INTRODUCTION

INTRODUCTION
Le département de Microbiologie (Contrôle de Qualité) joue un rôle majeur dans l'apport
produit sûr sur le marché. Ils sont impliqués dans des décisions critiques concernant
environnement de fabrication, développement de la formulation et du processus de fabrication qui
peut prévenir la contamination microbienne des produits pharmaceutiques. Ces tests comprennent
Test de bioburden
test et test microbien de l'eau (test de comptage microbien total et test pour les pathogènes).
Dans ce rapport de projet, le niveau d'implication approprié des microbiologistes dans
établir la qualité, la pureté, l'efficacité et la sécurité des produits pharmaceutiques et des...
les produits de lutte contre les drogues sont discutés, et les domaines de défi futur pour le
les microbiologistes pharmaceutiques sont explorés.

Le développement de nombreux vaccins et d'autres médicaments qui ont été si cruciaux pour
l'amélioration de la santé mondiale a été le résultat de grands investissements dans la recherche par
les grandes entreprises pharmaceutiques internationales devenant l'une des plus constantes
des industries réussies et importantes dans de nombreux pays, non seulement dans les secteurs traditionnels
bastions d'Amérique du Nord, d'Europe de l'Ouest et du Japon mais de plus en plus en Orient
Europe, le sous-continent indien et l'Extrême-Orient.

La croissance de l'industrie pharmaceutique au cours des dernières décennies a été parallèlement accompagnée d'une augmentation

normes de qualité des produits et réglementation plus stricte de la fabrication

procédures. Afin de recevoir une licence de fabrication, un médicament moderne doit être
démontré comme étant efficace, sûr et de bonne qualité. La plupart des médicaments sont constitués d' actifs
ingrédients formulés avec une variété d'autres matériaux (excipient) qui sont
nécessaire pour garantir que le médicament est efficace, stable, agréable au goût et sûr
durant le stockage et l'utilisation.

Les chimistes analytiques et les pharmaciens ont la responsabilité principale de s'assurer que le
les composants de la médecine sont présents dans la forme physique et la concentration correctes,
mais la qualité n'est pas jugée uniquement sur les propriétés physico-chimiques du produit :
Les micro-organismes ont également le potentiel d'influencer l'efficacité et la sécurité. Il est évident
que les médicaments contaminés par des microorganismes potentiellement pathogènes peuvent dans
En plus d'initier des infections, provoquer la détérioration des produits en se décomposant chimiquement.
l'ingrédient actif ou l'excipient. Cela peut entraîner un produit sous-dosé,
physiquement ou chimiquement instable ou éventuellement contaminé par des matériaux toxiques.
Ainsi, il est clair que la microbiologie pharmaceutique doit englober les sujets de
stérilisation et conservation contre la détérioration microbienne, et avec responsabilité pour
la fabrication sûre et hygiénique. À cet égard, la microbiologie pharmaceutique a
rôle très important. La production commerciale d'antibiotiques a créé une grande importance
de microbiologiste pharmaceutique dans l'industrie pharmaceutique.

La qualité microbiologique des produits pharmaceutiques est influencée par le

environnement dans lequel ils sont fabriqués et par les matériaux utilisés dans leur
formulation à l'exception de la préparation qui est stérilisée terminalement dans.
le conteneur final, la microflore du produit final peut représenter les contaminants
des matières premières, de l'équipement avec lequel il a été fabriqué

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ÉQUIPEMENTSPage1
 INTRODUCTION

atmosphère. Depuis la personne opérant le processus ou depuis le conteneur final dans

qu'il a été emballé. Certains de ces contaminants peuvent être pathogènes, tandis que d'autres
peut croître même en présence de conservateur et gâcher le produit.

L'air n'est pas un environnement naturel pour la croissance et la reproduction des microorganismes.
puisqu'il ne contient pas la quantité nécessaire d'humidité et de nutriments sous une forme qui
peut être utilisé. Un échantillon le plus bas d'air non traité contient de la matière en suspension
y compris les bactéries, les levures et les moisissures, mais pour survivre, les microorganismes doivent être
capable de tolérer la dessiccation et l'état sec. Les bactéries formant des spores, bacillus
espèces et espèces de clostridium et les bactéries non sporulées, espèces de staphylococcus,
Les espèces de streptocoques, les espèces de mucor et la levure rhodotorula sont toutes
communément isolé de l'air.

Le contenu microbien de l'air peut augmenter lors de la manipulation de matériaux contaminés.

matériaux lors de la distribution, du mélange et de leur ajout aux formulations. En particulier,
L'utilisation d'amidons et de sucres à l'état sec augmente le nombre de moisissures. Certains emballages
Les composants, par exemple la carte et le carton, ont une flore microbienne composée à la fois de moisissures.
et des bactéries, et cela se reflète souvent dans des niveaux élevés d'air autour du cartooning et
machines d'emballage.

L'écologie microbienne de l'eau est d'une grande importance dans l'industrie pharmaceutique.
puisqu'il est utilisé dans la formulation de nouveaux produits ainsi que pour divers lavages et
processus de nettoyage. Deux aspects principaux sont impliqués : la qualité de l'eau brute et tout
le traitement qu'il reçoit et le système de distribution. Les deux devraient être pris en compte.
considération lors de l'examen des dangers pour les produits finis ou à tout moment critique
point de contrôle.

Un test a été réalisé avec les objectifs suivants :

A) Test de bioburden de la solution en vrac préfiltrée.

B) Test d'énumération microbiologique des solubles et des insolubles
produits non stériles.
C) Test de stérilité.
D) Test microbiologique de l'eau.
E) Test d'endotoxine bactérienne.

TEST MICROBIOLOGIQUE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS DE L'API STÉRILE

ÉTABLISSEMENTSPage2
 INTRODUCTION

OBJECTIF ET BUT

L'analyse microbiologique de l'eau et des produits pharmaceutiques est réalisée par

objectifs suivants :

Test de Limite Microbienne : Ce test est effectué pour estimer le nombre de viables aérobies.
microorganisme présent dans l'échantillon d'eau.

Test de stérilité : Le test est effectué pour déterminer si le produit est stérile ou non.

Test d'endotoxine bactérienne : Le test est effectué pour déterminer la présence ou l'absence
de l'endotoxine dans la Gentamycine à l'aide du test LAL.

Surveillance environnementale : Le test est effectué pour estimer le nombre de cellules viables.

microorganisme aérobique présent dans l'environnement.

Étudier différentes méthodes de stérilisation pour différents produits pharmaceutiques

préparations.

Étudier le test de stérilité de différentes préparations pharmaceutiques.

Étudier les méthodes de validation

Étudier le principe et les méthodes impliqués dans différentes microbiologiques

test

Étudier les désinfectants, les antiseptiques, les agents fongicides et virucides

Étudier le mécanisme d'action de ce qui précède

L'étude des besoins nutritionnels, de la croissance et de la culture des bactéries et

virus

Étudier les différents milieux nécessaires à la croissance des aérobies et des anaérobies
bactéries et champignons.

Apprendre les méthodes disponibles pour maintenir des cultures de laboratoire

Étudier différentes techniques d'isolement et d'identification

Étudier les techniques de comptage des bactéries

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ÉTABLISSEMENTSPage 3
 INTRODUCTION

REVUE DE LA LITTÉRATURE
Les tests microbiologiques sont conçus pour estimer le nombre de bactéries aérobies viables.
organismes présents dans les matériaux pharmaceutiques et bruts. Le test est également utilisé pour

déterminez si les articles abritent des espèces microbiennes désignées qui sont
pathogène chez les organismes appelés dans la USP inclut Pseudomonas aeruginosa,
Salmonella sp., Staphylococcus aureus.
Tests microbiologiques sur les matières premières ainsi que sur les produits pharmaceutiques finis

peut aider à déterminer si le produit est conforme aux exigences du BP,

Ph. Eur. ou USP.
Les tests microbiologiques sont conçus pour effectuer des analyses qualitatives et quantitatives.

estimations des micro-organismes viables spécifiques présents dans les échantillons. Cela inclut des tests pour

nombre total viable (bactéries et champignons) et Escherichia coli. Le plus de soin doit être
pris lors de l'exécution des tests, de sorte que la contamination microbienne de l'extérieur puisse être

évité. Lorsque les échantillons de test ont une activité antimicrobienne ou lorsqu'ils incluent

Substances antimicrobiennes, ces propriétés antimicrobiennes doivent être éliminées par

dilution, filtration, neutralisation, inactivation ou d'autres moyens appropriés.

Nombre total de colonies aérobies viables :

Ce test vise à déterminer les bactéries et les champignons mésophiles qui se développent sous aérobiose.

conditions. Bactéries psychrophiles, thermophiles, basophiles et anaérobies, et

Les microorganismes qui nécessitent des ingrédients spécifiques pour leur croissance peuvent donner un résultat négatif.

résultat, même s'ils existent en un nombre significatif. Il existe quatre méthodes pour ce test :

Méthode de filtration membranaire.

* Méthode du plat.
* Méthode de répartition sur plaque.

* Méthode de dilution en série (méthode du nombre le plus probable).

Une méthode appropriée doit être choisie parmi ces quatre, en fonction de
des objectifs. Différents milieux et températures d'incubation sont nécessaires pour la croissance de
les bactéries et les champignons (moisissures et levures). La méthode de dilution en série n'est applicable qu'à

bactéries.
Préparation des fluides d'essai :

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INSTALLATIONSPage4
 INTRODUCTION
Pour dissoudre ou diluer l'échantillon, utilisez un tampon phosphate (pH 7,2), du chlorure de sodium

solution tampons de peptone, ou milieu fluide utilisé pour le test. Sauf indication contraire,
Utilisez 10 g ou 10 ml de l'échantillon. Cependant, un poids ou un volume différent de l'échantillon
doit être utilisé, en fonction de la nature de l'échantillon. Ajustez le liquide de test à un pH de 6 à 8.

Utilisez le liquide de test dans l'heure suivant sa préparation.

Échantillons de fluides ou échantillons de solides solubles :

Prenez 10 g ou 10 ml de l'échantillon et mélangez avec le tampon ou le milieu fluide donné

au-dessus pour faire 100 ml. Utilisez ce mélange comme fluide de test. Pour un échantillon de fluide incluant

substances insolubles, secouer vigoureusement juste avant de mélanger pour obtenir une suspension homogène.

Échantillons solides insolubles Prenez 10 g de l'échantillon, broyez en une fine poudre et suspendez
dans le tamis ou le milieu fluide donné ci-dessus pour préparer 100 ml. Utilisez cette suspension comme

le fluide d'échantillon. Un volume plus important du tampon ou du milieu fluidique que celui spécifié ici

peut être utilisé pour réaliser une suspension, selon la nature de l'échantillon. Si
Si nécessaire, un mixeur peut être utilisé pour disperser les particules insolubles dans le

suspension.
Échantillons gras :
Pour les échantillons semi-solides et les liquides constitués principalement de lipides, prenez 10 g ou 10 ml de

l'échantillon, émulsifiez l'échantillon dans le tampon ou le milieu fluide donné ci-dessus en utilisant un

tensioactif tel que le polysorbate 20 ou le polysorbate 80, et compléter jusqu'à 100 ml. Utilisez ceci.

échantillon émulsifié comme fluide d'échantillon. Si nécessaire, chauffer à une température ne dépassant pas

dépasse 45 pour émulsifier l'échantillon. Évitez de chauffer pendant plus de 30 minutes.

Test des pathogènes :
Les organismes pathogènes sont ceux qui peuvent causer des maladies chez les humains soit par des infections.

comme la Salmonella, l'E. coli pathogène ou dans des intoxications telles que Bacillus cereus,
Staphylococcus aureus ou Clostridium botulinum, mais dans le cas de l'industrie pharmaceutique nous

tester les pathogènes suivants :

01. Staphylococcus aureus.
02 Bacillus subtilis.
03. Escherichia coli.
04. Salmonella sps
05. Clostridium sporogenes
06. Candida albicans.
07. Aspergillus niger.
INSTALLATIONS

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INSTALLATIONSPage5
 INTRODUCTION

CONCEPTION DE SALLE PROPRE

Les tests microbiologiques doivent être effectués dans des conditions aseptiques, qui sont
de préférence conforme à la norme de salle blanche requise pour l'aseptique
fabrication de produits pharmaceutiques. Les locaux et les équipements doivent être qualifiés
selon les principes pertinents de la Qualification d'Installation et de l'Opération
Qualification.

Classification :

Le test microbiologique doit être effectué dans une hotte à flux laminaire de classe A
armoire située dans une salle blanche de classe B, ou dans un isolateur qui n'a pas besoin d'être
situé dans un environnement contrôlé. Le test peut également être effectué
dans une salle propre de classe A, si disponible. Les tests microbiologiques devraient être
réalisé dans une zone de travail qui offre un espace et des matériaux suffisants devrait être
placé de manière à ne pas perturber l'écoulement laminaire.
L'environnement de test, qui comprend la hotte à flux laminaire ou l'isolateur,
devrait être certifié au moins une fois par an par une personne compétente pour conformité
avec les conditions standards spécifiées.

Fourniture d'air :

L'air fourni à l'environnement doit être fourni par un filtre HEPA terminal.
des filtres, qui devraient être équipés d'alarmes audibles et/ou visuelles pour indiquer tout
des différences de pression soutenues, hors spécifications, à travers les filtres HEPA.
Il devrait y avoir un différentiel de pression d'au moins 10 à 15 Pascal
(valeur de référence) entre chacune des zones, c'est-à-dire ambiante/airlock et
salle de sas/test. Les relevés de pression doivent être effectués et enregistrés à partir de
jauges montées à l'extérieur à moins qu'un système de surveillance continue validé ne soit
installé. Au minimum, des relevés devraient être effectués avant l'entrée de l'opérateur dans
la suite de tests. Les manomètres doivent être étiquetés pour indiquer la zone desservie, le
spécification acceptable, et si la lecture est absolue ou non
différentiel.

TESTS MICROBIOLOGIQUES DES PRODUITS BRUTS ET FINIS DE L'API STERILE

INSTALLATIONSPage6
 INTRODUCTION

BLOCAGE D'AIR ET HABILLAGE ASEPTIQUE

Conditions de sas :

L'entrée de la salle propre doit se faire par une chambre à air dans laquelle les opérateurs sont
tenu de changer en vêtements de salle blanche.
L'écluse doit être conçue pour faciliter le mouvement de l'opérateur entre
les zones relativement sales et propres de la pièce sans compromettre le
procédure de mise en vêtement aseptique. Un banc de passage est une séparation appropriée entre
ces zones.
La chambre d'air doit contenir : un miroir mural pleine longueur ; des instructions de mise en tenue ;
installations de lavage à la main, de désinfection et de séchage. Si les vêtements de salle propre sont
stockés dans l'airlock, alors des installations de stockage adéquates et appropriées devraient être
fourni.

Vêtement aseptique :

L'opérateur de test microbiologique doit se changer dans une salle propre stérile
vêtements consistant en une combinaison intégrale, un couvre-chef, un protège-barbe (si
applicables), surchaussures, gants et masque. L'utilisation de vêtements désinfectés peut
être acceptable si le processus a été validé et leur utilisation n'est pas routinière
utilisé pour justifier la performance des tests de stérilité répétés.
Les vêtements de protection doivent être changés pour chaque session de travail ou au moins une fois par
jour si justifié par les résultats de la surveillance microbiologique et de la validation
études.
Des dossiers doivent être tenus de la stérilisation ou de la désinfection des vêtements.
le dossier peut prendre la forme d'une certification d'un fournisseur externe de stériles
vêtements de salle propre à condition qu'ils aient été approuvés par la stérilité
laboratoire d'essai.
Chaque opérateur devrait être formé et certifié dans les procédures d'habillage avec
dossiers de formation conservés.

ÉQUIPEMENTS ET SURFACES DE SALLE PROPRES :

Tous les appareils, tels que les prises de courant et les luminaires, doivent être affleurants avec le
surfaces de murs ou de plafonds et scellées pour prévenir l'enrôlement d'air sale.
Les surfaces doivent être lisses et imperméables aux agents de nettoyage utilisés.
Les joints entre le plafond, les murs et le sol doivent être arrondis pour faciliter le nettoyage.
Si fourni, les systèmes d'interphone ou de communication doivent être conçus pour permettre
utilisation sans contact, ou leur conception devrait faciliter la désinfection.
Les chaises, les armoires de rangement et les chariots doivent être conçus pour faciliter le nettoyage.
et être adapté à une utilisation dans un environnement de salle blanche.
Il ne doit pas y avoir d'équipement superflu dans l'environnement de salle blanche.
Les lampes ultraviolettes peuvent être installées uniquement dans des armoires de passage.
il y a plus d'un tube parallèle, ils devraient être protégés les uns des autres
et vérifié au moins une fois par an pour les performances, ou chaque fois que de nouvelles lampes sont
ajusté.

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ÉQUIPEMENTSPage7
 INTRODUCTION

NETTOYAGE, ASSAINISSEMENT ET DÉSINFECTION :

Les surfaces extérieures des échantillons et des équipements entrant dans la salle de test doivent être
désinfecté, de préférence avec un agent sporicide. Désinfection des surfaces et
Les échantillons doivent être transportés de manière à éviter toute contamination adventice.
contamination des échantillons par l'agent chimique. Par conséquent, les désinfectants
doit être exempt de contamination microbienne, ce qui peut être réalisé
par filtration aseptique ou utilisation d'une stérilisation terminale compatible avec le produit
méthode.
Les mains gantées des surfaces et des opérateurs doivent être désinfectées régulièrement pendant
la session de test.
Il devrait y avoir des protocoles pour couvrir tout le nettoyage quotidien, hebdomadaire et périodique.
procédures de désinfection, de désinfection et de fumigation utilisées dans les tests
environnement. Si un isolateur est utilisé, la méthode de désinfection ou de stérilisation
doit être spécifié.
Avant la mise en œuvre, toutes les procédures de nettoyage, de désinfection et de désinsectisation
doit être validé d'un point de vue microbiologique en ce qui concerne
temps de contact minimum des désinfectants et efficacité. Nettoyage et désinfection
les agents doivent être achetés selon les spécifications convenues et documentées.
Des enregistrements doivent être conservés concernant la préparation routinière du nettoyage et
agents désinfectants, instructions pour leur utilisation et validation de leur efficacité.

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INSTALLATIONSPage8
 INTRODUCTION

INSTRUMENTS UTILISÉS EN MICROBIOLOGIE

LABORATOIRE

Compteur de colonies numérique :

Il est conçu pour le comptage rapide et précis des colonies de bactéries et de moisissures dans des boîtes de pétri.
plats. Riche en fonctionnalités et facile à utiliser, c'est un outil de table indispensable pour le
microbiologiste occupé. Il est conçu pour le comptage rapide et précis des bactéries et
colonies de moisissures. Il suffit de placer la boîte de Pétri sur le support lumineux et de toucher la boîte.
avec le stylo fourni pour marquer chaque colonie à son tour. Cela entraîne un comptage qui est
enregistré sur l'affichage numérique et un ton audible confirme chaque décompte effectué.
Marquer le plat avec le stylo évite de manquer des colonies ou de faire un double comptage. Le numérique
Le compteur sur l'affichage peut être réinitialisé manuellement à tout moment en appuyant sur la touche RESET.
La visualisation optimale des colonies est facilitée par un éclairage périphérique sans éblouissement.
La loupe intégrale permet de compter plus facilement les petites colonies.

pH mètre
Un pH-mètre est un instrument électronique utilisé pour mesurer le pH (acidité ou alcalinité)
d'un liquide (bien que des sondes spéciales soient parfois utilisées pour mesurer le pH des semi- solides)

substances). Un pH-mètre typique se compose d'une sonde de mesure spéciale (un verre
électrode) connectée à un mètre électronique qui mesure et affiche le pH
lecture.

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ÉQUIPEMENTSPage9
 INTRODUCTION

Balance analytique :
Une balance analytique est utilisée pour mesurermasseà un degré de précision très élevé et
précision. La ou les plateaux de mesure d'une haute précision (0,1mgou mieux) analytique

les balances sont à l'intérieur d'une enceinte transparente avec des portes afin quepoussièrene collecte pas et
ainsi, tous les courants d'air dans la pièce n'affectent pas le fonctionnement de la balance. L'utilisation de

aenveloppe de sécurité à équilibre ventiléqui possède des profils aérodynamiques en acrylique conçus de manière unique,

permet un flux d'air lisse et sans turbulence qui empêche les fluctuations d'équilibre et le

mesure de masse jusqu'à 1 μg sans fluctuations ni perte de produit. Également, le

l'échantillon doit être àtempérature ambiante pour prévenir naturelconvectionde former de l'air
courants à l'intérieur de l'enceinte, affectant la mesure de la masse.

Le manchon à 3 places :
Le collecteur en acier inoxydable pour 3 ou 6 unités de filtration est équipé d'unités en acier inoxydable.

L'appareil peut être autoclavé et stérilisé par chaleur sèche jusqu'à 180°C. Convient
uniquement pour l'opération sous vide. Si des tubes de rinçage sont utilisés, ne dépassez pas 1,3 bar (300 mbar)

surpression).

TEST MICROBIOLOGIQUE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STERILE

INSTALLATIONSPage10
 INTRODUCTION

Analyse de contamination particulaire ou biologique par filtration à vide. Comprend

ensemble de mise à la terre pour une utilisation avec des liquides inflammables. Le support de filtre n'est pas autoclave avec

filtrer sur place.

Incubateurs :
L'incubateur est un dispositif utilisé pour cultiver et maintenir des cultures microbiennes ou des cultures cellulaires.

l'incubateur maintient une température, une humidité et d'autres conditions optimales telles que le

dioxyde de carbone (CO)2) et la teneur en oxygène de l'atmosphère à l'intérieur. Les incubateurs sont

utilisé pour cultiver à la fois des cellules bactériennes et eucaryotes.

Les incubateurs incluent également une minuterie, certains peuvent également être programmés pour passer par

différentes températures, niveaux d'humidité, etc. Les incubateurs peuvent varier en taille, allant des modèles de table.

à des unités de la taille de petites chambres.

TEST MICROBIOLOGIQUE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STERILE

INSTALLATIONSPage11
 INTRODUCTION

Hotte à air laminaire

Une armoire à flux laminaire ou un placard à flux laminaire ou une hotte de culture tissulaire est un dispositif soigneusement

banc fermé conçu pour prévenir la contamination des plaquettes de semi-conducteurs,

échantillons biologiques, ou tout dispositif sensible aux particules. L'air est aspiré à travers

unHEPAfiltré et soufflé dans un flux très lisse et laminaire vers l'utilisateur. Le cabinet
est généralement en acier inoxydable sans espaces ni joints où les spores pourraient s'accumuler.

De telles hottes existent en configurations horizontale et verticale, et il en existe de nombreuses

différents types de cabinets avec une variété de schémas de circulation d'air et d'utilisations acceptables.

Les cabines à écoulement laminaire peuvent avoir une lampe germicide UV-C pour stériliser le carter et

contenu lorsqu'il n'est pas utilisé.

Stérilisateur à vapeur (SHS) :

La stérilisation à la vapeur/à la chaleur humide est la plus largement utilisée en raison de sa polyvalence.

et d'efficacité pour les produits résistants à la chaleur. La chaleur humide tue les organismes en

coaguler et dénaturer leurs enzymes et protéines structurelles. Stérilisation par

La chaleur humide des spores les plus résistantes nécessite généralement 121 °C pendant 15 à 30 minutes.

La chaleur humide est utilisée pour la stérilisation des milieux de culture et de tous les autres matériaux.

par lequel la vapeur peut pénétrer.

TESTING MICROBIOLOGIQUE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STERILE

INSTALLATIONSPage12
 INTRODUCTION

Vortex :

C'est le mélangeur à vitesse variable pour éliminer le mélange manuel. Tenez le tube contre le vibreur
Le gobelet en caoutchouc effectue un mélange rapide des contenus. Il est proposé avec un régulateur de vitesse qui

contrôle le degré de vibration. Ces Cyclomixer ont la fonctionnalité tactile unique

fonctionne l'unité lorsque le tube est pressé sur la coupelle en caoutchouc. Adaptateurs interchangeables
améliorer considérablement l'utilisation du Cyclo Mixer pour le mélange dans différentes applications

Bain-marie

Plage de températures de quelques degrés au-dessus de la température ambiante jusqu'à 100 °C.

La température est contrôlée par un contrôleur de température numérique électronique-cum-

Indicateur avec une précision de plus ou moins 0,5 °C. Double paroi en acier inoxydable à l'intérieur

304 Qlty. et tôle en acier doux à l'extérieur peinte en finition époxy. Baignoire
comprend deux lampes pilotes, un interrupteur Marche-Arrêt. Fonctionne sur 220/230 Volts A.C. Agitateur avec

ESSAI MICROBIOLOGIQUE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STÉRILE

INSTALLATIONSPage13
 INTRODUCTION

Moteur haute vitesse de 1/20 HP avec tige et lame de mélange en acier inoxydable fournies avec
régulateur de vitesse. Le couvercle du bain d'eau est en acier inoxydable 304 Qlty.

TEST MICROBIOLOGIQUE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STÉRILE

INSTALLATIONSPage14
 INTRODUCTION

SOLUTIONS TAMPOONS ET MILIEUX

Introduction :
Utilisez les solutions tampons et les milieux, indiqués ci-dessous, pour le test microbiologique. Autre
les milieux peuvent être utilisés s'ils contiennent des ingrédients nutritifs similaires et ont des caractéristiques similaires

sélectivité et capacité de promotion de la croissance envers le microorganisme à tester.

Solutions tampons :

(i) Solution mère de tampon phosphate (pH 7.2) :

Dissoudre 34 g de phosphate monopotassique dans environ 500 ml d'eau, ajouter environ 175
ml d'hydroxyde de sodium (4,3 → 100) pour ajuster à un pH de 7,1-7,3, et ajouter de l'eau pour faire

1 000 ml. Utilisez cette solution comme solution de stockage. Autoclavez et laissez refroidir cette solution.

Conservez-le dans un endroit frais. Pour utilisation, diluez la solution mère avec de l'eau à 800 fois sa

volume original et autoclave pendant 15 à 20 minutes à 121℃.

(ii) Tampon chlorure de sodium-peptone (pH 7,0) :
Mélangez tous les ingrédients et autoclavez pendant 15 à 20 minutes à 121.℃Son pH devient

6.9 7.1 après autoclave. 0,1 1,0 % p/v polysorbate 20 ou polysorbate 80 peuvent être
ajouté.

Média
Médias utilisés dans les tests bactériologiques :

MacConkeyagar

Le milieu MacConkey est un milieu de culture conçu pour faire pousser des bactéries Gram-négatives.

bactéries et les teindre pour la fermentation du lactose. Le milieu a été développé par
Alfred Theodore MacConkey tout en travaillant comme bactériologiste pour la Royal
Commission sur l'élimination des eaux usées.

Il contient des sels biliaires, du colorant violet cristallin, du colorant rouge neutre, du lactose et du pepton.

Il existe de nombreuses variations de l'agar MacConkey en fonction des besoins. Si le

la propagation ou l'essaim de l'espèce Proteus n'est pas requise, le chlorure de sodium est omis.

TEST DE MICROBIOLOGIE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS DE L'API STÉRILE

ÉQUIPEMENTSPage15
 INTRODUCTION

Le violet de gentiane à une concentration de 0,0001 % (0,001 g par litre) est inclus lorsque
nécessitant de vérifier si les bactéries Gram-positives sont inhibées.

Agissant comme un indicateur visuel de pH, l'agar distingue les bactéries Gram-négatives.
qui peuvent fermenter le sucre lactose (Lac+) de ceux qui ne le peuvent pas (Lac-).

Ce milieu est également connu sous le nom de « milieu indicateur » et de « milieu à faible sélectivité ».

L'absence d'électrolytes sert à inhiber le comportement de groupe des espèces de Proteus.

Agar au mannitol salé

L'agar à sel de mannitol ou MSA est un milieu de culture couramment utilisé en microbiologie.

encourage la croissance d'un groupe de certaines bactéries tout en inhibant la croissance de

Ce milieu est important dans les laboratoires médicaux en distinguant les pathogènes.
microbes en une courte période de temps. Il contient une concentration élevée (~7,5%-10%) de
sel (NaCl), le rendant sélectif pour les bactéries à Gram positif Staphylocoques (et
Micrococcaceae) car ce niveau de NaCl est inhibiteur pour la plupart des autres bactéries. Il est également

un milieu différentiel pour les fermentateurs de mannitol, contenant du mannitol et l'indicateur

rouge phénol.

Agar Columbia :
Columbia Agaris utilisé avec ou sans sang pour l'isolement et la culture d'un
une grande variété de micro-organismes exigeants.

Ce milieu contient un mélange de peptonnes, qui fournit un mélange de composés azotés.

composés et acides aminés pour favoriser la croissance. L'Agar Columbia est utilisé pour le

culture de micro-organismes exigeants et comme base pour la préparation de divers

milieux de culture spécialisés auxquels des suppléments peuvent être ajoutés. L'Agar Columbia peut être

complété avec 5 à 10 % de sang de mouton, de lapin ou de cheval pour une utilisation dans l'isolement,

cultiver et déterminer les réactions hémolytiques des agents pathogènes exigeants

micro-organismes.

Agar cetrimide :

L'agar cetrimide est un type deagarutilisé pour l'isolement sélectif dugramme

négatifbactériePseudomonas aeruginosa. Comme le nom le suggère, cela

TEST DE MICROBIOLOGIE DES PRODUITS BRUTS ET TERMINÉS DE L'API STERILE

installationsPage16
 INTRODUCTION

contientcetrimide, qui est l'agent sélectif contre des micro-organismes alternatifs

flora. Le cetrimide augmente également la production de pigments de Pseudomonas tels que

pyocyanine etfluorescéine, qui montre un bleu-vert et un jaune-vert caractéristiques

couleur, respectivement.

Xyloselysinedésoxycholateagar(XLDA):
Xyloselysinedésoxycholateagar(Agar XLD) est unsélectifmilieu de culture utilisé dans

l'isolement deSalmonellaetShigellaespèces à partir d'échantillons cliniques et de

nourriture. Il a unpHd'environ 7,4, lui donnant une apparence rose vif ou rouge
en raison de l'indicateur rouge de phénol. Sucrefermentationabaisse le pH et le rouge de phénol
l'indicateur l'enregistre en passant au jaune. La plupart des bactéries intestinales,

y compris la salmonelle, peut fermenter le sucrexyloseproduire de l'acide ; colonies de Shigella

ne peut pas faire cela et reste donc rouge. Après avoir épuisé le xylose
les colonies de Salmonella décarboxyleront la lysine, augmentant à nouveau le pH à
alcalin et imitant les colonies de Shigella rouge.

Agar de digestion de soja-caseine :

Le milieu de digestat de soja-caséine (TSA), USP est un milieu nutritif hautement polyvalent

milieu recommandé pour une utilisation générale en laboratoire dans la préparation d'agar
plaques. En raison de l'inclusion à la fois de tryptone et de pepton de soja, le milieu va

soutenir la croissance de nombreux organismes fastidieux sans l'ajout de sérum, etc.

Agar Sabouraud :
L'agar Sabouraud est un type d'agar contenant des peptones. Il est utilisé pour cultiver
dermatophytes et d'autres types de champignons.

EEBM :
Le bouillon d'enrichissement des entérobactéries de Mossel (EEBM) est utilisé pour tester les Gram- tolérants au bile.

bactéries négatives. Milieu de culture pour tester des produits non stériles.

Bouillon de Rappaport-Vassiliadis
Le bouillon Rappaport-Vassiliadis est un milieu sélectif utilisé pour l'enrichissement de
Espèces de Salmonella. Un milieu sélectif pour le sous-culture, tel que le lysine xylose.

L'agar désoxycholate (XLD) est utilisé pour cultiver et indiquer la Salmonella.

Milieu clostridial renforcé :

TESTING MICROBIOLOGIQUE DU PRODUIT BRUT ET FINI DE L'API STÉRILE
INSTALLATIONSPage17
 INTRODUCTION

Le milieu clostridial renforcé est utilisé pour la culture et l'énumération de

Espèces de Clostridium, lactobacilles, autres anaérobies et autres organismes facultatifs
à partir d'échantillons cliniques et alimentaires.

AGAR VRBG :

L'agar bile-glucose contenant du violet cristallin et du rouge neutre (agar VRBG) a été utilisé
par Mossel pour la détection et le dénombrement des entérobactéries dans les produits laitiers, la viande,

produits de porc préparés et autres produits alimentaires.

Milieu Thioglycolate Fluide :

Le milieu thioglycolate fluide est principalement destiné à la culture de

bactéries anaérobies. Cependant, il détectera également des bactéries aérobies.
3. Milieu de digestion de caséine de soja :

Ce milieu est utilisé pour cultiver des champignons et des bactéries aérobies.

TEST MICROBIOLOGIQUE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STERILE

INSTALLATIONSPage18
 INTRODUCTION

MATÉRIAUX ET MÉTHODE
Conformément aux objectifs pour achever le travail de projet, les matériaux et les méthodes qui

ont été appliquées, sont comme suit.

Test de la bioburden de la solution en vrac préfiltrée

INTRODUCTION :

La charge biologique est l'estimation quantitative du nombre de micro-organismes viables dans un

solution et sur un instrument chirurgical ou un dispositif médical avant décontamination et
stérilisation. Presque tous les produits fabriqués dans un environnement de fabrication auront
certains micro-organismes qui sont naturellement présents sur le produit avant toute stérilisation
le traitement se produit. Ces contaminants peuvent provenir des matériaux utilisés, pour
exemple de nombreuses fibres naturelles et de composés à base biologique, ou ils pourraient tout simplement être
introduit par la main-d'œuvre lors de la manipulation.

Exigences en matériaux :

Assemblage de manifold (Sartorius)

Flacon magnétique (Sartorius)
Filtre à membrane stérilisé de 0,45 micron, 47 mm (Sartorius stedim)
Plaques d'Agar (SCDA)
Fluide de rinçage (Fluide-A)
Forceps
Flux d'air laminaire
Pompe à vide
Incubateurs
Alcool isopropylique (70% IPA)
Tuyau GPL avec brûleur/lampe à esprit

TEST DE MICROBIOLOGIE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STERILES

INSTALLATIONSPage 19
 INTRODUCTION

Procédure :

Collecte d'échantillons :

Collectez un échantillon de 100 ml de solution préfiltrée dans une bouteille préstérilisée après

le filtre de 1,2 micron dans la série de filtration dans la zone contrôlée.

En cas de solution saturée ou sursaturée telle que l'arginine, le sodium
carbonate maintenu à une température plus élevée pendant la dissolution, échantillon

doit être immédiatement dilué pour éviter toute nouvelle précipitation.

Dans ce cas d'échantillonnage, 100 ml de la solution à diluer avec 100 ml

de liquide pré-stérilisé-A (0,1 % d'eau peptonée) après échantillonnage à
installations de production.

Apportez les échantillons au laboratoire de microbiologie pour les tests.

PROCÉDURE DE TEST :

Assembler l'unité en polypropylène constituée d'un réservoir fermé et d'une

réceptacle entre lequel une membrane correctement supportée est placée, ensemble complet
doit être stérilisé et des tests effectués dans des conditions aseptiques.

Assemblez le jeu de filtres stérilisés à l'unité de filtration dans le flux d'air laminaire
station.
Placez aseptiquement la membrane stérilisée ou pré-stérilisée, montez le dessus
portion de la tasse de filtration.
La surface externe de l'échantillon de bouteille doit être désinfectée à l'aide de 70% d'IPA filtré.

Transférer une petite quantité de liquide stérilisé-A vers la membrane et filtrer en utilisant
la pompe à vide à des fins d'humidification.

Transférez 100 mL de l'échantillon pré-filtré (200 mL en cas de saturé ou

solution super saturée) et filtrer simultanément l'échantillon à l'aide de
la pompe immédiatement sans aucun retard de la solution dans la filtration
unité.
Transférez 8×100mL de fluide-A stérilisé vers la membrane. Ce volume est pour
rinçage de la membrane pour neutralisation.
Filtrez-le à l'aide de la pompe à vide.
Après le rinçage de la membrane, retirez l'ensemble de filtration.

TEST DE MICROBIOLOGIE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STÉRILE

ÉQUIPEMENTSPage20
 INTRODUCTION

Incinérer les pinces et retirer la membrane et transférer la membrane

sur la surface des plaques SCDA pré-incubées.
Contrôle négatif : 100 mL de fluide-A pré-stérilisé sera filtré et
la membrane sera transférée à la surface de la plaque SCDA pré-incubée.
Tous les plaques de test et de contrôle négatif doivent être incubées en position verticale.
initialement à 20-25 °C pendant 72 heures et sera ensuite incubé pendant 72 heures à
30-35 °C

Observation et interprétation des résultats :

Observez toutes les plaques incubées après la période d'incubation.

Les counts microbiens observés sur la membrane seront enregistrés comme total
dénombrements aérobies viables par 100 mL d'échantillon.

Rapport des Comptes Microbiens Aérobies Viables Totaux :

Test Observation après 3-6 Niveau d'action

jours
Plaques SCDA - 01 Néant 100 UFC/g
Plaques SCDA - 02 Nul 100 UFC/g
Moyenne Nil 100 UFC/g
Facteur de dilution Nul 100CFU/g
Microbien aérobie total Nil 100 UFC/g
comptes/g du produit
Contrôle négatif du Nil _
média
Contrôle négatif du Nil
Diluant

TEST DE MICROBIOLOGIE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STERILE

ÉQUIPEMENTSPage21
 INTRODUCTION

RÉSULTAT
L'échantillon est conforme car aucune croissance n'a été trouvée.

Tests d'énumération microbiologique des solubles et des insolubles

produits non stériles

Introduction :
Test de numération microbiologique effectuant l'évaluation qualitative et quantitative
estimation des micro-organismes viables spécifiques présents dans les échantillons. Cela inclut des tests pour

nombre total viable de bactéries et de champignons. Les tests sont conçus pour l'estimation de la
nombre de micro-organismes aérobies viables présents et pour détecter la présence de
espèces microbiennes désignées dans les substances pharmaceutiques.

Exigences en matériaux :

Plaques de milieu de digestion de soja (SDA)

Plaques de milieu de Sabouraud dextrose (SDA)
Plaques de milieu de digestion de caséine de soja (SCDA)
Milieu de digestion de caséine de soja (SCDM) 100 mL

Milieu de Sabouraud dextrose (SDM) 100 mL

Bouillon d'enrichissement pour entérobactéries de Mossel (EEBM)

Bouillon MacConkey
Bouillon d'enrichissement Rappaport vassiliadis salmonella (RVS)
Milieu renforcé pour clostridies
Plaques d'agar au mannital et au sel (MSA)

Plaques d'agar centrimide (CA)

Plaques d'agar xylose-lysine désoxycholate (XLDA)
Plaques de gélose Macconkey (MCA)
Plaques de gélose à bile rouge violet glucose (VRBG)

Plaques d'agar Columbia

Station de flux d'air laminaire

Stérilisé 0,45 µ 47 mm, hydrophile et MOC de nitrate de cellulose/PVDF

Fluide stérilisé-A (eau peptonée à 0,1 %) en quantités de 100 mL

TEST MICROBIOLOGIQUE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STÉRILE

ÉQUIPEMENTSPage22
 INTRODUCTION

Anse d'inoculation
Incubateurs
Ligne GPL avec brûleur/lampe à huile

MÉTHODES :
Comptes microbiens
Méthode de filtration membranaire pour produit hydrosoluble :

Dissous 1g de l'échantillon examiné dans 100ml de liquide stérilisé

A.

Préparez un récipient en verre ou en acier inoxydable approprié constitué d'une clôture.

réservoir et récipient entre lesquels un support approprié

la membrane est placée, l'ensemble du matériel doit être stérilisé et des tests effectués

dans des conditions aseptiques.

Utilisez le papier filtrant ayant une taille de pore ne dépassant pas 0,45 µ de diamètre

environ 47 mm, hydrophile et MOC de cellulose

nitrate/PVDF.

Filtrer 100 ml de liquide stérilisé A à travers la membrane comme pré

étape d'humidification.

Dissoudre 1 g de l'échantillon à examiner dans 100 ml de liquide stérilisé

A et transférer les comptes du filtre à membrane et filtrer immédiatement.
Deux ensembles de ce type à filtrer. Une membrane filtrée pour le comptage bactérien
et l'autre membrane filtrée pour les comptages de levures/moules.

Rincez chaque membrane en la filtrant à travers 8×100ml de stérilisé

fluide A.

Transférez le filtre en membrane filtré et rincé destiné à

énumération des bactéries, à la surface de la plaque de caséine de soja
Agar de digestion et la membrane destinée à l'énumération de
Levure/Moisissure à la surface de la plaque de gélose gélosée de Sabouraud.

TESTS MICROBIOLOGIQUES DES PRODUITS BRUTS ET FINIS DES API STERILES

ÉQUIPEMENTSPage23
 INTRODUCTION

Incuber la plaque à membrane SCDA à 30-35°C pendant 3-5 jours.

les plaques de membrane de l'Agar de Sabouraud Dextrose à 20-25°C pendant 5-7 jours

avec les contrôles. Ne pas inverser les plaques pendant l'incubation.

Pour les milieux de contrôle négatif, incubez une plaque SCDA à 30-35°C pendant 3-
5 jours et une plaque d'agar Sabouraud Dextrase à 20-25°C pendant 5-7 jours.

Pour le contrôle négatif des diluants, filtrez 100 ml de fluide stérilisé A et

transférez le filtre de membrane à la surface de la plaque de soja
Agar de digestion de caséine et incuber à 20-25°C pendant 3 jours suivi de
30-35°C pendant 2 jours.

Après la période d'incubation, comptez le nombre de bactéries et le nombre

de levures/molds par gramme de l'échantillon testé.

Méthode de plaque pour produit insoluble dans l'eau Insoluble

Produit

Suspendre 10g de l'échantillon à examiner dans 100ml de liquide stérilisé

milieu de digestion de caséine dans un flacon de 250 ml et homogénéisé la suspension

par vortexage manuel.

Des agents de surface actifs tels que 1 ml par L de polysorbate 80 doivent être

ajouté pour aider la suspension des substances peu mouillables.

Pour l'énumération bactérienne :

Ajoutez à chaque boîte de Petri stérilisée de 90-100 mm, 1 mL du surnageant de

l'échantillon enrichi et ajoutez aseptiquement.

20-25 mL d'Agar de digestion de soja et de caséine stérilisé à ne pas plus de

45 °C, effectuez-le en double et laissez-le se solidifier.

Pour le contrôle négatif du milieu, ajoutez 20-25mL de SCDA à un

plaque de Petri stérilisée de 90 à 100 mm et pour le contrôle négatif de la stérilisation

milieu de digestion de caséine de soja (SCDM) transférer aseptiquement 1 mL de

stériliser SCDM sur une plaque stérile et verser 20-25 mL de SCDA

médias.
TEST MICROBIOLOGIQUE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STERILES
ÉQUIPEMENTSPage24
 INTRODUCTION

Après solidification, incuber toutes les plaques à l'envers à

30 à 35 °C pendant 3 à 5 jours avec les contrôles de test.

Après la période d'incubation, comptez le nombre de CFU sur les plaques.

Calculez les résultats en exprimant la moyenne pour les deux plats et

déclarez le nombre total de micro-organismes aérobies/g en multipliant la dilution

facteur pris pour les tests.

Pour l'énumération des levures/moisissures :

Ajoutez à chaque boîte de Pétri stérilisée de 90/100 mm, 1 ml du surnageant de la

échantillon enrichi et ajouter aseptiquement 20-25 ml de Dextrose Sabouraud stérilisé
Agar à une température ne dépassant pas 45°C. Effectuez-le en double et laissez-le se solidifier.

Pour le contrôle négatif du milieu, ajoutez 20-25 ml de SDA à un tube stérilisé de 90-
Plaque de pétrie de 100 mm et pour le contrôle négatif de la digest de soja et de caséine stérilisé

Transférer aseptiquement 1 ml de SCDM stérilisé dans un récipient stérilisé

versez et ajoutez 20-25 ml de milieu SDA.
Après solidification, incuber toutes les plaques à l'envers à 20-25°c pendant
5-7 jours.
Après la période d'incubation, comptez le nombre d'UFC dans les plaques.
Calcule les résultats en exprimant la moyenne des deux plats et rapporte le
nombre total combiné de moisissures et de levures en multipliant le facteur de dilution pris pour

test

Méthode de répartition sur plaque :

Placez 0,05-0,2 ml du liquide de test sur la surface solidifiée et séchée du

milieu d'agar et étalez-le uniformément à l'aide d'un étaleur.

Procédez dans les mêmes conditions que pour la méthode du plat en pour, en particulier
à propos des plaques de Petri, des milieux de culture de gélatine, de la température et du temps d'incubation, et

méthode de calcul.

Méthode de dilution en série (Méthode du nombre le plus probable) :

Utilisez 12 tubes à essai : 9 contenant chacun 9 ml de milieu de digestion de soja et de caséine.

et 3 contenant 10 ml du même milieu chacun pour le contrôle.

TEST DES MICROBIENS DES PRODUITS BRUTS & FINIS D'API STERILE
INSTALLATIONSPage25
 INTRODUCTION

Préparez des dilutions en utilisant les 9 tubes. Tout d'abord, ajoutez 1 ml du liquide test à chacun de
trois tubes à essai et mélanger pour faire des dilutions à 10 fois. Deuxièmement, ajouter 1 ml de chacun

des dilutions à 10 fois dans chacun des trois autres tubes à essai et mélanger pour faire
dilutions de 100 fois. Troisièmement, ajoutez 1 ml de chacune des dilutions de 100 fois à

chaque tube à essai restant et mélanger pour réaliser des dilutions à 1 000 fois.

Incubez tous les 12 tubes à essai pendant au moins 5 jours à 30 - 35℃. Pas de croissance microbienne

doit être observé pour les tubes à essai de contrôle. Si la détermination du résultat
est difficile ou si le résultat n'est pas fiable, prenez 0,1 ml de liquide de chacun des 9
des tubes à essai et les placer dans un milieu d'agar ou un milieu liquide, incuber tous les milieux

pendant 24 à 72 heures à 30-35℃, et les vérifier.

Calculez le nombre le plus probable de microorganismes par ml ou gramme de
l'échantillon.

Tests de pathogènes :
Introduction :

Les organismes pathogènes sont ceux qui peuvent causer des maladies chez les humains, soit par des infections.

comme Salmonella, E. coli pathogène ou dans les intoxications telles que Bacillus cereus,
Staphylococcus aureus ou Clostridium botulinum, mais dans le cas de l'industrie pharmaceutique nous

testez les pathogenes suivants :

Procédure :

Test pour Escherichia Coli :

Suspendre/dissoudre 1g de l'échantillon à examiner dans 100ml de

milieu de digestion stérilisé de caséine de soja dans un flacon de 250 ml et

homogénéiser la suspension par vortexage manuel et incuber à

30-35°C pendant 18 à 24 heures.
Transférez 1 mL du SCDM enrichi dans 100 mL de MacConkey
bouillon et incuber à 42 à 44 °C pendant 24 à 48 heures.
Observez la croissance, si une croissance est observée, procédez comme suit,
à l'aide d'une anse de inoculation, étalez une portion de
bouillon d'enrichissement sur la surface du milieu de MacConkey.
Incuber les plaques striées à 30-35°C pendant 18 à 72 heures.
TEST DES MICROBIOLOGIES DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STÉRILE
INSTALLATIONSPage26
 INTRODUCTION

La croissance des colonies indique la présence possible d'E. Coli.

confirmer par identification de Mini API.

Le produit est conforme à l'essai si aucune colonie n'est présente ou si

les tests d'identification sont négatifs.

Test pour Salmonella :

Suspendre / Dissoudre 10g de l'échantillon à examiner dans 100ml de

milieu de digestion de caséine de soja stérilisé dans un flacon de 250 mL et

homogénéisez la suspension par vortexage manuel et incubate à 30

à 35°C pendant 18 à 24 heures.

Transférez 0,1 ml du SCDM enrichi dans 10 ml de

Rapporté Vassaliadis Enrichissement Salmonella bouillon et incuber
les tubes à 30-35°c pendant 18-24 heures.

Observer la croissance, si une croissance est observée, passer à ce qui suit,

à l'aide d'une boucle d'inoculation, étalez une portion du
bouillon d'enrichissement sur la surface de Xylose LysinDésoxycholate
Milieu de Agar. Incuber les plaques ensemencées à 30-35°C pendant 18-48 heures.

heures.

La présence possible de Salmonella est indiquée par la croissance de

Colonies bien développées, rouges avec ou sans centre noir. Confirmer
par identification de l'API Mini.

Le produit est conforme au test s'il n'y a pas de colonies présentes ou si

les tests d'identification sont négatifs.

Test pour Staphylococcus aureus :

Suspendre/dissoudre 1g de l'échantillon examiné dans 100ml de

milieu de digestion de caséine de soja stérilisé dans un flacon de 250 ml et

homogénéiser la suspension par agitation manuelle et incuber à 30

à 35°C pendant 18 à 24 heures.

TEST DE MICROBIOLOGIE DES PRODUITS BRUITS ET FINIS D'API STÉRILES

ÉQUIPEMENTSPage27
 INTRODUCTION

Observez la croissance, si une croissance est observée, procédez aux étapes suivantes.

À l'aide d'une anse d'inoculation, étalez une portion de la

bouillon d'enrichissement à la surface du milieu Agar Mannitolsalé.
Incubez les plaques striées à 30-35 °C pendant 18 à 72 heures.

La présence possible de Staphylococcus aureus est indiquée par le

croissance de colonies jaunes ou blanches entourées d'une zone jaune.
Confirmer par identification Mini API.

Le produit est conforme au test si des colonies ne sont pas présentes ou si

le test d'identification confirmatoire est négatif.

Test pour Pseudomonas aeruginosa :

Suspendre/dissoudre 1g de l'échantillon à examiner dans 100ml de

milieu de digestion de caséine de soja stérilisé dans un flacon de 250 ml et

homogénéiser la suspension par vortexage manuel et incuber à 30

à 35°C pendant 18 à 24 heures.

Observez la croissance, si une croissance est observée, procédez comme suit,

à l'aide d'une boucle d'inoculation, étalez une portion de
broth d'enrichissement à la surface du milieu d'agar Cetramide.
Incubez les plaques enstratifiées à 30-35°C pendant 18-72 heures.

La croissance des colonies indique la présence possible de pseudomonas

aeruginosa. Confirmer par identification Mini API.

Test pour les bactéries gram -ve tolérantes aux sels biliaires :

Suspendre/dissoudre 1g de l'échantillon examiné dans 100ml de

milieu de digestion de caséine de soja stérilisé dans un flacon de 250 ml et

homogénéiser la suspension par vortexage manuel à 20-25°C. Tester le

échantillon dans les 2 à 5 heures tout en étant conservé à 20 à 25 °C.

Transférer l'ensemble du bouillon de 100 kL dans 100 mL d'Enterobacteria

Bouillon d'enrichissement Mossel dans un flacon de 250 mL et incuber à 30 à 35 °C

de 18 à 24 heures.

TEST DE MICROBIOLOGIE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STERILES

INSTALLATIONSPage28
 INTRODUCTION

Observez la croissance, si la croissance est observée, procédez à ce qui suit. Par

au moyen d'une boucle d'inoculation, étalez une portion de l'enrichissement
bouillon à la surface du milieu de culture de bile rouge violet glucose. Incuber

les plaques enstries à 30-35 °C pendant 18-24 heures.

La présence possible de bactéries Gram -vétérantes à la bile. Confirmer par

Identification de la mini API.

Le produit est conforme au test si des colonies ne sont pas présentes ou si le

le test d'identification confirmatoire est négatif.

Test pour les Clostridies :

Suspendre/dissoudre 1g de l'échantillon à examiner dans 100ml de

stérilisé Milieu de digestion de caséine de soja dans un flacon de 250 ml et

homogénéiser la suspension par vortexage manuel.

Prenez deux portions égales. Chauffez une portion à 80 °C pendant 10 minutes et

refroidir rapidement. Ne pas chauffer l'autre portion.

Transférer 10 mL de la portion dans deux récipients séparés de 100 mL de renforcement.

milieu pour les Clostridia et incuber dans des conditions anaérobies à 30

35°C pendant 48 heures.

Observez la croissance, si une croissance est observée, procédez comme suit. Par
au moyen d'une boucle d'inoculation, étalez une portion de l'enrichissement
bouillon à la surface du milieu de culture Columbia Agar. Incuber la striée
plaques dans des conditions anaérobies à 30-35 °C pendant 48 heures.

La croissance anaérobie des bâtonnets (avec ou sans

des endospores) donnant une réaction catalase négative indique la présence
des Clostridies. Confirmer par identification Mini API.

S'il n'y a pas de croissance anaérobie de micro-organismes détectée sur Columbia

Si l'agar ou le test de catalase est positif, le produit est conforme à la

test.

Test pour Candida albicans :

ESSAI MICROBIOLOGIQUE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STERILE

INSTALLATIONSPage29
 INTRODUCTION

Suspendre/dissoudre 1g de l'échantillon examiné dans 100ml de

bouillon SabouraudDextrase stérilisé dans un flacon de 250 ml et
homogénéiser la suspension par vortexage manuel et incuber à 30
35°C pendant 3 à 5 jours.

Observer la croissance, si une croissance est observée, procéder comme suit. Par
au moyen d'une boucle d'inoculation, étalez une portion de l'enrichissement
bouillon à la surface du milieu de culture Sabouraud Dextrase. Incuber le
Plaques ensemencées à 30-35 °C pendant 24-48 heures.

La croissance des colonies d'eau peut indiquer la présence de Candida

albicans. Conformément à l'identification par Mini API.

Test Observation après 3-5 Niveau d'action

jours
Plaques SCDA - 01 Nul 100 CFU/g
Plaques SCDA - 02 Nil 100 UFC/g
Moyenne Nil 100 UFC/g
Facteur de dilution Rien 100UF/g
Comptes microbiennes aérobies totaux/g du Nil 100 UFC/g
produit
Contrôle négatif des médias Nil
Contrôle négatif du diluant Nil _
Résultats

Rapport des comptages microbiens aérobies totaux :

Test Observation après 3-5 actions

jours niveau
Plaques SDA/SCA - 01 Rien 50 UFC/g
Plaques SDA/SCA-02 Nulle 50 UFC/g
Moyenne Nil 50 UFC/g
Facteur de dilution Nul 50CFU/g
Total des comptages combinés de moisissures et de levures/g de Nil 50 UFC/g
le produit
Contrôle négatif des médias Nil

TESTS MICROBIOLOGIQUES DES PRODUITS BRUTS ET FINIS DE L'API STÉRILE

INSTALLATIONSPage30
 INTRODUCTION

Contrôle négatif du diluant Nul _

Rapport des comptes combinés totaux de moisissures et de levures :

Rapport d'analyse pour les pathogènes (Staphylococcus, Pseudomonas et Candida)

Échantillon - 1 :

Pathogène Enrichissement Présomptif Confirmatoire Remarques

Test Test Test
Staphylococcus Aucune croissance Non applicable Non applicable
Se conforme
aureus
Pseudomonas Aucune croissance Non applicable Non applicable Se conforme
aeruginosa
Candida Aucune croissance Non applicable Non applicable Se conforme
Rapport pour Pathogène (Escherichia Coli, Salmonella sps., Clostridia, et Bile)
bactéries Gram-négatives tolérantes) analyse de l'échantillon - 1 :

Pathogène Enrichissement Présomptif Présomptif Remarques Confirmées

ent Test Test-1 Essai-2 Test ry
Escherichia Coli Non NA NA NA Se conforme
croissance
Salmonella ssp. Non NA NA NA Se conforme
croissance
Clostridies Non NA NA NA Se conforme
croissance
Bile tolérant NA NA NA Se conforme
Gram-négatif croissance
Bactéries

Rapport pour l'analyse des pathogènes (Staphylococcus, Pseudomonas et Candida)

Échantillon- 2:

Pathogène Enrichissement Présomptif Confirmatoire Remarques

Test Test Test
Staphylococcus Pas de croissance Non applicable Non applicable Se conforme
aureus
Pseudomonas Aucune Croissance Non applicable Non applicable Conforme
aeruginosa

TEST DE MICROBIOLOGIE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STERILE

INSTALLATIONSPage31
 INTRODUCTION

Candida Aucune croissance Non applicable Non applicable Se conforme

Rapport sur les Pathogènes (Escherichia Coli, Salmonella sps., Clostridia et Bile)
bactéries Gram-négatives tolérantes) analyse de l'Échantillon- 2 :

Pathogène Enrichissement présomptif Présomptif Remarques Confirmato

test de l'ent Test-1 Test-2 test ry
Escherichia Coli Non NA NA NA Se conforme
croissance
Salmonella sps. Non NA NA NA Conforme
croissance
Clostridies Non NA NA NA Se conformer
croissance
Tolérant à la bile g- Non NA NA NA Se conforme
Bactéries croissance

Résultats :

Agent pathogène CFU dans l'échantillon 1 CFU dans l'échantillon 2 Limite

Staphylococcus aureus Nil Nul Devrait être absent

Pseudomonas aeruginosa Nil Nil Devrait être absent
Escherichia Coli Nul Nil Devrait être absent
Salmonella ssp. Nil Nul Doit être absent
Clostridies Nil Rien Devrait être absent
Candida Nil Nil Devrait être absent
Gram-négatif tolérant à la bile Nul Devrait être absent
Bactéries
*Remarques : Conforme

TEST DE STERILITÉ
INTRODUCTION

Le test de stérilité est utilisé pour détecter la présence de formes viables de bactéries, de champignons et de
levure dans ou sur des préparations pharmacopée. Les conditions de travail dans lesquelles les tests
doivent être exempts de toute forme microbienne et doivent être surveillés
régulièrement en échantillonnant l'air et les surfaces de la zone de travail et en effectuant
tests de contrôle.

TESTING MICROBIOLOGIQUE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STERILE

ÉQUIPEMENTSPage32
 INTRODUCTION

PRINCIPE

Les tests sont basés sur le principe que si des bactéries ou des champignons sont placés dans un milieu
qui fournit des matériaux nutritifs et de l'eau, et maintenu à une température favorable, le
les organismes vont se développer et leur présence peut être indiquée par la turbidité dans l'original
clair moyen.

Équipements requis :
LAF
Ensemble de support de collecteur
Pompe à vide.
Pince
Ciseaux

Matériel requis :
Échantillon pour les tests de stérilité
Filtre à membrane stérile 0,45 µ
FTGM stérile
SCDM stérile
Eau peptonée stérile à 0,1 % p/v.
Solution d'IPA stérile à 70 %.
Brûleur à gaz
Assemblage de filtration stérile
Plaques SCDA stériles
Tampon stérile

Méthode de filtration par membrane

Procédure :
Collectez les échantillons à tester pour la stérilité conformément à la SOP. Et conservez-les dans un endroit propre.
Plateaux S.S marqués avec le nom du produit, le numéro de lot et le numéro de lot, puis transfert
les échantillons vers la salle de stérilité par le biais de la boîte de passage propre pour effectuer
stérilité.
Préparez les tubes de média 100-100 ml quantité (FTM et SCDM) conformément à
SOP pour la préparation des milieux de culture.
Préchauffer les tubes de milieu à la température appropriée, c'est-à-dire les tubes SCDM à 20
à 250C alors que les tubes FTGM à 30 - 35ºC pendant 24 - 48 heures avant de soumettre
eux pour les opérations de stérilité.

TESTING MICROBIOLOGIQUE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STERILE

ÉQUIPEMENTSPage33
 INTRODUCTION

Entrez dans la salle de stérilité conformément à la procédure d'entrée/sortie pour la salle de stérilité.
Commencez le LAF conformément à la procédure opérationnelle standard pour les instructions de fonctionnement du LAF.
Éliminez tous les échantillons à tester pour la stérilité avec une solution d'IPA à 70 %.
Connectez l'ensemble du support du manifold de filtration au réservoir en S.S.
correctement avec un tuyau et placer des tasses en acier inoxydable stérilisées dans le récipient stérile en dessous
Unité de flux d'air laminaire. Vérifiez la lecture du manomètre du LAF en fonctionnement.
vérifiez la température ainsi que l'humidité de la salle de stérilité
Allumez la pompe à vide mais fermez le vide du support de collecteur.
assemblage avec l'aide de la clé de contrôle sous vide, présente sur la base de
support de collecteur individuel. Maintenant placez des filtres à membrane stériles de 0,45 m
entre la tasse de filtration et le réceptacle à l'aide de pinces stérilisées.
Humidifiez le filtre à membrane en ajoutant environ 15 ml du Fluide A stérilisé (0,1 %)
peptone eau) au porte-filtre, et filtrer le liquide en utilisant le vide.
Coupez le bout de la bouteille/vial ou ampoule avec une lame en acier inoxydable stérile devant le gaz
brûleur et transférer immédiatement pas moins de la moitié du contenu pour LVP et
tout le contenu du flacon pour SVP vers la membrane.
Filtrez immédiatement la solution avec l'aide d'un vide et lavez la membrane.
trois fois avec 100 ml de fluide A stérilisé (Le lavage avec le fluide A n'est pas
nécessaire en cas d'eau stérile pour injection).
Après la filtration complète, arrêtez le vide du manifold à l'aide de
clé de contrôle du vide du collecteur.
Soulevez la membrane délicatement à l'aide de pinces stériles, coupez aseptiquement le
filtre à membrane en deux moitiés avec des ciseaux en acier inoxydable stériles et transférer une moitié à
FTGM et une moitié des tubes SCDM en débranchant devant le bruleur à gaz uniquement.
Étiquetez les deux tubes avec le nom du produit, numéro B, numéro de lot, date d'essai.
Date d'achèvement
Préparez simultanément un contrôle négatif en filtrant 100 ml de peptonne à 0,1 %.
de l'eau au lieu d'un échantillon de produit, couper la membrane en deux moitiés avec un stérile
Coupez les ciseaux et transférez une moitié à FTGM et une moitié à SCDM et étiquetez.
les deux tubes comme contrôle négatif.
Préparez simultanément un contrôle de chambre lors de la stérilité, prenez deux tubes.
l'un est le tube SCDM et l'autre est le tube FTGM, débranchez le bouchon en coton du tube
et exposer dans LAF pendant la stérilité, après l'achèvement de la stérilité, rebrancher le
tubes et ensuite incuber les tubes comme un contrôle de chambre.
Incuber les tubes FTGM à 300C – 350Tubes C et SCDM à 200C – 250C pour
14 jours. La période d'incubation pour les produits stérilisés à terminale n'est pas inférieure à 7
jours et 14 jours pour les produits remplis aseptiquement conformément à l'IP. Si le produit est comme
selon l'USP, le BP, la période d'incubation est de 14 jours pour les deux stérilisés terminalement comme
eh bien en ce qui concerne les produits remplis de manière aseptique.

Contrôles positifs et négatifs :

Transférer de façon aseptique 1 x 100 ml de fluide de dilution vers l'assemblage de filtration.

Après avoir filtré le volume, coupez la membrane en quatre parties, dont deux en deux.
Séparez les tubes de Thioglycollate de Fluid (FTGM) et les autres en deux Soybean séparés.
Tubes de digestat de caséine (SCD). Incubez ces quatre tubes avec les tubes d'échantillons.
Après avoir inoculé l'un des tubes FTGM avec une culture mixte d'organismes -
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
TEST DE MICROBIOLOGIE DES MATIÈRES PREMIÈRES ET DES PRODUITS FINIS D'API STÉRILES
ÉQUIPEMENTSPage34
 INTRODUCTION

Cl. Sporogenes
Un des tubes moyens SCD avec
Bacillus subtilis
Candida albicans
A. niger

Les deux tubes incubés sont un contrôle positif pour vérifier la propriété de promotion de la croissance.
le milieu et les deux autres sont des témoins négatifs pour vérifier les accessoires aseptiques
et les conditions de travail du test.

Observation et Interprétation des Résultats :

Examinez visuellement les tubes de média quotidiennement jusqu'à leur conclusion pour des macroscopic.
Preuve de croissance microbienne.
S'il n'y a aucune preuve de croissance observée dans aucun des tubes, le produit doit être
examens pour le test conforme au test de stérilité.
Le test n'est pas valide à moins que le contrôle négatif ne montre un résultat négatif jusqu'à la fin de
incubation, et le contrôle positif montre une croissance dans l'incubation spécifiée
période.
Détruisez tous les contrôles positifs après confirmation de la croissance dans les deux FTGM
et des tubes SCDM (en général, la croissance sera observée dans les 24 à 48 heures).
Si des preuves de croissance microbienne sont trouvées dans l'un des tubes, enquêtez sur
Cause de son échec selon la procédure normale d'exploitation pour l'échec du test de stérilité, SOP. Si
Le rapport d'enquête conclut que le test est invalide, répétez le test avec 20 unités.
Si aucune preuve de croissance n'est trouvée dans le test de répétition, le produit examiné
est conforme au test de stérilité. Si des preuves de croissance microbienne sont trouvées dans
le test de répétition le produit examiné ne respecte pas le test pour
stérilité.

Précautions :

Les flacons / ampoules d'échantillons doivent être bien essuyés avec de l'IPA filtré à 70 % avant
les transférer dans la salle de stérilité et aussi à l'intérieur de la salle de stérilité avant
opérations de stérilité. La boîte d'incubation doit également être nettoyée correctement avec un filtre.
Solution à 70 % d'IPA.
Tout matériau utilisé dans l'opération de stérilité ou à l'intérieur de la salle de stérilité doit être
stérilisé correctement.
L'extrémité des flacons / ampoules d'échantillon doit être correctement chauffée devant le gaz.
brûleur avant de couper avec une lame de coupe chauffée stérile.

OBSERVATIONS

Incubation FLUID THIOGLYCOTATE SOJA CASÉINE

n Jour MOYEN DIGEST MOYEN Remarques
Test Positif Test négatif Positif Négatif
Contrôle e Contrôle e
TEST DE MICROBIOLOGIE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STERILE
INSTALLATIONSPage35
 INTRODUCTION

Contrôle Contrôle
Je II III Je II III
1. négatif -ve -ve +ve -ve -ve -ve D'accord.
e e
2. - -ve -ve +ve -ve -ve -ve D'accord.
e e
3. -ve +ve +v +v -ve -ve +ve +v +v -ve D'accord.
e e e e
4. - -ve -ve +ve +v +v -ve D'accord.
e e e e
5. -ve -ve - -ve D'accord.
e e e e
6. -ve +ve +v +v -ve -négatif -ve D'accord.
e e e e
7. -négatif -ve - -ve D'accord.
e e e e
8. -ve -ve -ve -ve D'accord.
e e e e
9. -négatif -ve -ve -ve D'accord.
e e e e
10 -ve -ve -négatif -ve D'accord.
e e e e
11 -ve +ve +v +v -ve -n -ve D'accord.
e e e e
12. -ve -ve -ve +ve +v +v -ve D'accord.
e e e e
13. -ve +ve +v +v -ve -ve +ve +v +v -ve D'accord.
e e e e
14. -ve -ve -négatif -ve D'accord.
e e e e
Remarque : + Ve = croissance présente Ve = croissance absente

Application Pour la détection des bactéries Pour la détection fongique

Thioglycollate de soja fluide
Digest de caséine
Moyen Moyen
Température d'incubation 30 - 35 C
o
20 - 25oC
Période d'incubation 14 jours 14 Jours
Contrôle positif Staphylococcus aureus Bacillus subtilis
2. Pseudomonas [Link]

TEST DE MICROBIOLOGIE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS DES API STERILES

INSTALLATIONSPage 36
 INTRODUCTION

aeruginosa 3.A. niger

3. Cl. sporogenes
Résultat : L'échantillon ci-dessus respecte le test de stérilité.

TEST D'EMBALLAGE MICROBIOLOGIQUE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STÉRILES

INSTALLATIONSPage37
 INTRODUCTION

TEST DE MICROBIOLOGIE DE L'EAU

INTRODUCTION :

L'eau est l'une des substances les plus largement et abondamment utilisées dans le domaine pharmaceutique.

fabrication. Il est nécessaire pour une variété de buts allant de la fabrication

processus de préparation des formes posologiques finales. La qualité de l'eau donc
revêt une importance considérable.

De nombreux facteurs, dont le plus important est la variabilité de la source de base à savoir.
l'eau municipale ou toute autre régule le contrôle des produits chimiques et microbiologistes
qualité de l'eau pour un usage pharmaceutique. La matière première pour la plupart des formes d'eau
c'est de l'eau potable, qui devrait normalement être soumise à la municipalité ou à tout autre niveau local

règlements ou est puisé d'un puits privé ou d'un réservoir. L'eau préparée à partir d'autres
le matériau de départ peut devoir être traité pour répondre aux normes de l'eau potable. Eau potable
l'eau elle-même peut être utilisée dans la fabrication de substances médicamenteuses mais pas dans le

préparation de formes posologiques, ou dans la préparation de solutions réactives et de test.

TYPES D'EAU

Eau brute
Eau douce
Eau Purifiée
Eau traitée
Eau pour injection (EPI)
Vapeur pure condensée propre (VPCC)

TEST DE MICROBIOLOGIE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STÉRILE

ÉQUIPEMENTSPage38
 INTRODUCTION

Ces eaux sont : (schéma de flux) :

Eau souterraine (Eau brute)

Réservoir de stockage en haut

(Ici, l'hypochlorite de sodium est ajouté pour éliminer la charge biologique)

MGF (filtres multi-grade)

(Des particules plus grandes comme le sable, etc. sont éliminées ici, mais cela contient toujours du magnésium,

calcium et d'autres ions.)

Adoucisseur (résines)

( La dureté est supprimée )

(eau douce) Filtre à cartouche

Osmose inverse 1

Osmose inverse 2

(eau traitée)

EDI (Électrode de ionisation)

Ultrafiltration
(Pour diminuer la conductivité)
(Pour éliminer les endotoxines et la charge biologique)

eau purifiée Réservoir de stockage

Le niveau d'eau est toujours >40%

WFI COURANT PUR PURIFIÉ

EAU

TEST DE MICROBIOLOGIE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STÉRILE

INSTALLATIONSPage39
 INTRODUCTION

MÉTHODES :

Détermination du nombre total de bactéries aérobies viables par échantillonnage d'eau

Technique de filtration sur membrane pour l'eau traitée, purifiée, WFI et

condensat de vapeur pure

Exigence :
Préparez les médias suivants, tels que des plaques de milieu R2A.

Ensemble de filtration

Gobelets de filtration membranaire

Station d'écoulement d'air laminaire

Membranes stérilisées / pré-stérilisées 0,45µ, 47mm et MOC - Cellulose

acétate / nitrate

Forceps et couveuses.

Procédure :
Comptes microbiens aérobies viables totaux par filtration sur membrane pour WFI
et condensat de vapeur pure:

Préparez une unité en verre/acier inoxydable/polypropylène adaptée comprenant un

réservoir fermé et un récipient entre lesquels un support correctement supporté
La membrane est placée, l'ensemble doit être stérilisé et les tests effectués sous
conditions aseptiques.
Utilisez le papier filtre ayant une taille de pore ne dépassant pas 0,45 µm, hydrophile.

membrane et diamètre d'environ 47 mm et MOC de cellulose

acétate/nitrates.
Assemblez le jeu de filtres stérilisés à l'unité de filtration dans le flux d'air laminaire
station.
Placez aseptiquement la membrane stérilisée ou pré-stérilisée à l'aide de la pince dans
la base de la tasse de filtration.

TEST DE MICROBIOLOGIE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STERILE

ÉQUIPEMENTSPage40
 INTRODUCTION

Ces eaux sont : (schéma de flux) :

Eau souterraine (Eau brute)

Réservoir de stockage en haut

(Ici, l'hypochlorite de sodium est ajouté pour éliminer la charge biologique)

MGF (filtres multi-grade)

(Des particules plus grandes comme le sable, etc. sont éliminées ici, mais cela contient toujours du magnésium,

calcium et d'autres ions.)

Adoucisseur (résines)

( La dureté est supprimée )

(eau douce) Filtre à cartouche

Osmose inverse 1

Osmose inverse 2

(eau traitée)

EDI (Électrode de ionisation)

Ultrafiltration
(Pour diminuer la conductivité)
(Pour éliminer les endotoxines et la charge biologique)

eau purifiée Réservoir de stockage

Le niveau d'eau est toujours >40%

WFI COURANT PUR PURIFIÉ

EAU

TEST DE MICROBIOLOGIE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STÉRILE

INSTALLATIONSPage39
 INTRODUCTION

Diluez 1 ml de l'échantillon à tester dans 100 ml de fluide A stérilisé et

transférez tout le contenu sur le filtre à membrane et filtrez immédiatement.
Appliquez le vide et filtrez l'échantillon en vous assurant que l'échantillon est complètement

filtré.
Flammez les forceps, laissez-les refroidir puis transférez la membrane filtrée à
la surface de la plaque d'agar R2A en plaçant lentement la membrane depuis le
bord à la partie complète de la surface de l'agar.
Assurez-vous qu'aucune bulle d'air ne soit piégée à l'intérieur de la membrane et que l'ensemble

La surface de la membrane doit être en contact avec la surface de l'agar.

Incuber les plaques de membrane R2A à 30-35 °C pendant 5 jours / 48-72 heures.
Le contrôle négatif de la membrane se fait également à la même température et au même temps

point.
Après la période d'incubation, comptez le nombre de CFU et reportez le total
nombre de CFU par mL.
Vérifiez également les plaques de contrôle pour la croissance.

Si une croissance est observée dans les plaques de R2A pour les échantillons de WFI, identifiez le

organisme jusqu'au niveau des espèces.

Comptes aérobiques microbiens viables totaux par détermination de l'eau

échantillons par méthode de plaque de gel pour l'eau douce et l'eau potable :

Exigence :
agar R2A
pointes de micropipette.

Procédure :
Ajoutez à chaque boîte de Petri stérilisée de 90 mm, 1 ml de l'échantillon d'eau en double.
dans la station de flux d'air laminaire.

Ajoutez de manière aseptique 20-25 ml de R2A stérilisé.

Vérifiez la température de pas plus de 45°C à l'aide du thermomètre infrarouge.

Faire tourner les assiettes dans le sens des aiguilles d'une montre et dans le sens inverse pour un mélange uniforme de

échantillonner et laisser solidifier.

Pour le contrôle négatif des milieux dans une boîte de Pétri stérilisée de 90 mm.

TEST DE MICROBIOLOGIE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STERILES

INSTALLATIONSPage42
 INTRODUCTION

Après solidification, incubez toutes les plaques dans une condition inversée à 30-35°C.
pendant 48 à 72 heures pendant 5 jours avec des contrôles de test.

Après la période d'incubation, comptez le nombre de CFU dans les plaques.

Calculez les résultats en exprimant la moyenne pour les assiettes et rapportez-la.

compte total de microbes aérobies/ml.

Test pour les microorganismes spécifiés pour les échantillons d'eau :

Exigences :
Préparez les médias suivants :

SCDM-100mL
bouillon Mac-Conkey
Broth d'enrichissement RVS

plaques MSA
plaque CA
plaques XLDA,
Plaques de gélose Mac Conkey.

LAF
Eau peptonée stérilisée à 0,1 % en quantités de 100 mL

Anse d'inoculation,
Kits de coloration de Gram

Incubateurs,
ensemble GPL

Membranes stérilisées/pré-stérilisées de 0,5 µm, 47 mm et MOC-Cellulose

acétate/nitrate
Forceps.

TEST DE MICROBIOLOGIE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STÉRILE

INSTALLATIONSPage43
 INTRODUCTION

Procédure :
Filtration de l'échantillon :

Préparez une unité appropriée en verre/acier inoxydable/polypropylène consistant en un

réservoir fermé et un réceptacle entre lesquels un support approprié
la membrane est placée, l'ensemble doit être stérilisé et des tests effectués sous
conditions aseptiques.
Filtrer 100 mL de l'échantillon à tester à travers le papier filtre ayant des pores.
taille ne dépassant pas 0,45µ, membrane hydrophile et diamètre
environ 47 mm et MOC de cellulose acétate/nitrate.
Assemblez l'ensemble de filtres stérilisés à l'unité de filtration dans le flux d'air laminaire
station.
Placez aseptiquement la membrane stérilisée sur la partie supérieure du haut.
portion de la tasse de filtration ou utiliser un système de filtration avec pré-stérilisé

gobelets en membrane avec membrane.

Transférez 100 mL de l'échantillon en cours d'examen sur le filtre à membrane et
filtrer immédiatement.
Appliquez le vide et filtrez l'échantillon et assurez-vous que l'échantillon est complètement

filtré.
Flammez les pincettes, laissez-les refroidir et transférez ensuite la membrane filtrée vers
100 mL de milieu de digestion de soja Cseim stérilisé.
Incubez le tube SCDM enrichi à 30-35°C pendant 18 à 24 heures et procédez.
pour le test de pathogène spécifié.

Enrichissement :

Test pour [Link] :

Transférez 1 mL de SCDM enrichi dans 100 mL de bouillon Mac Conkey et

incuber à 42-44°C pendant 24-48 heures.

Observez la croissance puis étalez sur une plaque de gélose MacConkey et incubez à 30-35°C
pour 18-72 heures.

Si la colonie se développe, alors confirmez par le test d'identification (Mini API).

ESSAI MICROBIOLOGIQUE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STERILE

ÉQUIPEMENTSPage44
 INTRODUCTION

Test pour Salmonella :

Transférez 0,1 mL du SCDM enrichi dans 10 mL de bouillon RVSE et incubez

à 30-35°C pendant 18-24 heures.

Observer la croissance puis étalez sur une plaque XLDA et incubez à 30-35°C pendant 18-

48 heures.
Si la colonie se développe, confirmez par un test d'identification (Mini API).

Test pour Staphylococcus aureus :

Observez la croissance dans le SCDM enrichi, si une croissance est observée, poursuivez.

suivant.
Par le biais d'un inoculum en traînant sur une portion du bouillon d'enrichissement
sur la surface d'une plaque d'agar au sel de mannitol et incuber à 30-35°C pendant 18-72 heures.

La présence possible de Staphylococcus Aureus est indiquée par la croissance de

des colonies jaunes ou blanches entourées d'une zone jaune.
Si la colonie se développe, confirmez par un test d'identification (Mini API).

Pseudomonas aeruginosa

Observer la croissance dans le SCDM enrichi, si une croissance est observée, procéder à

suivant. À l'aide d'une boucle d'inoculation, étalez une portion de

bouillon d'enrichissement à la surface d'une boîte de pétri d'agar Cetramide et incuber à 30-

35°C pendant 18-72 heures.

La croissance des colonies indique la présence possible de Pseudomonas

aeruginosa.
Si la colonie se développe, confirmez par un test d'identification (Mini API).

Résultats :

Type d'eau Quantité en mL Niveau d'alerte Niveau d'action

Eau brute et eau douce 1 ml dans 100 mL 200UFC/ml 500CFU/ml
Fluide A
Traité et Purifié 1 ml dans 100 mL 80UFC/ml 100 UFC/ml
Eau Fluide A
WFI et PSG 200ml 5CFU/ml 10UFC/ml
*Média utilisé : R2A
Rapport d'observation des comptes :
TESTS MICROBIOLOGIQUES DES PRODUITS BRUTS ET FINIS DE L'API STÉRILE
ÉQUIPEMENTSPage45
 INTRODUCTION

Échantillon (Eau) Observation Remarques Média

Échantillon WFI1 Nil/200ml Se conforme R2A
Exemple de WFI 2 Nil/200ml Conforme R2A
Échantillon purifié 1 2/ml Se conforme R2A
Échantillon Purifié 2 4/ml Se conforme R2A
Échantillon traité 1 13/ml Se conforme R2A
Échantillon traité 2 14/ml Conforme R2A
Échantillon doux 1 19/ml Se conforme R2A
Échantillon doux 2 14/ml Se conforme R2A
Échantillon brut 1 31/ml Conforme R2A
Échantillon Brut 2 33/ml Conforme R2A
Rapport sur l'analyse du pathogène (Staphylococcus aureus) dans l'eau :

Eau d'échantillon Test d'enrichissement Test présomptif Test de confirmation

WFI, échantillon 1 Croissance Pas de croissance NA
WFI, échantillon 2 Croissance Pas de croissance NA
Purifié, échantillon 1 Croissance Pas de croissance NA
Purifié, échantillon 2 Croissance Aucune Croissance NA
Traité, échantillon 1 Croissance Pas de croissance N/A
Échantillon 2 traité Croissance Pas de croissance NA
Doux, Échantillon 1 Croissance Pas de croissance NA
Doux, échantillon 2 Croissance Pas de croissance NA
Brut, échantillon 1 Croissance Pas de croissance NA
Brut, échantillon 2 Croissance Pas de croissance NA
*Remarques : Conforme

Rapport pour l'analyse du pathogène (Pseudomonas aeruginosa) de l'eau :

Eau d'échantillon Test d'enrichissement Test présomptif Test de confirmation

WFI, échantillon 1 Croissance Pas de croissance NA
WFI, échantillon 2 Croissance Pas de croissance NA
Purifié, échantillon 1 Croissance Pas de croissance NA
Purifié, échantillon 2 Croissance Pas de croissance NA
Échantillon traité 1 Croissance Pas de croissance NA
Échantillon traité 2 Croissance Pas de croissance NA
Douce, Échantillon 1 Croissance Pas de croissance NA
Doux, échantillon 2 Croissance Pas de croissance NA
Brut, échantillon 1 Croissance Pas de croissance NA
Brut, échantillon 2 Croissance Pas de croissance NA
*Remarques : Conforme

TEST DE MICROBIOLOGIE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STÉRILE

ÉQUIPEMENTSPage46
 INTRODUCTION
Rapport pour l'analyse des Pathogènes ([Link]) dans l'eau :

Eau d'échantillon Enrichissement Présomptif Présomptif Confirmatoire

Test Test 1 Test 2 Test
WFI, échantillon 1 Croissance Pas de croissance Pas d'analyse NA
WFI, échantillon 2 Croissance Pas de croissance Pas d'analyse NA
Purifié, S-1 Croissance Pas de croissance Pas d'analyse NA
Purifié,S-2 Croissance Pas de croissance Pas d'analyse NA
Traité, S-1 Croissance Pas de croissance Pas d'analyse NA
Traité, S-2 Croissance Pas de croissance Aucune analyse NA
Doux, S-1 Croissance Pas de croissance Aucune analyse NA
Doux, S-2 Croissance Pas de croissance Pas d'analyse NA
Brut, échantillon 1 Croissance Pas de croissance Pas d'analyse NA
Brut, échantillon 2 Croissance Pas de croissance Pas d'analyse NA
*Remarques : Conforme

Rapport pour l'analyse du pathogène (Salmonella) dans l'eau :

Eau échantillon Enrichissement

Test 1 2 Test
WFI, échantillon 1 Croissance Pas de croissance Pas d'analyse NA
WFI, échantillon 2 Croissance Pas de croissance Pas d'analyse NA
Purifié, S-1 Croissance Pas de croissance Pas d'analyse NA
Purifié, S-2 Croissance Aucune croissance Pas d'analyse NA
Traité, S-1 Croissance Pas de croissance Pas d'analyse NA
Treated, S-2 Croissance Pas de croissance Aucune analyse NA
Douce, S-1 Croissance Pas de croissance Pas d'analyse NA
Douce, S-2 Croissance Pas de croissance Pas d'analyse NA
Brut, échantillon1 Croissance Pas de croissance Pas d'analyse NA
Brut, échantillon2 Croissance Pas de croissance Pas d'analyse NA
*Remarques : Conforme #NA = Non applicable.

TEST DE MICROBIOLOGIE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS DE L'API STERILE

ÉQUIPEMENTSPage47
 INTRODUCTION

Fig : Les colonies se développent sur la membrane

TEST D'ENDOTOXINE BACTÉRIENNE (TEB)

INTRODUCTION :

Le test des endotoxines bactériennes est utilisé pour détecter ou quantifier les endotoxines des grammes.
origine bactérienne négative qui peut être présente dans ou sur l'échantillon auquel le test est
appliqué, en utilisant du lysat d'amoebocytes de l'éponge de cheval (Limulus polyphenus) ou
(Tachyplustridentatus)
La détermination du point final de la réaction se fait par dilution du matériau.
sous test en comparaison directe avec une dilution parallèle des endotoxines standards de contrôle
(CSE) de potentiel défini en unités d'endotoxines par ml. EU/ml.

ÉQUIPEMENTS, APPAREILS ET RÉAGENTS :

APPAREIL :

12 tubes en verre de 75 mm, 10 tubes en verre de 75 mm, pointes micro de 20-200µl

(Dépyrogéné, emballé individuellement), support pour tubes à essai.

ÉQUIPEMENTS

Bloc de chauffage, micropipette (20 - 200µl), micropipette (100 - 1000µl).

TESTS MICROBIOLOGIQUES DES PRODUITS BRUTS ET FINIS DE L'API STERILE

INSTALLATIONSPage48
 INTRODUCTION

RÉACTIFS
Réactif LAL de sensibilité 0,125 UE/ml
Eau réactif LAL
Contrôler les endotoxines standard :
Le contenu entier d'un flacon de RSE a été constitué avec 5 ml de LRW
Mélanger par intermittence pendant 30 minutes à l'aide d'un mélangeur vortex et ce concentré
ont été utilisés pour réaliser une dilution sérielle appropriée.
Conservé le concentré au réfrigérateur pour faire la dilution suivante pour
pas plus de 14 jours.

HCl 0,1N sans endotoxine :

En utilisant une pipette sans endotoxines, ajouter 100 µl de HCl concentré dans 10 ml.
LRW qui était contenu dans une bouteille déshydrogénée.

NaOH 0,1 N sans endotoxine :

0,1 g de NaOH a été ajouté dans 25 ml de LRW contenu dans un récipient dépyrogéné.
bouteille.

Préparation d'échantillons :

La solution échantillon a été préparée en dissolvant ou en diluant des médicaments ou en extrayant.

dispositifs médicaux utilisant LRW. Certaines substances peuvent être plus appropriées à dissoudre,
dilué, ou extrait dans une autre solution aqueuse. Le pH de la solution devrait être compris entre
6.0 -8.0.

Échantillon utilisé :

WFI (Eau pour Injection).

Figure : montrant le kit de protocole pour le test d'endotoxine.

TEST D'ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STÉRILES

INSTALLATIONSPage49
 INTRODUCTION

Principe :
Il est important d'avoir un test sensible pour identifier la présence d'endotoxines dans les médicaments.
dispositifs médicaux et fluides corporels. Les matériaux qui ont été stérilisés peuvent contenir
endotoxines, même si aucune bactérie ne peut être cultivée à partir d'elles. Un tel test de laboratoire
appelé test LAL, qui peut détecter même une quantité minuscule de test LAL est conforme
avec la dernière demande de la commission de la pharmacopée européenne pour des remplacements de
test basé sur les animaux pour notre méthode alternative là où cela est possible. Standard pour le test
est préparé à partir d'endotoxine dérivée d'E. coli.

L'unité de mesure est l'UE pour l'USP et l'UI pour la Pharmacopée Européenne et le reste.
Le test de l'endotoxine bactérienne dans le monde peut être effectué par trois méthodes.

Méthode du gel de coagulation

Méthode chromogénique cinétique.

Méthode turbidimétrique

MÉTHODE D'ANALYSE :
Méthode de gel de coagulation :

37(± 1) º C

Échantillon / étalon de contrôle + réactif LAL observer la présence

ou
60(± 2) min absence de gel

+ Gel → gel qui conserve son intégrité lorsque le tube est inversé à 180º

- Gel → liquide clair ou visqueux, qui s'écoule lorsque le tube est inversé.

Reconstitution du réactif LAL :

Le flacon d'eau réactif LAL lyophilisé a été reconstitué comme indiqué sur l'étiquette du flacon et
couvrir le flacon avec un bouchon. Le flacon a été tourné doucement, jusqu'à ce qu'il se dissolve. Reconstitué
Le réactif LAL a été stocké en dessous de -200C jusqu'à 28 jours.

Série standard de contrôle des endotoxines :

Le flacon de norme de contrôle endotoxines lyophilisé a été reconstitué avec le volume de

eau réactif LAL sans endotoxines.

Le flacon était recouvert d'un bouchon et vortexé vigoureusement pendant au moins 30 minutes.
le CSE reconstitué a été stocké à 2-80C jusqu'à 4 semaines. Les flacons de CSE reconstitués
TEST DE MICROBIOLOGIE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS DE L'API STERILE
INSTALLATIONSPage50
 INTRODUCTION

ont été restaurés pendant 1 min. avec l'aide d'un cyclomélangeur. La dilution de CSE était
préparé en concentration de 4 λ, 2λ, λ, λ/2, λ/4.

Tableau 1 montrant la dilution du CSE.

Tube LRW CSE ajouté depuis le tube Concentration finale de CSE

Non
01 0,9 ml 0,1 ml de 20 UE/ml 20 UE/ml
02 1,2 ml 0,4 ml du tube n°1 0,5 UE/ml-4λ
03 1,0 ml 01,0 ml de tube n°2 0,25EU/ml-2 λ
04 1,0 ml 1,0 ml de tube n°3 0,125EU/ml- λ
05 1,0 ml 1,0 ml de tube n°4 0,06U/ml- λ /2
06 1,0 ml 1,0 ml de tube n°5 0,03EU/ml- λ /4

Test de sensibilité des revendications étiquetées du réactif LAL :

La sensibilité de la revendication d'étiquette de chaque lot de réactif LAL avant utilisation dans le test était altérée.
comme ci-dessous :

Une série de dilutions en deux fois de CSE à une concentration donnée de 2λ, λ, λ/2, λ/4 a été préparée.
où est la sensibilité étiquetée du réactif LAL en EU/ml le test a été réalisé sur quatre
& annulation standard.

Procédure de test :

Essuyé la zone de travail avec de l'IPA à 70 % v/v.

Des verreries dépyrénées ont été utilisées.

Désinfecté la surface extérieure du conteneur d'échantillons avec 70 % d'IPA.

Préparé les dilutions utilisées dans le test en utilisant de l'eau BET comme Tableau I. Échantillon
la dilution a été choisie entre la dilution non-interférente et la MVD pour éliminer
facteurs d'interférences.

Essuyé la surface extérieure du flacon et du conteneur ainsi que l'ouvre-flacon avec une solution à 70% v/m.
IPA.

Calculé la dilution maximale valide pour le produit par une formule.

PROCÉDURE DE TEST DES LIMITES D'ENDOTOXINE :

TEST DE MICROBIOLOGIE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STÉRILE

INSTALLATIONSPage51
 INTRODUCTION

Matériel : Eau purifiée / eau stérile pour injection (I.P. / B.P. / U.S.P.)

Limite d'endotoxines : NMT 0,25 Eu/ml

Sensibilité du LAL : 0,125Eu/ml

Calcul du MVD (Dilution Maximale Valide)

MVD = Limite d'endotoxine (Eu/mg) × puissance du produit

Sensibilité du LAL =
(0.25 x 1.0)/0.125

Contrôle négatif : 100µl LRW + 100 µl de lysat

Test 50 µl d'échantillon + 50 µl de LRW + 100 µl de lysat

PPC 50µl d'échantillon + 50µl de 4λ + 100µl de lysat

CSE :

100µl de chaque dilution + 100 µl de lysat

Agitez doucement la bouteille pour dissoudre complètement le contenu et la mettez sur de la glace.

tout au long du test.

Après l'ajout au lysat, le tube à essai a été conservé pour une incubation à 370C + 10C pour 60 +
2 min dans un bloc de chauffage calibré.

Figure : Montrant l'incubation de l'échantillon, PPC et NPC dans l'incubateur BET.

TEST DE MICROBIOLOGIE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STÉRILES

INSTALLATIONSPage52
 INTRODUCTION

TESTING MICROBIOLOGIQUE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STERILE

INSTALLATIONSPage53
 INTRODUCTION

OBSERVATIONS :

Table pour un test d'endotoxine

TUBES ÉCHANTILLONS CSE LRW OBSERVATION DE LYSATE

PPC 50µl 50 µl (CSE - 100 µl Formation de gel

(MVD/2) 4λ)
PNJ 50µl - 50 µlLRW 100 µl Pas de formation de gel
(MVD/2)
NWC - 50 µl LRW 100 µl 100 µl Aucune formation de gel

PWC - 50 µl(4λ) 50 µl 100 µl Gel ferme

0,5 € / µl formation

RESULT
L'échantillon est conforme car il n'y a aucune preuve d'une quantité considérable de
endotoxines.

PRÉCAUTIONS :

Endotoxines standard Vortex pendant au moins 30 minutes en scotchant le flacon à

mélange vortex.
Vortexer tous les endotoxines pendant au moins 1 minute
Ne laissez pas les dilutions d'endotoxines reposer pendant plus de 10 minutes sans
revortexing.
Reconstituez le lysat très délicatement et mélangez soigneusement afin d'éviter la formation de
bulles.
Incuber les tubes dans un bloc chauffant posé sur une surface stable, qui ne se déplace pas.
les vibrations secouent ou heurtent. Ne pas incuber le tube dans une armoire LAF qui peut
vibrer et casser le gel fragile.
Ne transférez ni ne dérangez les tubes à aucune étape de l'incubation jusqu'à la lecture du résultat.
Lisez les résultats une seule fois. Les gels sont fragiles et peuvent se briser lorsqu'ils sont manipulés.

Application du BET dans l'industrie pharmaceutique :

1. Validation du stérilisateur à chaleur sèche (DHS) / four ou tunnel pour la dépyrrogénation.

2. Surveillance du système d'eau pour le contenu en endotoxines.

3. Contrôle en cours de processus des endotoxines dans les produits pharmaceutiques en vrac.

4. Détection des endotoxines dans les dispositifs médicaux.

TEST MICROBIOLOGIQUE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STÉRILE

ÉQUIPEMENTSPage54
 INTRODUCTION
5. Formulation en cours de traitement.

CONCLUSION
Les tests microbiologiques sont très importants pour chaque produit pharmaceutique.

produit car il existe plusieurs microorganismes qui interfèrent avec

ces produits et leurs tests sont nécessaires, il y a plusieurs produits
qui ne peut pas être détecté par des méthodes chimiques donc microbiologiques
les essais sont très utiles pour résoudre les doutes concernant un changement possible dans

la puissance de ces produits et leur préparation.

Tous les tests microbiologiques tels que la stérilité, le test microbiologique de l'eau (total

test de comptage microbien et test pour pathogènes), test des endotoxines bactériennes,

L'essai microbiologique de la vitamine B12 est dans les limites selon

la pharmacopée et les produits pharmaceutiques fabriqués sont passés

par la section microbiologique de la division du contrôle de la qualité.

Il est maintenant conclu que la qualité de l'injection d'Omez, de l'eau purifiée,

La capsule Becozinc et le WFI sont conformes aux normes prescrites par
Pharmacopée indienne.

Chaque produit pharmaceutique devrait certifier sa revendication, alors il est

lancé sur le marché sinon s'il échoue dans sa réclamation, le produit n'est pas
lancé sur le marché

Chaque pays a sa propre pharmacopée selon laquelle les médicaments et autres

les produits sont certifiés.

TEST DE MICROBIOLOGIE DES PRODUITS BRUTS ET FINIS D'API STERILE

INSTALLATIONSPage55
 INTRODUCTION

RÉFÉRENCES
Microbiologie pharmaceutique (par Hugo et Russell).
Microbiologie pour chimiste analyste. (Par R.K. Dart)
Blechova R., D Pivodva; Test LAL – une méthode alternative de
dilution de l'endotoxine bactérienne Acta Vet. Brno 2001 ; 70 ; 291-296.
Cooper JF, Arrondir les calculs liés à BET. LAL. Temps 5 : 3,
1998.
Danyer S.P et Hodges (NA) (1989) "Théorie et application de"
Assai microbiologique” Academic Press Londres.
Pharmacopée Indienne
Microbiologie par Lansing M. Prescott, J. Harley et D. Klein.
Directives pharmaceutiques
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