Chromatographie d’adsorption :
- Adsorption : Le processus par lequel une molécule est transférée d’une phase liquide ou
gazeuse vers la surface d’une phase solide. Elle est contrôlée par les interactions
s’établissant entre le support solide et le soluté.
- Adsorbant : Un solide sur lequel les solutés peuvent s’adsorber L’adsorbant le plus courant
en chromatographie est la silice Plus la surface adsorbante est grande, plus l’adsorbant peut
adsorber d’analytes Le solide adsorbe donc d’autant plus de composés qu’il est finement
divisé(= particules de petite taille) et poreux
- CCM
- Chromatographie sur colonne : chromato flash solvant poussé à faible P purification +rapide
et meilleure séparation
- Chromatographie d’adsorption différent types de silanols = différents sites d’interaction
Vers chromatographie de partage
Le gel de silice est hydrophile il s’hydrate et ses caractéristiques évoluent.
Manque de reproductibilité des séparations
On modifie alors la surface du gel de silice en greffant des groupements chimiques sur les fonctions
silanols
Le gel de silice greffé est assimilé à un liquide immobilisé. La séparation se fait alors par un
mécanisme de partage et non plus d’adsorption c’est la chromato de partage
La chromatographie de partage
La colonne chromatographique est assimilée à une succession d’opérations de partage
Dans chaque « tronçon » de colonne, il y a un équilibre de partage
Chaque soluté se partage entre les deux phases selon son K
= selon sa solubilité ou son affinité relative pour les deux phases La séparation est basée sur les
différences de solubilité (affinité) des composés dans la phase mobile et la phase stationnaire
Principe de la chromatographie de partage :
2 types de chromatographie de partage
- Le partage normal (NP) a été décrit par analogie à l’adsorption NP
Phase Stationnaire polaire et Phase Mobile moins polaire
- le partage inverse (RP) est maintenant le plus courant (≈70% de l’HPLC) RP
Phase Stationnaire peu polaire Phase Mobile plus polaire
Polarité des composés :
Cmoléculeoctanol
logP=
Cmolécule eau
La méthode de Rekker permet de calculer le coefficient de partage octanol/eau en décomposant la
molécule en fragments à chacun desquels on attribue une lipophilie f
Log P = Σ fx
fal pour groupement sur chaine Aliphatique
far pour groupement sur cycle Aromatique
Valeur positive de f groupe qui apporte de l’hydrophobie
Valeur négative de f groupe qui apporte de l’hydrophilie
chromato de partage en phase normale (NP-HPLC) : phase stationnaire polaire
Phase mobile : solvant et leur force éluante
Composition de la phase mobile
Les solvants ont des sélectivités différentes notamment en raison de leurs interactions polaires avec
les analytes :
- Le tétrahydrofurane est accepteur de proton dans une liaison H mais pas donneur de proton
- Le méthanol est un fort donneur de proton et un fort accepteur de proton dans une liaison H
- L'acétonitrile a un moment dipolaire. C’est un très faible accepteur de proton dans la liaison
hydrogène
La force éluante est une mesure de la relative polarité des solvants = capacité à déplacer un analyte
Les échelles existantes sont basées sur silice (varient d’un adsorbant à l’autre)
Mode d’élution :
- Mode isocratique : même compo tt au long de l’analyte
Généralement, le débit total est maintenu constant, seules les proportions des solvants changent
- Mode gradient : compo phase mobile évolue au cours du temps
la vision de l’échantillon est plus complète
le temps d’analyse total est réduit
la résolution globale est améliorée
les formes de pics sont améliorées
la sensibilité est améliorée
La phase mobile : équilibrage de la colonne :
Lorsqu’on change la composition de phase mobile, il faut attendre suffisamment longtemps que la
colonne soit ré-équilibrée pour assurer la répétabilité de l’analyse
Au moins dix fois le volume mort de la colonne (volume de vide de la colonne V0)
Si P trop élevée diminution du débit et augmentation de la température
Chromato de partage inverse (RP-HPLC) : phase stationnaire : apolaire
Interaction hydrophobe
Longueur de chaine alkyle croissante=polarité décroissante
La polarité optimale est obtenue en mélangeant des solvants
En RP-HPLC, la phase stationnaire est peu polaire (C18)
donc la phase mobile doit être polaire
On réalise des mélanges eau + solvant polaire (acétonitrile, méthanol ou THF)
+ proportion eau est gd + force éluante est faible + temps d’analyse est long
Rétention augmente avec le nb de CH2 diminue avec le nb de double liaison
Nb croissant de groupe CH3 : polarité décroissante
Nb croissant de double liaison polarité croissante
Hydrophobicité dpd état d’ionisation
Contrôle pH de la phase mobile= utilisation tampon convenable
Bilan Chromatographie de Partage :
La rétention des composés et gouvernée par leur solubilité respective dans les 2 phases stationnaire/
mobile
NPLC RPLC
phase stationnaire polaire phase stationnaire non polaire
Analyse de composés capables d’établir des Analyse de composés capables d’établir des
interactions polaires interactions non polaires
Rétention augmente avec polarité des Rétention augmente avec non polarité des
composés composés
Solvant non polaire peu éluant / Solvant polaire Solvant polaire peu éluant / Solvant peu polaire
plus éluant plus éluant