Chapitre 3 : Les milieux de cultures
La microbiologie, et notamment la bactériologie, a connu son plein développement suite à la
découverte des méthodes et outils permettant la culture bactérienne. Le microscope à lui seul, est
insuffisant pour identifier la bactérie. La culture bactérienne et sa caractérisation est rendue possible
par l’utilisation des milieux de culture.
Les milieux de cultures sont des préparations utilisées pour faire croître, reproduire, transporter et
conserver des micro-organismes. Ils contiennent des éléments nutritifs nécessaires à la nutrition et la
croissance bactérienne. Ils doivent donc satisfaire les exigences nutritives du germe étudié. (apporte
la source : d’eau, de carbone et d’énergie, d’azote, de phosphore, d’ions minéraux, de facteurs de
croissance, pH voisin du pH optimal,…).
Ils peuvent être liquides, solides ou semi solides. Généralement, les milieux liquides sont solidifiés
avec de l’agar-agar (1.5%). Selon leurs consistances les milieux de culture se divisent en deux types :
Le milieu de culture liquide = le bouillon
Le milieu de culture solide = le bouillon + agar-agar (gélose)
-L’agar-agar ou la gélose : est un polysaccharide extrait de la paroi cellulaire d’algues rouges
possédant des propriétés permettant son utilisation pour solidifier (gélifier) les milieux de culture des
germes :
La gélose se dissout dans l’eau à 90°C, reste en surfusion jusqu’à 45°C, puis à températures basses
forme un gel transparent plus ou moins solide selon la concentration dans l’eau.
Elle n’est pas dégradée par les microorganismes.
Ils permettent la séparation des espèces bactériennes: chaque microbe fixé à la surface du milieu
donne naissance en peu de temps à une descendance de plusieurs milliards d'individus constituant
un amas visible à l'œil nu ou colonie. La forme, la dimension, la couleur d'une colonie sont
caractéristiques de l'espèce bactérienne qui la constitue: la différenciation des espèces bactériennes
est donc possible sur ces milieux.
Les germes se développent parfaitement dans les milieux de culture liquide sous forme d’un
mélange. Ce qui implique l’impossibilité de séparer les microorganismes. Par contre, les milieux de
culture solides permettent une croissance des germes avec fixation sous forme des colonies
microbiennes séparées, ce qui facilite leur isolement et par conséquent leur purification et
identification. Les milieux de culture solides sont utilisés alors pour l’isolement microbien.
On distingue différents types de milieux de culture à savoir;
I. Les différents milieux de cultures
1. Milieux de culture à utilisation générale
Qui supportent la croissance de différents micro-organismes (ex : gélose au soja, gélose nutritive)
2. Milieux enrichis
Qui sont des milieux de culture à utilisation générale auxquels on ajoute des nutriments spéciaux que
les bactéries ne peuvent synthétiser. Ce sont des milieux utilisés pour l’obtention des bactéries dites
exigeantes et auxotrophes. Par exemple : le milieu au sang frais ou gélose au sang ( le sang est riche
en nutriments divers comme le fer, principal facteur de croissance des bactéries.
3. Milieux sélectifs:
C’est un milieu qui favorisent la croissance de certains microorganismes particuliers tout en inhibant
la croissance d’autres espèces ou d'isolats d'une même espèce (ex : Géloses Mac Conkey, éosine-bleu
de méthylène qui sélectionnent les bactéries Gram-négatives).
4. Milieux différentiels
C’est un milieu qui permet de distinguer différents groupes de bactéries et même d’identifier des
micro-organismes sur la base de leurs caractéristiques. Ex : 1) Gélose au sang : Bactéries
hémolytiques versus non-hémolytiques 2) Gélose Mac Conkey : Bactéries qui fermentent ou pas le
lactose
II. Notions et caractères culturaux
II.1. Notions
-Colonie microbienne : ensemble de cellules identiques issues de la même cellule microbienne mère.
- Isoler : consiste à séparer les divers microorganismes d’un mélange poly microbien.
- Souche pure ne donnera qu’un type de colonies par boite de Pétri.
Ensemencement: L’ensemencement a pour but de porter des microorganismes sur un milieu de
culture neuf, solide ou liquide.
II.2. Caractères culturaux
L’aspect macroscopique des colonies est le caractère primaire utilisé pour orienter
l'identification bactérienne. Les critères comme la taille des colonies, leur forme
(punctiforme, ronde régulière, dentelée irrégulière...) et leur aspect sont recherchés. L'aspect
rough "R" est attribué aux colonies rugueuses à surface irrégulière, l'aspect Smooth "S" pour
les colonies lisses, brillantes et régulières et l'aspect muqueux "M" pour les colonies grasses
et coulantes. La forme et l'aspect des colonies dépend des facteurs intrinsèques à la bactérie
comme la mobilité, morphologie (taille, forme, contour), production d’une capsule,
pigmentation, présence de fibrine...etc., et des facteurs extrinsèques tels que les gradients
de solutés créés autour de la colonie et la présence de colorants dans le milieu de culture.
Chapitre 4 : Techniques d’isolement d’une culture pure
I. Principe
L’examen microscopique tout seul n’est pas suffisant pour caractériser et identifier un germe. Pour
cela, il est nécessaire d’ensemencer le microorganisme sur des milieux de culture.
-Ensemencer : consiste à déposer un microorganisme dans un milieu de culture neuve et stérile.
Milieu de culture : est une préparation permettant aux microorganismes de se multiplier rapidement
en grand nombre. Il doit donc satisfaire les exigences nutritives du germe étudié. (apporte la source :
d’eau, de carbone et d’énergie, d’azote, de phosphore, d’ions minéraux, de facteurs de croissance,
pH voisin du pH optimal,…).
Les germes se développent parfaitement dans les milieux de culture liquide sous forme d’un
mélange. Ce qui implique l’impossibilité de séparer les microorganismes. Par contre, les milieux de
culture solides permettent une croissance des germes avec fixation sous forme des colonies
microbiennes séparées, ce qui facilite leur isolement et par conséquent leur purification et
identification. Les milieux de culture solides sont utilisés alors pour l’isolement microbien.
-Colonie microbienne : ensemble de cellules identiques issues de la même cellule microbienne mère.
- Isoler : consiste à séparer les divers microorganismes d’un mélange poly microbien.
- Souche pure ne donnera qu’un type de colonies par boite de Pétri.
2. Outils d’ensemencement
Anse de platine, Pipettes Pasteur, boites de Petri,
3. Techniques d’ensemencement
Avant toute manipulation, il faut rassembler tout le matériel dont on a besoin. On l’organise de façon
à les avoir dans la zone stérile (à proximité du bec). Selon l’objectif visé, on utilisera différentes
techniques :
Chapitre 5 :