Module : Génie microbiologique, L3 Biotechnologie microbienne ABDELLI W

Opération en aval des fermenteurs (Downstream)

Extraction des métabolites

Le contenu du bioréacteur est complexe puisqu’il comprend une phase solide représentée par la
biomasse et éventuellement d’autres particules ainsi qu’une phase liquide dans laquelle se
trouvent en solution divers métabolites et des résidus de substrats non métabolisés.
Les objectifs principaux des traitements en aval des fermenteurs sont :
1- Obtenir un taux de récupération élevé du produit recherché avec le moins possible de
contaminants ;
2- Mettre en œuvre des techniques fiables, s’adaptant à de faibles variations dans la nature et les
propriétés physico-chimiques du flux à traiter.

Moût fermenté

Produit intracellulaire Produit extracellulaire

Disruption cellulaire

Séparation solide/liquide

Concentration

Purification

Conditionnement du produit

Disruption cellulaire

Méthodes physiques Méthodes chimiques Méthodes biologiques

Homogénéisation à haute pression Alcalis Traitements enzymatiques :
Congélation - décongélation Solvants organiques Lysozyme
Choc osmotique Détergents Glucanase, mannase, protéase
Ultrasonication

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1. Séparation solide/liquide
La première étape de la récupération du produit est la séparation des cellules microbiennes et
d'autres ingrédients insolubles du bouillon de culture.

1.1. Sédimentation
1.1.1. Principe
La sédimentation consiste à introduire le fluide porteur de bio-particules dans la zone la plus
calme du bassin afin de permettre aux particules de descendre vers le fond du bassin.

1.1.2. Technologie
▪ Les décanteurs longitudinaux : le fluide chargé de bio-particules est introduit à une
extrémité du bassin et chemine doucement d’un bout à l’autre. Au cours de cette
translation, les particules chutent vers le fond où elles s’accumulent. Un système de
raclettes les repousse à intervalles réguliers vers une « fosse à boues », d’où elles sont
pompées vers la suite du traitement.

▪ Les décanteurs circulaires : le fluide à décanter entre par le centre de l’ouvrage et en

sort en périphérie, via une goulotte de débordement qui ne récolte que la partie supérieure
du volume. Les particules quant à elles sédimentent et s’accumulent dans le fond, où des
raclettes les chassent également vers une fosse à boue. Celle-ci est en position centrale vu
que le fond du bassin est habituellement en forme de cône renversé.

Flux

Flux
décanté

Boues

Décanteur longitudinal Décanteur circulaire

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1.2. Flottation
Lorsqu'un gaz est introduit dans le bouillon liquide, il forme des bulles. Les cellules et autres
particules solides sont adsorbées sur les bulles de gaz. Ces bulles s'élèvent jusqu'à la couche de
mousse qui peut être recueillie et éliminée.

1.3. Floculation
Dans la floculation, les cellules forment de grands agrégats pour se déposer facilement.
L'addition d'agents floculants (sel inorganique, polyélectrolyte organique, hydrocolloïde minéral)
est souvent nécessaire pour obtenir une floculation appropriée.

1.4. Filtration
1.4.1. Principe
La filtration est la technique la plus couramment utilisée pour séparer la biomasse et le filtrat de
culture. Elle repose sur un tout autre principe puisque ce n’est plus la densité des particules qui
permet de les extraire mais bien leur taille.
L'efficacité de la filtration dépend de nombreux facteurs: la taille de l'organisme, la présence
d'autres organismes, la viscosité du milieu et la température.

1.4.2. Technologie

Technique Taille des particules Composés ou particule séparés

Microfiltration 0.02 à 10 µm cellules ou fractions cellulaires, virus
Ultrafiltration 0.001 à 0.1 µm composés avec un PM > 1000 (ex : enzymes)
Hyperfiltration (Osmose inverse) 0.0001 à 0.001 µm composés avec un PM < 1000 (ex : lactose)

▪ Filtration classique (frontale) : le flux est amené perpendiculairement à la surface

filtrante. Dans ce cas, un dépôt que l’on nomme « gâteau de filtration » se forme sur cette
surface diminuant alors sa porosité, augmentant la pression à fournir et réduisant le flux
de perméat produit (colmatage).

▪ Filtration tangentielle : consiste à amener le fluide chargé des particules à éliminer,

parallèlement à la surface filtrante. Ainsi, vu le mouvement du fluide, le gâteau est
désagrégé au fur et à mesure de sa formation (la grande partie des particules est
emportées par le rétentat). Il y a en début de traitement, la diminution de la vitesse de
filtration. Ceci s’explique par la formation d’un gâteau minimal résultant de l’adsorption
des premières particules sur la surface filtrante.

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1.5. Centrifugation
1.5.1. Principe
La centrifugation est basée sur le principe des différences de densité entre les particules à séparer
et le milieu. Elle est principalement utilisée lorsque :
1. La filtration est lente et difficile ;
2. Les cellules ou autres matières en suspension doivent être exemptes d’adjuvants de filtration ;
3. Une séparation continue à un haut niveau d’hygiène est requise.

1.5.2. Technologie

▪ Centrifugeuses à bols : le fluide chargé est introduit au centre d’une série de bols de
forme conique qui tournent à très grande vitesse. De ce fait, le liquide et son contenu sont
mis en rotation et les éléments les plus denses (bio-particules) sont projetés vers
l’extérieur où elles sont récupérées tandis que le liquide est repris en zone centrale.

▪ Centrifugeuses à vis : le fluide à traiter est également injecté en zone centrale mais la
mise en rotation est assurée par une vis. Cette technique assure l’évacuation en continu de
la phase solide alors que la phase liquide s’écoule également en continu à contre courant
de la phase solide.

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Centrifugeuse à bols Centrifugeuse à vis

2. Concentration
Le filtrat exempt de particules en suspension contient généralement de 80 à 98% d'eau.
Le produit désiré est un constituant très mineur. L'eau doit être éliminée pour atteindre la
concentration du produit.

2.1. Evaporation
Les évaporateurs, en général, ont un dispositif de chauffage pour la fourniture de vapeur, et une
unité pour la séparation du produit concentré et de la vapeur, un condenseur pour la vapeur de
condensation, des accessoires et des équipements de contrôle.

2.2. Extraction liquide-liquide

L’extraction liquide-liquide est basée sur le fait que le produit à extraire est plus soluble dans un
des deux liquides non miscibles mis en contact. Les deux liquides mis en contact sont appelés :
• Solution d’alimentation : c’est le liquide contenant le produit à extraire (moût de
fermentation) ;
• Solvant ; c’est le liquide ajouté pour lequel le soluté a le plus d’affinité
(préférentiellement soluble dans le solvant).

2.3. Filtration sur membrane

Selon le gradient de pression et la taille des pores des membranes, on distingue : microfiltration,
ultrafiltration, hyperfiltration (osmose inverse), pervaporation et électrodyalise.
Les membranes utilisées dans la filtration sont constituées de matériaux polymères tels que le
polyéthersulfone et le polyfluorure de vinyle. Au cours des dernières années, des micro-filtres et

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des ultrafiltres composés de céramiques et d'acier sont disponible, leur nettoyage et leur
stérilisation sont plus faciles.

2.4. Précipitation
C’est un procédé particulièrement utile car il permet l'enrichissement et la concentration en une
seule étape. Il est possible d’obtenir certains produits ou d’éliminer certaines impuretés
directement à partir du bouillon. Les agents typiques utilisés dans la précipitation rendent le
composé d'intérêt insoluble, et ceux-ci comprennent: les sels neutres (ammonium, sulfate de
sodium), les solvants organiques (méthanol, éthanol), les polymères de haut poids moléculaire
(ionique ou non ionique), traitement thermique, changement de pH (acides ou bases),
précipitation d’affinité et par ligand.

2.5. Adsorption
Les produits biologiques de la fermentation peuvent être concentrés en utilisant des particules
adsorbantes solides. Dans les premiers temps, le charbon actif a été utilisé comme matériau
adsorbant. Ces dernières années, des adsorbants à base de cellulose sont utilisés pour la
concentration en protéines.
Pour la concentration de composés de bas poids moléculaire (vitamines, antibiotiques, peptides)
on utilise des matrices à base de polystyrène, de méthacrylate et d'acrylate. Le processus
d'adsorption peut être réalisé en faisant un lit de colonne adsorbante et en faisant passer le
bouillon de culture à travers celui-ci. Le produit désiré, retenu par l'adsorbant, peut être récupéré
par élution / extraction de solvant et l’adsorbant peut ensuite être recyclé.

3. Purification
3.1. Chromatographie
Les méthodes chromatographiques séparent les solutés en fonction de la charge, de la polarité, de
la taille et de l'affinité.
La phase stationnaire: agarose, cellulose, polyacrylamide, silice poreuse, dextrane réticulé,
polystyrène...etc.

1. Chromatographie d'adsorption ;
2. Chromatographie d'échange d'ions ;
3. Chromatographie par perméation de gel ;
4. Chromatographie d'affinité ;
5. Chromatographie en phase inverse ;
6. Chromatographie en phase liquide à haute performance.

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3.2. Cristallisation
La cristallisation est une méthode établie utilisée dans la récupération initiale des acides
organiques et les acides aminés, et plus largement utilisé pour la purification finale d'une gamme
diversifiée de composés (ex : acide glutamique, lysine, saccharose). Dans ce processus, le
produit cristallise lentement afin d’éviter de piéger du solvant ou des impuretés dans les cristaux.
• Cristallisation par refroidissement : l’abaissement de la température du fluide provoque la
diminution de la solubilité du produit en solution ;
• Cristallisation par évaporation : l’évaporation du solvant provoque l’augmentation de la
concentration du produit en solution ;
• Cristallisation par relargage : l’addition d’un sel ou d’un contre-solvant qui ne dissout pas
ou peu le produit à cristalliser mais qui solubilise les impuretés. Ces agents sont miscibles
avec le solvant et provoquent le relargage du produit en solution.

4. Conditionnement du produit fini (Formulation)

La formulation fait généralement référence au maintien de l'activité et à la stabilité des produits
biotechnologiques pendant le stockage et la distribution.

4.1. Séchage
Le séchage est une opération ayant pour but d’éliminer par évaporation l’eau d’un corps humide.
Il peut se faire par séchoirs à contact, à convection ou à rayonnement.

4.2. Lyophilisation
La lyophilisation, aussi appelée séchage à froid, est basée sur le principe de la sublimation d’un
liquide à partir d’un état congelé.
Cette technique est préférée au séchage car elle permet la formulation d’une large gamme de
produits (produits pharmaceutiques, produits alimentaires) sans pour autant provoquer de perte
de l’activité biologique du produit souhaité. De plus, elle permet une conservation à long terme
du produit.