I.

Introduction
Uvaria chamae est une plante médicinale largement utilisée en Afrique de
l’Ouest pour ses propriétés antimicrobiennes et autres bienfaits thérapeutiques 1.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un nématode souvent utilisé comme
modèle biologique en raison de sa simplicité et de sa pertinence pour les études
de toxicité et d’efficacité des composés bioactifs2. Cette recherche vise à évaluer
l’activité antibactérienne des extraits de Uvaria chamae en utilisant C. elegans
comme modèle.
Problématique
Comment les extraits de Uvaria chamae affectent-ils la survie et la réponse
immunitaire de C. elegans infecté par des bactéries pathogènes ?
Hypothèse
Les extraits de Uvaria chamae possèdent des propriétés antibactériennes qui
augmentent la survie de C. elegans infecté par des bactéries pathogènes.
Objectifs
1. Évaluer l’effet des extraits de Uvaria chamae sur la survie de C. elegans
infecté par des bactéries.
2. Analyser les changements dans la réponse immunitaire de C. elegans
après traitement avec les extraits.
3. Comparer l’efficacité des extraits aqueux et éthanoliques de Uvaria
chamae.
Généralités
Uvaria chamae contient des composés bioactifs tels que l’uvaretin et le
chamanetin, connus pour leurs propriétés antimicrobiennes1. C. elegans est un
modèle efficace pour étudier les interactions hôte-pathogène et les effets des
traitements antimicrobiens2.
Méthodologie
 Population et échantillon : C. elegans (souche N2) sera utilisé. Les
bactéries pathogènes incluront Escherichia coli et Staphylococcus aureus.
 Instruments de mesure : Microscope, plaques de culture,
spectrophotomètre pour mesurer la croissance bactérienne.
 Procédure :
 1. Préparation des extraits aqueux et éthanoliques de Uvaria chamae.
2. Infection de C. elegans avec les bactéries pathogènes.
3. Traitement des nématodes infectés avec différents concentrations
des extraits.
4. Mesure de la survie des nématodes et analyse de la réponse
immunitaire (expression des gènes de défense).
Calendrier
 Mois 1-2 : Revue de la littérature et préparation des extraits.
 Mois 3-4 : Expérimentation et collecte des données.
 Mois 5-6 : Analyse des données et rédaction du rapport.
Budget
 Réactifs et consommables : 500 €
 Équipement de laboratoire : 1000 €
 Analyse des données : 300 €
II.
1. Introduction
Le nématode Caenorhabditis elegans est un organisme modèle bien établi pour
des études de toxicité, de vieillissement et d’interactions hôte-pathogène. Cette
étude vise à évaluer l'activité antibactérienne d'extraits de Uvaria chamae, une
plante médicinale reconnue pour ses propriétés antimicrobiennes, en utilisant C.
elegans infecté par des bactéries pathogènes.
2. Objectifs
 Évaluer l'activité antibactérienne de différents extraits de Uvaria chamae
(feuilles, racines, écorce).
 Utiliser C. elegans comme modèle pour étudier l'effet de ces extraits sur
l'infection bactérienne.
 Comparer l'efficacité des extraits avec celle d'antibiotiques standards.
3. Hypothèses
1. Les extraits d'Uvaria chamae possèdent une activité antibactérienne
significative contre les bactéries pathogènes.
 2. Ces extraits améliorent la survie de C. elegans infecté par des bactéries
par rapport au contrôle non traité.
4. Matériels et Méthodes
4.1. Matériel biologique
 Caenorhabditis elegans (souche N2)
 Bactéries pathogènes : Escherichia coli OP50, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa
 Extraits de Uvaria chamae (feuilles, racines, écorce)
 Antibiotiques de référence : Ampicilline, Ciprofloxacine
4.2. Préparation des extraits d'Uvaria chamae
 Récolter les parties choisies de Uvaria chamae (feuilles, racines, écorce).
 Séchage et broyage des échantillons à l'ombre.
 Extraction par macération ou Soxhlet avec des solvants comme l'éthanol,
le méthanol, et l'eau.
 Concentrer les extraits à l'aide d'un évaporateur rotatif.
4.3. Culture de C. elegans
 Faire croître C. elegans sur des plaques NGM (Nematode Growth
Medium) ensemencées avec E. coli OP50.
 Synchroniser les vers adultes pour expérimentations.
4.4. Infection des vers par des bactéries pathogènes
 Infecter les vers avec des bactéries pathogènes (ex. S. aureus, P.
aeruginosa) en les exposant à des plaques NGM contenant les bactéries
pendant 24 heures.
4.5. Traitement avec les extraits de Uvaria chamae
 Diviser les vers infectés en groupes :
1. Groupe témoin négatif : vers non traités.
2. Groupes de traitement : vers traités avec différentes concentrations
d'extraits d'Uvaria chamae.
3. Groupe témoin positif : vers traités avec des antibiotiques
standards.
  Administrer les extraits dans l’alimentation ou dans le milieu de culture
pendant 24 à 72 heures.
4.6. Évaluation des paramètres biologiques
 Survie des vers : Évaluer la survie des vers infectés dans chaque groupe.
 Quantification bactérienne : Utiliser la méthode CFU (Colony Forming
Units) pour quantifier les bactéries dans les vers après traitement.
 Stress oxydatif : Mesurer les niveaux de stress oxydatif et d'antioxydants
dans les vers traités.
 Microscopie : Examiner les changements morphologiques chez C.
elegans sous un microscope à fluorescence.
4.7. Analyse des données
 Comparer les taux de survie entre les groupes traités et le groupe témoin à
l'aide d'une ANOVA ou d'un test de Kaplan-Meier pour les courbes de
survie.
 Évaluer la réduction des charges bactériennes par test t ou tests non
paramétriques selon la distribution des données.
5. Résultats attendus
 Une amélioration de la survie de C. elegans infecté après traitement avec
les extraits d'Uvaria chamae par rapport aux témoins non traités.
 Une réduction significative des charges bactériennes et du stress oxydatif
chez les vers traités.
6. Conclusion
L'utilisation de Caenorhabditis elegans pour évaluer l'activité antibactérienne
des extraits d'Uvaria chamae pourrait fournir un modèle rapide, fiable et
économiquement viable pour identifier des composés naturels ayant des
propriétés thérapeutiques potentielles.
7. Calendrier de recherche
1. Mois 1-2 : Préparation et extraction des échantillons de Uvaria chamae.
2. Mois 3 : Culture des vers et préparation des souches bactériennes.
3. Mois 4-5 : Infections, traitements et collecte de données.
4. Mois 6 : Analyse des résultats et rédaction du rapport.
 Introduction
Ce protocole décrit une méthode pour évaluer l'activité antibactérienne
d'extraits de Uvaria chamae en utilisant le nématode Caenorhabditis
elegans comme modèle d'infection.
Objectifs
 Déterminer si les extraits de Uvaria chamae ont une activité
antibactérienne contre des souches bactériennes pathogènes.
 Évaluer l'efficacité de différents extraits de Uvaria chamae (ex. :
éthanolique, aqueux).
 Déterminer la concentration minimale inhibitrice des extraits actifs.
Matériel et Méthodes
1. Préparation des extraits de Uvaria chamae
 Collecter des échantillons de Uvaria chamae.
 Préparer des extraits en utilisant différentes méthodes d'extraction (ex. :
macération, percolation) et solvants (ex. : éthanol, eau).
 Concentrer les extraits et les stériliser par filtration.
2. Culture bactérienne
 Sélectionner des souches bactériennes pathogènes d'intérêt (ex. :
Escherichia coli, Staphylococcus aureus).
 Cultiver les bactéries dans un milieu de culture approprié.
3. Maintenance de C. elegans
 Maintenir une culture de C. elegans sur des plaques de gélose NGM
ensemencées avec Escherichia coli OP50.
4. Test d'activité antibactérienne in vivo
 Préparer des plaques de gélose NGM contenant différentes concentrations
des extraits de Uvaria chamae.
 Ensemencer les plaques avec la souche bactérienne sélectionnée.
 Transférer un nombre défini de vers C. elegans synchronisés (ex. : L4) sur
chaque plaque.
 Incuber les plaques à une température appropriée (ex. : 20°C).
 Surveiller la croissance bactérienne et la survie des vers à différents
intervalles de temps (ex. : 24h, 48h, 72h).
 Comparer la survie des vers sur les plaques contenant les extraits à celle
des vers sur les plaques témoins (sans extrait).
5. Détermination de la CMI
 Déterminer la plus faible concentration d'extrait qui inhibe la croissance
bactérienne et/ou augmente la survie des vers.
Analyse des données
 Analyser les données de survie des vers en utilisant des tests statistiques
appropriés (ex. : Kaplan-Meier, log-rank).
 Calculer la CMI pour chaque extrait.
Discussion
 Discuter des résultats obtenus en les comparant à la littérature existante.
 Discuter des limitations de l'étude et des perspectives futures.
1. Préparation des extraits de Uvaria chamae
 Collecte et identification botanique: Collecter des échantillons de
Uvaria chamae et les faire identifier par un botaniste qualifié. Un
échantillon voucher doit être conservé pour référence.
 Préparation des extraits:
o Sécher les échantillons à l'air et les broyer finement.
o Procéder à l'extraction en utilisant différentes méthodes (ex. :
macération à froid pendant 72h, percolation, Soxhlet) et solvants
(ex. : éthanol absolu, eau distillée, mélanges hydroalcooliques).
o Réaliser des extractions successives avec des solvants de polarité
croissante pour une meilleure séparation des composés.
o Concentrer les extraits à l'aide d'un évaporateur rotatif sous
pression réduite.
o Lyophiliser les extraits aqueux pour obtenir une poudre sèche.
o Stériliser les extraits par filtration à travers un filtre de 0.22 µm.
 Stockage: Conserver les extraits à l'abri de la lumière et à basse
température (-20°C) jusqu'à utilisation.
2. Culture bactérienne
 Sélection des souches bactériennes: Choisir des souches bactériennes
pathogènes d'intérêt connues pour infecter C. elegans (ex. : Pseudomonas
aeruginosa PA14, Salmonella enterica). Inclure une souche non
pathogène comme Escherichia coli OP50 comme contrôle.
 Culture bactérienne: Cultiver les bactéries dans un milieu de culture
liquide approprié (ex. : LB) à 37°C sous agitation. Déterminer la densité
optique à 600 nm pour standardiser l'inoculum bactérien.
3. Maintenance de C. elegans
 Souche de C. elegans: Utiliser la souche sauvage N2 de C. elegans.
 Milieu de culture: Maintenir une culture de C. elegans sur des plaques de
gélose NGM ensemencées avec Escherichia coli OP50 comme source de
nourriture.
 Synchronisation: Synchroniser la population de vers en utilisant la
méthode de blanchiment à l'hypochlorite de sodium suivie d'une
incubation des œufs dans du M9 buffer.
4. Test d'activité antibactérienne in vivo
 Préparation des plaques de test: Préparer des plaques de gélose NGM
contenant différentes concentrations des extraits de Uvaria chamae (ex. :
1000 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL). Utiliser du DMSO comme solvant
pour les extraits non aqueux et s'assurer que la concentration finale de
DMSO dans le milieu ne dépasse pas 1%. Inclure des plaques témoins
avec le solvant seul et sans extrait.
 Infection des nématodes: Transférer un nombre défini de vers C. elegans
synchronisés au stade L4 (ex. : 30-40 vers) sur chaque plaque de test
ensemencée avec la souche bactérienne pathogène.
 Incubation: Incuber les plaques à une température optimale pour C.
elegans (ex. : 20°C) pendant une période définie (ex. : 48h, 72h).
 Surveillance:
o Survie des vers: Observer les plaques à intervalles réguliers (ex. :
toutes les 24h) et compter le nombre de vers vivants et morts. Un
ver est considéré comme mort lorsqu'il ne répond plus à un
stimulus tactile.
o Croissance bactérienne: Prélever des échantillons de bactéries à
partir des plaques à différents temps d'incubation et mesurer la
densité optique à 600 nm pour évaluer l'effet des extraits sur la
croissance bactérienne.
 Contrôles: Inclure les contrôles suivants:
o Contrôle positif: Vers exposés à la bactérie pathogène sans extrait.
o Contrôle négatif: Vers exposés à E. coli OP50 sans extrait.
o Contrôle de solvant: Vers exposés à la bactérie pathogène en
présence du solvant utilisé pour l'extrait à la même concentration
que dans les plaques de traitement.
5. Détermination de la CMI
 Définition: La CMI est définie comme la plus faible concentration
d'extrait qui inhibe visiblement la croissance bactérienne et/ou augmente
significativement la survie des vers par rapport au contrôle positif.
 Méthode: Déterminer la CMI en comparant la croissance bactérienne et
la survie des vers dans les différentes conditions de traitement.
Analyse des données
 Analyse statistique:
o Utiliser des tests statistiques appropriés (ex. : ANOVA, Kaplan-
Meier, log-rank) pour comparer la survie des vers entre les
différents groupes de traitement.
o Utiliser des tests statistiques appropriés (ex. : ANOVA, t-test) pour
comparer la croissance bactérienne entre les différents groupes de
traitement.
 Représentation graphique: Représenter graphiquement les données de
survie des vers en utilisant des courbes de survie.
Discussion
 Discuter les résultats obtenus en les comparant à la littérature existante sur
l'activité antibactérienne de Uvaria chamae et d'autres plantes similaires.
 Discuter des avantages et des limitations de l'utilisation de C. elegans
comme modèle d'infection.
 Discuter des mécanismes d'action potentiels des extraits