Méthodes d’étude du génome
Comprendre la PCR
Qualitative
Quantitative (=PCR en temps réel)
PCR qualitative
• Ne permis pas de quantifier les copies cibles
• Indique si la séquence rechercher est présente
ou non dans l’échantillon
PCR quantitative
(=PCR en temps réel)
Exemple: l’ajustement de traitement de
certaines maladies viral comme le VIH ou
l’hépatite C
Techniques permettant de quantifier
l'ADN en biologie moléculaire.
Spectromètrie à 260 nm
Southern blot
Northern blot
PCR quantitative/qPCR/PCR en temps réel
Techniques permettant de quantifier
l'ADN en biologie moléculaire.
Spectromètrie à 260 nm
Southern blot
Northern blot
PCR quantitative/qPCR/PCR en temps réel
Spectromètrie à 260 nm
260 nm est la zone d'absorbance maximale des
acides nucléiques
Spectromètre
La méthode la plus répandue pour le dosage
d’acides nucléiques;
Mesure l’absorbance (ou densité optique D.O)
des acides nucléiques à 260 nm;
On utilise l’absorbance des rayons ultraviolets.
QUANTIFICATION ET ANALYSE DE LA PURETÉ DES ACIDES NUCLÉIQUES
Spectromètrie à 260 nm
Spectromètre
Instrument permettant de réaliser une mesure spectrophotométrique1
de l'absorbance d'une solution à une longueur d'onde donnée.
Selon la loi de Beer-Lambert, l'absorbance d'une solution est
proportionnelle à la concentration des substances en solution, à
condition de se placer à la longueur d'onde à laquelle la substance
absorbe les rayons lumineux.
Techniques permettant de quantifier
l'ADN en biologie moléculaire.
Spectromètrie à 260 nm
Southern blot
Northern blot
PCR quantitative/qPCR/PCR en temps réel
Techniques permettant de quantifier
l'ADN en biologie moléculaire.
Southern blot
Northern blot
Repérer soit dans le génome soit dans les ARNm d'une
cellule un fragment particulier, par exemple un gène donné.
Southern blot (également appelé transfert d'ADN)
Est une méthode de biologie moléculaire permettant
l’analyse de l'ADN et de repérer un fragment d'ADN particulier
dans un génome
Schéma des différentes étapes d'un Southern blot
Northern blot
Cette technique permet le repérage d'un type de molécule
d'ARN dans une population.
Utilisation : Pour repérer l'expression d'un gène dans un tissu, dans des conditions
particulières de l'environnement... Penser à normaliser avec un gène de ménage.
Techniques permettant de quantifier
l'ADN en biologie moléculaire.
Spectromètrie à 260 nm
Southern blot
Northern blot
PCR quantitative/qPCR/PCR en temps réel
Q-PCR
La technologie de la PCR en temps réel est basée
sur la détection et la quantification d’un signal
fluorescent.
L’augmentation de ce signal est proportionnelle à la
quantité d’amplicons générés durant la réaction de la
PCR.
PCR
La PCR quantitative (ou qPCR),
ou PCR en temps réel
Mesure le nombre d'amplicon
(= portion d'ADN définie par un couple d'amorces)
À chaque cycle d’amplification, la quantité
d’amplicon est mesurée grâce:
marqueur fluorescent
Principe
Suivre la quantité d'ADN présente dans la
réaction à tout instant et non seulement à la fin
de la PCR (PCR point final)
La PCR en temps réel c’est quoi?
Suivre cycle après cycle
Marqueur fluorescent
Intensité d’émission est proportionnel à la quantité
de produit formé
Sous quelle formes introduit-on l’ADN ?
Matrice d’ADN double Matrice d’ADN simple
brin: brin:
ARNm
Reverse transcriptase
ADNc
ADN polymérase
1èr cycle
PCR
Comment designer les amorces?
Les règles de base:
Vingtaine
de paires de bases
3’ 5’
5’ 3’
Riche en C et en G
Tm (65°C)
Ne doivent pas s’hybrider
entre elles
Quelle est la composition du mélange
réactionnel?
La matrice d’ADN simple
ou double brin
ADN polymérase thermorésistante
(ex: Taq polymérase)
A T C G 4 desoxynucléotides triphosphates
Le couple d’amorces
Molécule émettrice de fluorescence
- Agents se liant à l’ADN double brin = Sybr green
- Sondes fluorescentes = sondes d’hydrolyse
Les Agents intercalants
Agents se liant à l’ADN double brin
Leur émission fluorescente augmente lorsqu’ils
Sont liés à l’ADN double brin
Ne doivent pas inhiber la réaction de PCR
Le SYBR GREEN
L’agent intercalant le plus fréquemment utilisé
20 fois plus fluorescent quand il est intercalé
que sous forme libre
Avantages: -Economique;
-Facile à utilisé
SybrGreen
Fluorochrome stimulé Fluorochrome non stimulé libre
SyberGreen
L’augmentation du signal fluorescent est observé pendant l’étape de polymérisation
Décroissance du signal fluorescent est observé pendant l’étape de denaturation
Visualisation de la progression de l'amplification à l'aide
du SYBR green|
L’émission de la fluorescence est mesuré à la fin de chaque étape
d’élongation pour chaque cycle;
Cette mesure se fait par un système de lecture intégrer à l’appareil
de PCR en temps réel ce qui permet le suivie de la quantité d’ADN
amplifier durant la réaction.
Le thermocycleur
Suivi de l'amplification en temps réel
• Intercalants:
Fluorescents en
présence d’ADN
DOUBLE brin
•Mesure à la fin de
CHAQUE cycle
• LOGARITHME
de fluorescence
Attention:
Si on veut utiliser la PCR comme méthode de
quantification, il est nécessaire d'analyser le
processus d'amplification de l'ADN lorsqu'il se
trouve dans la phase exponentielle.
La PCR en temps réel permet plusieurs
types d’analyses:
PCR en temps réel
PCR quantitatifve (qPCR)
Courbe d’amplification
PCR qualitative
Courbe de fusion
SyberGreen
Résultats d’une PCR classique
Exemple: Vérification de l’intégration d’un virus par PCR (Plantes A B C)
1
Plantes
2
virus
Virus
3 Electrophorèse sur gel d’agarose
f
L'électrophorèse sur gel d'agarose
Un gel d'agarose avant Le gel est exposé à des
éclairage sous ultraviolets rayonnements UV qui
colorent l'ADN en une
Le colorant le plus utilisé car non couleur rouge-
toxique est le bromure d’éthidium orangée.
Analyse des résultats de la PCR
quantitative…
Courbe d’amplification
Quantité de produit Nn = quantité finale de produit
(fluorescence) après n cycles
No = quantité initiale de produit
n = nombre de cycles
Nn = No x 2n Inhibition
Bruit de fond
Nombre de cycles de PCR à partir duquel la valeur de l’intensité de fluorescence
est significativement différente du bruit de fond. La valeur du Ct est d’autant plus
faible que le nombre initial de copies de la séquence cible est grand.
Méthode:
La quantité d'ADN obtenue à l'issue de n cycles d'amplification Qn se
détermine à partir de la quantité d'ADN obtenue à l'issue du cycle précédent
Qn-1 de la façon suivante :
où E est l'efficacité de la duplication de l'ADN.
Si l'efficacité de duplication est de 100% (E = 1), on a un doublement de la
quantité d'ADN : Qn = 2 Qn-1 .
Si l'efficacité de duplication est plus faible, exemple 90% (E = 0,9), la relation
devient: Qn = 1,9 Qn-1 .
Par extension, on peut calculer la quantité d'ADN obtenue à l'issue de n cycles
d'amplification d'ADN Qn à partir de la quantité initiale d'ADN Q0 de la façon
suivante :
Inversement, on peut calculer la quantité initiale d'ADN si on connaît la
quantité finale :