Rapport des TP
de la
microbiologie
BCG S4.
GROUPE 8.
EQUIPE 11 :
ANNEE UNIVERSITAIRE 2023-2024
H
Sommaire :
I. Introduction.
II. Matériel et méthode.
TpN°1 : Mise en évidence des microorganismes de
l’environnement et technique d’ensemencement dans
milieu de culture liquide.
TPN°2 : Technique d’ensemencement dans un milieu de
culture solide et dénombrement des microorganismes.
TPN°3 : Isolement des souches bactériennes par des milieux
sélectifs et différentiels.
TPN°4 : Morphologie et observation microscopique des
microorganismes.
III. Résultat.
TPN°1
TPN°2
TPN°3
TPN°4
IV. Conclusion.
o
Introduction :
La microbiologie est une sous-discipline de biologie
basée sur l’étude des microorganismes. Ces microorganismes
sont des êtres vivants de petite taille qui ne peuvent pas être
vu à l’œil nu mais on peut les observer à l’aide d’un
microscope, et cultivés dans des milieux permettant leur
croissance et leur isolement. Ils sont diversifiés selon leur
forme, taille et mode de vie. Les microorganismes peuvent être
classifiés en procaryotes et eucaryotes.
Thématique :
► TP N°1 : MISE EN EVIDENCE DES MICROORGANISMES DE
L’ENVIRONNEMENT ET TECHNIQUES D’ENSEMENCEMENT DES
MILIEUX DE CULTURE LIQUIDE
► TP N°2 : TECHNIQUES D’ENSEMENCEMENT DES MILIEUX DE
CULTURE SOLIDE ET DENOMBREMENT DES
MICROORGANISMES
► TP N°3 : ISOLEMENT DES SOUCHES BACTERIENNES PAR DES
MILIEUX SELECTIFS ET DIFFERENTIELS
► TP N°4 : MORPHOLOGIE ET OBSERVATION MICROSCOPIQUE
DES MICROORGANISMES
Les objectifs :
Respecter les règles de sécurité, savoir organiser sa paillasse
et se familiariser avec le matériel.
L’exploration des microorganismes de l’environnement.
Réalisation des techniques d’ensemencement dans des
milieux de culture liquide et solide.
Connaitre les techniques d’isolement des bactéries à l’aide
des milieux sélectifs et différentiels.
Savoir réaliser une préparation microscopique colorée par la
technique de Gram
Etre capable d’utiliser le microscope.
Matériels et Méthodes :
→ Pour le TP N°1 : Mise en évidence des microorganismes
de l’environnement et technique d’ensemencement des
milieux de culture liquide.
1/ Mise en évidence des microorganismes de l’environnement.
► Matériel utilisé :
ne Une salle de microbiologie, paillasse lisse facilement à nettoyer,
cheveux, javel, l’alcool 70°.
Coton-tige stérile Etuve Boite de pétri Bec Bunsen
► Méthode :
-Préciser une source de prélèvement (on a utilisé les cheveux).
-frotter les cheveux avec un coton tige stérile et inoculer la
gélose par striation.
-renverser la boite de pétri pour éviter des contaminations.
-incuber les boites dans l’étuve à une température 37C°
pendant 48h.
2/ Technique d’ensemencement des milieux de culture liquide.
► Matériel utilisé :
suspension microbienne, javel, alcool70°.
,
Portoir de tube ensemenceur Bec Bunzen Etuve 2tubes
Métallique de bouillon nutritif
► Méthode :
Toujours travailler avec : une paillasse désinfecté avec eau
de javel, des mains désinfectées avec l’alcool 70° et
manipuler proche du bec bunsen.
-Stériliser l’ensemenceur au-dessus de la flamme bleue du bec bunsen
jusqu’à il devient rouge, laisser le refroidir.
-prélever un inoculum microbien, faire sortir l’ensemenceur en évitant
de toucher les parois interne du tube, flamber et boucher le tube et le
remettre dans le portoir.
C-frotter l’ensemenceur à l’intérieure du tube de bouillon nutritif.
Boucher le tube, stériliser l’ensemenceur et le mettre sur la paillasse.
-déposer le tube de bouillon nutritif ensemencé avec le portoir dans
l’étuve à une température de 37°C /24H.
→ Pour le TP N°2 : Techniques d’ensemencement des milieux
de culture solide et dénombrement des microorganismes.
1/Technique d’ensemencement d‘un milieu solide par
méthode de quadrant.
► Matériel utilisé :
Bec Bunsen, suspension microbien, une boite de pétri
gélosé nutritive, ensemenceur métallique, portoir tube,
étuve, alcool, javel 70°.
► Méthode :
Toujours travailler avec : une paillasse désinfecté avec eau
de javel, des mains désinfectées avec l’alcool 70° et
manipuler proche du bec bunsen.
Prendre une boite de pétri de gélose nutritive et la deviser
le fond en 3 parties.
A l’aide d’un ensemenceur métallique stérile prélever un inoculum
à partir d’une culture bactérienne sur un milieu gélosé.
Ensemencer le quadrant N°1 en effectuant des stries très serrées.
Stériliser l’ensemenceur au flamme bleue du Bec Bunsen.
Ensemencer le quadrant N°2 à partir du quadrant N°1 en effectuant
des stries très serrées.
Stériliser l’ensemenceur au flamme bleue du Bec Bunsen.
Ensemencer le quadrant N°3 à partir du quadrant N°2 en effectuant
des stries serrées. Incuber la boite en position renversée dans l’étuve à
37°C/24H
2/Dénombrement des microorganismes de sol.
x-Prélèvement Stériliser l’ensemenceur et ranger la paillasse.
de la suspension mère :
► Matériel biologique : sol
► Matériel :
Tamis broyeur balance bec plaque agitatrice
Précision bunsen chauffante
-peser 10g de sol à l’aide du balance de précision. On
élimine les grosses particules par tamisage.
-broyer l’échantillon dans une quantité d’eau
physiologique stérile suffisante pour réaliser la suspension-
dilution 10̄¹.
-agiter la suspension à l’aide d’une plaque agitatrice dans
le but de libérer le maximum de charge microbienne.
x-Préparation des suspensions-dilutions
► Matériel :
Bec bunsen 6 tubes contient micropipette et la suspension
mère. 9ml d’eau
Physiologique stérile
La suspension mère correspond exactement à la dilution 10̄¹. Ensuite
des suspension en série doivent été réalisées à partir de 10̄¹et 10−6 ,à
l’ordre de 1ml dans 9ml d’eau physiologique stérile.
1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 10̄¹de la
suspension
mère.
Prélevé avec
10−6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 la
x-technique d’ensemencement utilisées :
1. Méthode d’étalement en surface :
► Matériel :
Bec bunsen, série de dilution de l’échantillon à utiliser, une
boite de gélose nutritive,
ensemenceur métallique, pipette, pipette râteau, javel,
alcool70°, étuve.
► Méthode :
-prélever 0.1ml de suspension mère diluée avec la pipette et déposer
ce volume sur la gélose nutritive.
-avec une pipette râteau stérilisée, étaler l’inoculum en faisant des
mouvements de va et vient et en tournant la boîte.
-laisser la boîte sur la paillasse pendant 10 minutes.
-stériliser la pipette râteau et ranger la paillasse.
-incuber la boîte en position renversée dans l’étuve à30°C pendant 24
à48h
2. Méthode d’étalement en profondeur :
► Matériel :
Bec bunsen ,série de dilution de l’échantillon à analyser ,une
boîte de pétri vide et stérile , gélose nutritive maintenue à une
température de surfusion (45°c) , ensemenceur métallique ,
pipettes et micropipette , solution désinfectante , bain marie ,
portoir de tubes , étuve .
► Méthode :
-Agiter le tube de dilution de l’échantillon à analyser.
-Déboucher aseptiquement le tube et flamber son orifice.
-Prélever 1 ml à l’aide d’une pipette en verre stérile ou d’une pipette
automatique.
-Entrouvrir légèrement une boîte de pétri stérile et vide en soulevant le
couvercle.
-Déposer l’inoculum au fond de la boîte.
-Couler le milieu gélosé dans la boîte.
-Mélanger doucement en agitant horizontalement dans le sens d’une
aiguille d’une montre et dans le sens trigonométrique.
-Laisser la boîte sur la paillasse jusqu’à solidification du milieu pendant
15 minutes.
-Incuber les boîtes en position renversée dans l’étuve à 30°c pendant
24 à 48 h.
→ Pour le TP N°3 : isolement des souches bactériennes par
des milieux sélectifs et différentiels.
1/préparation des milieux :
1. Le milieu chapman : c’est un milieu sélectif avec forte
concentration NaCl.
La mesure de quantité à dissoudre :
111g 1000ml
C
120*111 =
……. 120ml
13,32g
1000
2. le milieu VRBL(Violet Red Bile Agar With Lactose) : milieu
sélectif et différentiel.
39g 1000ml 39*120 =4,68g
…….. 120ml
C 1000
3. Milieu gélose nutritive : milieu électif, pas de sélection.
20g 1000ml 20*120 = 2,4g
……. C
120ml 1000
2/Isolement des
staphylocoques :
► Matériel :
Bec bunsen, suspension
bactérienne contenant les
Gélose
Nutritive
VRBL
Chapman
l’étuve 30°C pendant 24à48H.
3/Isolement des coliformes :
► Matériel :
Bec bunsen, suspension bactérienne contenant les
microorganismes à isoler, boite de milieu VRBL, eau de javel,
alcool70° et étuve.
► Méthode :
-Agiter la suspension bactérienne.
-ensemencer une boite de milieu VRBL par la méthode du
quadrant.
-incuber la boite n position renversée dans l’étuve 30°C pendant
24 à 48H.
4/Isolement de bacillus.
► Matériel :
Bec bunsen, suspension bactérienne contenant les
microorganismes à isoler, boite de milieu gélose nutritive, eau
de javel, alcool70°, étuve, bain marie, portoir tubes.
► Méthode :
-placer le tube de suspension bactérienne dans le bain marie 80°C
pendant 15 min.
-Agiter la suspension bactérienne.
-ensemencer une boite de milieu gélose nutritive par la méthode
du quadrant.
-incuber la boite n position renversée dans l’étuve 30°C pendant
24 à 48H.
→ Pour le TP N°4 : Morphologie et observation microscopique des
microorganismes :
1/observation de l’état frais des levures (Frottis frais) :
► Matériel :
Bleu pipette lamelle lame microscopes culture
de pasteur levure
méthylène
► Méthode :
-prélever avec la pipette pasteur stérile une goutte de la
suspension de levure.
-déposer la goutte sur une lame propre puis ajouter une goutte de
bleu de méthylène.
-poser la lamelle doucement et d’une manière oblique pour éviter
les bulles d’air.
-observation au microscope par l’objectif 4 jusqu’à l’objectif 40.
2/coloration de Gram (Frottis sec) :
► Matériel :
Bec bunsen, culture bactérienne, ensemenceur métallique,
lame, cristal violet, lugol
, alcool-acétone, fuchsine, une pince, huile à immersion et
microscope.
► Méthode :
La coloration de gram se fait par 4 étapes :
-Etalement : sur une lame propre stérile, déposer une goutte d’eau
au milieu et étaler à l’aide d’un ensemenceur une parcelle de colonie
des bactéries.
-Séchage : sécher la lame à côté de la flamme bleue du bec
bunsen.
-Fixation : passer la lame 2 à 3 fois sur la flamme du bec bunsen
afin de tuer les microorganismes et laisser la refroidir.
-Coloration :
Plonger la lame dans le borel du cristal violet et laisser agir 1min
Rincer la lame sous un filet fin d’eau du robinet jusqu’à l’élimination
De l’excès du colorant.
Plonger la lame dans le borel du lugol et laisser 1 min pour le
Mordançage puis rincer avec filet fin d’eau.
Le mordançage sert la fixation de cristal violet au niveau de paroi
de Gram+ par lugol.
Mettre la lame dans le borel du alcool-acétone pendant 30 secondes
puis rincer avec un filet fin d’eau du robinet.
Mettre la lame dans le borel du fuchsine pendant 30 secondes pour
une recoloration et rincer par un filet fin d’eau.
Sécher la lame sur le bec bunsen ou par papier filtre puis observation
au microscope débutant par l’objectif 4 puis objectif 10 et objectif
100, dans cette manipulation n’utiliser pas l’objectif 40 car il est
convexe et les huiles d’immersion vont détruire l’objectif.
Dans chaque manipulation :
-désinfecter la paillasse avec eau de javel.
-désinfecter les mains avec alcool 70°
-travailler proche du bec bunsen.
→ pour le TP N°1 :
Résultat :
la mise en évidence des microorganisme de
l’environnement :
On a distingué les caractéristiques macroscopiques des microorganismes :
Bactérie : Procaryote colonie séreuse, forme, couleur, aspect variable et
rarement qu’on trouve une odeur, multiplication par scissiparité.
Les actinomycètes : Procaryote colonie jeune, lorsque il fructifie donne des
spores et devient crayeuse et exerce un poids sur la gélose.
Moisissures : Eucaryote, champignon filamenteux, colonie en amas,
cotonneuse, laineuse avec des filaments aériens et intramatrician,
multiplication par ramification.
Levure : Eucaryote souvent séreuse, couleur en terme générale comme
crème caractérisé par l’odeur, a une multiplication par bourgeonnement.
On a eu une moisissure et des actinomycètes.
Technique d’ensemencement des milieux de culture
liquide :
Le but de cette manipulation c’est d’indiquer le mode
respiratoire des microorganismes.
Aérobie stricte, micro-aérophile, anaérobie facultative
et anaérobie strict ;
Apres l’incubation on voit qu’il s’agit d’anaérobie strict.
→ Pour le TP N°2 :
Tech d’ensemencement d’un milieu solide par méthode de
quadrant :
On a ensemencé à partir d’une moisissure et on voit qu’on a eu une
forme qui est laineuse d’une couleur vert olivier et colonie en amas
Méthode d’étalement en surface :
La boite ensemencé à partir de la dilution 10−6 , on a obtenu 6 bactéries .
Dénombrement entre 30 et 500 dans l’environnement.
Avec un volume V=0,1ml
10−1 10−2 10−3 10−4 10−5 10−6
840 1191 84 46 156 6
840 880 112 46 156 2
x>500 x>500 30<x<500 30<x<500 30<x<500 x<30
N1= 98 =9,8*105 UFC/ml 9,94 0,75 Ps
0.1*10 −3
N2= 46 =4,6*106 UFC/ml 1ml 0,075gPs
0.1*10−4
N3= 156 =1,56*108 UFC/ml
0.1*10−5
N/B=(N1+N2+N3)/ 3=5,39 UFC/ml donc N/B=5,39/0,075=7,19*108 UFC/gPs
Méthode d’étalement en profondeur :
La boite ensemencé à partir de la dilution 10−1 on a obtenue 208 bactéries
Dénombrement entre 30 et 500 dans l’environnement.
Avec un volume V=1ml
10−1 10−2 10−3 10−4 10−5 10−6
208 160 472 166 32 18
184 160 472 200 80 18
De même manière calculer N/B=2,13*109 UFC/gPs
→ Pour le TP N° 3 :
Isolement des staphylocoques :
On voit que le milieu n’a pas changé de couleur donc il s’agit des
colonies de mannitol- donc c’est Staphylococcus epidermidis.
Isolement des coliformes :
On vois qu’il y a une colonie de diamètre de 4 à 6 mm et qui
présente un centre gris marron par transparence sont des
Enterobacter lactose+.
Isolement des bacillus :
Les endospores de Bacillus subtilis se développent à la surface de la
gélose nutritive
Les caractéristique microscopique des microorganismes :
Les bactéries : Des cellules sphérique Cocci et coque comme les
Staphylocoques.
Des cellules allongées en forme bâtonnet comme les
Bacillus.
0,26µm<D<1µm ; 1µm<L<5µm
Les actinomycètes : par des filaments fin ramifié ou non avec ou
sans spore 0,3µm<D<1,5µm
Les moisissures : champignon filamenteux, la présence des
mycéliums fortement ramifiées avec ou sans cloison, avec ou sans
anse d’anastomose où conjugaison sert à la reproduction, avec ou
sans spore 5,1µm<D<10µm.
La levure : des cellules ovales, sphérique globuleuse,
bourgeonnante ou non. Parfois on trouve des pseudos mycélium.
5µm<D<10µm.
→ Pour le TP N°4 :
Observation de l’état de levure dans le microscope :
Les levures mortes apparaissent en bleu et les levures vivantes
restent incolores avec un diamètre plus grand que les bactéries de
forme ronde ou ovale regroupées en amas.
Coloration de Gram :
Les bactéries apparaissent en violet car la paroi épaisse constitue
une barrière imperméable à l’alcool-acétone car il est composé
d’une couche de peptidoglycanes plus importante donc il est Gram+
Conclusion :
Les méthodes de prélèvement et d'analyse microbienne
dans les milieux environnementaux tels que l'air, les
surfaces, l'eau et même les cheveux, ont été l'objet de
nombreuses recherches visant à améliorer la collecte, la
quantification et l'identification des microorganismes
présents. Ces avancées sont cruciales pour permettre une
pratique efficace de la microbiologie dans des laboratoires
spécialisés, en offrant des outils plus précis et fiables pour
étudier la diversité microbienne et son impact sur
l'environnement et la santé publique.