Onglet 1

Université Mohammed V de Rabat

Ecole Normale Supérieure de Rabat

Filière : MASTER ECVARENAVEM

Semestre N° 2

Compte rendu du TP
TP 1 : Métabolites Secondaires

Note Observations

Professeur encadrant : Réalisé par :

Pr. GUAOUGUAOU CHEMARAH Douha
Pr ALAOUI RAFIQUE Farah
Pr ES-SAFI

Année universitaire 2024-2025

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 Introduction
Les métabolites secondaires sont des composés organiques
produits par les plantes, qui, contrairement aux métabolites
primaires, ne sont pas directement impliqués dans la
croissance ou la reproduction. Cependant, ils jouent un
rôle essentiel dans la défense des plantes, l’attraction des
pollinisateurs et l’adaptation à leur environnement. Ces
substances présentent également un grand intérêt pour la
santé humaine en raison de leurs nombreuses propriétés
biologiques.​
Parmi ces métabolites, on retrouve les flavonoïdes, une
vaste famille qui comprend notamment la quercétine, un
aglycone aux effets antioxydants puissants ainsi que
d’autres aglycones qui partagent des structures similaires et
des fonctions protectrices. En parallèle, les anthocyanes,
responsables des pigments rouges, violets et bleus chez les
végétaux, jouent un rôle clé dans la protection contre le
stress oxydatif.​
Ce compte rendu se propose d’explorer ces composés, leur
structure, leur rôle dans le règne végétal, ainsi que leurs
applications potentielles dans les domaines
pharmaceutique et nutritionnel.

I-But de la manipulation:

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 ●​ Étudier le spectre UV d’un flavonoïde en milieu méthanolique neutre,
puis en présence de réactifs chélatants et ionisants.
●​ Doser les anthocyanidines et les aglycones flavoniques dans des extraits
végétaux.

II-Etude du spectre UV d’un flavonoïde:

1-Matériel :
Spectrophotomètre UV-Visible
Cuvettes en quartz
Béchers​

2-les réactifs :
Flavonoïde étudié (quercétine)

Méthanol pur (solvant)​

Hydroxyde de sodium (NaOH)

Chlorure d’aluminium (AlCl₃)​

Acide chlorhydrique (HCl)​

Acétate de sodium (CH₃COONa)​

Acide borique (H₃BO₃)

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préparation des solutions :

3-Mode opératoire:
●​ Dissoudre le flavonoïde dans du méthanol.
●​ Ajouter les réactifs (MeOH, AlCl₃, AlCl₃ + HCl,NAOH, CH₃COONa,
H₃BO₃) à différentes portions de la solution.
●​ Mesurer le spectre UV de chaque solution (200-600 nm).

4- les résultats de spectre UV :

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 Dans un milieu méthanolique neutre et en présence des réactifs chélatants
et ionisants ; On a étudié leur spectre UV .
les réactifs sont :

MeOH, AlCl₃, AlCl₃ + HCl, CH₃COONa, H₃BO₃

le flavonoïde utilisé est : la quercétine

Les résultats sont présentés dans le tableau suivant :

Bande 1 Bande 2 Bande 3

Quercétine+MeOH 371 nm 255nm —

Q+AlCl3 425 nm(+) 261 nm(+) —

Q+AlCl3+HCl 371 nm 254 nm —

Q+NaOH 424 nm(+) 330 nm(+) 274 nm

Q+CH3COONa 374 nm 253 nm —

Q+H3BO3 377 nm 255 nm —

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5- Interprétation des effets :
●​ Quercétine+AlCL3 : Quand on met AlCl₃ avec la quercétine, les pics dans
le spectre UV changent : ils se déplacent vers des longueurs d’onde plus
grandes (effet bathochrome). Cela veut dire que la quercétine forme un
complexe avec AlCl₃.
●​ Q+AlCl3+HCl : Mais si on ajoute HCl dans ce mélange, les pics
reviennent comme avant. Donc l’acide empêche la formation du complexe, et
la quercétine revient à sa forme normale.
●​ Q+NaOH : Quand on ajoute NaOH à la quercétine, les pics dans le
spectre UV se déplacent vers des longueurs d’onde plus grandes (effet
bathochrome). Cela montre que les groupes OH de la quercétine sont
ionisés (ils perdent un proton), ce qui rend la molécule plus conjuguée.
Cette ionisation modifie la structure électronique et change donc
l’absorption de la lumière.
●​ Q+CH3COONa : Quand on ajoute CH₃COONa à la quercétine, on
observe un petit déplacement vers les grandes longueurs d’onde. Cela
signifie qu’il y a une ionisation partielle des groupes OH, mais moins
forte qu’avec NaOH. Le CH₃COONa est une base plus faible, donc
l’effet est plus léger.
●​ Q+H3BO3 : Avec H₃BO₃, le spectre UV de la quercétine ne change
presque pas par rapport à celui en méthanol. Cela veut dire que
l’interaction entre l’acide borique et la quercétine est très faible ou que
la complexation n’est pas assez forte pour modifier le spectre de façon
visible. On peut donc considérer les deux spectres comme équivalents.

III-Dosage des anthocyanidines et des aglycones flavoniques

contenus dans un extrait végétal :

Matériel utilisé :
●​ Erlenmeyer (pour la suspension du matériel végétal)
●​ Bain-marie (pour chauffer la solution)
●​ Ampoule à décanter (pour l'extraction)
●​ Agitateur (pour homogénéiser le mélange)

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 ●​ Pipettes (pour prélever des aliquotes)
●​ Plaque CCM (pour l'enregistrement des spectres)
●​ Bécher (pour contenir les solutions)
●​ Ballon (pour la dilution des solutions)
●​ Bain de glace (pour refroidir la solution après hydrolyse)

Réactifs utilisés :
●​ Acide chlorhydrique 2N (pour l'hydrolyse acide)
●​ Éther éthylique (pour l'extraction des composés phénoliques)
●​ n-butanol (pour l'extraction des anthocyanes et C-glycosides)
●​ AlCl₃ (pour la chélation des flavonoïdes)

HCl ( 2N) Éther éthylique n-butanol AlCl₃

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III- 1- Hydrolyse acide :

La plante qu’on a utilisé est le Basilic (Ocimum basilicum) séché

avant le séchage après le séchage

Mode opératoire :
[Link]éparation de l’échantillon : Prenez 5 g de matériel végétal sec et broyé.

[Link] : Placez l’échantillon dans un erlenmeyer et ajoutez 400 ml

d’acide chlorhydrique 2N.

[Link] : Laissez imbiber le matériel végétal pendant quelques minutes.

[Link] : Chauffez l’ensemble au bain-marie bouillant pendant 40

minutes.

[Link] : Agitez régulièrement et oxygénez le mélange par insufflation

d’air toutes les 10 minutes.

[Link] : Après 40 minutes, retirez le mélange du bain-marie et

refroidissez-le immédiatement dans un bain de glace pour arrêter la réaction.

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 ⇒ ⇒ ⇒

⇒ ⇒ ⇒
⇒ La couleur rouge indique la présence des anthocyanidines
III-2-Extraction des aglycones:

III-2-1-Ajout de l’éther éthylique:

●​ Refroidir l’hydrolysat dans un bain de glace.

●​ Verser dans une ampoule à décanter.
●​ Ajouter de l’éther éthylique, agiter doucement puis laisser décanter.
●​ Récupérer la phase éthérée (en haut).
●​ Réunir les phases éthérées contenant les aglycones flavoniques.

⇒ ⇒ ⇒

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On obtient deux phases :

la phase organique (supérieur) est :

la phase éthéré

la phase aqueuse (inférieure) est :

la phase des anthocyanes

III-2-2-Ajout de n-butanol :

●​ Prendre la phase aqueuse restante après extraction à l’éther.

●​ Ajouter du n-butanol dans une ampoule à décanter.
●​ Agiter doucement puis laisser décanter.
●​ Récupérer la phase butanolique
●​ Réunir les phases butanoliques contenant les anthocyanidines (colorées
en rouge/rose).

⇒ ⇒ ⇒

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On obtient deux phases :

Phase supérieure : phase butanolique

Phase inférieure : la phase aqueuse

III-3-Analyse quantitative de l’hydrolysat:

on utilise :

III-3-1-dosage des anthocyanes :

●​ Prélever une partie de la phase butanolique (diluer si nécessaire).

●​ Enregistrer le spectre UV-visible entre 500 et 600 nm.
●​ Calculer la concentration en utilisant la loi de Beer-Lambert

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 Loi de Beer-Lambert :

A=ε⋅l⋅C Alors C=A/ ε⋅l

A : Absorbance.

ε : Coefficient d’extinction molaire.

C : Concentration.

l : trajet optique.

La spectrométrie a donnée les résultats suivants :

Sachant que A=0.96 ; l=1cm et ε=26900 [Link](-1) Alors C= 0.96/26900

C= 3.56*10^(-5)mol/l

III-3-2--dosage des aglycones flavoniques :

●​ prélever une partie de la phase éthérée

●​ Enregistrer le spectre UV entre 360 et 460 nm.
●​ Ajouter du chlorure d’aluminium (AlCl₃) pour former un complexe
coloré.
●​ Utiliser la loi de Beer-Lambert pour déterminer la teneur en aglycones.

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 La spectrométrie a donnée les résultats suivants :

Sachant que A=0.79 ; l=1cm et ε=25000 [Link](-1)

Alors C= 0.79/25000

C=3.16*10^(-5) mol/l

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 conclusion
Ce TP a permis d’extraire, d’identifier et de quantifier les
anthocyanidines, les aglycones flavoniques et la quercétine à
partir d’un extrait végétal. L’hydrolyse acide et les extractions
successives avec l’éther et le n-butanol ont permis d’isoler ces
composés. Les résultats spectrophotométriques ont révélé des
effets bathochromes intéressants pour la quercétine : en milieu
acide, la quercétine subit un déplacement vers des longueurs
d'onde plus longues, ce qui modifie sa couleur et sa capacité
d'absorption. Ce phénomène est dû à la protonation des
groupes hydroxyles et à la formation de complexes de
coordination. Ces propriétés sont particulièrement
significatives pour ses applications en tant qu'antioxydant et
agent anti-inflammatoire, confirmant ainsi l'intérêt de la
quercétine dans divers domaines thérapeutiques.

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