Date :
19/05/2025
TP n°1 : Observation des maladies et Nom : Rouissi
Prénom :
méthodes d’isolement Chaima
Classe : 2 -ème
SPV
I. Objectif :
Le but de cette séance pratique est de prélever les spores de certains champignons découverts
dans les champs de céréales de l'INAT, puis de les examiner au microscope afin de
diagnostiquer la maladie correspondante
II. Observation des maladies sur terrain :
Démarrage par une visite des parcelles de l'INAT, avec un début sur celle pour l'avoine, l'orge
Et le blé, dans le but d'observer des symptômes de pathogènes sur ces cultures.
Figure 1 Rayures réticulées sur l’orge
• Maladie : Rayures réticulées ( net blotch)
• Agent causal : Pyrenophora teres
• Symptômes : présence de taches allongées ou de stries
longitudinales brunes.
Figure 2 Oïdium
Maladie : Oïdium
Agent causal : Blumeria graminis
Symptômes : présence de tâches blanche à feutrage
cotonneux en face supérieure. Poutse griser et se parsemer de
ponctuations noires.
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Figure 3 Rouille brune
Maladie : Rouille brune
Agent causal : Puccinia hordei
Symptômes : Les plants présentent des pustules orange à
brunes, dispersées sur la surface des feuilles.
III. Travail au laboratoire :
1. Matériels expérimentaux :
• Scalpels stériles, pinces, boîtes de Petri
• Alcool à 70 %, eau de Javel
• Eau distillée stérile
• Milieu V8 agar préparé et stérilisé (120 °C, 20 min)
• Hotte à flux laminaire ou espace désinfecté
Figure 4 Matériels expérimentaux
2. Matériels végétaux :
Figure 5 Figure 6 Figure 7
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A. Isolement de mise en boite :
Protocole d'isolement
1. Préparation des échantillons végétaux
• Prélever des fragments de tissus végétaux (2–3 mm²) en limite de zone saine/nécrosée
• Nettoyer délicatement la surface avec un pinceau pour éliminer les débris
2. Stérilisation de surface
• Rinçage à l’alcool :
Tremper les fragments dans de l’éthanol à 70 % pendant 10–30 secondes
• Trempage dans l’eau de Javel :
Immerser dans une solution d’eau de Javel à 1 % pendant 1 à 3 minutes.
3. Ensemencement sur milieu V8
• À l’aide d’un scalpel stérilisé (flambé à l’alcool), déposer 4–_8 fragments par boîte de
Petri contenant le milieu V8.
• Étiqueter les boîtes
4. Incubation et surveillance
• Incuber à température ambiante (20–25 °C) à l’obscurité.
• Contrôler quotidiennement :
• Éliminer les fragments contaminés par des bactéries ou champignons
opportunistes.
• Repiquer les colonies fongiques pures sur de nouvelles boîtes.
B. Méthode d'isolement directe :
Matériel
• Cutter stérile ou lame de rasoir
• Solution désinfectante (alcool à 70 % ou eau de Javel à 0,5 %)
• Eau distillée stérile
• Boîtes de Petri avec milieu gélosé V8
• Loupe binoculaire
Étapes
1. Prélèvement ciblé
• Sélectionner des tissus végétaux présentant des symptômes actifs (taches, mycélium
visible).
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• Découper un morceau de 5 mm en bordure de la lésion (zone de transition
saine/malade).
2. Désinfection légère
• Tremper le fragment dans alcool à 70 % pendant 10 secondes uniquement.
• Rincer immédiatement à l’eau stérile pour éviter la sur-stérilisation.
3. Transfert direct
• Déposer le fragment végétal sans découpage supplémentaire au centre de la boîte de
Petri.
• Appuyer délicatement pour assurer un contact optimal avec le milieu V8.
4. Incubation accélérée
• Conserver à 25–28 °C avec un cycle lumière/obscurité (12h/12h) pour stimuler la
sporulation.
• Contrôler après 24–48 h : repérer les hyphes émergeant du fragment.
Figure 9
Figure 8
Figure 10
Observation microscopique des conidies et des Conidiophores D oïdium