :

o Contribuer au traitement aérobie de la matière organique en réduisant d’environ 50%

la charge carbonée dissoute comme cela a été observé dans les essais pilotes et induire
l’accumulation de matière plus humifiée en surface du 1er étage (Kania et al., 2019) ;

217

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o Contribuer de manière plus marginale au traitement du phosphore comme cela a

précédemment été montré par Kim et al., (2014) en garantissant des conditions
d’oxygénation suffisantes à la rétention du phosphore associé aux dépôts constituant
la couche de boues de surface du premier étage ;

La circulation des eaux usées dans le lit bactérien en amont des filtres permet donc de
favoriser le traitement sur les 2 étages de filtres plantés. Les résultats obtenus dans les travaux
réalisés ici ont permis de confirmer que le traitement de l’azote total se fait en grande partie
sur le premier étage de filtration et demeure très limité sur le second étage. De manière
quantitative, plus de 80% de la charge ammoniacale entrante a été nitrifiée et 70% des nitrates
crées ont été dénitrifiés avant le second étage. Les conditions opératoires des deux étages sont
sensiblement identiques en termes de pH, de température et de potentiel d’oxydo-réduction
des zones saturées. Cependant la dénitrification hétérotrophe est plus limitée dans la partie
immergée du second étage de filtration en raison de la plus faible disponibilité du carbone
organique, et plus précisément de ratio carbone : azote trop faible pour permettre une bonne
dénitrification.

4.2 CARTOGRAPHIE EN PROFONDEUR DES ETAGES DE FILTRATION

L’échantillonnage par horizons de 5cm dans les deux étages de filtration a permis d’étudier
l’évolution en profondeur des potentiels de nitrification et de dénitrification. Il en ressort
notamment que dans chacun des étages de filtration les plus forts potentiels sont observés à
l’interface entre la zone non-saturée et la zone saturée. Cette observation est d’autant plus
marquée pour la dénitrification dont les plus forts potentiels se situent dans les premiers
horizons de saturation et déclinent très fortement dans le fond de la zone d’immersion. Il
apparait que les meilleures conditions de dénitrification dans le système AZOE sont réunies
dans la partie supérieure de la zone de saturation, très certainement en raison d’une plus
grande disponibilité en carbone organique dans ces horizons. Le potentiel d’oxydo-réduction
est favorable et la nature des matériaux permet une plus grande surface de croissance du
biofilm (par rapport aux graviers grossiers drainant de fond de filtre).

218

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Une station AZOE-N permet le traitement d’environ 70 à 75% de la charge d’azote total
entrante. Toutefois, la variabilité des performances sur ce paramètre reste importante en
comparaison des performances obtenues sur le traitement de la charge carbonée. La figure 4-
1 présente de manière schématique la dégradation du carbone et les transformations de l’azote
sur chaque élément du procédé AZOE, et en fonction des conditions d’oxygénation.

FIGURE 4.2-1 : SCHEMA CONCEPTUEL DES MECANISMES DE TRAITEMENT EN CARBONE, AZOTE ET PHOSPHORE EN
FONCTION DE L’AVANCEE DU TRAITEMENT SUR LA FILIERE AZOE.

4.3 DYNAMIQUE DE L’AZOTE DANS LE SYSTEME AZOE-N®

Le suivi en ligne de l’azote sur les essais pilote apporte une vision plus fine de la dynamique
du traitement sur le système AZOE. Après toute phase d’alimentation suivie d’une phase de
repos, il a été observé un pic de nitrates dans les 12 heures après la remise en alimentation du
premier étage. Ce pic est dû au lessivage des nitrates formés pendant la phase de repos par
oxydation de l’ammonium préalablement accumulé pendant la phase d’alimentation. Ce pic
très marqué sur le premier étage est observé de manière plus étalée en sortie du second étage
avec un temps de retard proche du temps de rétention hydraulique moyen de la zone saturée.

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Pour affiner l’étude le suivi de l’azote en termes de rétention, transformation et migration dans
le système, un protocole de suivi isotopique a été développé spécifiquement. Une bâchée
marquée à 4,6 % en 15N-ammonium a été suivie pendant toute la durée d’une période
d’alimentation par analyses d’échantillons prélevés à intervalles de 2 heures entre chaque
étage de traitement composant le procédé AZOE. Cette étude a permis de confirmer
l’importante réactivité de l’ammonium avec le média filtrant. Ce traçage montre notamment
que le transfert de l’azote le long de la filière de traitement suit globalement la dynamique
hydraulique mais avec un retard temporel. A titre d’exemple, l’eau contenue dans le premier
étage est totalement renouvelée après 30 heures tandis que de l’azote marqué est toujours
détecté après 48 heures. L’ammonium marqué de la première bâchée est progressivement
nitrifié et restitué vers le second étage.

4.4 RELATION ENTRE CARBONE ET AZOTE

Les suivis de terrain et les essais pilotes ont démontré que les carences en carbone
organique étaient le facteur limitant de la dénitrification hétérotrophes dans le second étage
de filtration. Il s’agit plus généralement d’un problème récurrent pour les stations de
traitement des eaux usées dès lors que le traitement de l’azote total est impliqué (Wu et al.,
2014). Par ailleurs, il n’est pas étonnant de retrouver cette limite sur les systèmes AZOE-N dont
le lit bactérien contribue à réduire la quantité de carbone organique sur les étages de filtrations.
Une fois le traitement sur le lit bactérien effectué, l’effluent traverse la couche de dépôt de
surface où la majeure partie de son carbone organique particulaire est retenue. Les conditions
très oxydantes de la partie non-saturée du filtre entraînent la minéralisation de la matière
organique puis la nitrification de l’azote ammoniacal. Le rapport carbone : Azote à dénitrifier
évolue donc à la baisse tout au long de la filière. Quelle que soit l’échelle, réelle ou pilote, ce
rapport n’est d’environ que de 1 en entrée du second étage de filtration, soit une valeur bien
trop faible pour réaliser une dénitrification complète.

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Le rapport SUVA254, a également été suivi sur les échantillons d’eau prélevés en sortie de
chaque étage de traitement. Ce rapport est proportionnel à l’aromaticité de la matière
organique de l’échantillon (Weishaar et al., 2003, Banc et al., 2022). Les mesures montrent une
augmentation régulière du rapport SUVA254 et donc du pourcentage d’aromaticité (eaux
brutes = 1,7 soit 15% ; sortie lit bactérien= 3,5 soit 19% ; sortie 1er étage = 3,4 soit 25,6% ; eaux
traitées = 5,7 soit 40,9 %) le long de la filière de traitement et indiquent une complexification
de la matière organique, la rendant moins disponible (figure en annexes). Les composés
organiques les plus simples et disponibles sont donc préférentiellement dégradés au détriment
des plus aromatiques et complexes dont la part augmente logiquement à mesure que
traitement s’effectue. Le problème de la carence organique à la dénitrification est en somme
un problème de quantité mais aussi de qualité et donc de disponibilité de cette MO.

4.5 SOLUTIONS D’OPTIMISATION

Deux solutions d’apport de carbone sur le second étage de filtration ont été testées. Dans
un premier temps, le step-feeding a été étudié à l’échelle pilote. L’effet principal observé est la
modification de l’activité enzymatique de dénitrification après utilisation du step-feeding.
L’activité enzymatique de dénitrification a été significativement augmentée sur tous les
horizons de 5cm étudiés dans la zone saturée du second étage. En revanche, d’un point de vue
des performances de dénitrification, le step-feeding n’a pas eu d’impact significatif. Le rapport
carbone : azote relativement faible des eaux brutes des effluents urbains utilisées pour les
essais pilotes ait placé l’expérimentation dans des conditions limites. Son utilisation est
conditionnée à la valeur du rapport carbone : azote dans les eaux brutes. Un rapport inférieur
à 4 avec des effluents réels semble limiter les possibilités d’utilisation du step-feeding, en raison
du le volume trop important à dériver vers le second étage et de la quantité d’azote apportée
en conséquence.

Les boues de surface du premier étage font l’objet d’un intérêt croissant ces dernières
années au regard de leur caractérisation de leur comportement dans le temps (Kania, 2018) et
de leur propriété de complexation (Banc, 2021). Ces boues jouent notamment un rôle
important de rétention de la matière particulaire, dont l’azote organique et ammoniacal. Le
regard porté sur ces boues tend à changer et elles ne sont plus seulement considérées comme
un déchet inévitable du traitement, mais comme une ressource valorisable. La valorisation des

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boues a ici été considérée comme source éventuelle de carbone organique dans le but
d’améliorer la dénitrification sur le second étage. Cependant les quantités relarguées semblent
insuffisantes pour assurer un apport de carbone organique suffisant.

L’utilisation de matériaux bio-sourcés comme source de carbone a donc également été

évaluée. Il a été montré que le choix du matériau est déterminant et que le potentiel d’apport
de carbone entre eux est très variable. La valorisation des parties supérieures de roseaux en
été ou après faucardage ne semble pas être une solution efficace. En revanche, certains
matériaux comme les pailles de blé ou les rafles de maïs, présents en quantité sur tout le
territoire, semble présenter un fort potentiel grâce à leur libération importante de carbone et
une quantité limitée d’azote relarguée associée. La manière opérationnelle d’apporter les
matériaux sur le filtre demeure la principale interrogation à l’issue de ces travaux. Les déposer
à la surface du massif filtrant apparait comme une solution à bas coût de mise en œuvre mais
difficile à exploiter par l’accumulation des matériaux et leur éventuel curage. La réalisation
d’une macération de matériaux à fort potentiel comme les rafles de maïs est à explorer
puisqu’elle ne présente aucun risque de colmatage et pourrait permettre un dosage plus fin du
carbone apporté sur le filtre.

4.6 MODIFICATIONS OPERATIONNELLES

La mise en place d’une station AZOE aux performances optimisées est étroitement liée à la
gestion du carbone et de l’azote, en quantité et en qualité, le long de la filière de traitement.
Ces travaux ont permis d’explorer deux manières de compenser la carence en carbone sur le
second étage : le step-feeding et l’apport de matériaux biosourcés. Le step-feeding est
l’exemple même d’une modification qui pourrait être facilement prévue sur de futurs projets
sans surcoût trop conséquent (Nivala et al., 2019). Outre la modification structurelle
(canalisation, pompes, automates) que suggère le step-feeding, la station optimisée gagnerait
à devenir plus intelligente en s’ajustant à la dynamique de l’azote mise en évidence par ces
travaux. L’ajustement de l’ajout de carbone sur le second filtre pourrait être fonction des pics
de nitrates observés à chaque changement d’alimentation des cellules.

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4.7 MISE EN APPLICATION DES TRAVAUX DE THESE A TRANS-LA-FORET
A grande échelle ces solutions pourront être éventuellement testées sur la station de Trans-
la-Forêt. Le step-feeding semble être la solution privilégiée tant par sa facilité de mise en place
que par son coût d’exploitation très faible. Une pompe asservie à un compteur horaire entre le
poste de relèvement entre le lit bactérien et le premier étage et le poste de relèvement entre
le premier et le second étage (voir synoptique dans matériels et méthodes) devrait être
installée. Le rapport carbone : azote de Trans-la-forêt en prenant en compte la DCOd varie
entre 5 et 8, et semble donc favorable à l’utilisation de cette solution d’apport de carbone.

L’apport par matériaux biosourcés par différentes solutions est actuellement à l’étude, en
prenant en compte l’investissement du matériel nécessaire et les coûts de renouvellement des
matériaux.

4.8 MAITRISE DE L’EPURATION DE L’AZOTE DANS UN CONTEXTE GLOBAL

Les mesures de potentiel de nitrification et de dénitrification réalisées dans la profondeur
du massif filtrant soulignent que le N2 n’est pas nécessairement la forme finale de l’azote réduit.
Sous certaines conditions, du N2O peut être libéré en proportion significative. Certaines
modifications apportées à la filière de traitement, par exemple l’ajout de carbone pourraient
modifier la forme sous laquelle l’azote gazeux pourrait être libéré après dénitrification. Les
résultats obtenus dans cette thèse suggèrent donc une certaine prudence. Le N2O a en effet
un pouvoir de réchauffement global (PRG) très élevé (310). Son émission même marginale
renvoie ainsi au contexte de réchauffement global. Les processus biologiques impliqués dans
la réduction des nitrates au sein des filtres plantés sont complexes et la dénitrification
hétérotrophe, bien que très contributrice à la dénitrification globale, n’est qu’un processus
parmi d’autres possibles. Le lien entre les communautés de micro-organismes présentes dans
le milieu, les facteurs environnementaux et la forme finale de l’azote reste encore largement à
explorer.

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D’un point de vue opérationnel, ces travaux invitent à un changement d’échelle de pilote à
réelle quant à la faisabilité des méthodes d’apport de carbone testés. Concernant le step-
feeding un suivi fin de cette solution peut être mené sur le terrain qui peut très probablement
être optimisée par un pilotage asservi à la dynamique propre du système. A ce titre, ces travaux
soulignent l’importance du développement de capteurs et d’instrument de mesures en ligne
robustes, à coût acceptables et d’une précision suffisante.

Concernant l’utilisation de matériaux biosourcés, ces travaux ouvrent la voie à tester in-situ
différentes méthodes d’apport, et en particulier la mise en place d’un protocole de préparation
des matériaux par macération ou autres prétraitement réalisables.

Dans un autre registre, les collaborations interdisciplinaires dans le domaine de

l’isotopie et de la microbiologie ouvrent de nombreuses voies. La prise en compte de l’azote
gazeux sur le traçage isotopique serait une perspective d’intérêt pour boucler le bilan de masse
de l’azote et estimer au mieux les flux émanant de la dénitrification à partir d’une bâchée
initiale marquée. De plus, un développement isotopique dont un marquage supplémentaire
porterait sur une source de carbone ajouté pourrait être mis en place afin de renseigner sa
contribution réelle à la dénitrification. De plus, la mise en place d’un protocole simplifié
permettrait un changement d’échelle pour réaliser ce type de traçage à plus grande échelle et
sur des périodes plus longues. Enfin, le potentiel de l’isotopie pour le traitement des eaux usées
demeure encore sous-estimé et des investigations complémentaires ouvriraient encore le
champ des possibles.

Enfin, notre connaissance des facteurs environnementaux impliqués dans la dénitrification

et conduisant à la réduction des nitrates en N2O plutôt qu’en N2 méritent d’être affinée. La
disponibilité en carbone, la gestion de l’aération et de la dynamique hydraulique semblent
influencer les communautés de micro-organismes et sont des paramètres contrôlables dans les
filtres plantés de roseaux. De fait, les perspectives de recherche en ce domaine sont
nombreuses, notamment dans un contexte de réchauffement climatique.

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Annexes relative à article 1

Surface
NOM STEP Bilan Type EH Date Point DCO DBO MES NK Norg NH4 NO3 NGL PT
Total
ARBECEY 24h Classique 300 16/01/2020 entrée 750 453 130 110 78 33,7 44,3 0 78 7
ARBECEY 24h Classique 300 16/01/2020 sortie 750 43 6 52 5,5 2,5 3 45 51,7 1
CIEL 24h AZOE 2 étages 1200 10/10/2018 entrée 1680 583 170 280 60 17 43 0,2 60,3 6,7
CIEL 24h AZOE 2 étages 1200 10/10/2018 sortie 1680 18 0,7 2 1,5 0,5 1 14,7 16,2 2,8
CORMATIN 24h AZOE 2 étages 1000 23/08/2015 entrée 1500 480 350 280 100 36,22 63,78 2,3 100 7,7
CORMATIN 24h AZOE 2 étages 1000 23/08/2015 intermédiaire 1500 29 3 2 7,5 1,12 6,38 22,1 29,8 1,9
CORMATIN 24h AZOE 2 étages 1000 23/08/2015 sortie 1500 19 3 2 5,2 5,04 0,16 22,1 27,3 0,67
CORMATIN 24h AZOE 2 étages 1000 13/02/2019 entrée 1500 310 280 193 68 25,15 42,85 0,9 68,99 3,94
CORMATIN 24h AZOE 2 étages 1000 13/02/2019 intermédiaire 1500 14,9 0,7 4 7 7 0 14,9 21,99 0,16
CORMATIN 24h AZOE 2 étages 1000 13/02/2019 sortie 1500 10,8 0,6 64 1,4 1,4 0 13,3 15,9 0,19
CORMATIN 24h AZOE 2 étages 1000 27/04/2017 entrée 1500 470 190 140 65,6 14,4 51,2 0,23 65,9 6,5
CORMATIN 24h AZOE 2 étages 1000 27/04/2017 sortie 1500 30 3 2,2 3 2,22 0,78 11,1 14,1 3,6
CORCELLES-LES-
24h AZOE 1 étage 1250 22/07/2020 entrée 1250 624 330 980 110 13,6 96,4 0 110 11,84
CITEAUX
CORCELLES-LES-
24h AZOE 1 étage 1250 22/07/2020 sortie 1250 38 3 2 11,6 1,4 10,2 27,1 39,3 2,12
CITEAUX

238

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© [K. Maciejewski], [2022], INSA Lyon, tous droits réservés
Surface
NOM STEP Bilan Type EH Date Point DCO DBO MES NK Norg NH4 NO3 NGL PT
Total
CRAS SUR
24h AZOE 1 étage 1125 11/09/2017 entrée 1125 872 421 416 113 8 105 0,11 113,12 11,3
REYSSOUZE
CRAS SUR
24h AZOE 1 étage 1125 11/09/2017 sortie 1125 58 10 8 21,5 1,7 19,8 9,19 31,92 1,99
REYSSOUZE
CRAS SUR
24h AZOE 1 étage 1125 17/10/2018 entrée 1125 998 392 476 85,7 16,6 69,1 0,11 85,82 10,1
REYSSOUZE
CRAS SUR
24h AZOE 1 étage 1125 17/10/2018 sortie 1125 45 7 9 7 2,61 4,39 38 45,66 5,29
REYSSOUZE
CURTAFOND 24h AZOE 1 étage 700 19/06/2017 entrée 700 752 259 353 94,3 19,7 74,6 0,11 94,42 10
CURTAFOND 24h AZOE 1 étage 700 19/06/2017 sortie 700 60 6 8 8 2,58 5,42 29,1 39,57 4,57
DAUPHIN 24h AZOE 1 étage 1083 06/06/2018 entrée 1100 866 170 280 65,4 14 51,4 0,23 65,73 7,1
DAUPHIN 24h AZOE 1 étage 1083 06/06/2018 sortie 1100 85 9 12 14,3 1,8 12,5 24,8 41,65 6,2
LAVERNAY 24h AZOE 2 étages 1080 21/10/2019 entrée 1080 1550 720 400 88,8 32,8 56 0 88,8 15
LAVERNAY 24h AZOE 2 étages 1080 21/10/2019 sortie 1080 12 3 2 0,9 0,1 0,8 13,6 14,2 1,4
MARLIEUX 24h AZOE 1 étage 1250 26/08/2020 entrée 1248 912 470 380 91 25 66 0 91 11,3
MARLIEUX 24h AZOE 1 étage 1250 26/08/2020 sortie 1248 32 3 9,2 10,6 1,2 6,4 7,8 18,6 0,5
MASSERAC 24h AZOE 1 étage 700 07/08/2019 entrée 770 1352 440 520 132 33 99 0 132 14,72
MASSERAC 24h AZOE 1 étage 700 07/08/2019 sortie 770 6 69 13 6,8 3 3,8 36 42,8 7,49
PETIT-NOIR 24h AZOE 2 étages 1500 18/12/2014 entrée 1500 418 200 200 52,9 17,3 35,6 4,2 60,3 7,4
PETIT-NOIR 24h AZOE 2 étages 1500 18/12/2014 sortie 1500 3 2,9 5 5,86 2,86 3 1,67 5,86 2,9
PETIT-NOIR 24h AZOE 2 étages 1500 22/10/2014 entrée 1500 484 209 200 73,2 17,3 55,9 0,26 73,473 7,23
PETIT-NOIR 24h AZOE 2 étages 1500 22/10/2014 sortie 1500 22,7 6,7 4,5 3,4 1,4 2 32 35,485 3,26
POULIGNEY-
24h AZOE 1 étage 1000 10/07/2019 entrée 1000 577 248 290 93,6 18,5 75,1 0,23 93,85 10,8
LOUSANS

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Surface
NOM STEP Bilan Type EH Date Point DCO DBO MES NK Norg NH4 NO3 NGL PT
Total
POULIGNEY-
24h AZOE 1 étage 1000 10/07/2019 sortie 1000 87 11 26 15,6 1,1 14,5 1,5 17,36 9,8
LOUSANS
REILLANE 24h AZOE 2 étages 1950 11/09/2014 entrée 3000 740 280 390 79,3 21,3 58 0,22 79,63 9,9
REILLANE 24h AZOE 2 étages 1950 11/09/2014 sortie 3000 48 3 5,7 14 3 11 6,2 20,5 3,6
REILLANE 24h AZOE 2 étages 1950 17/12/2014 entrée 3000 806 400 400 90,3 15,1 75,2 0 90,3 8,95
REILLANE 24h AZOE 2 étages 1950 17/12/2014 sortie 3000 40 3 2 8,17 1,48 6,69 4,06 12,23 1,58
SAINT-BOIL 24h Classique 500 13/02/2019 entrée 1250 145 137 74 22 7,766667 14 4 26 1
SAINT-BOIL 24h Classique 500 13/02/2019 intermédiaire 1250 25,8 5,8 75 19 5,155556 14 11 30 1
SAINT-BOIL 24h Classique 500 13/02/2019 sortie 1250 18 0,9 14 3 -13,7222 17 28 32 1
SAINT-LUPERCE 24h AZOE 2 étages 1300 25/09/2017 entrée 1680 1852 580 1100 74,4 4,4 70 0,6 75,24 17,2
SAINT-LUPERCE 24h AZOE 2 étages 1300 25/09/2017 sortie 1680 30 3,4 4,4 1,7 0,9 0,8 31 32,71 9,5
SAINT-LUPERCE 24h AZOE 2 étages 1300 13/02/2017 entrée 1680 480 180 155 98 9,8 88,2 0,6 98,61 10
SAINT-LUPERCE 24h AZOE 2 étages 1300 13/02/2017 sortie 1680 35 1,8 6,4 3,6 0,36 3,24 20 23,75 8,16
SAINT-LUPERCE 24h AZOE 2 étages 1300 27/09/2018 entrée 1680 714 270 233 121 12,1 108,9 0,6 121,61 12,9
SAINT-LUPERCE 24h AZOE 2 étages 1300 27/09/2018 sortie 1680 39 1,2 2 8,6 0,86 7,74 0,6 9,21 13,6
SAINT-LUPERCE 24h AZOE 2 étages 1300 28/03/2018 entrée 1680 1726 660 1064 78,9 33,9 45 0,6 79,51 12,9
SAINT-LUPERCE 24h AZOE 2 étages 1300 28/03/2018 sortie 1680 30 3,3 6 6,8 3,5 3,3 11 17,85 3,62
SAINT DESERT 24h AZOE 2 étages 1000 22/09/2016 entrée 1500 217 130 144 36,9 10,2 26,7 0,2 37,13 4,1
SAINT DESERT 24h AZOE 2 étages 1000 22/09/2016 sortie 1500 30 3 2 3 2,2 0,8 13,3 16,6 1,3
SAINT DESERT 24h AZOE 2 étages 1000 23/09/2016 entrée 1500 385 89 110 33,5 8,3 25,2 1 34,53 3,7
SAINT DESERT 24h AZOE 2 étages 1000 23/09/2016 sortie 1500 89 3 2 3 2,2 0,8 14 17,03 1,3
SAINT DESERT 24h AZOE 2 étages 1000 15/05/2017 entrée 1500 130 69 92 31 12,12 18,88 0,29 31,97 2,92
SAINT DESERT 24h AZOE 2 étages 1000 15/05/2017 sortie 1500 3 3 4 1,6 1,55 0,05 9,49 11,096 1,27

240

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Surface
NOM STEP Bilan Type EH Date Point DCO DBO MES NK Norg NH4 NO3 NGL PT
Total
SAINT DESERT 24h AZOE 2 étages 1000 16/05/2017 entrée 1500 160 87 120 29 4,3 24,7 0,12 29,126 3,31
SAINT DESERT 24h AZOE 2 étages 1000 16/05/2017 sortie 1500 7 3 4 3,2 3,11 0,09 10,62 13,826 1,26
SAINT DESERT 24h AZOE 2 étages 1000 17/05/2017 entrée 1500 200 68 94 25 6,56 18,44 0,29 25,854 3,47
SAINT DESERT 24h AZOE 2 étages 1000 17/05/2017 sortie 1500 4 3 4 1,2 1,14 0,06 11,75 12,956 1,52
SAINT DESERT 24h AZOE 2 étages 1000 07/08/2018 entrée 1500 768 270 340 138 38 100 0,22 138,24 12
SAINT DESERT 24h AZOE 2 étages 1000 07/08/2018 sortie 1500 24 3 2 1,4 0,8 0,6 9,82 11,24 0,69
SAINT DESERT 24h AZOE 2 étages 1000 08/08/2018 entrée 1500 1930 470 780 79,7 35,7 44 0,22 79,94 12
SAINT DESERT 24h AZOE 2 étages 1000 08/08/2018 sortie 1500 11 3 2 0,9 0,3 0,6 8,48 9,4 0,74
SAINT DESERT 24h AZOE 2 étages 1000 09/08/2018 entrée 1500 740 180 350 82,5 23,5 59 0,22 82,74 7,7
SAINT DESERT 24h AZOE 2 étages 1000 09/08/2018 sortie 1500 23 3 2 1,2 0,6 0,6 5,9 7,12 0,67
SAINT DESERT 24h AZOE 2 étages 1000 14/02/2019 entrée 1500 199 180 181 51 16,63 34,37 3,29 54,5 2,56
SAINT DESERT 24h AZOE 2 étages 1000 14/02/2019 intermédiaire 1500 14,9 2,3 90 19 5,08 13,92 1,49 20,58 2,04
SAINT DESERT 24h AZOE 2 étages 1000 14/02/2019 sortie 1500 10,8 1,6 36 12 5,78 6,22 7,5 19,62 0,8
SAINTE-HELENE 24h Classique 400 14/02/2019 entrée 800 248 138 184,74 38 13,34 24,66 4,55 42,86 2,37
SAINTE-HELENE 24h Classique 400 14/02/2019 intermédiaire 800 37,7 5,3 81,90 28 8,17 19,83 8,20 36,32 4,05
SAINTE-HELENE 24h Classique 400 14/02/2019 sortie 800 21,9 1,4 25,95 3 2,22 0,78 34,32 37,41 2,84
SAINT-PAUL-DE-
24h AZOE 2 étages 2500 14/03/2020 entrée 3500 165 62 57 31 8 23 0 31 3,1
VARAX
SAINT-PAUL-DE-
24h AZOE 2 étages 2500 14/03/2020 sortie 3500 20 3 4,5 5,5 2,8 2,7 1,65 8,95 1,24
VARAX
SONCOURT SUR
24h Classique 450 15/07/2015 entrée 1035 592 228 180 84,4 16,3 68,1 0,23 84,68 8,95
MARNE
SONCOURT SUR
24h Classique 450 15/07/2015 sortie 1035 36 4,7 4,6 8,1 4,1 4 36 44,77 4,16
MARNE

241

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Surface
NOM STEP Bilan Type EH Date Point DCO DBO MES NK Norg NH4 NO3 NGL PT
Total
SAINT MICHEL
24h AZOE 2 étages 1200 08/11/2017 entrée 1740 621 170 183 60,2 11 49,2 0,23 60,46 6
L'OBSERVATOIRE
SAINT MICHEL
24h AZOE 2 étages 1200 08/11/2017 sortie 1740 20 3 2 4,3 0,9 3,4 18,3 22,83 1,8
L'OBSERVATOIRE
THOARD 24h AZOE 1 étage 900 15/02/2016 entrée 880 587 220 206 43,6 4,6 39 0 43,6 5,1
THOARD 24h AZOE 1 étage 900 15/02/2016 sortie 880 50 6 11 6,26 0 6,26 22,12 29,18 0,5
THOARD 24h AZOE 1 étage 900 16/02/2016 entrée 880 418 130 160 35,3 3,5 31,8 0 35,3 4,4
THOARD 24h AZOE 1 étage 900 16/02/2016 sortie 880 46 7 4,3 4,3 -0,52 4,82 20,54 25,94 0,5
THOARD 24h AZOE 1 étage 900 17/02/2016 entrée 880 304 210 207 38,1 3,4 34,7 0 38,1 4,7
THOARD 24h AZOE 1 étage 900 17/02/2016 sortie 880 48 6 5,2 5,2 1,11 4,09 20,54 26,64 0,5
THOARD 24h AZOE 1 étage 900 11/06/2015 entrée 880 728 270 280 76 8,8 67,2 0 76 8,99
THOARD 24h AZOE 1 étage 900 11/06/2015 sortie 880 128 24 17 24,7 5,7 19 24,6 49,3 6,88
TRANS LA FORET 24h AZOE 2 étages 450 25/07/2016 entrée 675 1099,7 320,0 468,7 120,7 22,7 98,0 0,4 121,1 12,7
TRANS LA FORET 24h AZOE 2 étages 450 25/07/2016 intermédiaire 675 62,7 3,3 8,6 27,9 2,6 25,3 4,9 33,2 0,9
TRANS LA FORET 24h AZOE 2 étages 450 25/07/2016 sortie 675 63,7 5,3 7,4 3,6 2,5 1,2 25,6 29,3 0,9
TRANS LA FORET 24h AZOE 2 étages 450 25/07/2016 entrée 675 625,3 330,0 224,0 118,0 19,7 98,3 0,2 118,3 12,4
TRANS LA FORET 24h AZOE 2 étages 450 25/07/2016 intermédiaire 675 59,7 5,7 5,9 18,9 0,6 18,3 23,2 42,2 3,8
TRANS LA FORET 24h AZOE 2 étages 450 25/07/2016 sortie 675 34,3 3,0 2,0 3,0 2,2 0,8 36,9 39,9 4,7
TRANS LA FORET 24h AZOE 2 étages 450 25/07/2016 entrée 675 675,0 366,7 529,3 116,0 31,7 84,3 0,3 116,3 12,4
TRANS LA FORET 24h AZOE 2 étages 450 25/07/2016 inter 675 53,3 3,0 9,9 22,8 1,9 20,8 10,1 33,0 1,4
TRANS LA FORET 24h AZOE 2 étages 450 25/07/2016 sortie 675 45,0 3,0 3,8 15,7 1,3 14,4 11,5 27,2 2,3
TRANS LA FORET 24h AZOE 2 étages 450 25/07/2016 entrée 675 943,0 346,7 410,7 113,7 34,3 79,3 0,2 113,9 8,1
TRANS LA FORET 24h AZOE 2 étages 450 25/07/2016 intermédiaire 675 61,0 5,0 9,5 36,8 4,7 32,2 3,4 40,5 4,2

242

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Surface
NOM STEP Bilan Type EH Date Point DCO DBO MES NK Norg NH4 NO3 NGL PT
Total
TRANS LA FORET 24h AZOE 2 étages 450 25/07/2016 sortie 675 54,7 5,3 5,1 12,4 2,3 10,0 19,9 32,4 3,5
VERCIA ponctuel AZOE 2 étages 1200 13/02/2019 entrée 1200 85,9 79 293,8 44,0 12,4 31,6 4,0 48,3 1,5
VERCIA ponctuel AZOE 2 étages 1200 13/02/2019 sortie 1200 22,3 0,1 26,2 16,0 3,1 12,9 1,9 18,0 2,6
VENTEROL ponctuel AZOE 2 étages 188 10/05/2019 entrée 188 768 320 672 51,4 31 20,4 0,1 51,6 14,8
VENTEROL ponctuel AZOE 2 étages 188 10/05/2019 sortie 188 115 36 62 22,2 6 16,2 2,7 25,18 2,9
BAGE-LA-VILLE1 24h Classique 919 09/05/2012 entrée 2200 346 100 126 33,8 10,8 23 0,23 34 3,9
BAGE-LA-VILLE1 24h Classique 919 09/05/2012 sortie 2200 49 3 3 1,3 1,04 0,26 47,9 49,2 2,5
BAGE-LA-VILLE1 24h Classique 919 26/03/2013 entrée 2200 267 170 226 32 2,4 29,6 0,61 33,1 3,89
BAGE-LA-VILLE1 24h Classique 919 26/03/2013 sortie 2200 19 10 2 1,1 0,94 0,16 21,8 22,9 3,15
SAINT-ANDRE-DE-
24h Classique 300 22/05/2012 entrée 1600 248 170 197 21,5 9,1 12,4 0,2 21,7 2,13
BAGE-LA-VILLEE
SAINT-ANDRE-DE-
24h Classique 300 22/05/2012 sortie 1600 17 3 2 1,6 1,44 0,16 19,4 21 2,98
BAGE-LA-VILLEE
VILLEMOTIER 24h Classique 133 17/04/2012 entrée 700 340 120 98 47 13,1 33,9 1,47 48,5 4,7
VILLEMOTIER 24h Classique 133 17/04/2012 sortie 700 13 3 3 1 0,84 0,16 37 38 5,3

243

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TOC
(mg/L)
J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8

VER 33,6 ± 0,0 22,4 ± 5,9 18,6 ± 5,0 17,4 ± 0,8 21,6 ± 0,0 15,3 ± 12,8 ± 0,0 11,5 ± 0,0
Paillis 799,0 ± 0,0 514,3 ± 77,9 498,7 ± 0,0 485,6 ± 745,8 ± 0,0 384,7 ± 78,6 282,4 ± 0,0 196,1 ± 0,0
BRF 2075,0 ± 120,2 954,0 ± 55,2 448,5 ± 27,6 279,0 ± 14,1 298,2 ± 11,5 125,1 ± 0,2 84,2 ± 2,7 97,7 ± 21,9
Rafles 4490,0 ± 268,7 1680,0 ± 169,7 641,5 ± 120,9 309,0 ± 43,8 355,5 ± 60,1 197,0 ± 8,4 131,4 ± 2,0 117,9 ± 6,3
RV 2955,0 ± 21,2 1506,0 ± 22,6 850,3 ± 25,3 569,6 ± 59,7 964,5 ± 78,5 412,4 ± 24,3 226,7 ± 33,4 156,1 ± 31,5
RH 1278,0 ± 76,4 999,0 ± 62,2 691,0 ± 19,8 737,5 ± 10,9 950,5 ± 13,4 404,6 ± 27,9 275,7 ± 15,6 202,0 ± 10,3
Foin 5615,0 ± 332,3 4050,0 ± 14,1 3225,0 ± 219,2 2325,0 ± 49,5 2110,0 ± 282,8 921,5 ± 2,1 741,4 ± 316,3 507,5 ± 186,0

TOC
(mg/L)
J9 J10 J11 J12 J13 J14 J15 J16

VER 6,7 ± 0,4 9,5 ± 3,8 9,0 ± 0,0 5,5 ± 0,0 6,4 ± 0,2
Paillis 161,7 ± 0,0 190,1 ± 0,0 110,4 ± 0,0 95,0 ± 0,0 67,1 ± 0,0 37,0 ± 8,3 42,3 ± 9,0 37,1 ± 8,0
BRF 62,9 ± 9,5 55,1 ± 2,3 24,5 ± 0,0 32,2 ± 21,7 11,2 ± 3,7 12,0 ± 1,3
Rafles 110,6 ± 0,9 259,0 ± 32,5 133,0 ± 0,0 84,9 ± 9,1 58,7 ± 5,8 43,5 ± 6,1
RV 67,4 ± 4,7 116,1 ± 16,3 51,6 ± 0,0 32,2 ± 8,9 12,8 ± 0,1
RH 162,1 ± 7,5 179,4 ± 7,5 113,3 ± 0,0 49,0 ± 12,1 28,4 ± 1,6 20,8 ± 1,0 42,8 ± 0,8
Foin 425,5 ± 170,4 508,5 ± 235,6 430,8 ± 0,0 365,0 ± 172,6 275,5 ± 125,2 261,9 ± 80,7 414,5 ± 55,9

244

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THESE DE L’UNIVERSITE DE LYON OPEREE AU SEIN DE L’INSA LYON

NOM : MACIEJEWSKI DATE de SOUTENANCE : 12/07/2021

Prénoms : Kévin

TITRE :
Traitement des eaux usées dans les filtres plantés à écoulement vertical. Etude dynamique de l’azote dans les
étapes du procédé et des limitations de la dénitrification

NATURE : Doctorat
Numéro d'ordre : 2022LYSEI064
Ecole doctorale : ED 206

Spécialité : Environnement

RESUME :
Les systèmes de traitement des eaux usées par filtres plantés de roseaux se sont imposés comme une référence
sur le territoire national, notamment pour le traitement d’effluent domestiques ou agricoles en zone rurale. Le
procédé AZOE développé par l’entreprise SCIRPE, est un procédé optimisé de traitement de l’eau végétalisée. Les
bases de ce procédé sont celles d’un filtre planté de roseaux classiques à deux étages et à flux hydraulique vertical,
auquel a été ajouté un lit bactérien en tête de filière. Les travaux de ce mémoire de thèse se divisent en deux
grandes parties i) étude et compréhension du système à différentes échelles ii) optimisation du traitement de l’azote.
Dans la première partie une étude de données de terrain sur une période de 15 ans de fonctionnement de la filière
AZOE a fait l’objet d’une publication scientifique. De plus, un suivi de la filière AZOE à l’échelle pilote est présenté.
Quel que soit l’échelle, réelle ou pilote, les résultats montrent l’importance de l’association lit bactérien et premier
étage dans le traitement du carbone et l’azote par nitrification et dénitrification, le potentiel d’optimisation de second
étage. L’étude de la filière AZOE a fait l’objet d’un développement de méthode de traçage isotopique par azote
marqué avec le laboratoire d’isotopie de l’Institut des Sciences Appliquées de Lyon dont les résultats y sont
présentés. Une seconde partie du mémoire est dédiée à l’étude de l’optimisation du traitement de l’azote total par
dénitrification. Une stratégie d’apport de carbone par dérivation d’effluent brute y est présentée via des tests sur le
pilote. Les résultats sont discutés au regard des performances d’abattement de l’azote, mais aussi des
modifications sur les communautés de micro-organismes présente sur le système. Ce dernier point a fait l’objet
d’une collaboration avec l’unité de recherche en écologie microbienne de l’université de Lyon.

MOTS-CLÉS :
Filtres plantés de roseaux, azote, nitrification, dénitrification, lit bactérien, traçage isotopique, microbiologie du
traitement de l’eau

Laboratoire (s) de recherche :

Déchets Eaux Environnement et Pollutions (DEEP INSA, Lyon)
SCIRPE Centre-Est

Directeur de thèse : Rémy Gourdon

Composition du jury :

Rousseau, Diederik Professeur – Univ. Ghent Rapporteur

Andres, Yves Professeur - IMT Atlantique Rapporteur
Delolme, Cécile Directrice de recherche – ENTPE Examinatrice
Garcia, Joan Professeur – Univ. Polytechnique de Catalogne Examinateur
Mendret, Julie Maître de conférences – IEM Examinatrice
Gourdon, Rémy Professeur – INSA Lyon Directeur de thèse
Gautier, Mathieu Maître de conférences – INSA Lyon Co-Encadrant
Molle, Pascal Directeur de recherche – INRAE Co-Encadrant

246

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