Réalise par : Hamza benallal Mohamed Hadil
Introduction
Les pigments végétaux des plantes autotrophes exploitent l'énergie lumineuse pour produire
des réserves de glucides et d'autres matières organiques à partir de CO2 et H2O. Ces pigments se divisent en
deux catégories : les tétraterpènes (xanthophylles, caroténoïdes) et le groupe des porphyrines, qui fait l'objet de
cette étude et englobe les chlorophylles a et b. L'objectif de cette expérience est de mettre en évidence les deux
chlorophylles et de déterminer leur concentration respective en mg/g de matière fraîche dans les feuilles de
persil.
Manipulation1 : Extraction des pigments
Principe : Elle se base sur la solubilité des chl a et b du persil dans l’acétone après broyage, et filtration,
permettant ainsi leur extraction
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Mode opératoire :
Continuer à broyer
On extrait 10g de herbe le broyer avec une pincée on ajoute 20mL de l’acétone
Filtrer le résidu pendant 10 minutes
On répète cette opération 3 fois
Résultat :
On obtient un liquide de couleur vert foncé c’est l’extrait acétonique qui contient tous les pigments qui
sont: chlorophylle A et B, carotène et xanthophylle
Manipulation 2 : Dosage des chlorophylles
Principe :
Le principe de la base de dosage de chlorophylles repose sur la capacité des
chlorophylles à absorber la lumière à des longueurs d’onde spécifiques . la spectrophotométrie
est couramment utilisée pour cette absorption .
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Mode opératoire
Prélever 4mL de l’extrait acétonique auquel on ajoute 1mL d’eau distillée de façon à obtenir
1 ml d’eau
distllée Solution
acetonique 80%
+ 4 ml D’acetone
On mesure grâce au spectrophotomètre la densité optique aux 2 longueurs d’onde 645 et 663.
Une 1ère cuve de référence
contient le solvant pur soit
l’acétone à 80% et une 2ème
cuve contient la solution des
pigments à doser. 1
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NB : Au cas où la solution serait trop concentrée, procéder à des dilutions dans des
proportions Connues.
calculer les quantités de chlorophylles contenues dans 1g de matière végétale
fraîche.
Résultats :
Les valeurs de DO correspondantes à chaque longueur d4onde utilisée : -DO663 = 3.41
-DO645= =1.833
On utilise les formules de MAC KINNEY et BRUNSMA :
Ca = 12,7 x DO663 – 2,69 x DO645 (en mg/L)
Calcul :
Ca = 12.7 * 3.41 - 2.69 * 1.833 = 38.38 mg/ml Donc : Ca = 38.38 mg/L
Dilution à 80 % : Ca * Va = Ca’ * Va’
Alors : Ca’ = Ca * (V/V’) = 38.38 *(5/4) Donc : Ca’ = On a : 47.97 mg/l
47.97 mg 100 ml acétone 80 %
m 60 ml D’acétone 100 %
Alors : m = 47.97* (60/1000) Donc : m = 28.78 mg
On a : 28.78 10 g feuilles Alors : mf = 28.78 *1/10
mf 1g Donc mf = 2.878 mg
Cb = 22.9 x DO645 – 4.68 x DO663 (en mg/L)
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Calcul :
Cb = 22.9 x DO645 – 4.68 x DO663 = 26 mg/ml Donc : Cb = 26 mg/L
Dilution à 80 % : Cb * Va = Cb’ * Vb’
Alors : Cb’ = Cb * (V/V’) = 26 *(5/4) Donc : Cb’ = 32.5 mg/l
On a :
47.97 mg 100 ml acétone 80 %
m 60 ml D’acétone 100 %
Alors : m = 32,5* (60/1000) Donc : m = 1,95 mg
Plus que :
On a : 1,95 10 g feuilles Alors : mf = 1,95*1/10
mf 1g Donc mf= 0.195 mg
(chla)/g
Manipulation 3: Séparation chimique des chlorophylles
Principe : une technique de séparation des pigments végétaux,
tels que la chlorophylle a, la chlorophylle b, les carotènes et les
xanthophylles, à partir d'une matière végétale. Le processus repose sur la
différence de solubilité des pigments dans différents solvants, ainsi que
sur des réactions chimiques spécifiques
Mode opératoire :
a) Introduction du solvant :
Solvant S : éther de pétrole
Solution aqueuse : l’extrait acétonique
La phase supérieure : Phase concentrée de couleur vert-
foncé, contient les chlorophylles, les carotènes et les
xanthophylles dans l’éther de pétrole (A conserver).
La phase inférieure : Jaune-verdâtre, dans l’acétone, sera
éliminée (enlever le bouchon de l’ampoule et ouvrir le
robinet).
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N.B : - Rincer 2 fois de suite la solution de pigments conservée, en ajoutant à chaque fois
dans l’ampoule 75mL d’eau distillée.
On agite alors comme précédemment, on laisse reposer. On éliminera chaque fois la
phase inférieure.
Après qu‘on termine la suite du protocole expérimentale on :
Récupère chacune des 4 pigments séparé dans des tubes à essai ;
Chlorophylle a / Chlorophylle b / Carotènes / Xanthophylles.
Transvaser 50mL de la solution de pigments dans une nouvelle
ampoule à décanter,
Ajouter 50mL d’alcool méthylique à 92%, agiter par un
mouvement de rotation lent mais régulier.
Laisser reposer pendant 10min puis recueillir la phase inférieure,
constituée par la Chlorophylle b en solution méthanolique dans un
bécher.
La phase supérieure renferme chlorophylle a en solution dans
L’éther de pétrole.
Déterminer les densités optiques de la chlorophylle a et de la
chlorophylle b à 645nm et à 663nm et calculer les concentrations
en mg/g
Résultats : Pas fait en Tp
MANIPULATION 4 :Séparation physique des pigments par chromatographie
sur papier
Principe :
Cette manipulation se devise en deux grands partie en but de savoir les pigments chlorophylle d
une manière physique :
Migration et séparation des pigments.
Élution des pigments à partir du chromatographie
1 Migration et séparation des pigments:
Manipulation:
Dans un tube vertical entouré de papier noir pour éviter l’altération des pigments à la lumière.
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On verse un solvant au bout du temps pour saturer son atmosphère qui contient :
17ml d’éther de pétrole léger
2ml d’acétone
1ml de benzène.
Le tube est fermé par un bouchon muni d’un crochet
permettant de suspendre la bandelette de papier
Whatman n°1 servant de chromatogramme
Écraser un bout de feuille a peu prêt 1.3 cm pour que les
pigments seront soluble et réalisable
Suspendre le papier dans un tube
contenant des solvants organiques.
Les solvants progressent par capillarité dans le papier de
chromatographie et emportent les pigments selon leur solubilité
+ on laisse seche à l obscurité.
Comme résultat on a :
le chlorophylle A qui est au dessous (poids moléculaire plus
important )avec un RF: RF:Da/Dt=2.7/5.9=0.46
Le chlorophylle B qui est au dessous avec un RF:
RF :Db/Dt=5.2/5.9=0.88
○ Elution des pigments à partir du chromatogramme:
Principe :
L'élution des pigments à partir d'un chromatogramme désigne le
processus de récupération des pigments séparés à différentes distances le long du
chromatogramme. Cela implique souvent le rinçage de la plaque ou du support
chromatographique avec un solvant approprié pour dissoudre et récupérer spécifiquement les
pigments séparés.
Manipulation :
Découper et plonger dans des tubes à hémolyse contenant 3mL d’acétone chacune des
régions du chromatogramme occupée par la chlorophylle a et la chlorophylle b.
- L’élution est instantanée, retirer les fragments de papier
Résultat : DO du chlorophylle A à 663 = 0.067
DO du chlorophylle B à 645 = 0.1
6
7
s.
9
10