QUESTIONNAIRES GENIE GENETIQUE

1-Définition, rôle et importance du génie génétique.

Les méthodes et les techniques de biologie moléculaire développées durant ces dernières
décennies, pour séquencer, « recombiner », transférer et analyser les produits de l’expression
du matériel génétique des diverses espèces vivantes
Le génie génétique permet :
• d’identifier et d’isoler,
• de modifier et de transférer,
• de cloner et d’amplifier,
• de contrôler l’expression d’un gène ou d’un transgène dans le matériel biologique.
2- Définitions de gène et transgène.
Gene : portion de l’ADN qui code pour une fonction précise
Transgène : séquence isolée d’un gène étranger transféré a un organisme
3- Définition de mutagène.
Tout agent ayant des propriétés ou la capacité de modifier le génome d’un organisme
et élève le nombre de mutation génétique au-dessus du taux naturel.
4- Définition de séquençage.
Il a pour but la détermination de la séquence nucléotidique de l’ADN isolé pour définir les
introns, les exons et les zones de régulation de l’ADN inséré dans le vecteur. Deux méthodes
classiques sont alors utilisées.
5- Les techniques du génie génétique.
• d’identifier et d’isoler,
• de modifier et de transférer,
• de cloner et d’amplifier,
• de contrôler l’expression d’un gène ou d’un transgène dans le matériel biologique.
6- Comment à partir d’absorbance pouvez-vous contrôle la pureté d’un ADN extrait ?
*R = A260nm/A280nm
* ADN pur: 1,8 < R < 2
* ADN contaminé par les protéines : R < 1,7
* ADN contaminé par les ARN : R > 2
7- Quel est intérêt de connaitre les sites uniques de restriction dans un vecteur de
clonage ?
Il permet que connaitre le lieu où la coupure de l’ADN va se faire précisément.
8-Quelles sont les raisons pour qu’un vecteur lambda soit un vecteur de clonage ?
Le bactériophage  sauvage ne peut pas être toujours utilisé pour le clonage car son ADN
comporte des sites multiples pour beaucoup d'endonucléases de restriction utilisées dans les
différents processus de clonage. De plus, ces sites sont souvent localisés dans les régions du
génome indispensables pour le cycle lytique du phage. La longueur de l'ADN pouvant être
encapsidé ne peut dépasser 5 kb, si bien que la taille de l'ADN étranger qui pourrait être inséré
est très limitée.
9-Importance du polylinker et lacZ.
Un ou plusieurs sites de restriction (poly préalable à l'insertion de l'ADN exogène.
Le gène lacZ’ (codant pour le peptide Į de la ȕ-galactosidase et contenant les séquences
régulatrices de l’opéron lactose) qui permet la sélection des colonies. De plus, l’ADN inséré
est sous la dépendance du promoteur du gène lacZ’.
10- Après avoir définir enzyme de restriction, précisez les nomenclatures et citer leur
différentes types en précisant celui qui est valorisée en génie génétique.
Les enzymes de restriction sont des endonucléases qui coupent d’une manière définie et
reproductible l’ADN double-brin quelle que soit son origine. Elles ont permis de caractériser
un génome entier en une série de fragments reproductibles.
Nomenclature des enzymes de restriction. En 1973, Smith et Nathan ont proposé une
nomenclature qui est définitivement adoptée. Chaque endonucléase a un nom de code
déterminé selon les principes suivants :
• La première lettre en majuscule est l'initiale du genre de la bactérie.
• Les deux lettres suivantes, en minuscule désignent l'espèces de la bactérie.
• La 4ème lettre en majuscule, (pas toujours présente) désigne la souche bactérienne.
• Un chiffre romain distingue les enzymes d'une même souche dans l'ordre de leur découverte.
Exemple : EcoR 1 : E = Escherichia Co = espèce Coli R = Souche RY13 I = 1 ère
endonucléase isolée
Enzyme de type I : Ayant reconnu la séquence cible, l'enzyme se déplace sur l'DNA et coupe
de manière aléatoire mille à quatre mille bases plus loin (Système de boucles d’ADN ?).
Enzyme de type II : L'enzyme coupe l'ADN au niveau de la séquence reconnue.
Enzyme de type III : L'enzyme reconnaît la séquence cible et coupe la molécule de DNA 20 à
25 bases plus loin.
Seules les enzymes de type II qui coupent au niveau du site de reconnaissance sont utilisés en
génie génétique parce qu’on peut contrôler parfaitement le site de coupure et donc les
extrémités
engendrées.
11- Quelles sont les caractéristiques et différentes parties ou composantes d’un plasmide.
Caractéristiques des plasmides utilisés en génie génétique La cellule hôte la plus
utilisée est Escherichia coli.
Les plasmides naturels dits de première génération ont été utilisés dans le passé comme
vecteur de clonage, mais les plasmides utilisés actuellement sont modifiés et sont donc des
chimères obtenues par des recombinaisons de différents plasmides naturels et de DNA viral.
Ils sont petits de taille pour permettre l'insertion d'une importante quantité d'ADN exogène
tout en maintenant une bonne efficacité de transformation.
Ils possèdent :
La plupart des plasmides naturels contiennent des gènes qui confèrent à l'hôte des propriétés
supplémentaires comme la résistance aux antibiotiques. Une bactérie peut posséder en même
temps plusieurs plasmides différents sauf si leur cohabitation est incompatible avec la survie
de la bactérie.
12-Quelles différentes faites-vous entre plasmide de première génération et seconde
génération.
Les plasmides de première génération : (ColE1, RSF2124, pSC101) Ce sont les plasmides
rencontrés dans la nature. Il s'agit des plasmides ColE1, RSF2124, pSC101. Ces types de
plasmides n'ont pas les propriétés requises pour les manipulations génétiques.
Les plasmides de seconde génération : ce sont les plasmides de la famille pBR. (pBR312 à
328) obtenus par construction. Le plus utilisé est le plasmide pBR322, constitué de 4 363
paires de bases.
13-Criteres de classification des vecteurs de clonage

14- Quelle différence faites-vous entre une banque génomique et une banque ADN
complémentaire.

15- A quoi consiste une construction dans une banque génomique.

Construire une banque génomique consiste à fragmenter l’ADN tout entier d’une cellule (la
méthode du shotgun) et à introduire chaque fragment dans un vecteur, puis dans un hôte
approprié
L’ADN complémentaire (ADNc) est la copie sous forme d’ADN d’un ARN messager
(ARNm). Une banque de cDNA doit contenir au moins une copie de tous les ARNm présents
dans la cellule.
16- Avantages des banques génomique.
Les avantages des banques génomiques :
Les banques génomiques permettent de connaître :
- Les régions non transcrites des exons
- Les séquences de régulation
- Les gènes silencieux
- Les introns
17-Différence entre transformation et infection.
Transformation (avec des plasmides) ou infection (avec phages) des bactéries
18. Différence entre ARNm dans le noyau et ARNm dans le cytoplasme.
19-Eléments nécessaires pour la réalisation de la PCR.
Les éléments de la PCR : les réactifs et le matériel :
• l’ADN à amplifier
• 2 amorces : sens et anti sens
• tampon de réaction (Buffer)
• MgCl2
• Dntp
• Taq polymérase
• L’appareil thermocycleur pour PCR
• H2O bi distillée et stérile
20-Citer 8 techniques d’analyses de ADN cloné et pour chaque technique donner son
intérêt.
Le criblage par des oligonucléotides de synthèse :
Le criblage par des anticorps : Cette technique ne peut se réaliser que sur une banque
d’expression puisqu’elle vise à révéler le produit d’expression d’un gène cloné
. Electrophorèse Elle permet de récupérer les fractions d’intérêt pour un séquençage de l’ADN
inséré
Le séquençage : Il a pour but la détermination de la séquence nucléotidique de l’ADN isolé
pour définir les introns, les exons et les zones de régulation de l’ADN inséré dans le vecteur
Analyse du génome et de ses modifications : Le Southern blot
La PCR : La PCR est la méthode actuelle la plus efficace et la plus rapide d’amplification
d’un ADN cible, c’est pourquoi elle est maintenant largement utilisée
Étude des polymorphismes : RFLP, VNTR, SSTR, SSCP
Puces à ADN (microarray) ou ADN chips
21- Citer les applications du génie génétique dans 4 domaines de votre choix.
22- Donner les types de banques en génie génétique et donnez-leur rôle.
Banque génomique et une banque ADN complémentaire.

23-Citer quelques exemples de techniques de l’étude du polymorphisme de ADN.

Les RFLP (restriction fragment length polymorphism)
VNTR (Variable Number of Tandem Repeats)
SSCP (single Strand Conformation Polymorphism)
24-Differentes éléments effectuer lors d’une étude de ADN clone.
25-Citer 10 outils du génie génétique.
26- Citer les différentes étapes de Southern blot.
Le processus est le suivant :
• L’ADN génomique est d’abord fragmenté par une enzyme de restriction appropriée
• Les fragments sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel d’agarose,
• L’ADN est dénaturé in situ par une solution de soude,
• L’ADN dénaturé (simple brin) est transféré par capillarité sur un support solide (filtre de
nitrocellulose ou nylon). Les membranes de nylon sont les plus utilisées car par un traitement
au UV (254 nm), on forme des liaisons covalentes entre le DNA et le nylon de sorte que le
support peut être utilisé plusieurs fois avec d’autres sondes.
• Le support solide est hybridé avec une sonde monobrin marquée à faible astringence puis
lavé
• Le ou les fragments reconnus par la sonde sont révélés par la technique de
l’autoradiographie.
27- Avantages et importance du southern Blot.
Cette technique permet :
• L’établissement des cartes de restriction : Les enzymes de restriction coupent l’ADN au
niveau de séquences bien définie. Il est donc facile d’établir une carte de restriction par cette
méthode.
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• La mise en évidence de pseudogènes et de gènes apparentés : Une sonde suffisamment
longue peut s’hybrider avec des séquences non totalement complémentaires : pseudogènes,
gènes d’une même famille ou gènes homologues d’une espèce différente. Ces gènes sont mis
en évidence en fonction des conditions d’hybridation (astringence).
• Les mutations par délétions : Cette technique permettant de visualiser un gène, il est possible
de mettre en évidence une délétion pourvue qu’elle ne soit pas très grande.
• La détection de mutation ponctuelle : Le remplacement d’une base par une autre peut se
traduire par la disparition ou la création de sites de coupures pour une enzyme de restriction
donnée. Cette variation des sites de coupure se traduit par la disparition d’une ou de deux
bandes (suivant la longueur de la sonde utilisée) et l’apparition d’une bande de taille supérieur
dont la longueur est égale à la somme des longueurs des deux bandes disparues. La création
d’un nouveau site de coupure donne le résultat contraire.
• La détection des recombinaisons : L’échange entre chromosomes homologues au cours de la
méiose est la recombinaison. Dans certains cas, il est possible de mettre en évidence ces
recombinaisons par cette technique.
28- Etapes, intérêt et application de la PCR.
Etapes
•la dénaturation de l’ADN à amplifier à 94°C,
•l’hybridation avec une amorce, appariement primer, annealing à 64°C
• extension de l’amorce à 70 - 72°C par la Taq polymérase. L’amplification est effectuée par
la répétition des cycles qui assure une duplication exponentielle de chaque brin.
29-Intéret de la transgénèse.
Au plan zootechnique : l’un des intérêts majeurs de la transgénèse est l’amélioration des
caractères phénotypiques des animaux de rente : amélioration de la croissance des animaux,
comme le porc, le saumon, l’acquisition de résistances aux maladies causes de mortalité dans
les élevages de lapins, de truites, de carpes….
- Au niveau des plantes : La création de plantes résistantes aux insectes, au stress hydrique et
pour la production de protéines utiles comme les anticorps : (maïs résistant aux insectes,
tomates transgéniques à mûrissement lent, bananes vaccinantes…)
Sur le plan médical : Production de protéines d’intérêt pharmaceutique : Certaines protéines
trop complexes (glycosylées, carboxyméthylées…) ne peuvent être synthétisées
complètement par les bactéries in vitro. Il faut donc chercher à en obtenir par un animal
transgénique (dans le lait, le sang, les urine...).
30-Quelles sont les risques qui peuvent être lié à la transgénèse.
Risques liés à la transgénèse sont :
1. L’utilisation de l’hormone de croissance humaine chez les animaux perturbe leur croissance
et leur reproduction. Les moutons qui sur-expriment GH (hormone de croissance humaine)
sont diabétiques et meurent avant l’âge d’un an.
2. Les risques liés à la consommation des produits OGM comme les protéines de la vache
folle qui provoque des troubles chez l’homme. Les maïs transgéniques possèdent aussi des
gènes de résistance aux ampicillines. Ces transgènes peuvent donc s’intégrer dans les
bactéries du tube digestif humain et conférer des résistances bactériennes aux antibiotiques
que nous utilisons pour nos traitements.
3. Les risques liés à l’environnement : Ces risques sont liés à la dissémination des organismes
transgéniques. Des bactéries et des souris transgéniques qui s’échappent d’un laboratoire de
recherche ou d’un centre de production, les déchets des produits transgéniques déversés dans
la nature constituent de grands dangers qui guettent sans cesse notre écosystème.
31- Donnez une espèce procaryote et une espèce eucaryote.
Pro (E. coli) euca (saccharomyces cerevisiae)
32-Comment le génie génétique peut impacte sur le réchauffement climatique.