(Treponema Pallidum
Réalisé par Hassan Bourri
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Table des matières
I- Intérêt biologique du TPHA ............................................................................................. 3
II- Technique de prélèvement du TPHA ................................................................................ 3
III- Principe du TPHA ........................................................................................................... 4
1. Principe de la réaction d’agglutination ............................................................................... 4
2. Lecture du résultat............................................................................................................ 5
IV- Procédure du TPHA .................................................................................................... 5
1. Matériels.......................................................................................................................... 5
2. Réactifs ............................................................................................................................ 5
3. Étapes techniques ............................................................................................................. 6
3.1. Méthode qualitative ................................................................................................... 6
3.2. Méthode semi-quantitative ......................................................................................... 6
4. Facteurs qui influencent la technique................................................................................. 7
V- Lecture des résultats ......................................................................................................... 8
1. Expression des résultats .................................................................................................... 9
2. Interprétation des résultats ................................................................................................ 9
3. Analyse des résultats ...................................................................................................... 10
VI- VI- Comparaison des tests TPHA, VDRL et FTA: avantages et inconvénients .............. 11
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TPHA
I- Intérêt biologique du TPHA
La syphilis est une maladie vénérienne. Elle évolue selon trois phases distinctes avec
des phases sans symptômes pendant lesquelles seul le diagnostic sérologique permet de
la détecter. Dans sa phase terminale, elle peut engager le pronostic vital, ou tout au moins
des troubles neurologiques et cardiovasculaires.
La syphilis est causée par la bactérie Treponema pallidum (tréponème pâle). C’est
une bactérie Gram négative spiralée et mobile. Elle provoque l’apparition, entre autres,
d’anticorps spécifiques, détectables par le TPHA. Couplé au dosage du VDRL (Venereal
Disease Research Laboratoratory), le TPHA permet de faire le diagnostic de la syphilis.
Treponema pallidum
II- Technique de prélèvement du TPHA
Le TPHA peut être effectué sur sérum, sur plasma ou liquide céphalo-rachidien
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Nous avons choisi d’étudier la procédure avec sérum. Celui-ci ne doit pas être
hémolysé, ni présenter de turbidité (capacité d’un liquide à absorber ou diffuser la lumière
incidente, étant ainsi trouble). Il ne doit pas être lipémique (c’est le cas si l’on ne peut lire
du papier imprimé au travers).
Pour obtenir du sérum :
• Prélever du sang veineux dans un tube sec selon les normes
• Laisser coaguler le sang total à température ambiante pendant au moins 20 minutes
ou centrifuger à 3000 tr/min pendant 5 minutes dès que le culot est pris.
• Transférer le sérum dans un autre tube (tube Eppendorf par exemple) et étiqueter le
tube.
Si le test n’est pas exécuté dans les 4 heures, réfrigérer le sérum à 2-8 °C. Si le test
n’est pas exécuté dans les 5 jours, le congeler à -20°C. L’on doit laisser revenir le sérum à
température ambiante (23-30°C) avant le test. Il faut toujours vérifier qu’il ne présente pas
de débris avant le test.
III- Principe du TPHA
1. Principe de la réaction d’agglutination
Le TPHA repose sur une réaction d’agglutination passive. Dans une telle réaction,
les antigènes, normalement solubles, sont rendus particulaires par fixation à un support.
Dans le cas du TPHA, l’antigène engagé dans la réaction est fixé sur des hématies aviaires
par traitement à l’acide tannique.
En 1er, il s’agit de mélanger le sérum à tester dans un puits d’une microplaque de
titration à un diluant qui détache les anticorps hétérophiles. C’est-à-dire ceux qui peuvent
se lier aux hématies animales, pouvant ainsi causer des réactions croisées. De plus, le fait
de diluer ainsi le sérum enlève, bloque ou absorbe les anticorps anti-tréponèmes non
pathogènes pouvant eux aussi causer des réactions croisées. Puis l’on mélange cette
dilution aux hématies aviaires auxquelles les antigènes ont été fixés. L’on incube le
mélange pendant 45 à 60 minutes.
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2. Lecture du résultat
S’il y a agglutination (voile au fond du puits de la plaque) alors le patient a des
anticorps contre T. pallidum. La réaction est positive.
Si les hématies ne s’agglutinent pas et se déposent en bouton compact au fond du
puits, alors le patient ne possède pas les anticorps recherchés. La réaction est négative.
Si le mélange présente un voile lors de cette phase qualitative, l’on peut passer à
la titration des anticorps du sérum du patient. C’est la phase quantitative. Il s’agit de faire
une dilution en série du sérum, puis de le mélanger aux hématies-test, jusqu’à l’obtention
d’une agglutination nulle du mélange.
L’on obtient le titre en multipliant l’inverse du facteur de dilution du dernier
mélange positif par le seuil de dépistage du kit du fabricant du test.
IV- Procédure du TPHA
1. Matériels
• Microplaque de titration à 96 puits à fond en U, qui permet un pipetage facile et
libre de résidus;
• Micropipette pouvant distribuer des volumes de 10, 25, 75 et 190µL;
• Gants à usage unique;
• minuteur;
• Solution décontaminant pour y jeter les cônes.
2. Réactifs
Selon le kit, nous comptons parmi eux :
• Le tampon de dilution : c’est un diluant. Il sert à prédiluer les spécimens. Il contient
un extrait de tréponèmes de Reiter qui ont pour rôle d’absorber les anticorps de
tréponèmes non pathogènes;
• Cellules-test : érythrocytes aviaires stabilisées à l’eau formolée, auxquelles sont
fixés des antigènes de T. pallidum (souche de Nichols).
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• Cellules-contrôle : érythrocytes aviaires stabilisés. Des antigènes n’y sont pas fixés.
• Contrôle positif : serum predilué au 1/20, titré à 1/640 .
• Contrôle négatif : sérum humain prédilué au 1/20, exempt d’anticorps contre T.
pallidum.
3. Étapes techniques
3.1. Méthode qualitative
Prévoir 3 puits de la microplaque par échantillon. Dans cet ordre, il faut :
1. Ramener chacun des composants du kit à température ambiante. De même que les
échantillons si nécessaire.
2. Avec la micropipette, déposer 190µL de tampon de dilution dans le puits A.
3. Déposer 10µL de sérum dans le puits A avec un nouveau cône.
4. A l’aide d’une micropipette, mélanger le contenu du puits A et transférer 25µL de
cette dilution 1/20 dans les puits B et C.
5. Remettre en suspension par retournement les cellules-test et contrôle
6. Ajouter 75µL de cellules contrôle dans le puits B
7. Ajouter 75µL de cellules-test dans le puits C
8. Homogénéiser mécaniquement ou manuellement le contenu des puits
9. Couvrir la plaque et la placer à l’abri de la lumière de la chaleur et de toutes sources
de vibrations
10. Incuber pendant 45-60 minutes à température ambiante. Lire les résultats.
Ceux-ci sont stables pendant 24 heures si la plaque est couverte et si les precautions
énoncées ci-dessus ont été respectées. Pour les contrôles positifs et négatifs, il faut
suivre les mêmes manipulations que pour l’échantillon.
3.2. Méthode semi-quantitative
Prévoir 5 puits supplémentaires par patient. A numéroter de D à H. Les sérums
contrôlent positif et négatif peuvent ne pas être testés, puisqu’ils l’ont déjà été.
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Il faut procéder ainsi :
1. A l’aide d’une micropipette, distribuer 25 µL de tampon dans les puits D à H.
2. Transférer 25µL de sérum précédemment dilué au 1/20 dans le puits D et mélanger
en aspirant et refoulant.
3. Prélever 25µL de sérum dilué au 1/40 du puits D et le déposer dans le puits E.
Mélanger encore et faire la même chose pour les puits F, G, H. Prélever 25µL du
mélange du puits H et le jeter.
4. S’assurer que les cellules-test sont bien remises en suspension. Ajouter 75µL de ces
cellules dans les puits D à H inclus, successivement. Ceci conduit aux dilutions
suivantes :
puits D E F G H
dilution 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560
Facteurs de dilution du sérum pour la phase semi-quantitative
• Homogénéiser mécaniquement le contenu des puits (ou manuellement) en tournant
la plaque en cercles
• Couvrir la plaque et la placer à l’abri de la lumière, de la chaleur et des vibrations.
• Incuber pendant 45-60 minutes à température ambiante. Lire les résultats.
Les résultats sont stables pendant 24 heures si la plaque est couverte et les précautions
suscitées ont été prises.
4. Facteurs qui influencent la technique
Parmi ces facteurs, nous pouvons dégager :
• La propreté désireuse de la microplaque si elle a été recyclée et mal nettoyée peut
affecter la réaction antigène-anticorps. Il faut donc s’assurer de sa propreté.
• La bonne conservation des réactifs : à 2-8°C et à l’abri de la lumière. Ils ne
doivent pas atteint leur date de péremption.
• Le technicien ne doit pas mélanger les réactifs de différents lots .
Limites de la procédure et propositions pour surmonter ces limites
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Si l’agglutination dans la série des cellules-contrôle est supérieure ou égale à celle de la
série des cellules-test, alors, la réaction est non-spécifique.
La procédure ci-dessous doit être appliquée :
1. Transférer 100µL de sérum à tester dans un petit tube puis ajouter 400µL de cellules-
contrôle. Ensuite, bien mélanger, et laisser incuber pendant une heure.
2. Centrifuger 15 minutes à 1000 tpm et tester le surnageant avec la méthode
qualitative. Le spécimen est ainsi dilué au 1/5. Nous prenons cela en compte pour
les futures manipulations lors du passage à la quantification.
Si le test est à nouveau non spécifique, il faut faire un autre test, alternatif ou
complémentaire et non le TPHA.
V- Lecture des résultats
Les résultats potentiels sont les suivants :
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Lors de la quantification, le sérum doit arrêter d’être dilué dès obtention d’un résultat
négatif.
Expression, interprétation et analyse des résultats
1. Expression des résultats
Le titre correspond à la plus forte dilution conduisant à une agglutination. Le compte
rendu de résultat indique généralement la positivité ainsi que ce titre et les valeurs de
référence.
2. Interprétation des résultats
Les anticorps développés après une syphilis peuvent persister après guérison. C’est
pourquoi un TPHA positif peut indiquer une infection présente ou passée. Dans ce cadre,
il faut interpréter les résultats du TPHA en les complétant avec ceux du VDRL et
éventuellement du FTA-ABS tel que suit :
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N’exclut pas le diagnostic de
VDRL – TPHA – sérologie est négative (1)
syphilis débutante
Le FTA est en général
VDRL- TPHA + syphilis traitée(2) négatif, ou faiblement positif
(FTA=<400)
Les 3 marqueurs VDRL,
Syphilis non traitée ou TPHA et FTA sont à des
VDRL+ TPHA+
traitée tardivement(3) taux variables selon le stade
de l’infection
Syphilis primaire (chancre)
VDRL+ TPHA- FTA positif
(4)
Faux positif en
VDRL (anticorps
FTA négatif
anti-
cardiolipidiques)
Interprétation des résultats du TPHA en regard des examens complémentaires
3. Analyse des résultats
Cette analyse est essentiellement tirée de la ressource bibliographique.
❖ (1): n’exclut pas le diagnostic de syphilis précoce.
❖ (2): ce groupe peut comporter également les patients ayant des réactions faussement
positives. Ce peut être le cas chez les patients souffrant de lèpre, de mononucléose
infectieuse ou de troubles du tissu conjonctif. Le test TPHA peut s’avérer aussi
positif s’il y a des infections treponemiques non vénériennes comme le pian, le
bejel, ou pinta. Les signes cliniques doivent donc être pris en considération.
❖ (3): lorsque les taux d’anticorps sont élevés (par exemple VDRL>8 unités et TPHA
>5120), le diagnostic est aisé, surtout si les signes cliniques sont évocateurs.
Cependant pour un patient traité tardivement, le suivi sérologique devra mettre en
évidence une diminution significative du VDRL (il est admis qu’une baisse du titre
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du VDRL de 4 fois en six mois est significative. Par exemple de 32 unités à 8 unités,
soit de 2 dilutions).
❖ (4): au stade de syphilis primaire, généralement nous avons le VDRL positif et le
TPHA positif, mais le TPHA peut s’avérer négatif. Il faut alors effectuer le FTA,
pour être sûr qu’il s’agit d’un faux positif pour le VDRL.
NB : en routine, les tests TPHA et VDRL sont réunis sous l’appellation de BW (Bordet
et Wassermann). Le FTA-ABS nécessite l’utilisation d’un microscope à fluorescence.
Il n’est pas pratiqué en routine.
VI- VI- Comparaison des tests TPHA, VDRL et FTA:
avantages et inconvénients
Le diagnostic biologique de la syphilis est basé essentiellement sur la sérologie
syphilitique, la mise en évidence du Treponema Pallidum à l'examen direct étant difficile.
Les techniques sérologiques utilisées sont de natures diverses comprenant : TPHA, VDRL,
FTAABS…
Un TPHA positif dans le sang signe le diagnostic de tréponématose, en revanche,
aucune sérologie ne peut différencier la syphilis des autres tréponématoses non
vénériennes. Un VDRL positif peut s'observer en dehors de toute syphilis (fausse sérologie
positive). Ainsi, il est utile de demander les deux tests (TPHA : tréponémique, VDRL :
non tréponémique).
Une interprétation correcte de la sérologie syphilitique permet de connaître les
différents stades de la maladie et d'en suivre l'évolution. La diminution du titre de VDRL
quantitatif est le principal critère de surveillance sérologique après traitement.
Certaines difficultés d'interprétation sont rencontrées au cours de la neurosyphilis
et de la syphilis congénitale. L'avènement de nouvelles techniques telles que l'ELISA et la
PCR ont facilité leur diagnostic, mais restent coûteuses et de réalisation difficile.
Comme dit plus haut, le diagnostic sérologique de la syphilis en routine repose sur
l’interprétation des résultats du TPHA et du VDRL, ensemble.
L’intérêt biologique du VDRL repose sur le fait que c’est un test qui a pour but de
détecter et quantifier les réagines. Ce sont des anticorps non spécifiques à Treponema
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pallidum car elles sont dirigées contre des antigènes dits de Wassermann, qui peuvent être
élaborés même par des organismes qui ne sont pas T. pallidum.
L’intérêt et principe du FTA-ABS (Fluorescent Treponemal Antibody
Absorption) consiste en l’étalement du sérum du patient sur une lame à laquelle des
germes de T. Pallidum ont été fixés. Si le sérum contient des anticorps, ceux-ci vont adhérer
aux germes. Ensuite une immunoglobuline antihumaine marquée à un fluorophore est
ajoutée. Elle va se lier aux IgG et IgM du patient qui adhèrent à T. pallidum, et grâce au
fluorophore, le complexe sera détectable au microscope à fluorescence.
Comparaison VDRL TPHA et FTA
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