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Les méthodes Elisa

Le principe de l'ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) est de détecter et de

quantifier une substance spécifique, souvent un antigène ou un anticorps, dans un
échantillon biologique grâce à une réaction colorimétrique . La méthode repose sur
l'utilisation d'anticorps marqués par une enzyme qui réagissent avec la substance cible,
produisant un signal détectable.
Ainsi, le radio-immunodosage (en anglaise : RIA, radio immune assay) a fait son
apparition au cours des années 50. Le test fait appel au marquage radioactive de réactifs
se liant spécifiquement aux complexes antigène-anticorps. Ce type de test tend à
diminuer à cause des dangers de la radiation, de la nécessité d’avoir accès à des
compteurs de radioactivité. En 1971, deux groupes de chercheurs (Engvall et Perlmann
1971, Van Weemen et Schuurs 1971) eurent l’idée de remplacer l’isotope radioactive par
une enzyme. Cette technique permet l’utilisation de substrats chromogène et une
visualisation de la presénce de complexes antigènes-anticorps par l’apparition de
produits colorés pouvant être quantifiés au spectrophotomètre. La technique fut nommée
ELISA pour “Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay” (Engvall et Perlmann 1971), ou
EIA pour “Enzyme Immuno Assay” (Van Weemen et Schuurs 1971) .

Voici les étapes clés du principe ELISA :

1. L'antigène ou l'anticorps cible est fixé à la surface des puits d'une microplaque.
2. L'échantillon à analyser est ajouté au puits et l'antigène ou l'anticorps présent dans
l'échantillon se lie à celui fixé à la surface du puits.
3. Un anticorps spécifique à l'antigène ou à l'anticorps cible, marqué par une enzyme,
est ajouté. Cet anticorps se lie à l'antigène ou à l'anticorps lié dans le puits.
4. Un substrat chromogénique (qui change de couleur en présence de l'enzyme) ou
fluorogénique est ajouté. L'enzyme marque l'anticorps catalyse la transformation
du substrat, produisant un signal détectable (par exemple, une couleur).
5. La densité optique (ou la fluorescence) est mesurée à l'aide d'un lecteur de
plaque. L'intensité du signal est proportionnelle à la concentration de l'antigène ou
de l'anticorps dans l'échantillon.

L’incubation permet la fixation des anticorps présents dans l’ échantillon aux antigènes
fixés à la surface de la plaque.

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L’ étape de rinçage permet d’éliminer les anticorps conjugués non fixés ou tout ce qui est
en excès .
Le substrat est une substance qui réagit avec l'enzyme liée à l'anticorps pour produire un
signal mesurable, généralement un changement de couleur.
L'enzyme est un catalyseur biologique qui transforme un substrat en un produit visible
ou mesurable. Elle est souvent couplée à un anticorps spécifique pour la détection.
Le spectrophotomètre sert à mesurer la concentration d’une solution colorée. La méthode
est le dosage colorimétrique.

Il existe plusieurs types d'ELISA : l'ELISA direct, l'ELISA indirect, l'ELISA sandwich et
l'ELISA compétitif, chacun ayant des spécificités différentes en fonction de la substance à
détecter et de la méthode de detection employée.

Matériel :
- Un tube ou une plaque de plastique multipuits
- Enzyme
- Substrat
- Spectrophotomètre
- Sérum du patient

I- Elisa direct :
La méthode ELISA directe, ou dosage immuno-enzymatique direct, est une technique de
laboratoire utilisée pour détecter et quantifier un antigène spécifique dans un échantillon
en utilisant un anticorps marqué directement à une enzyme.

En pratique :

Principe du test ELISA direct :

Prenons 2 patients pour lesquels le médecin suspect une infection virale. Au
laboratoire, un prélèvement de sang est réalisé sur chacun des 2 patients dans le but
d’obtenir le sérum. Après avoir preparé les échantillons biologiques, le test Elisa peut
être effectué. Toutes les étapes se déroulent dans les puits du plaque de microtitration.

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Le protocole et le principe d’un test Elisa sont les suivants :

1- Etape de coating : Les antigènes viraux contre lesquels les anticorps sont détectés
sont absorbés au fond de chacun des puits de la plaque de microtitration.
2- Ensuite c’est l’ajout du sérum du patient contenant les anticorps dirigés contre
l’antigène d’intérêt.
3- L’incubation permet la fixation des anticorps présents dans l’échantillon aux
antigènes fixés à la surface de la plaque (fig. 1) .
Les anticorps du sérum du patient A présentent une complémentarité parfaite avec
l’antigène. Cette propriété permet de fixer spécifiquement sur les antigènes viraux
absorbés au fond du puits.
Au contraire, les anticorps du sérum du patient B ne présentent aucune
complémentarité avec l’antigène, ces anticorps ne sont pas spécifiques des antigènes
viraux absorbés au fond du puits; ces anticorps restent libres dans la solution.

4- L’étape de rinçage permet d’éliminer les anticorps non fixés ou présents en excès.
5- La détection des anticorps fixés est réalisée par les anticorps conjugués à une
enzyme; ces anticorps peuvent reconnaȋtre spécifiquement les anticorps du patient
fixés aux antigènes absorbés (Fig. 2).
6- L’étape de rinçage permet d’éliminer les anticorps conjugués non fixés ou
présents en excès.
7- La révélation des anticorps conjugués est possible grȃce à l’addition du substrat
enzymatique généralement appelé le chromogène (Fig. 3).
L’enzyme fixé sur l’anticorps de détection reconnaȋt spécifiquement le substrat
chromogène incolore; ce dernier se fixe sur le site actif de l’enzyme pour être
transformé en un produit coloré.
Ainsi la solution contenue dans le puits devient colorée, ce qui témoigne une réaction
positive. Au contraie si la solution contenue dans le puits reste incolore, la réaction
est négative.
Dans notre cas d’étude, c’est le puits du patient A change de couleur, le patient A
possède des anticorps dirigés contre l’antigène; le patient A est dit séropositif pour les
virus recherchés (Fig. 4).
Le patient B est dit séronégatif.
L’intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité d’anticorps détectés.
Pour la détermination, la lecture du microplaque en absorbance s’est utilisé.

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Les avantages de l’Elisa direct : il possède un seul anticorps et le procédé se fait avec
quelques étapes seulement.
Les inconvénients de l’Elisa direct : la sensibilité est limitée ; chaque cible de test
nécessite un anticorps primaire conjugué spécifique et rend le test coûteux.

L’Elisa est utilisé pour faire le diagnostic des maladies infectieuses:

 Infections virales : VIH (SIDA), hépatites A, B et C, COVID-19.
 Infections bactériennes : maladie de Lyme, brucellose, syphilis.
 Dosage d'hormones : Insuline, hormones thyroïdiennes.
 Détection d'allergènes : Allergènes alimentaires, allergènes environnementaux.
 Détection de marqueurs de grossesse et de consommation de drogues ……

ELISA direct

Fig. 1 Fig. 2

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Fig. 3

Fig. 4

II- ELISA indirecte

Dans un test ELISA indirect, l'antigène est lié au fond du puits de la microplaque, puis un
anticorps spécifique à l'antigène est ajouté. Un anticorps secondaire, conjugué à une
enzyme est ensuite lié au premier anticorps, et il est utilisé pour détecter le premier
anticorps lié à l'antigène. La méthode ELISA indirecte permet de détecter la présence et
la concentration d'anticorps spécifiques .

En pratique :
La méthode ELISA est une réaction immunoenzymatique et nous permet de détecter
aussi bien les anticorps que les antigènes.
Les méthodes ELISA les plus couramment utilisées pour le laboratoire sont : l’Elisa
indirect, l’Elisa Sandwich et l’Elisa par compétition.
Le protocole du test Elisa indirect est utilisé pour la mise en évidence d’anticorps chez le
sujet séropositif.

Voici le protocole du test ELISA indirect :

1- Prenons 2 échantillons sériques : l’un avec des anticorps, et l’autre non.
2- Prenons aussi 2 cupules sensibilisées avec des antigènes (Fig.1).

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Après distribution des échantillons sériques au niveau des cupules , aussi

bien l’échantillon positif que l’échantillon négatif , seul le sérum positif va
ramener des anticorps.
3- Faire une incubation, le but est la fixation des anticoprs sur des antigènes.
4- Puis on fait un lavage, le but du lavage est d’éliminer tout ce qui est en
excès.
Après l’incubation et le lavage, commence le stade de la fixation des
anticorps sur des antigènes.
5- Ajouter le conjugué; le conjugué va ramener des anticorps marqués avec
une enzyme car on a 2 anticorps : les anticorps sérique qui sont fixés sur
l’antigène , les anticorps qui sont dirigés contre ce dernier et qui sont des
anticorps marqués avec une enzyme (Fig. 2).
6- Incuber et toujours faire le lavage.
7- Ajouter le substrat et on va incuber (Fig.3).
8- Après l’incubation, et sans faire le lavage, on ajoute la solution d’arrêt
H2SO4.
9- Faire la lecture. Ainsi l’enzyme qui est porté par un anticorps et qui
immobilise sur le complexe antigène-anticorps va dégrader le substrat pour
donner une coloration au niveau de la cupule (Fig.4).
L’intensité de cette coloration est proportionnelle aux complexes formés; plus
le complexe est formé, plus la coloration est intense, c’est une réaction
positive.
Pour la réaction négative, la cupule reste incolore.

Est-ce-que les anticorps dans le sérum du patient et les anticorps marqués par une
enzyme sont les mêmes dans l'ELISA indirect ?
Dans l'ELISA indirect, les anticorps du sérum du patient et les anticorps marqués par une
enzyme ne sont pas les mêmes. Les anticorps du sérum sont des anticorps primaires qui
reconnaissent un antigène. Les anticorps marqués par enzyme sont des anticorps
secondaires qui reconnaissent les anticorps primaires.
En résumé :
 Anticorps du sérum (anticorps primaire): Reconnaissent l'antigène cible.
 Anticorps marqués par enzyme (anticorps secondaire): Reconnaissent et se lient
aux anticorps primaires, permettant la détection.

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L'ELISA indirect est une technique qui utilise deux types d'anticorps pour détecter la
présence d'un anticorps spécifique dans un échantillon. L'anticorps primaire se lie à
l'antigène, tandis que l'anticorps secondaire lié à une enzyme détecte la présence de
l'anticorps primaire.

L'ELISA indirecte est utilisée pour faire le diagnostic :

 Infections bactériennes: La maladie de Lyme, la brucellose et la syphilis.
 Infections virales: Le VIH, l'hépatite A, B et C.
 Autres infections: La détection d'allergènes dans des échantillons alimentaires et
environnementaux, ainsi que la détection de marqueurs de grossesse et de
consommation de drogues.
 Maladies auto-immunes: elle permet de mesurer la réponse immunitaire de
l'organisme.

ELISA indirect
Fig. 1 Fig. 2

Fig. 3 Fig. 4

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Fig. 3 Fig. 4

L'ELISA direct et indirect sont deux types de tests ELISA utilisés pour détecter ou doser
des anticorps. La principale différence réside dans le type d'anticorps utilisé pour la
détection : l'ELISA direct utilise un anticorps marqué directement à l'enzyme, tandis que
l'ELISA indirect utilise une combinaison d'anticorps primaire et d'anticorps secondaire
marqué.

 Sensibilité:
L'ELISA indirect est généralement plus sensible que l'ELISA direct, car l'utilisation
d'un anticorps secondaire permet une amplification du signal.

III- ELISA sandwich

La méthode ELISA sandwich est une technique immunoenzymatique qui utilise deux
anticorps pour détecter et quantifier un antigène dans un échantillon. Un anticorps de
capture est fixé aux puits, puis l'antigène de l'échantillon est ajouté et se lie à l'anticorps
de capture. Ensuite, un anticorps de détection, également spécifique à l'antigène, est
ajouté, se liant à un autre site de l'antigène, formant ainsi un "sandwich". L'anticorps de
détection est conjugué à une enzyme, qui catalyse une réaction avec un substrat,
produisant un signal détectable.
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En pratique :

La méthode ELISA sandwich permet de rechercher aussi bien les antigènes que les
anticorps.

Comme l’exemple, prenons AgHBs.

1- Pour commencer, on doit avoir 2 échantillons : un échantillon positif c’est-à-dire

contient des antigènes et un autre est négatif.
2- On a aussi 2 cupules , les 2 sont sensibilisées avec des anticorps.

On va distribuer ces sérums, ce dernier c’est-à-dire le positif va ramener les antigènes.

3- On va incuber : c’est la fixation des antigènes sur les anticorps, c’est-à-dire entre
les épitopes et les paratopes.
4- Après on va faire des lavages.

Après une incubation, il y a la fixation des antigènes sur des anticorps.

5- On va ajouter le conjugué : le conjugué comporte des anticorps qui sont marqués

avec une enzyme. L’enzyme est de la peroxidase (Fig.1).
6- Après on va incuber, toujours après les incubations on doit faire le lavage dont le
but est d’éliminer tout ce qui est en excès. Les anticorps qui n’ont pas d’antigènes
ne peuvent pas se fixer , et seront éliminés lors du lavage.
7- Pour visualiser la fixation des anticorps marqués avec l’enzyme sur le complexe
antigène-anticorps, on doit ajouter le substrat (Fig.2).
8- Après on doit incuber, seulement après cette incubation , on ne fait pas le lavage.
9- Avant de faire la lecture, ajouter la solution d’arrêt.
10- Sur la cupule positive, on a l’antigène qui est pris en sandwich; l’antigène sérique
c’est-à-dire l’antigène qui se trouve dans le sérum est pris en sandwich entre les
anticorps de la cupule et les anticorps du conjugué c’est-à-dire les anticorps
marqués avec l’enzyme; donc l’enzyme ainsi immobilisé sur le complexe
antigène-anticorps va dégrader le substrat qu’on a ajouté (Fig.3).

La dégradation du substrat va donner une coloration.

Cette coloration et dont l’intensité est proportionnelle aux complexes formés.

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Plus il y a le complexe antigène-anticorps formé, plus la coloration est intense.

Pour la cupule négative, cette dernière reste incolore.

Remarque de l'ELISA sandwich:

 L'antigène doit avoir au moins deux sites antigéniques: pour que deux anticorps
différents puissent se lier et former le "sandwich".
 Les anticorps utilisés doivent être spécifiques et de haute qualité: pour garantir la
spécificité et la sensibilité du test.

ELISA Sandwich
Fig.1 Fig.2

Fig. 3
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Les avantages de l’Elisa en sandwich :

- il y a la flexibilité et sensibilité , des méthodes de detection directe et indirecte
peuvent être utilisées ;
- il y a une haute spécificité , deux anticorps sont utilisés pour détecter l’antigène .

Les inconvénients de l’Elisa en sandwich :

- Flux de travail complex : nécessite plus d’étapes d’incubation que les autres types
d’Elisa ;
- Il y a la réactivité croisée entre les différents anticorps utilisés et doit être vérifiée .

L'ELISA sandwich est utilisée pour diagnostiquer des maladies en détectant des
antigènes ou des anticorps spécifiques dans un échantillon. Elle est notamment
employée pour diagnostiquer des infections virales comme le VIH ou l'hépatite,
mais aussi des maladies bactériennes, fongiques , pour la détection d'allergènes ,
mesure de marqueurs de grossesse , identification de contaminants ( dans l'eau, les
aliments et l'air ) , identification de marqueurs de maladies auto-immunes .
La technique est utilisée pour la détection de différents antigènes, notamment en
microbiologie, en immunologie et en recherche.

IV- ELISA par compétition

La méthode ELISA par compétition est une technique qui permet de doser un antigène en
compétition avec un antigène marqué. L'antigène à doser et l'antigène marqué, tous deux
se liant à un anticorps spécifique, sont mis en concurrence sur une plaque ELISA. La
concentration de l'antigène à doser est déterminée en fonction de la quantité d'antigène
marqué qui a été déplacée de son site de liaison.

En pratique :

L’Elisa compétition peut permettre aussi bien de rechercher les anticorps que les
antigènes.

1- Pour le protocole, on a 2 cupules, les 2 cupules sont sensibilisées avec des

antigènes c’est-à-dire au niveau de la phase solide.

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2- On a aussi 2 échantillons sériques, 2 sérums dont l’un est positif avec des
anticorps, et l’autre est négatif .

Après addition du sérum, le sérum positif va ramener des anticorps dirigés contre
les antigènes de la phase solide.

3- On va faire une incubation , c’est la fixation des anticorps sériques sur les
antigènes de la phase solide et on fait un lavage dont le but est d’éliminer tout ce
qui est en excès.
4- Après l’incubation et le lavage, les anticorps se sont fixés sur les antigènes.
5- Ajouter le conjugué, ce dernier va ramener les anticorps marqués avec une enzyme
(Fig.1).

Ces anticorps sont dirigés directement contre l’antigène, ce n’est pas comme dans
l’Elisa de la méthode indirecte où les anticorps sont dirigés contre notre anticorps .

6- On fait encore une incubation, et après l’incubation c’est toujours le lavage.

Après l’incubation, du conjugué, voilà dans la première cupule traitée avec le

sérum positif, les anticorps sont fixés c’est-à-dire ils sont saturés tous les
déterminants ou déterminants antigéniques.

Dans la cupule négative, les antigènes étaient libres , les anticorps marqués sont
venus pour se fixer sur ces antigènes.

7- Pour démontrer l’immobilisation de cet enzyme sur le complexe antigène-

anticorps, le complexe qui constitue de l’anticorps marqué et l’antigène, on doit
ajouter le substrat (Fig.2).
8- Après addition du substrat, on va incuber, simplement il n’y a pas de lavage.
9- Après cette incubation, on fait la lecture (Fig.3).
10- Ce qui est différent par rapport les 2 autres méthodes : l’Elisa indirecte et l’Elisa
Sandwich, la réaction positive c’est-à-dire la cupule où il y a les anticorps
sériques, la cupule reste incolore, il n’y a pas de coloration parce qu’il n’y a pas
d’enzyme, et le substrat ne peut pas être degradé .

Alors dans la réaction négative, où l’anticorps marqué se fixe sur l’antigène après
addition et il a été dégradé pour donner une coloration.

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Nous avons déjà dit que la méthode permet de rechercher aussi bien des antigènes
que des anticorps.

On doit ajouter le sérum qui va ramener les antigènes, et le sérum négatif n’a pas
d’antigène , ce sérum va fixer sur l’anticorps , il va occuper pour ne pas dire
saturer tous les sites, on va ajouter le conjugué, cet conjugué va ramener les
antigènes marqués (Fig. 4).

Ces antigènes marqués ne peuvent pas se fixer dans la cupule parce que les
antigènes sériques sont occupés tous les anticorps.

Alors les anticorps sont libres, ces antigènes se sont fixés , ce dernier va dégrader
avec une obtention de coloration.

Donc, la réaction est négative et la cupule est colorée.

La réaction positive, et la cupule est incolore.

Avantages de la méthode ELISA par compétition:

 Sensibilité: Elle permet de doser des antigènes même présents à faible
concentration.
 Rapidité: La procédure est relativement rapide par rapport à d'autres méthodes
ELISA.
 Simplicité: La méthode est relativement simple à mettre en œuvre.

L’inconvénient de l’Elisa par compétition est que le protocole très complexe .

L'ELISA de compétition est utilisée pour diagnostiquer une variété de maladies,

notamment des infections bactériennes, virales et fongiques. Elle peut également
être utilisée pour mesurer les niveaux d'hormones, détecter des allergènes et
diagnostiquer des maladies comme le VIH, l'hépatite et la COVID-19 , autres
maladies: la grippe A chez les animaux (grippe aviaire, porcine et équine), la peste
des petits ruminants, l'iléite chez les porcs.

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ELISA compétitif
Fig.1 Fig.2

Fig. 4

Fig. 3

Référence :
Google search 2025

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Questions
1- Parler les étapes clés du principe Elisa .
2- Parler la méthode Elisa sandwich .
3- Répondre les questions suivantes :
a- Quels sont les méthodes Elisa les plus couramment utilisées pour le
laboratoire?
b- Quel est le rôle de l’incubation pour la méthode Elisa ?
c- Quel est le rôle du lavage pour la méthode Elisa ?
d- Quel est le rôle de l’enzyme pour la méthode Elisa ?
e- Quel est le rôle du substrat pour la méthode Elisa ?
f- Quel est le rôle du spectrophotomètre pour la méthode Elisa ?

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