UE DYNAMIQUE ET FONCTIONNALITÉ DES ACIDES NUCLÉIQUES
MÉCANISMES DE LA TRANSPOSITION BACTÉRIENNE
Cours du 30 Mars 2005
Marie-Claude Serre
I- INTRODUCTION
II- RECOMBINAISON TRANSPOSITIONNELLE
a. La duplication au site d’insertion : signature des évènements de transposition
b. Transposition réplicative
c. Transposition non réplicative
III- LES PARTENAIRES DE LA TRANSPOSITION
a. La cible de transposition
b. Les extrémités des transposons
c. Les transposases et les protéines associées
IV- LES TRANSPOSONS PROCARYOTES
a. Séquences d’insertion et transposons composites
b. Transposons unitaires
c. Transposons conjugatifs
d. Le cas particulier du transposon Tn7
V- ASPECTS MÉCANISTIQUES: VARIATIONS AUTOUR DU COUPER-COLLER
a. Tn7 ou la division du travail: changer de partenaire pour changer de cible
b. Formation d'intermédiaire en hairpin: l'exemple de Tn5
c. Formation d'un intermédiaire circulaire: IS911 et la famille IS3
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I- INTRODUCTION
Les génomes de tous les organismes ont la capacité de subir des réarrangements qui vont
permettre de modifier ou diversifier (acquisition, délétion) le pool de leurs gènes et/ou le
niveau de leur expression. Ces mécanismes de recombinaison génétique, essentiels à
l’évolution, peuvent être classés en trois familles :
- Recombinaison homologue
- Recombinaison spécifique de site
- Recombinaison transpositionnelle
Les deux dermières sont souvent regroupées sous le terme «recombinaison spécialisée». Ces
trois voies se distinguent par les mécanismes mis en œuvre, les protéines impliquées et la
nature de l’ADN recombiné. La transposition est le mécanisme capable de générer le plus de
diversité. Il n’y a en effet aucune similitude de séquence entre les sites échangés. Les
réarrangements provoqués auront donc un très fort caractère aléatoire. Les éléments
transposables (ET) ont été identifiés il y a près de 50 ans par Barbara McClintock dans le
cadre d’études sur des mutations instables du maïs. Les ET sont présents dans tous les
génomes en dépit de leurs effets mutateurs dûs à leur déplacement aléatoire. Ils apparaissent
donc comme un moteur évolutif puissant.
Ce cours se concentrera sur les ET bactériens, leur diversité et les différents mécanismes qui
régissent leurs déplacements.
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II- LA RECOMBINAISON TRANSPOSITIONNELLE
La transposition est déterminée par une ou plusieurs protéines spécifiques de chaque
élément transposable. Tous les ET comprennent dans le segment d’ADN mobilisé un gène
codant une protéine essentielle, la transposase. Les ET sont donc des éléments autonomes
parasites des génomes dans lesquels ils se propagent. La transposase va reconnaître deux
catégories distinctes de sites, d’une part les extrémités de l’élément et d’autre part un site
cible (non spécifique) situé à un autre locus du génome. La recombinaison transpositionnelle
repose donc sur un mécanisme complexe qui fait intervenir trois sites distincts séparés dans
l’espace. De plus, l’événement de recombinaison n’est pas réciproque, et est en général suivi
d’une étape de synthèse d’ADN consécutive aux étapes de coupure et ligation essentielles
pour l’échange des brins d’ADN.
a- duplication de l’ADN au site d’insertion
La signature quasi universelle d’un événement de transposition est la duplication de quelques
paires de bases du site cible de l’insertion. Cette duplication est de longueur constante pour un
ET donné, et varie de 2 à 14 pb. Il a cependant été montré pour certains ET qu’ils pouvaient
générer des DR de longueur atypique à faible fréquence. Les deux copies de la séquence
dupliquée se retrouvent en répétition directe encadrant l’élément intégré. La génération de
répétitions directes est une conséquence du mécanisme d’intégration, et n’a aucun rôle à jouer
dans des évènements de transposition ultérieurs. L’apparition des DR peut aisément
s’expliquer par un modèle où la séquence cible de l’insertion va subir une coupure décalée, et
où seul un brin de chaque extrémité de l’élément transposable serait religué aux extrémités
sortantes. Les parties simple brin seront réparées par une néo synthèse d’ADN, générant les
duplications aux bornes de l’élément nouvellement acquis.
Quelques éléments transposables ne génèrent pas de duplication du site cible après
intégration. C’est le cas par exemple d’IS91, de Tn554 ou des transposons conjugatifs.
Cependant, d’autres mécanismes peuvent conduire à une absence de répétitions directes. A
titre d’exemple, des évènements de recombinaison homologue intra ou inter moléculaire entre
deux copies d’IS ayant chacune des DR différentes, conduiront à une absence locale de
répétition autour de l’IS recombinée qui sera alors encadrée par des DR issues de chaque
copie parentale.
b- Transposition réplicative
La présence de DRs aux bornes de l’ET suggère qu’un seul brin de chaque extrémité de l’ET
serait transférée au cours de l’échange de brin avec la cible. Le devenir du second brin de
l’ET est déterminant pour la suite de la réaction, et va définir le type de produit de
transposition obtenu. On distinguera ainsi deux modes de transposition selon que l’élément
soit répliqué ou non au cours de l’étape terminale. Cette distinction est basée sur le clivage ou
le maintien du second brin qui n’est pas ligaturé au site cible.
Si le brin des extrémités qui n’est pas transféré est laissé intact, on aboutit à une structure
intermédiaire où la cible et le donneur sont réunis par l’élément. Cette structure appelée
«Intermédiaire de Shapiro» présente une structure similaire à une fourche de réplication à
chaque extrémité du transposon. Sa résolution par réplication va conduire à la duplication du
transposon, à la réparation du site cible et à la fusion des deux molécules (donneuse et
accepteuse de l’ET). Le produit de cette réaction est nommé cointégrat, et est caractéristique
de la transposition de nombreux éléments bactériens. La résolution de l’intermédiaire de
Shapiro est totalement dépendant de la machinerie de réplication de l’hôte. Aucun transposon
eucaryote ne semble avoir adopté ce mode de transposition, mais trois grands groupes
d’éléments génétiques mobiles utilisent également une étape de réplication pour leur
propagation: les rétrovirus, les rétrotransposons et les rétroposons. Ces éléments ne sont pas
abordés dans ce cours.
c- Transposition non réplicative
Un grand nombre d’éléments procaryotes ou eucaryotes ne se répliquent pas au cours de leur
transposition. Le brin des extrémités qui n’est pas ligaturé à la cible est alors coupé à une
étape précoce de la réaction. Le produit obtenu sera réparé aux bornes du transposon (ce qui
va générer les DR), le résultat étant l’insertion «simple» de l’élément à un endroit quelconque
du génome. Ce mode de transposition est fréquemment appelé «couper-coller (cut and
paste)». Différents types d’intermédiaires réactionnels ont pu être isolés in vivo. Selon les ET
concernés, il peut s’agir de formes libres linéaires ou circulaires de l’ET. Dans tous les cas,
ces formes sont la preuve que les deux brins de chaque extrémité de l’ET ont été coupés avant
le transfert dans la cible.
A la différence de la transposition réplicative où l’intégrité du donneur est conservé après
l’événement de transposition, le devenir de la molécule donneuse est plus problématique dans
la transposition par couper-coller. Une exception notable est constituée par les transposons
conjugatifs où le donneur ayant perdu l’élément sera précisément refermé comme nous le
verrons plus loin.
Dans le mécanisme de couper-coller, le donneur a plusieurs devenirs possibles, mais tous
conduisent à son altération, conduisant de fait à un événement mutateur plus ou moins
dramatique pour la cellule. L’apparition d’une cassure double brin sur la molécule donneuse
peut conduire à sa perte. Ce devenir est acceptable s’il existe une autre copie du réplicon
d’origine et si le nombre exact de copies de ce réplicon n’est pas vital pour la cellule (cas des
plasmides par exemple). Une autre possibilité est la refermeture imprécise du donneur. Elle
peut intervenir directement après la perte de l’ET ou après addition ou perte de quelques
nucléotides (par l’action de transférases ou nucléases). Dans tous les cas, la conséquence
biologique de cet événement sera une altération locale du locus d’origine de l’ET. Enfin, on
peut dans certains cas observer un phénomène de conversion génique. Cette voie n’est
possible que s’il existe des régions d’homologies entre le donneur et une autre région du
génome. Si c’est le receveur de l’ET qui est utilisé (comme présenté sur ce schéma), on
retrouvera alors la structure d’origine, ce qui revient en terme de produits à une transposition
réplicative.
Pour finir, il faut mentionner qu’un certain nombre d’ET ont adopté un mode de transposition
dit « mixte » où les produits de transposition observés se répartissent entre cointégrats et
insertions simples. C’est le cas notamment d’IS1. Pour expliquer ce type d’événement, il a été
proposé un second devenir possible pour l’intermédiaire de Shapiro (voir figure).
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III- LES PARTENAIRES DE LA TRANSPOSITION
Bien que les modes de transposition puissent être différents d’un élément à un autre, ils
aboutissent tous au même résultat qui est l’acquisition d’une séquence mobile à un endroit
quelconque du génome. La seule propriété commune à tous ces évènements est donc la
précision des réactions intervenant aux extrémités des ET et au niveau du site cible. Les
partenaires communs à tout événement de transposition sont donc les extrémités de ET, les
cibles et les protéines médiant les réactions, les transposases.
a- La cible de transposition
Une des caractéristiques majeures de la transposition est la nature aléatoire de la cible utilisée
lors de l’intégration. Cependant, cette séquence cible n’est pas neutre, en d’autres termes, on
peut observer des cibles préférentielles pour la transposition. Pour un ET donné, on pourra
éventuellement définir une préférence d’insertion. Certains ET ont une spécificité « régionale
», comme certaines IS qui ciblent en préférence des séquences naturellement courbées, voire
pour IS1 des séquences riches en AT. D’autres ont une spécificité de séquence comme par
exemple IS10 qui a une cible hot spot de 9 pb, ou Tn7 qui s’intègre préférentiellement à un
site nommé attTn7. De plus, selon que la cible soit située sur le même réplicon ou sur un autre
réplicon, on obtiendra des produits de transposition différents. On parle alors de réaction intra
ou intermoléculaire. Les produits d’une transposition intramoléculaire sont soit des
insertions/inversions soir des délétions adjacentes.
Enfin, quelques transposons présentent la particularité de ne pas pouvoir s’insérer dans une
molécule d’ADN qui portent déjà une de leur copie (Tn7 et famille Tn3 par exemple). Ce
phénomène appelé « immunité de transposition », va conduire ces ET à favoriser les
évènements intermoléculaires. Ce sont les protéines codées par l’élément et en particulier leur
transposase (ou une protéine associée à la tranposase) qui sont responsables de cette propriété.
A ce jour cette propriété n'a été retrouvée que pour des transposons très complexes et jamais
pour des IS.
b- Les extrémités des éléments
transposables
Les extrémités des ET sont en général
nécessaires et suffisantes pour que la
transposition ait lieu. Il est possible de les
séparer des gènes du transposon, pour
autant que ces derniers soient exprimés en
« trans ». Les extrémités sont
spécifiquement reconnues par les protéines
essentielles à la transposition, et
spécifiquement coupées et transférées à la
cible par la transposase. Elles sont souvent
inversées l’une par rapport à l’autre et
diffèrent en longueur et en complexité
selon l’élément dont elles proviennent.
Elles peuvent être divisées en deux domaines fonctionnels, un domaine interne indispensable
pour leur reconnaissance par la transposase et un domaine externe impliqué dans les réactions
de coupure et de transfert de brin. La reconnaissance et la fixation de la transposase sur le
domaine interne va permettre le positionnement correct des bases terminales dans le site actif
de la transposase, et donc la précision de la coupure et de l’échange de brin. Un très grand
nombre d’ET ont un dinucléotide terminal conservé 5’-CA-3’ (famille IS3, Tn7 par exemple,
mais aussi les rétrovirus). D’autres éléments ont également une signature conservée à leurs
extrémités (famille IS4, …). Ces dinucléotides terminaux peuvent être modifiés sans que la
fixation de la transposase soit affectée. En revanche, la réaction de coupure sera inhibée. Cette
compartimentation fonctionnelle implique que les étapes précoces de la transposition suivent
un ordre strict ; la transposase reconnaîtra les séquences internes des extrémités avant de
procéder à la coupure.
c- Les transposases et les protéines associées
Les transposases sont des protéines multifonctionnelles, ayant un rôle structural (assemblage
du transpososome) et catalytique (coupure et échange de brin). Après fixation spécifique aux
extrémités de l’ET, les deux extrémités seront rapprochées dans l’espace par le biais
d’interactions protéine-protéine pour former le transpososome. Dans certains cas, la séquence
cible sera requise pour que cet assemblage ait lieu, dans d’autres cas elle ne sera recrutée
qu’après formation du complexe nucléoprotéique. A cette étape peuvent également intervenir
des protéines dites accessoires, codées soit par l’hôte soit par l’ET, qui auront un rôle
architectural et/ou régulateur réactionnel. Après l’assemblage de cette structure, les réactions
catalytiques pourront intervenir. Cette multifonctionnalité se traduit par une organisation
domaniale des transposases, chaque domaine correspondant à une fonction spécifique. Au
sein d’une famille d’ET on retrouvera une organisation commune des transposases associées.
- Domaine de liaison à l'ADN
Dans la plupart des cas, ce domaine se trouve dans la région N-terminale des transposases. Le
motif le plus fréquemment utilisé est le motif "hélice-tour-hélice".
- Domaine catalytique
Historiquement, l'alignement des transposases de la famille IS3 avec les intégrases
rétrovirales a mis en évidence l'existence d'une triade conservée d'acides aminés acides ayant
un espacement caractéristique. Cette triade est connue sous le nom de motif DD(35)E.
D'autres positions conservées ont également été identifiées, en particulier un résidu K (qui
peut être remplacé par une R). Cette signature fut ensuite retrouvée dans de nombreuses autres
transposases, dont celle de Mu (MuA), de Tn7 (TnsA), d'IS50 et celles de la famille Tn3.
Actuellement, la grande majorité des transposases d'IS entre dans cette famille. Bien que
l'espacement entre les résidus DDE, et quelque fois leur conservation stricte soit variable, la
conservation de ce motif est remarquable.
Un rôle essentiel du motif DDE est de coordiner les cations divalents, indispensables à la
catalyse. La représentation de la poche catalytique à l'état de transition fait intervenir le
phosphate cible dans un état pentacoordiné (pseudo-plan). Un des ions Mg 2+ est proposé jouer
le rôle d'acide de Lewis dans le mécanisme de substitution nucléophile. Il est coordiné par les
deux résidus aspartate, et l'oxyanion du groupe partant. Le second Mg 2+ est également
coordiné par un oxygène du phosphate cible. Il va jouer le rôle de la base permettant de
déprotoner le nucléophile entrant. Lors de l'excision de l'ET, le nucléophile est une molécule
d'eau; c'est l'extrémité 3'-OH de l'ET lors de l'intégration. Sur ce schéma, le substrat est la
séquence 5'-R1-R2-3' et le produit de la réaction, 5'-R3-R2-3'.
codées par l’ET coopèrent avec la transposase et l’assistent dans la réaction. C’est le cas par
exemple du transposon Tn7 qui sera détaillé plus loin. Il est également fréquent de rencontrer
des régulateurs négatifs de la transposition, qui seront soit des répresseurs transcriptionnels,
soit des inhibiteurs de transposition. Ce type de régulation négative est retrouvé assez
fréquemment chez les IS, en particulier celles présentant deux phases chevauchantes de
lecture.
Un certain nombre de protéines codées par l’hôte peuvent également être utilisées par les ET
pour leur transposition. De très nombreux ET requièrent la présence d’histone-like (IHF, HU,
FIS..), mais également des protéines chaperones, qui vont induire des changements
conformationnels de la transposase conduisant à son activation (IS1 par exemple). Des
protéases cellulaires peuvent également jouer un rôle de régulateur de transposition en
protéolysant la transposase (effet répresseur) ou un inhibiteur de transposase (effet activateur).
Il existe donc une très grande variété de stratégies développées par les ET et leurs hôtes, afin
de limiter les évènements transpositionnels, ou de les coupler à l’état physiologique de la
cellule hôte.
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IV- LES TRANSPOSONS PROCARYOTES
Les ET représentent une famille très hétérogène du point de vue de leur structure. De plus
comme nous le verrons plus loin, ils se distinguent au sein d’une même famille en fonction du
mode de transposition qu’ils adoptent et des produits qu’ils génèrent.
Ce sont leurs particularités structurales qui ont servi à établir la classification suivante. Il est
de ce point de vue important de noter que des ET « procaryotes » peuvent être trouvés dans
des organismes eucaryotes. Le terme « procaryote » renvoie dans ce cas à une organisation
structurale de l’ET.
a- Séquences d’insertion et transposons composites
Les séquences d’insertion (IS) sont des ET de petite taille (de 750 à 2500 pb) présentant une
organisation très compacte, universellement retrouvés dans le le phylum procaryote.
En général, elles ne codent que pour des fonctions liées à leur mobilité. La plupart des IS
présentent à leurs extrémités de courtes séquences inversées répétées (de 10 à 40 pb), les IR
qui sont des séquences d’ADN actives en recombinaison. Ces IR encadrent une phase ouverte
de lecture qui code la transposase (TnpA) de l’élément. C’est cet enzyme qui va reconnaître et
recombiner les extrémités lors du mécanisme de transposition. Dans certains cas, la
transposase sera codée par deux phases de lecture chevauchantes, et ne sera produite que par
un événement de décodage non conventionnel, le décallage de phase en –1. C’est le cas par
exemple d’IS1 et des membres de la famille IS3. Dans tous les cas, la ou les phases ouvertes
de lecture représentent la quasi totalité de l’élément. Par convention, l’IR comportant le
promoteur qui va permettre l’expression des phases ouvertes de lecture est appelée IR gauche
(IRL), et celle située à la fin du gène IR droite (IRR).
Les séquences d’insertion ne présentent pas de mode de transposition unique. Certaines seront
non réplicatives (IS10), d’autres réplicatives (IS6) ou mixtes (IS1). Dans tous les cas, les
fréquences de transposition sont faibles et contrôlées soit par l’élément soit par des facteurs de
l’hôte.
Une particularité importante des IS est qu’elles peuvent collaborer entre elles lors de leur
transposition. Cette propriété permet de mobiliser toute séquence d’ADN comprise entre deux
copies d’une même IS, en orientation directe ou inverse. La structure déplacée est appelée
transposon composite, les plus « célèbres » étant Tn5 (IS50), Tn9 (IS1) et Tn10 (IS10)
auquels sont associés des gènes de résistance à un antibiotique.
La collaboration entre deux copies d’une même IS peut provoquer des remaniements
multiples et complexes des génomes en fonction des extrémités impliquées et de la
localisation du site cible.
Un événement de transposition intermoléculaire (c’est à dire, où transposon et cible ne sont
pas portés par le même réplicon), pourra ainsi conduire à des produits de transposition directe
si les IR activées étaient les IR externes ou des produits de transposition inverse si ce sont les
IR internes qui ont été mobilisées. Dans ce dernier cas les marqueurs séquestrés entre les IR
internes de l’ADN donneur seront perdus.
Un événement de transposition intramoléculaire (c’est à dire où transposon et cible sont portés
par le même réplicon) conduira systématiquement à la perte de l’ADN situé entre les IR
internes. Selon la polarité de l’événement, on génèrera des délétions adjacentes ou des
invertions/délétions. Ce dernier type de produit correspond à la formation d’un nouveau
transposon composite.
b- Les transposons unitaires
Contrairement aux séquences d’insertions, les transposons unitaires forment une famille très
homogène, tant du point de vue structural que du point de vue fonctionnel. Leur mode de
transposition implique une transposase mais également une autre enzyme, la résolvase qui
permettra de terminer la réaction en catalysant une étape de recombinaison à un site
spécifique (res) porté par le transposon. Les transposons unitaires se subdivisent en deux
groupes. Leur classification est basée sur l’orientation relative du cadre de lecture de la
résolvase (TnpR) par rapport à celui de la transposase (TnpA). Ils sont soit consécutifs et non
interrompu par le site res où agit la résolvase, soit divergeant et séparés par le site res. En plus
des protéines essentielles à leur dissémination, ces transposons codent des gènes de résistance
aux antibiotiques ou aux métaux lourds. Leur transposition est exclusivement réplicative, et
conduit invariablement à une duplication de 5 pb du site cible.
Les transposons unitaires possèdent la propriété unique de résoudre spécifiquement les
cointégrats générés au cours de leur transposition. Après obtention du cointégrat, catalysé par
la transposase de l’élément et la machinerie de réplication de l’hôte, la réaction de résolution
intervient permettant ainsi de n’avoir qu’une copie de l’élément par réplicon. La résolution
s’effectue au site res du transposon et est unidirectionelle, puisqu’elle n’intervient que si deux
sites res sont présents sur le même réplicon. Les produits finaux de transposition
correspondent donc à des insertions simples qui sont obtenues par un mécanisme en deux
étapes.
c- Les transposons conjugatifs
Les transposons conjugatifs forment une famille très homogène. Le plus petit de ces éléments,
Tn916, a une taille de 18,4 kpb, ce qui classe cette famille dans les très grands ET, les plus
importants pouvant atteindre 100 kpb.
Leurs extrémités sont formées de séquences inversées répétées de 20 à 30 pb. Entre ces
bornes on trouve des gènes impliqués dans la coupure et l’échange de brins d’ADN, la
conjugaison, et des marqueurs de résistance (antibiotiques par exemple). La plupart de ces
transposons codent une recombinase spécifique de site (Int-Tn) appartenant à la famille des
recombinases à tyrosine (comme l’intégrase du phage lambda). Certains comportent en outre
un gène adjacent (Xis-Tn) dont le produit est analogue à l’excisionase Xis de lambda. Les
fonctions catalysant la conjugaison (Tra) sont très similaires à celles portées par les plasmides
conjugatifs d’E. coli. L’originalité de ces transposons est qu’ils sont capables de se propager «
verticalement » mais également « horizontalement » par conjugaison. Ils sont donc très
souvent associés aux phénomènes de propagation des résistance aux antibiotiques.
La première étape de la transposition (l’excision) conduit à la circularisation précise de
l’élément, et est controlée par deux protéines du transposon, l’intégrase (Int-Tn) et
l’excisionase (Xis-Tn). L’excision du transposon va générer un intermédiaire non réplicatif
correspondant au transposon circularisé dont les extrémités sont séparées par quelques
nucléotides provenant des bordures initiales. Le nombre de nucléotides impliqués est fixe
pour un élément donné. Cette séquence, appelée séquence de couplage, est presque toujours
différente entre les extrémités impliquées dans l’excision, ce qui conduit à la formation d’une
courte région hétéroduplex. La circularisation du transposon peut également s’accompagner
de la refermeture précise de son site d’origine. Bien que cela n’ai jamais été démontré
expérimentalement, il est proposé que le mécanisme d’excision du transposon génère un
intermédiaire de type jonction de Holliday. La structure hétéroduplex du site d’excision
disparaitra lors de la réplication du génome de l’hôte, conduisant à l’existence de deux allèles
différents de ce site. La séquence hétéroduplex du transposon circularisé sera éliminée après
son intégration dans une nouvelle cible. De manière surprenante, les séquences de couplage
n’ont pas besoin d’être similaires pour que la recombinaison intervienne, ce qui est totalement
différent du mode d’action des autres recombinases à tyrosine.
L’intégration du transposon dans une nouvelle cible est dépendante de l’intégrase de
l’élément. Elle est sensée être très similaire à ce qui est observé pour l’excision. Elle peut
intervenir dans le même génome ou après conjugaison dans un nouvel hôte. Après intégration,
le transposon est encadré par deux régions hétéroduplex de taille identique mais de séquence
différente. Après réplication, on obtiendra deux molécules de transposons bordées
respectivement à droite et à gauche par les séquences contenues dans la forme circulaire. Une
conséquence de ce mode d’intégration est que la transposition des transposons conjugatifs ne
génère pas de répétitions directes de l’ADN cible.
d- Le cas particulier du transposon Tn7
Tn7 est un transposon dont l’organisation fonctionnelle est très complexe. Contrairement à la
plupart des ET qui n’expriment qu’une ou deux protéines pour leur transposition, Tn7 en
synthétise 5 (TnsA à TnsE). Leurs gènes se succèdent à proximité de l’une des extrémités du
transposon. A l’autre extrémité du transposon sont regroupés les gènes de résistance aux
antibiotiques eux même bordés par une courte séquence répétée, et capables de se déplacer
indépendamment du transposon.
Une particularité de Tn7 est que sa transposition s'effectue dans une cible spécifique, nommée
attTn7. Nous verrons que des protéines de l'ET sont spécialisées dans l'adressage à la cible.
L'insertion de Tn7 dans sa cible préférentielle n'est pas dommageable pour la cellule hôte. Il
arrive cependant que des sites dits secondaires puissent être utilisés comme cible, ne limitant
pas les mouvements de Tn7 à une seule position. Ces sites sont en général portés par des
plasmides conjugatifs et leur utilisation va donc permettre la propagation horizontale de
l'élément. Enfin, Tn7 présente des propriétés d'immunité de transposition; un réplicon portant
une copie de Tn7 ne sera pas utilisé comme cible de transposition. L'intérêt de ce phénomène
peut être d'éviter d'avoir plusieurs copies de l'ET sur un plasmide, et donc de limiter des
évènements de recombinaison homologue entre ces copies, évènements qui pourraient être
délétères pour Tn7.
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V- ASPECTS MÉCANISTIQUES DE LA TRANSPOSITION: VARIATIONS
AUTOUR DU COUPER-COLLER
a- Tn7 ou la division du travail: changer de partenaire pour changer de cible
Nous venons de voir qu'une originalité de Tn7 est le nombre de protéines requises pour sa
mobilité. L'association des protéines TnsA et TnsB fourni les fonctions de tranposase de
l'élément. La protéine TnsB a un domaine N-terminal impliqué dans la fixation de l'ADN et
porte le motif catalytique DDE. C'est TnsB qui est le responsable de la coupure générant les
extrémités 3'-OH et le transfert dans la cible. En revanche, TnsA est indispensable pour que
les extrémités 5' soient coupées. Le motif DDE présent sur cette protéine est très dégénéré.
Une particularité de Tn7 est en effet la libération du transposon sous forme linéaire. Il est
notable que la coupure des extrémités 5' ne soit pas strictement aux bornes du transposon,
mais quelques paires de bases dans les séquences flanquantes. TnsA et TnsB agissent sous
forme d'hétérodimère (TnsAB) et sont donc synergiques bien que l'on puisse obtenir des
mutants de l'une ou l'autre qui conduiront à des coupures simple brin abortives en terme de
transposition. La coupure des extrémités de Tn7 est donc répartie entre deux protéines.
Cependant, la division du travail ne s'arrète pas là. En effet, l'activité de transposition requiert
la
présence
de deux
autres
protéines
codées par
le
transposon,
TnsC et
TnsD ou
TnsC et
TnsE, pour
que
l'insertion
dans la
cible ait
lieu.
TnsD reconnaît spécifiquement le site spécifique d'insertion de Tn7, attTn7. Sa fixation à ce
site va entraîner une distorsion du site, nécessaire à la fixation de TnsC. C'est la fixation de
TnsC sur attTn7 qui permet le recrutement de TnsAB fixé aux extrémités du transposon, et un
positionnement correct pour que l'intégration soit effectuée. De même, l'utilisation de TnsE
est nécessaire à l'intégration dans les sites secondaires. De nouveau, l'intégration interviendra
après que TnsC puis le complexe TnsAB-Tn7 aient été recrutés. Un point commun entre
TnsD et TnsE est que ces deux protéines reconnaissent des structures particulières de leurs
sites cibles. Chaque chemin transpositionnel utilise donc un sélecteur de site particulier (TnsD
ou TnsE) et un complexe multiprotéique commun, TnsABC. En plus de rôle de sélecteurs de
sites, TnsD et TnsE sont également des activateurs des protéines TnsABC.
b- Formation d'intermédiaire en hairpin: l'exemple de Tn 5
Tn5, comme Tn10, est un transposon composite qui utilise des IS de la famille IS4. Sa
transposase possède également le motif catalytique DDE, et le mode de transposition utilisé
est le couper-coller. Tout comme IS50, et Tn10, le mécanisme de transposition présente
comme originalité de libérer un ET linéaire dont les extrémités présentent des "hairpins". Le
mécanisme permettant leur formation est complexe et requiert la formation d'un complexe
synaptique correctement assemblé. Ce complexe est composé de la transposase de l'élément et
des extrémités du transposon. L'activité de la transposase s'exerce en "trans", c'est à dire
qu'elle va couper l'extrémité qu'elle n'a pas fixé. Un dimère de transposase est donc requis
pour exciser le transposon.
La formation des extrémités en hairpin va nécessiter trois attaques nucléophiles séquentielles.
Ces trois attaques dépendent toutes du motif catalytique DDE. La première étape va conduire
à la coupure d'une jonction avec l'ADN donneur sur chaque brin. L'extrémité 3'-OH générée
aux bornes du transposon va attaquer la liaison phosphodiester du brin complémentaire et
conduire à la formation de l'intermédiaire en hairpin. Ce hairpin sera ensuite coupé en
utilisant comme nucléophile une molécule d'eau. Les extrémités du transposon sont alors de
nouveau actives, et vont pouvoir engager la coupure de l'ADN cible en utilisant le même type
de réaction. Au total, il faut donc quatre substitutions nucléophiles par extrémité de
transposon pour observer un cycle complet de transposition. Au cours de ces différentes
étapes, un certain nombre de changements conformationnels vont être induits dans le
complexe synaptique.
c- Formation d'un intermédiaire circulaire: IS911 et la famille IS3
Le dernier exemple de mécanisme transpositionnel est celui qui est utilisé par IS911 et
certains autres membres de la famille IS3. Une fois encore, le mécanisme de transposition est
de type couper-coller, et la transposase de l'élément possède un motif catalytique de type
DDE. La tranposase, TnsAB, est produite par un mécanisme de décallage de phase
traductionnelle programmé entre les deux ORFs codées par l'IS, OrfA et OrfB. Après s'être
fixée aux extrémités de l'élément, elle va catalyser la coupure d'un brin en utilisant une
molécule d'eau comme nucléophile. L'extrémité 3'-OH libérée va alors attaquer une liaison
phosphodiester située sur le même brin d'ADN, à trois bases de l'autre extrémité. Cette
réaction, lorsque l'IS est portée par un plasmide, génère un intermédiaire appelé "figure en 8".
La seconde réaction permettant l'excision de l'IS sous forme circulaire dépend de la
machinerie de l'hôte sans que le mécanisme utilisé soit encore indentifié (réplication du brin
circularisé à une pseudo fourche de réplication, ou recombinaison. La circularisation de l'IS
génère un promoteur très fort à la jonction des extrémités, permettant probablement un second
cycle de production des protéines OrfA et TnsAB. La deuxième étape de transposition
(intégration dans la cible) nécessite outre la présence de TnsAB, la présence de la protéine
OrfA. En absence de cette dernière, on observe une accumulation de l'intermédiaire circulaire.
OrfA est proposée être impliquée dans l'étape de capture de la cible de transposition. TnsAB
va linéariser l'intermédiaire circulaire, générant des extrémités 3'-OH aux bornes de l'IS. Ces
extrémités seront alors utilisées comme nucléophiles lors de la réaction d'intégration. La fin
du processus impliquant une néo-synthèse avec réparation des bornes de l'IS est finalement
prise en charge par la machinerie de l'hôte.
Nous avons vu au travers de quelques exemples qu'il n'existe pas un mécanisme de
transposition unique, même au sein d'une classe d'évènement comme le couper-coller. Même
si les réactions chimiques de la catalyse sont conservées, il existe un grand nombre de
variations autour d'un même thème. Ceci s'applique également aux évènements de
transposition réplicative.
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