UNIVERSITE MARIEN NGOUABI
FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES
DEPARTEMENT DES MASTERS
PARCOURS DES MASTERS DES SCIENCES BIOLOGIQUES
COMPTE RENDU DU TP DE BACTERIOLODIE
Titre : Etude de la croissance bactérienne en milieu
liquide non renouvelé et de la production d’enzyme
protéolytique chez deux souches Bacillus
Présenté par : KENDE Sereinah Daniella
Niveau : Master I
Option : Biologie Cellulaire et Moléculaire
Responsable du cours : Pr NGUIMBI Etienne
Année Académique
2023-2024
1
I BUT
Le but de la manipulation est de suivre simultanément la croissance et la
production d’enzyme protéolytique chez deux souches de Bacillus
I PRINCIPE
La croissance bactérienne se définit comme une augmentation du nombre
de bactéries cela se manifeste lorsque les bactéries sont placées dans un
milieu de culture possédant des nutriments favorables à leur croissance. Le
milieu de culture étant non renouvelé (milieu pour lequel on n’apporte pas
de nouveau substrat en cours de culture), la croissance est limitée et
s’arrête par épuisement des substrats et accumulation de déchets toxiques
issus du métabolisme des bactéries.
II MATERIELS
➢ Matériel biologique : Deux souches de Bacillus
➢ Appareils : l’étuve, la hotte, le PH mètre, l’agitateur magnétique,
la balance, le spectrophotomètre, plaque chauffante,
réfrigérateur, le four, l’autoclave
➢ Verreries : bêcher, erlenmeyer, boite de pétri
➢ Milieu de culture : le LB liquide, le Mossel, l’Agar
➢ Autres matériels : bec Bunsen, embouts, baron aimanté,
micropipette, anse de prélèvement, cuve à spectrophotomètre,
tube Falcon, tubes Eppendorf, papier aluminium
III MODE OPERATOIRE
Préparation des milieux de cultures
➢ Pour le Mossel : peser 45g de poudre de Mossel et dissoudre dans 950ml
d’eau distillée, chauffer pour dissoudre complètement. Stériliser pendant
15 minutes à 121°c à l’autoclave.
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➢ Pour le LB : peser 23g de poudre de LB et dissoudre dans 1L chauffer
pour dissoudre complètement. Stériliser pendant 15 minutes à 121°c à
l’autoclave.
➢ Réactiver les souches sur Mossel
➢ Racler une portion de colonies puis cultiver cette colonie over night
dans l’erlenmeyer contenant 20 ml de LB liquide
➢ Prélever 1ml de la culture over night inoculée dans l’erlenmeyer
contenant 100 ml de LB liquide ensuite incubé à 37°c pendant 48h
➢ Prélever toutes les 2 heures 3ml (dont 2ml pour la mesure de la DO et 1ml
pour la production enzymatique)
➢ Mesurer la densité optique à l’aide spectrophotomètre à 600nm
➢ Mesurer le pH à l’aide d’un PH-mètre
➢ Mettre en évidence la production d’enzyme protéolytique contre la
caséine contenue dans le lait écrémé
• Prendre 1g d’agarose et dissoudre dans 100ml de tampon PBS à
0,1M. Chauffer jusqu’à dissolution complète d’agarose puis laisser
refroidir (entre 50 et 60°). Ajouter 10ml de lait écrémé,
homogénéiser puis couler sur les boites
• Après solidification, faire des puits dans le milieu avec l’embout
d’une pipette
• Centrifuger la culture, pipeter 0,2 ml du surnageant et déposer dans
chaque puits
• La production d’enzymes protéolytiques se manifeste par
l’apparition d’une zone claire autour du puits
❖ Utiliser un tableau pour les résultats.
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1er jour 2ième jour
Temps
8h 1Oh 12h 14h 16H 24h 26h 28h 30h 32h
D.O 0,15 0,22 0,38 0,50 0,78 0,84 0,85 0,81 0,48 0,46
P.H 4,74 5,28 5,61 4,99 4,996 4,48 5,83 5,89 5,68 6,13
P. E 0 1,06 0,83 1,83 0,7 1,03 0,86 0,86 0,83 0,73
IV ANALYSE ET INTERPRETATION DES COURBES
Courbes de la densité optique (DO)
D.O RE21
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
8h12 10h12 12h25 14h25 16h25 24h15 26h22 28h25 30h25 32h25
Cette courbe nous montre la variation de la DO en fonction du temp. Nous
constatons qu’il y’a absence de phase de latence ce qui signifie que les
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bactéries possèdent déjà des enzymes capables de dégrader les nutriments
contenus dans le milieu.
❖ De 8h12 à 14h25 : la densité optique augmente ce qui s’explique par
l’augmentation de la vitesse de croissance : il s’agit de la phase
d’accélération
❖ De 14h25 à 16h 25 : la densité optique augmente progressivement ce
qui signifie que la vitesse de division est constante et maximale. Les
bactéries sont dans un bon état physiologique et se divisent de façon
exponentielle : il s’agit de la phase exponentielle
❖ De 16h25 à 24h15 : il y’a ralentissement de la densité optique ce qui
signifie que le taux de croissance diminue. Les nutriments ont commencé
à s’épuiser dans le milieu causant ainsi la mort de certaines bactéries : il
s’agit de la phase de ralentissement.
❖ De 24h15 à 26h22 : la densité optique est constante ce qui signifie que
le nombre de bactéries vivantes est égal au nombre de bactéries mortes.
Il y a épuisement du milieu particulièrement le facteur limitant et
l’accumulation de déchets toxiques libérés dans le milieu par les
bactéries : il s’agit de la phase stationnaire.
❖ De 26h22 à 28h25 : la densité optique décroit ce qui signifie que le
nombre de bactéries mortes est supérieur à celui des bactéries vivantes.
Cela marque le début de la phase de déclin
❖ De 28h25 à 30h 25 : la densité optique décroit progressivement ce qui
signifie que les bactéries meurent sous l’action des enzymes
protéolytiques endogènes (autolyse) : il s’agit de la phase de déclin
❖ De 30h25 à 32h 25 : la densité optique est une droite ce qui signifie que
le taux de mortalité est constant. Certaines bactéries se sont mises à
former leurs endospores empêchant ainsi un taux de mortalité d’ordre
exponentiel.
Nous pouvons dire que la densité optique est proportionnelle à la croissance
bactérienne. Plus le taux de croissance est élevé plus la densité optique
augmente.
Courbe de la DO et du PH
5
Titre du graphique
0,9 7
0,8 6
0,7
DENSITÉ OPTIQUE
5
0,6
0,5 4
PH
0,4 3
0,3
2
0,2
0,1 1
0 0
8H 10H 12H 14H 16H 24H 26H 28H 30H 32H
TEMPS
DO R21 pH R21
Cette courbe montre la variation de la DO et du PH en fonction de temps. Nous
constatons que le PH est resté acide durant toute la durée de la culture.
L’acidité du milieu n’a pas empêché la croissance bactérienne ce qui signifie
que les bactéries supportent l’acide et sont capables croitre dans un milieu
acide : elles sont dites acidophiles.
❖ De 8h à 12h : le PH varie de façon proportionnelle à la densité optique
ce qui signifie que les métabolites libérés par les bactéries dans le milieu
rendent le PH moins acide.
❖ De 12h à 14h : le PH varie de façon inversement proportionnelle à la
densité optique cela s’explique par une diminution des métabolites
libérés par les bactéries
❖ De 14h à 16h : le PH est constant par rapport à la densité optique qui
augmente progressivement ce qui signifie que ce PH est favorable à la
croissance exponentielle des bactéries
❖ De 16h à 24h : le PH varie de façon inversement proportionnelle à la DO
au cours de la phase de ralentissement ce qui signifie que le contenu
cellulaire libéré par les bactéries mortes modifie le PH.
❖ De 24h à 28h : le PH augmente par rapport à la densité optique ce qui
signifie que les bactéries vivantes libèrent dans le milieu des métabolites
qui rendent le PH moins acide
❖ De 30h à 32h : le PH tend vers la neutralité cela s’explique par le fait que
les bactéries vivantes sont sous forme sporulées
Courbe de la DO et de la production enzymatique (PE)
6
0,9
Titre du graphique 2
0,8 1,8
0,7 1,6
1,4
0,6
1,2
0,5
1
0,4
0,8
0,3
0,6
0,2 0,4
0,1 0,2
0 0
8H 10H 12H 14H 16H 24H 26H 28H 30H 32H
DO R21 PE
Cette courbe nous montre la variation de la densité optique et celle de la
production enzymatique en fonction du temps.
❖ De 8h à 10h : la PE croit proportionnellement à la DO cela s’explique par
le fait que les bactéries ont synthétisé des enzymes capables de dégrader
la caséine présente dans le milieu
❖ De 10h à 12h : la courbe baisse légèrement parce qu’il y a eu baisse de
la production des enzymes
❖ De 12h à 14h : la PE croit proportionnellement à la DO cela s’explique
par le fait que les bactéries ont synthétisé des enzymes capables de
dégrader la caséine présente dans le milieu
❖ De 14h à 16h : la PE varie de façon inversement proportionnelle à la DO
cela s’explique par le fait qu’il y’a diminution de la caséine dans le milieu :
la caséine à un effet inducteur
❖ De 16h à 24h : la PE croit cela s’explique par le fait que les bactéries
mortes par autolyse libèrent le contenu cellulaire favorisant ainsi la
production des enzymes
❖ De 24h à 32h : la PE des enzymes diminue cela s’explique par
l’épuisement de la caséine dans le milieu causant ainsi la mort des
bactéries
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ANNEXE
PH mètre Micropipette PE de la souche R 21
Etuve Becher Bec Bunsen
Tube Falcon Erlenmeyer Hotte
Spectrophotomètre