Compte rendu de travail pratique des analyses microbiologiques

Encadré par Dr. Mahdhi

Elaboré par Jaballah Oumaima
Section LCEE3
2024/2025

Objectif :

L’objectif de ce travail pratique est d’apprendre et d’appliquer les techniques d’analyse

microbiologique pour détecter, identifier et quantifier les microorganismes présents dans un
échantillon.

Il vise à :

➢ Maitriser les bonnes pratiques de laboratoire :

Le fait de respecter les règles d’asepsie, d’hygiène et de sécurité pour éviter les contaminations
croisées.

➢ Préparer et manipuler les milieux de culture :

Choisir et préparer les milieux adaptés pour l’isolement et l’identification des bactéries, levures
et moisissures.

➢ Effectuer des analyses microbiologiques standards :

Appliquer des méthodes telles que la numération sur boite (UFC).

➢ Interpréter les résultats :

Identifier les colonies, interpréter les résultats en fonction des normes en vigueur et évaluer la
conformité des échantillons analysés.

➢ Comprendre l’importance des analyses microbiologiques :

Savoir leur rôle dans le contrôle qualité des produits, la sécurité sanitaire et la protection de
l’environnement.

Dans ce travail on a réalisé quatre séances successives pendant une semaine :

N°1 Préparation de milieu de culture.
N°2 Dénombrement après dilution.
N°3 Extraction de l’ADN.
N°4 Préparation de gel d’Agarose.

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Séance N°1 Préparation de milieu de culture

Produits
▪ Flacon gélose pour dénombrement (PCA) 500 g poudre.
▪ Flacon gélose TBX 500 g poudre.
▪ Eau distillée stérilisée.

Mode opératoire
1- Préparation de gélose type PCA et type TBX
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1
1
1
On pèse 10,28 g de gélose (pour chaque type de gélose),
2

1
1
1
On la dissout dans un flacon en verre.

1
1
1 On mesure 500 ml eau stérilisée.

1
1
On ajout l’eau et on a bien agité le flacon. 1

1
1
1 On met les flacons dans un bain marie à 100°C et on l’agite chaque
1 minute.

1
1
1
Puis on met dans l’autoclave à 121°C pendant 15 à
20 minutes.

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 1.a - Résultats

Les bons résultats doivent être transparentes.

2- Remplissage de boite à pétri

Tout d’abord, laisser le milieu de culture refroidir à environ

45-50°C pour éviter la condensation excessive et la
formation de bulles. Verser environ 15 à 20 ml du milieu
dans chaque boite de Pétri de manière homogène, en évitant
toute contamination.

Après solidification à température ambiante, stocker les

boites à l’envers dans un réfrigérateur à 4 °C si elles ne sont
pas utilisées immédiatement, afin de limiter l’évaporation et
la contamination.

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Séance N°2 Dénombrement après dilution

1. Dilution

Cette méthode est très importante pour obtenir une concentration de microorganismes favorable
au comptage et à l’identification, elle vise à éviter la mobilité des bactéries.

En réduisant progressivement la densité bactérienne par des dilutions en série au facteur de 10,
on évite la formation de tapis bactériens indénombrables et facilite l’observation des colonies
distinctes sur les milieux de culture.

Mode opératoire

On commence par la préparation d’un eau physiologique stérile, réparti en tubes de 9 ml.
Une quantité précise de l’échantillon (1 ml) est ensuite ajoutée au premier tube pour obtenir
une dilution de 10-1. A l’aide d’une micropipette, 1 ml de cette dilution est transféré dans un
second tube contenant 9 ml d’eau physiologique stérile, réalisant ainsi une dilution une dilution
de 10-2, et ainsi de suite jusqu’à la dilution souhaitée. Chaque tube est soigneusement agité pour
assurer une bonne homogénéisation à l’aide d’un vortex.

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 Ensuite, un volume défini de chaque dilution
est étalonné sur un milieu de culture.

Enfin, incuber environs 24 H à 37°C les boites pour admettre la croissance

des bactéries.

1.a - Résultats
On obtient ces résultats après dilution.

10-1 10-2 10-3

➢ Règle de choix de nombre

30 < N < 300 UFC/ml

N
N d’UFC / ml =
V×F

10
Pour la dilution 10-1 N = 37 × 1
= 370 UFC/ml

5
 100
Pour la dilution 10-2 N = 1 × = 100 UFC/ml
1

1000
Pour la dilution 10-3 N = 3 × = 3000 UFC/ml
1

Finalement, on fait la comparaison des résultats aux normes exigées.

2. Test Galerie API 20E [identification biochimique]

Matériel nécessaire

- Galerie API 20E

- Suspension bactérienne (souche pure, fraiche, incubée 18-24h)
- Boite API avec couvercle
- Eau distillée ou physiologique stérile
- Micropipette
- Réactifs spécifiques
- Logiciel API

Etape de protocole

[Link]éparation de la suspension bactérienne :

Prélever plusieurs colonies d’une culture pure et fraiche, les suspendre dans 9 ml d’eau
physiologique.

[Link] de la galerie :

A l’aide d’une micropipette on prélève 200 µl, remplir chaque tube

et cupule de la galerie avec la suspension préparée.

Pour certains tests (ADH, LDC, ODC, H2S, URE), ne remplir que le
tube et recouvrir d’huile minérale (anaérobiose).

Pour les autres tests, remplir tube et cupule (aérobie).

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[Link] :

Placer la galerie dans la boite API avec un peu d’eau dans le fond pour éviter la déshydratation,
puis fermer la boite et incuber à 37°C pendant 18-24 h.

[Link] des résultats :

Observer les changements de couleur.

Pour certains tests (ex : IND, VP, TDA), ajouter des réactifs après incubation :

- IND : ajouter 1 goutte de réactif Kovac

S’il y a changement de couleur vers rouge c’est un test positif.

- VP : ajouter 1 goutte de réactif alpha-naphtol +1 goutte de KOH

S’il y a changement de couleur vers rose ou rouge alors c’est un test positif.

- TDA : ajouter quelques gouttes de réactif de chlorure ferrique

S’il y a changement de couleur vers brun ou rouge c’est-à-dire positif.

[Link] et interprétation :

✓ Regrouper les résultats par série de 3 tests.

✓ Chaque test est codé 1 (si positif), 0 (si négatif).
✓ Les 3 tests forment un code à 7 chiffres.
✓ Entrer le code dans le logiciel APIWEB.

Figure : Résultat de Api 10S

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Résultat de l’APIWEB :
Après la validation, le résultat prouve qu’avec 51,9 %, les bactéries sont identifiées
de Proteus vulgaris group. Et avec 46.6% de Proteus mirabilis.

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 3. Coloration de Gram [identification microscopique et macroscopique]

Matériels

▪ Lame de microscope
▪ Echantillon bactérien
▪ Colorant cristal violet
▪ Lugol (iode)
▪ Alcool (décolorant)
▪ Fuchsine ou safranine (contre-colorant)
▪ Eau distillée stérilisée
▪ Bec bunsen
▪ Microscope optique

Etapes de la coloration de Gram

1) Préparation du frottis :

Etalez une fine couche de la culture bactérienne sur une lame propre, fixez le frottis en passant
la lame rapidement au-dessus de la flamme (3 fois environ).

2) Coloration au cristal violet (1 minute) :

Recouvrez entièrement le frottis avec du cristal violet, laissez agir 1 minute puis rincez
doucement à l’eau distillée

3) Application du Lugol (1 minute) :

Recouvrez le frottis avec du Lugol, laissez agir 1 minute pour former un complexe avec le
cristal violet puis rincez doucement à l’eau

4) Décoloration à l’alcool (10-30 secondes) :

Appliquez l’alcool goutte à goutte jusqu’à ce que le colorant cesse de s’écouler coloré, rincez
immédiatement à l’eau pour arrêter l’action de l’alcool

5) Contre-coloration (1 minute) :

Appliquez la safranine ou la fuchsine, laissez agir 1 minute, rincez à l’eau distillée

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6) Observation au microscope :

Utilisez un objectif à immersion (100×) pour observer

Résultats et interprétation

Figure 1. Observation microscopique

L’observation montre une coloration violette c’est-à-dire les bactéries sont à Gram positives.

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 4. Test catalase

Le test catalase est une technique utilisée en microbiologie pour détecter la présence de
l’enzyme catalase chez les bactéries. Cette enzyme permet la dégradation du peroxyde
d’hydrogène (H2O2) en eau (H2O) et dioxygène (O2), un mécanisme qui protège les cellules des
effets toxiques du peroxyde d’hydrogène.

➢ Interprétation des résultats

Réaction positif (+)
Apparition immédiate d’un dégagement de bulles d’oxygène après l’ajout de H2O2.
Signifie que la bactérie possède l’enzyme catalase.

Exemple : Staphylococcus, Bacillus.

Réaction négatif (-)

Aucune formation de bulles.
Indique l’absence de l’enzyme catalase.

Exemple : Streptococcus.

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 5. Test coagulase

Le test de la coagulase est une méthode utilisée en microbiologie pour identifier certaines
bactéries, notamment Staphylococcus aureus, qui produit l’enzyme coagulase.

Matériels

Plasma de lapin

Bactéries à tester (culture fraiche)

Tube à homolyse stérile

Bain-marie à 37°C.

Procédure

✓ Mettre 0.5 ml plasma dans un tube à hémolyse stérile.

✓ Ajouter 0.5 ml d’une suspension bactérienne.
✓ Homogénéiser à l’aide de vortex.
✓ Incuber le tube à 37°C.
✓ Observer après 24 heures.

Résultats

Test positive : observation d’une agglomération

Test négative : pas de coagulation

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Séance N°3 Extraction de l’ADN

L’extraction de l’ADN est une étape essentielle dans les analyses microbiologiques, notamment
pour l’identification des microorganismes par PCR ou séquençage.

1. Extraction par choc thermique

Prélever une colonie de la boite TSA et l’incuber dans 1 ml de TSB.

Centrifuger à 13000 rpm pendant 8 minutes à 4°C.

Laver le culot une fois avec de l’eau distillée stérile.

Ajouter 200 µl d’eau distillée stérile au culot.
Centrifuger à nouveau à 13000 rpm pendant 8 minutes à 4°C.

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Porter le tube à ébullition (100°C) pendant 5 minutes.

Transférer immédiatement les tubes dans la glace.

Centrifuger une dernière fois à 13000 rpm pendant 8 minutes à 4°C.

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Récupérer le surnageant, qui contient l’ADN bactérien extrait.

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Séance N°4 Test PCR [identification moléculaire]

Le test PCR (Réaction de Polymérisation en Chaine) repose sur l’amplification d’une région
spécifique de l’ADN génomique de bactérie.
Les amorces (des courtes séquences d’ADN simple brin) sont utilisées sont spécifiques à cette
région et permettent une détection ciblée de cette bactérie.
Gel d’Agarose
Matériel nécessaire
Poudre d’agarose
Tampon TBE
GelRed (colorant)
Erlenmeyer
Plaque chauffante
Bac à gel + peigne
Plateau de coulage
Gants et lunettes de protection.
Etapes
1. Peser l’agarose :
Pour un gel 1%, peser 1 g d’agarose pour 100 ml de tampon TB
2. Mélanger dans un erlenmeyer :
Ajouter l’agarose dans le tampon, bien agiter et chauffer jusqu’à dissolution complète.
3. Quand le flacon est tiède au toucher, ajouter le colorant :
GelRed : 1 µl pour 10 ml de gel
4. Installer le peigne dans le bac à gel, verser doucement le
gel.
5. Laisser solidifier (15-30 min) à température ambiante.
6. Retirer le peigne délicatement, le gel est prêt pour la
migration.

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 Chargement des tubes
Distribuer le réactif dans les tubes Eppendorf.
Ajouter l’ADN matrice individuellement à chaque tube.

Mélanger délicatement sans créer des bulles par pipetage lent.

Programme de thermocycleur

Etape Température Durée Cycles

Dénaturation 94-95°C 2-5 minutes 1×

initiale
Dénaturation 94-95°C 30 secondes

Hybridation 50-65°C 30 secondes 25-30×

(amorçage)
Elongation 72°C 30 sec – 1 min

Elongation finale 72°C 5-10 minutes 1×

Conservation 4°C Illimitée

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Analyse des résultats
Réaliser une électrophorèse sur gel d’agarose :
Colorer le gel avec un agent intercalant GelRed.

Charger les produits PCR avec un marqueur de taille.

Visualiser sous lumière UV pour détecter les bandes correspondent aux fragments amplifiés.

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