‫ا ﻟﺟﻣﮭورﯾﺔ اﻟﺟزاﺋرﯾﺔ اﻟدﯾﻣﻘراطﯾﺔ اﻟﺷﻌﺑﯾﺔ‬

RÉPUBLIQUE ALGÉRIENNE DÉMOCRATIQUE ET POPULAIRE

‫وزارة اﻟﺗﻌﻠﯾم اﻟﻌﺎﻟﻲ و اﻟﺑﺣث اﻟﻌﻠﻣﻲ‬

MINISTÈRE DE L’ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

Université des Frères Mentouri Constantine ‫ﺟﺎﻣﻌﺔ اﻻﺧوة ﻣﻧﺗوري ﻗﺳﻧطﯾﻧﺔ‬

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie ‫ﻛﻠﯾﺔ ﻋﺎوم اﻟطﺑﯾﻌﺔ و اﻟﺣﯾﺎة‬

Département : Biologie Animale ‫ ﺑﯿﻮﻟﻮﺟﯿﺎ اﻟﺤﯿﻮان‬: ‫ﻗﺴﻢ‬

Mémoire présenté en vue de l’obtention du Diplôme de Master

Domaine : Sciences de la Nature et de la Vie
Filière : Sciences Biologiques
Spécialité : Génétique Moléculaire

Intitulé :

Détermination de la variabilité de l’effet de nodulation de la légumineuse

Phaseolus vulgaris et Phaseolus coccineus par différentes souches
rhizobiales
………………………………………………………………………
…………………………………………………………
Présenté et soutenu par : Zouilekh Zahira
Le : 21/06/2016
Détermination de laOuadi
variabilité
Rayanede l’effet de nodulation de la légumineuse
Phaseolus vulgaris et Phaseolus coccineus par différentes souches
Jury d’évaluation :
rhizobiales
Président du jury : Gharzouli Razika (Maitre de conférence classe B - UFM Constantine),
………………………….
Rapporteur : Saoudi Mouna (Maitre assistante classe A - UFM Constantine),

Examinateurs : Bechkri Sara (Maitre assistante classe A - UFM Constantine).

Année universitaire
2015 - 2016
 Table des matières

Liste des abréviations

Liste des figures

Résumé

Abstract

‫ﻣﻠﺨﺺ‬

Introduction…………………………………………………………….……………………01

Chapitre 1: Revu bibliographique

I-la symbiose fixatrice d’azote Rhizobium/ légumineuses………..……………………….03
I-1-La fixation biologique de l’azote………………………..………………………...…….03

I-2- Le couple Rhizobium-légumineuse……………………………………………..04

I-2-1- Le partenaire bactérienne : Rhizobium…………...………………………..04

I-2-2- Le partenaire végétal : la légumineuse…………………………………….06

II- Génétique de fixation et les différentes étapes de formation de nodosité……………09

II-1-Pré ‘échange de signal de l’infection………….………………………………09

II-2-L’infection………….………………………………...…………………………10
II-3-L’organogenèse du nodule……………………………………………………..11

Chapitre II : Matériel et méthodes

I-Isolement des bactéries et étude phénotypique des isolats………………………..…….14
1-1-Isolement des bactéries à partir des nodules……………..……………………14
I-2-Etudes des caractères morphologiques des isolats…………………..…….16
I-2-1-Examen microscopique…………………………………………………..16
1- 2-2-Examen macroscopique des isolats…………………………...…………16
II-Recherche d’enzymes spécifiques à la nodulation……………………………………..17
II-1- Réduction des nitrates………………...……………………………...……….17
II-2- Hydrolyse de l’urée……………………...…………………………………….17
II-3-Activité cellulosique…………………...……………………………………….18
 II-4- Activité pectinolytique………………………………………………………...18
III-la prestation symbiotique avec la plante (test de nodulation)…………...……………….18

III-1-La croissance bactérienne………………..…………………………...………...18

III-2- Stérilisation des graines……………………...……………………………….19

III-3- Inoculation des jarres……………………………...……………………...….20

Chapitre III: Résultat et discussion

I-Etudes des caractères morphologiques des isolats…………………………………..23

I-1-Examen microscopique…………………………………………………………23

1-2- Examen macroscopique des isolats……………………………………………23

II-Recherche d’enzymes spécifiques à la nodulation……………………………………..24

II-1-Réduction des nitrates……………………………...………………………....24
II-2-Hydrolyse de l’urée…………………………………………………………….25
II-3-Activité cellulosique…………….……………………………………………...26
II-4-Activité pectinasique…………………...……………………...……………….26
II-La prestation symbiotique avec la plante hôte (test de nodulation)………………………27
II-1- Mesure de la croissance bactérienne…………………………………...………..27
II-2-Test de nodulation…………………………………………………..………….30

Conclusion …………………………….………………………………………………..……32

Référence biobibliographique………………………………………………………………34

Annexes
 Liste des tableaux

Tableau Titre page

N°
01 Classification des rhizobia selon Berrada et Benbrahim (2014) 04
02 Isolats et des souches de référence utilisée pour cette étude 15
03 Mesure de la Croissance bactérienne(D.O600) de la souche témoin 1 44
- Mezorhisobium ciceri
04 Mesure de la Croissance bactérienne(D.O600) de la souche témoin 1 44
- Rhizobium sullae -
05 Mesure de la Croissance bactérienne(D.O600) de l’isolat S10 44
06 Mesure de la Croissance bactérienne(D.O600) de l’isolat m2 44
07 Mesure de la Croissance bactérienne(D.O600) de l’isolat T1 44
08 Mesure de la Croissance bactérienne(D.O600) de l’isolat b1 44
 Liste des figures
Figure Titre Page
N°
01 Phaseolus coccineus et leur graines (Anonyme, 2009) 08
02 Phaseolus vulgaris et leur graines (Anonyme, 2009) 08
03 Dialogue moléculaire initiant la symbiose Rhizobium –légumineuses 10
(Oldroyd, 2001, Hassan; Mathesius, 2012)
04 Etapes de la formation d'un nodule racinaire chez une légumineuse infectée 12
par rhizobia (Madigan et Martinko, 2007)
05 Conservation des nodules (Vincent, 1970).
06 Flacons contiennent du TY 19
07 (A) : flacon remplis des graines de [Link] dans l’eau distillée stérile 19
(B) : flacon remplis des graines de [Link] dans l’eau distillée stérile
(C) : boite de Pétri contient des graines stériles après leur scarrification
Mécanique
08 Flacon contient la solution nutritive 20
09 Flacon après leur inoculation 21
10 Observation microscopique des coccobacilles a Gram négatif (isolat S 2) sous 23
microscope optique(x100)
11 L’aspect des colonies : (A): sur YMA (isolat Z2) 23
(B): sur YMA+rouge Congo (isolat S2)
12 Test de la vitesse de croissance :(A): avant incubation (Isolat T2) 24
(B) : après 24h d’incubation
13 Test de nitrate réductase (résultat positive d’isolat m2) 25
14 Test de l’urease : (A): Boite témoin 25
(B): Résultats positive d’isolat T2
15 Test de pictinase :(A) : Résultats positif (isolat z2) 26
(B): Résultats négatif (isolat m2)
16 Test de pictinase( résultats positif d’isolat z2) 26
17 Courbe de croissance bactérienne de la souche Témoin 27
- Mezorhisobium ciceri -
18 Courbe de croissance bactérienne de la souche témoin
27
- Rhizobium sullae -
19 Courbe de croissance bactérienne de la souche S2 28
20 Courbe de croissance bactérienne de la souche m2 28
21 Courbe de croissance bactérienne de la soucheT1 29
22 Courbe de croissance bactérienne de la souche B1 29
23 Figure 23: 30
(A):représentation des nodules chez la plante qu’il est inoculé avec la
souche -Mesorhizobium ciceri-
(B):représentation des nodules chez la plante qu’il est inoculé avec l’isolat B1
(C) : représentation des nodules chez la plante qu’il est inoculé avec l’isolat
S2
 Remerciement

Nous remercions tout d’abord

le bon Dieu,

le tout puissant de nous avoir

donné la chance,

la volont et la patience,

le courage

pour réaliser ce modeste

travail.
 Remerciement

Nous tenons à remercier infiniment et très sincèrement Mme Saoudi M., maître
assistante classe A de l’université des Frères Mentouri Constantine pour la
confiance qu’elle nous a fait et d’avoir accepté de diriger ce travail, et d’être
disponible et patiente tout au long période de notre étude.

Nous tenons à remercier aussi Mm Gharzouli R, Maitre de conférences classe

B de l’université des Frères Mentouri Constantine, pour avoir fait l’honneur
d'être président du jury.
Mm Bechkri S, Maitre assistante classe A de l’université des Frères Mentouri
Constantine, pour avoir accepté d’examiner ce travail.

Nous aimerons remercier également toute l’équipe de laboratoire de

biotechnologie Radja, Hanane, leila, Marwa pour leurs conseils et aides et
pour nous avoir facilité l’accès au laboratoire, et à tous ceux qui ont participé à
l’aboutissement de ce travail.
 Dédicaces

Merci mon dieu de m'avoir donné la capacité d'écrire et de réfléchir, La force d'y croire, la
patience jusqu'au bout du rêve
Et le bonheur de lever mes mains vers le ciel et de dire" Ya ‫" ﷲ‬

Je dédie ce modeste travail à celle qui m'a donné la vie, Le symbole de tendresse, qui s'est
sacrifiée pour mon bonheur et ma réussite,
A ma mère et mon père

A mes frères : Bourhane El-Dine, El-moundir Imad El-dine

Et mes sœurs:Nawel, Souad et Meriame

A mes chers grands mère, A mon grand père et toute ma famille sans exception
A mon bras droit, mon binôme. rayane qui m’a apporté :
La force, la patience,l’ amitié

A tous ceux qui me sont chers, A tous ceux qui m'aiment,

A tous ceux que j'aime.

Je dédie ce travail.

Zahira
 Dédicaces

J’ai l’honneur de dédie le modeste travail à

Mes cher parentes, la source de ma tendresse, de mon bonheur, mon courage pour réussie
tout ce que je peux t’offrir ne pourra exprimer l’amour que je porte, que dieu vous protègent
et vous gardent pour nous

A mes chères sœurs Aya, Hawa et à mon frère Fatah

A tous les membres de ma famille, petits et grands

A mes adorables amies qui sont proche de mon coeur

Meriem, Asma, Radia, Rania, Dallel ,Amani ,Rayane, Sandra,
Nardjess, Lina, Fatiha, wissel, Yasmin

Merci a mon binôme Zahra pour tout le beau moment que nous avons partagé

A tous mes collègues de promotion

A tous ce membre de laboratoire

A tous les personnes qui ont été toujours prés de moi,

Pour vos nombreux encouragements et vos conseils

Rayane
Résumé

Parmi de nombreuses légumineuses, nous sommes intéressés au cours de ce

travail à étudier la biodiversité des bactéries nodulant les deux espèces du genre Phaseolus,
([Link] et [Link]), ce dernier a une importance dans l’alimentation humaine vu sa
richesse nutritionnelle.
Nous avons effectuées un isolement e t purification de 10 souches à partir des
nodosités prélevés de différentes régions de l’Est de notre payé.
La caractérisation des isolats porte sur une étude morphologique et culturelle suivie
d’une caractérisation phénotypiques qui basées sur la recherche d’enzymes spécifiques au
processus de nodulation (le nitrate réductase, l’uréase, le cellulase et le pectinase) en présence
de souches témoins, Cette étude montre que toute les souches présentent des caractères
phénotypiques comparables aux Rhizobium.
Un test de nodulation est effectue en mettant en évidence l’aptitude des isolats et les
souches de références à noduler les racines de la plante hôte qui a montré après Cinque
semaines d’inoculation, l’apparition des nodules au niveaux des racines secondaires des deux
légumineuses([Link] et [Link]) les nodules ainsi induits montrent une hétérogénéité
dans la taille.

Mots clés : Phaseolus, [Link], [Link], nodulation, Rhizobium, symbiose

Abstract

Among many leguminous plants, we have been interested througbout this work in
studying the biodiversity of the bacteria nodulant the two species of the Phaseolus kind,
([Link] and [Link]), this last has an importance in the human consumption
considering its nutritional richness.

We made an isolation a n d purification of 10 strains from nodosities taken of different

region of the East of our country.

The characterization of the isolates relates to a study morphological and farming followed of a
characterization phenotypical which based on the search for enzymes specific to the process of
nodulation (the nitrate réductase, urease, the cellulase and the pectinase) in the presence of the
control strain strains, this study shows that all the strains present phenotypical characters
comparable with Rhizobium.

Nodulation test is performed by highlighting the ability of the isolates and the strains
of references to nodulate the roots of the plant host which showed after five weeks of
inoculation, the appearance of the nodules on the level of the secondary root of the two
leguminous plants ([Link] and [Link]) the nodules thus induced show a
heterogeneity in the size.

Keywords: Phaseolus, [Link], [Link], nodulation, symbiosis, Rhizobium.

 ‫ﻣﻠﺨﺺ‬

‫ﺑﯾن اﻟﻌدﯾد ﻣﻦ اﻟﺒﺎﻗﻮﻟﯿﺎت ﻧﺤﻦ ﻧﮭﺘﻢ ﻓﻲ ھﺬا اﻟﻌﻤﻞ ﺑﺪراﺳﺔ اﻟﺘﻨﻮع اﻟﺒﯿﻮﻟﻮﺟﻲ ﻟﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎ ﻣﻌﺰوﻟﺔ ﻣﻦ ﻋﻘﺪ ﺟﺬرﯾﺔ ﻟﻜﻼ‬
‫‪ P. vulgaris‬و ‪ [Link]‬واﻟﺘﻲ ﻟﮭﺎ أھﻤﯿﺔ ﻓﻲ اﻟﻨﻈﺎم اﻟﻐﺬاﺋﻲ ﻟﻺﻧﺴﺎن ﻧﻈﺮا‬ ‫‪Phaseolus‬ﻧﻮﻋﻲ‬ ‫ﻣﻦ ﺟﻨﺲ‬

‫ﻟﺜﺮوﺗﮭﺎ اﻟﻐﺬاﺋﯿﺔ ﺣﯿﺚ أﺟﺮﯾﻨﺎ ﺗﻨﻘﯿﺔ وﻋﺰل ‪ 10‬ﺳﻼﻻت ﻣﻦ اﻟﻌﻘﯿﺪات اﻟﺘﻲ ﺗﻢ ﺟﻤﻌﮭﺎ ﻣﻦ ﻣﻨﺎطﻖ ﻣﺨﺘﻠﻔﺔ ﻣﻦ ﺷﺮق ﺑﻠﺪﻧﺎ‪.‬‬

‫اﻟﺪراﺳﺔ اﻟﻮﺻﻔﯿﺔ ﻟﻠﻌﺰﻻت ﺗﻌﺘﻤﺪ ﻋﻠﻰ ﻣﺠﻤﻮﻋﺔ دراﺳﺔ ﻣﺮﻓﻮﻟﻮﺟﯿﺔ ﻣﺘﺒﻮﻋﺔ ﺑﺨﺼﺎﺋﺺ وﺻﻔﯿﺔ ﻣﻈﮭﺮﯾﺔ ﻟﻠﺒﺤﺚ‬
‫ﻋﻦ أﻧﺰﯾﻤﺎت ﺧﺎﺻﺔ ﻟﻌﻤﻠﯿﺔ اﻟﺘﻜﻮﯾﻦ اﻟﻌﻘﺪي ) اﺧﺘﺰال اﻟﻨﺘﺮات ‪ ،‬اﻟﯿﻮرﯾﺎز ‪ ،‬و اﻟﺴﯿﻠﻮﻟﻮز و ﺑﻜﺘﯿﻨﺎز ( ﺑﻮﺟﻮد ﺳﻼﻻت ﺷﺎھﺪة‪.‬‬
‫ﺗﺒﯿﻦ ھﺪه اﻟﺪراﺳﺔ أن ﺟﻤﯿﻊ اﻟﺴﻼﻻت ﻟﮭﺎ ﻧﻔﺲ اﻟﺼﻔﺎت اﻟﻤﻈﮭﺮﯾﺔ اﻟﻤﺸﺎﺑﮭﺔ ل ‪. Rhisobium‬‬

‫ﺗﻢ إﺟﺮاء اﻻﺧﺘﺒﺎر اﻟﺘﻌﺎﯾﺸﻲ و دﻟﻚ ﻣﻦ ﺧﻼل ﺗﺴﻠﯿﻂ اﻟﻀﻮء ﻋﻠﻰ ﻗﺪرة اﻟﻌﺰﻻت ﺑﺘﺸﻜﯿﻞ ﻗﺪرة ﺟﺬرﯾﺔ ﻟﻨﺒﺎت ﺣﯿﺚ‬
‫ظﮭﺮت ﺑﻌﺪ ﺧﻤﺴﺔ أﺳﺎﺑﯿﻊ ﻣﻦ اﻟﺘﻠﻘﯿﺢ‪،‬ﻋﻘﺪ ﺟﺬرﯾﺔ ﻋﻠﻰ ﻣﺴﺘﻮى اﻟﺠﺬور اﻟﺜﺎﻧﻮﯾﺔ ﻟﻜﻼ ﻧﻮﻋﻲ ﻟﻔﺎﺻﻮﻟﯿﺎ وﻗﺪ أظﮭﺮت اﻟﻌﻘﯿﺪات‬
‫اﻟﻨﺎﺟﻤﺔ ﻋﻦ ﻋﺪم اﻟﺘﺠﺎﻧﺲ ﻓﻲ اﻟﺤﺠﻢ‪.‬‬

‫اﻟﻜﻠﻤﺎت اﻟﻤﻔﺘﺎﺣﯿﺔ ‪ .Phaseolus, [Link], [Link] :‬اﻟﺘﻜﻮﯾﻦ اﻟﻌﻘﺪي ‪، Rhizobium,‬اﻟﺘﻌﺎﯾﺶ‬

Introduction
 Introduction

La symbiose rhizobium légumineuse est un processus indispensable non seulement à

la plante (premier partenaire) pour acquérir l’azote sous forme réduite, mais aussi aux
rhizobia (deuxième partenaire) pour obtenir les nutriments nécessaires à leur développement.

L'association symbiotique rhizobium -légumineuse présente un haut niveau de

spécificité sur une communication moléculaire entre deux partenaires. Cette relation se
manifeste par la formation des structures racinaires, les nodules qui sont le siège de la fixation
d'azote atmosphérique.
Le genre Phaseolus ou l’haricot, appartenant à la famille des fabacées, sous famille
des Papilionoideae, est une légumineuse très répandue dans le monde à cause de ces valeurs
nutritionnelle et son grand intérêt économique. Les espèces du genre Phaseolus sont
largement distribuées dans le monde entier et, en plus cultivées dans les régions tropicales,
également développé dans les zones tempérées du Nord et du Sud (Martin Brink, Getachew
Melese Belay - 2006).
La présente étude a été réalisée au laboratoire de biotechnologie,université des Frères
Mentouri de Constantine. Elle porte en priorité sur l’évaluation et l’étude des bactéries
symbiotiques nodulant les espèces de genre Phaseolus (particulièrement les deux espèses
[Link] et [Link]) cultivées en Algérie dans différents étages climatique.
Dans l’objectif d’évaluer la spécificité de la relation symbiotique existant entre les
deux partenaires, les isolats sont caractérisés phénotypiquement : test morpho-culturaux,
tests enzymatiques et par une prestation symbiotique entre isolats et plante hôte.
Donc notre travail est structuré de la manière indiquée ci-dessous :

 Revue Bibliographie est consacré sur la symbiose fixatrice d'azote

légumineuse –Rhizobium
 La partie Matériel et Méthodes adopté à l'expérimentation en laboratoire.

 Les Résultats et Discussion obtenus de cette présente étude.

En fin le travail sera achevé par une conclusion générale.

Page1
 Chapitre I
Revue bibliographique
Chapitre I : Revue bibliographique

I-La symbiose fixatrice d’azote légumineuse /Rhizobium

I-1-La fixation biologique de l’azote

La fixation biologique de l’azote est une activité microbienne aussi importante

pour le maintien de la vie sur le globe terrestre que la photosynthèse. Les organismes
assimilateurs de N2 sont des eubactéries et archaebactéries procaryotes réparties dans plus
de 100 genres; certains fixent l’azote en vivant à l’état libre, d’autres le font au cours d’une
symbiose (Pelmont, 2005): c’est le processus qui permet aux végétaux de fixer l’azote
atmosphérique par le biais d’une relation symbiotique principalement entre les bactéries du
genre Rhizobium associés aux plantes de la famille Fabacées. (Pousset, 2002).

Dans cette association symbiotique, la plante représente l’hôte et le partenaire

bactérien le symbionte. Chez les légumineuses, les rhizobia s’installent dans les racines
des plantes; le végétal fournit des matières nutritives à la bactérie; celle-ci capte l’azote de
l’air et le donne à son hôte (Pousset, 2003). La réaction chimique type est

2N2(g) + 3{CH2O} +3H2O → NH4 + 3CO2

Azote matière E au Ammonium Dioxyde de
(gaz) organique Carbonne

L'interaction symbiotique se traduit par la formation d'organes spécifiques, appelés

nodules ou nodoisités, à l'intérieur duquel la bactérie, intracellulaire, se différencie en
bactéroïde capable de fixer l'azote atmosphérique en le réduisant, via le complexe nitrogénase,
en ammonium (Perret et al., 2000 ; Gibson et al., 2008). L'établissement et le fonctionnement
de la symbiose sont sous le contrôle génétique de chacun des deux partenaires

Page 3
Chapitre I : Revue bibliographique

I-2- Le couple Rhizobium-Légumineuse

I-2-1- Le partenaire bactérien : Rhizobium

a - Généralités

Le terme Rhizobium est attribuée aux bactéries telluriques a été utilisé pour désigne ces
bactéries formant des nodules sur les légumineuses du grec, ‹‹ Rhizo›› = racine et bium=
vivant. Dénommé ainsi par Franck car ce microorganisme vit dans les racines (Franck, 1889).

Les Rhizobium sont des bactéries à Gram négatifs, strictement aérobie non sporulant, et
généralement mobile grâce à la présence d’un ou plusieurs flagelles
(Jordan, 1984 et Werner, 1992) ces bactéries peuvent exister sous deux formes: la forme
végétative que l’on trouve dans le sol et la forme bactériode que l’on rencontre à l’intérieur
des cellules de cortex racinaire (werner, 1992).

Le génome au Rhizobium est particulièrement intéressant, il peut y avoir trois types de

réplicons pour un chromosome de taille supérieur à 4 Mb, un méga-plasmide (1-2 Mb) et un
plasmide de taille inférieur à 1 Mb, selon les espèces (Laranjo et al., 2002). L’existence de
séquences répétitives d'ADN est une caractéristique du génome de Rhizobium.

b- Classification des Rhizobium

La classification des Rhizobium a été passée par un changement substantiel au
cours des dernières années grâce à l'ajout de plusieurs nouveaux genres et espèces de ce
groupe de bactéries importantes. Des études récentes ont montré l'existence d'une grande
diversité parmi les bactéries fixatrices d'azote isolées à partir de différentes légumineuse
(tableau 1).
Tableau1 : Classification des Rhizobia selon Berrada et Benbrahim (2014)
Source d'isolement Référence

Classe: Alphaproteobacteria
Ordere: Rhizobiales Famille:
Rhizobiaceae Genre:
Rhizobium R. leguminosarum Frank et al., 1889
Symbiovarviciae Pisum, Viciae, Lens, Lathyrus Frank et al., 1889; Jordan et al., 1982
Jordan et al., 1982; Renan et al., 2012
symbiovar trifolii Trifolium pratense Frank et al., 1889; Jordan et al., 1982
Terefework et al.,1998; Lindstrom et al.,
symbiovar phaseoli Phaseolusvulgaris 1989 Lindstrom et al., 1989
R. galegae Galega, Leucaena Martinez et al., 1991
Symbiovar officinalis Galega orientalis Renan et al., 2012 Martinez et al., 1991
Symbiovar orientalis Galega officinalis Lopez et al., 2010

Page 4
 Chapitre I : Revue bibliographique

R. tropici Phaseolus, Medicago, Macroptilieum

Tian et al., 2008 Segovia et al., 1993
R. leucaenae
R. tropici Wang et al., 1999
R. endophyticum Phaseolus vulgaris Souza et al., 1994
R. phaseoli Phaseolus de Lajudie et al., 1998
R. fabae Viciafaba Amarger et al., 1997
R. etli Phaseolus,
Symbiovar mimosae Mimosa affinis
Symbiovar phaseoli Phaseolus
R. undicola Neptunia natans
R. gallicum Phaseolus vulgaris
Symbiovar phaseoli Phaseolus vulgaris Chen et al., 1988
Symbiovar gallicum Phaseolus vulgaris Wang et al., 1998
R. giardinii Phaseolus vulgaris Van et al., 1998
Symbiova rphaseoli Phaseolus Tan et al., 2001
Symbiovar giardinii Phaseolus vulgaris Bouzar et al., 2001
R. hainanensis Desmodium sinuatum, Centrosema Wei et al., 2002
R. huautlense Sesbania herbacea Squartiniet al., 2002
R. mongolense Medicago ruthenica, Phaseolus Wei et al., 2003
R. yanglingense Amphicarpaea Garciaet al., 2007
R. larrymoorei Ficus benjamina Gu et al., 2008
R. indigoferae Indigofera spp. Han et al., 2008
R. sullae Hedysarum Peng et al., 2008
R. loessense Astrgalus, Lespedeza Ramirez et al., 2008
R. cellulosilyticum Populus alba Lin et al., 2008
R. miluonense Lespedeza Berge et al., 2009
R. multihospitium Multiple legume species Lu et al., 2009
R. oryzae Oryza alta Hou et al., 2009
R. pisi Pisum sativum El Akhal et al., 2008
R. mesosinicum Albizia, Kummerowia Dalbergia Hou et al., 2009
R. alamii Arabidopsis thaliana Young et al., 2001
R. alkalisoli Caragana intermedia
R. tibeticum Trigonella archiducis-nicolai
R. tubonense Oxytropis glabra
R. halophytocola Coastal dune plant Pulawska et al., 2012

A. oxalatiphilum
Genre: Devosia
Devosianeptuniae Neptunia natans
Famille: Bradyrhizobiaceae Xu et al 1995
Genre: Bradyrhizobium Yao et al., 2002
B. japonicum Glycine max, Glycine soja Rivas et al., 2004
B. elkanii Glycine max Vinuesa et al., 2005
B. liaoningensese Glycine max Islam et al., 2008
B. yuanmingense Lespedeza Ramirez et al., 2009
B. betae Betae vulgaris
B. canariense Genisteae et Loteae Islam et al., 2008
B. iriomotense Entada koshunensis
B. jicamae Pachyrhizus erosus
B. lablabi Lablab purpureus Zhang et al., 2012
B. huanghuaihaiense Glycine max
B. cytisi Cytisusvillosus
B. daqingense Glycine max Chahbourne et al., 2011
B. denitrificans Aeschynomene Wang et al., 2013
B. oligotrophicum
B. pachyrhizi Pachyrhizus erosus Van et al., 2006
Classe: Beta Proeobacteria
Ordere: Burkholderiales
Famille: Burkholderiaceae
Genre: Burkholderia
B. caribensis Vertisol microaggregates
B. cepacia Alysicarpus glumaceus Ramirez et al., 2013
B. tuberum Aspalatus carnosa Van, Eardly 2002
B. phymatum Machaerium lunatum Achouak et al., 1999
B. nodosa Mimosa bimucronata, Mimosa Moulin et al., 2001
B. sabiae Mimosa
scabrellacaesalpiniifolia Vandamme et al., 2003
B. mimosarum Mimosa spp. Chen et al., 2007
B. rhizoxinica Rhizopus microsporus Chen et al., 2008
B. diazotrophica Mimosa spp. Chen et al., 2003
B. endofungorum Rhizopus microsporus Partida et al., 2007
B. heleia Eleocharis dulcis Sheu et al., 2013
B. symbiotica Mimosa spp. Partida et al., 2007
Genre: Cupriavidus Aspalatus carnosa Aizawa et al., 2010

Page 5
Chapitre I : Revue bibliographique

C. taiwanensis Mimosa sp. SHEU et al., 2012

Classe: Gamma-Proteobacter Vandamme, Coeyene, 2004
Ordere: Pseudomonadales
Famille: Pseudomonaceae
Pseuomonas sp. Robinia pseudoacacia Shiraishiet al., 2010

*: Espéces ne parviennet pas à noduler incluses traditionnellement dans les rhizobiums*

I-2-2- Le partenaire végétal : La légumineuse

a- Généralités
Les légumineuses sont cultivées principalement comme source de protéines pour la
consommation humaine (haricot, pois, fève,…) ou l’alimentation animale (soja, luzerne,…)
grâce à la fixation symbiotique de l’azote. Elles sont aussi une source importante d’huiles
végétales (arachide) et de bois de qualité (bois de rose, ébène).
La famille des légumineuses ou Fabacées est la troisième des plus grandes familles de
plantes à fleurs (après les orchidées et les astéracées), avec environ 650 genres et près de 20
000 espèces (Gepts et al., 2005), Ces espèces sont réparties en trois sous-familles:
Mimosoideae, Caesalpinioideae, et Papilionoideae (Doyle et Luckow, 2003),Elles constituent
de loin le groupe le plus important de plantes participant à la fixation de l'azote avec des
bactéries symbiotiques (Raven et al., 2000).

-Les Caesalpinioideae : ce sont majoritairement des arbres ou des arbustes tropicaux

ou subtropicaux. Leur fleur irrégulière possède 5 pétales non différenciés et des étamines
visibles extérieurement (Judd et al., 2001).
-Les Mimosoideae : Ce sont pour la plupart des arbres tropicaux. Leurs fleurs sont
régulières, petites, groupées souvent sous forme de pompons. Les étamines sont les parties les
plus visibles de la fleur (Judd et al., 2001).
-Les Papilionoideae : Dans cette sous-famille dont le genre Phaseolus fait partie,
97% des espèces examinées peuvent être nodulées. La majorité des espèces sont herbacées;
leur fleur est irrégulière composée de 5 pétales: un étendard, deux ailes et deux pétales
partiellement fusionnés en une carène (Judy et al., 2001).

b- Le Phaseolus
Le genre Phaseolus se classe dans la sous-tribu des Phaseolinae, tribu des Phaseoleae,
famille des Fabaceae sous-famille Papilionoideae et ordre des Fabales. Au sein des
Phaseolinae (à stylet barbu sous le stigmate), les deux genres Phaseolus et Vigna sont les plus

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Chapitre I : Revue bibliographique

importants et contiennent à eux seuls le plus grand nombre d’espèces cultivées comme
légumineuses vivrières. La section Phaseolus du genre Phaseolus est la plus importante
et regroupe notamment les cinq espèces cultivées : P. acutifolius A. Gray., P. coccineus L.,
P. lunatus L., P. polyanthus Greenm. et P. vulgaris L .Comme pour la plupart des espèces du
genre, le génome du phaseolus comprend 11 paires de chromosomes (2n=22).
(Maréchal et al., 1978 ; Baudoin et al., 2002 ; Freytag et Debouck, 2002. Gepts et al., 2008).
- Phaseolus coccineus (L’ haricot d'Espagne)
L’origine : L’haricot de l’Espagne est présent à l’état sauvage de Mexique à Panama,
il a probablement été domestique au Mexique. L’haricot d’Espagne est cultivé dans les pays
tempérés et parfois dans les régions de hautes terres d’Amérique centrale et du sud d’Afrique
(Martin Brink, Getachew Melese Belay - 2006)
Description morphologique : Le haricot d'Espagne est une plante herbacée vivace à
rames. C'est une légume oublié, appréciée pour ses fleurs rouge écarlate ou blanches en
bouquets s'épanouissant en été et pour leurs graines comestibles.
L’espèce Phaseoulus coccineus fixe l’azote atmosphérique par la symbiose avec des bactéries
Rhizobium à croissance rapide. A la différence des autres espèces du genre Phaseolus, c'est
une plante par sa racine pivotante tubérisée mais uniquement en climat chaud. C'est pour cette
raison qu'elle est habituellement cultivée comme plante annuelle). Les graine de l’haricot
d’Espagne germent au bout de 10-14 jour âpres le semis, la florison début 40-60 jours après
le semis ces fleurs s’ouvrent au lever du soleil et se fanent au moment ou il se couche.
(Martin Brink, Getachew Melese Belay - 2006) (Figure1).

Figure 1: La plante phaseolus coccineus et leur graines (Anonyme ,2009)

- Phaseolus vulgaris (L’haricot commun) :

L’origine : est de l’amérique latine et central, l’haricot comme sous le nom

scientifique de Phaseolus vulgaris parmi les légumineuses qui ont été domestiquées depuis

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Chapitre I : Revue bibliographique

plus de 8000 ans (Gepts et Debouck, 1991) et occupe une place importante dans le système
agricole de presque touts les pays tropicaux (Kplan, 1981,Gepts,1990) .l’haricote était cultivé
par les tribus indiennes du Mexiques ainsi qu’ au Pérou.

Description morphologique : L’haricot de Phaseolus vulgaris est une plante

herbacée avec un port qui peut changer d’une variété à une autre .deux grands groupes sont
distingués les variétés à tige volubile qui peut atteindre 3m de hauteur ces variétés ont besoin
de support pour soutenir la tige, et les variétés naines à tige ramifiée de 40 à 60 cm de hauteur
(Guignard, 1998).
L’espèce [Link] est une plante annuelle à végétation rapide son cycle est de 90 à 20 jours
(Peron, 2006). Le système radiculaire est profond et peut descendre jusqu’ à 1.20m, après 15
à 20 jours des semis, des nodules peuvent se former sur ces radicelles (Adams et al., 1985).

Figure 2: Phaseolus vulgaris et leur graines (Anonyme ,2009)

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Chapitre I : Revue bibliographique

II- Génétique de fixation et les différentes étapes de formation de nodosité

La nodulation est considérée comme la première caractéristique à l’association

symbiotique est strictement contrôlée par des mécanismes d’autorégulation interne de la
plante hôte (Figueiredo et al., 2008 ; Lohar et al., 2009).
La formation des nodosités exige une collaboration génétique intime entre les bactéries et la
plante (Michelle et Lindeque, 2006)'. L’analyse génétique de diverse espèce de Rhizubium
a permis d’identifier trois types de gènes symbiotiques qui entre le dialogue moléculaire
plante / Rhizubium ;
- Les gènes nod contrôlent la reconnaissance spécifique, l’infection et la nodulation.
- Les gènes fix indispensable pour la fixation d’azote.
- les gènes nif codent pour le complexe de nitrogénase.
L’expression régulière de ces gènes nous permettons d’établir les étapes de nodulation :

II-1-Pré’échange de singnal de l’infection

La bactérie et la plante hôte mettent en place un système de dialogue basé sur un
échange de molécules chimique. Dans un premier temps, les racines excrètent des flavonoïdes
(molécules signales) en conditions de carence en ions ammonium (Patriarca et al., 2004). ce
signale une fois perçu par le Rhizobium, Il est reconnu spécifiquement par des protéines
régulatrice bactérienne, les protéines nod D. avec la coopération des flavonoïdes, les protéines
nodD vont pouvoir mouvoir l’expression coordonnées des gènes de nodulation (gène nod).
par l’intermédiaire de boite régulatrice (nod Box) lieu de régulation des gènes nod A, B et C.
Les gènes nod sont organisés en opérons et produisent des enzymes qui contrôlent la synthèse
de molécule indispensable au processus de nodulation, ces signaux généralement connu sous
le nom de facteurs nod sont des molécules Lipo-chito-oligosaccharidiqu( Tereferwork,2002)
ils sont constitués d’un squelette de trois à six résidus N-acétyl-D-glucosamine réunie par de
liaisons B(1-4) (Figure 3).

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Chapitre I : Revue bibliographique

Figure 3 : Dialogue moléculaire initiant la symbiose Rhizobium –légumineuses.

(A) (1) Les racines de la plante hôte sécrètent des flavonoïdes. (2) Les flavonoïdes sont perçus
par les rhizobia, activant la protéine nodD responsable de la régulation positive de l’expression
des gènes nod bactériens. (3) Les rhizobia sécrètent en retour des facteurs Nods. (4) Les
facteurs Nods sont perçus par la plante au niveau des poils absorbants racinaires et activent
l’initiation du programme symbiotique (Oldroyd, 2001, Hassan; Mathesius, 2012).

II-2- L’infection
Les bactéries s'attachent aux racines par l'intermédiaire de, la rhicadhésine ainsi que
d’autres protéines spécifiques, les lectines localisées à la surface des cellules (Krishnan et
Bannett, 2007). Les facteurs nod émis par les rhizobia, induisent une dépolarisation de la
membrane plasmique accompagnée d'une oscillation du flux de Ca2+. Cette étape se poursuit
par une induction de l'expression de gènes spécifiques, les gènes A, B et C sont physiquement
et fonctionnellement conservés chez toutes les espèces rhizobial et leur mutation provoquent
une perte complet de la capacité à noduler les plantes hôtes. En effet, ces gènes sont
indispensable pour induire la déformation, la modification de la croissance polaire des poils
absorbants en formant une structure dite en « crosse de berger» qui enferme les rhizobia
(Esseling et al., 2003 Pelmont, 1995; Gage, 2004).l’infection qui s’accompagne d’une
digestion de la paroi cellulaire du poil racinaire peut avoir lieu à travers les poils absorbants,
les blessures, ou l’espace intracellulaire (Rasanen, 2002).

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Chapitre I : Revue bibliographique

II-3- L’organogenèse du nodule

Dans le poil absorbant, des vésicules golgiennes convergent vers le point de contact,
forment un cordon amorphe c’est le filament d’infection (Dupuy et Nougier, 2005). Ce
cordon relie les cellules épidermiques aux cellules corticales. De là, l'organogenèse se
poursuivra jusqu'à l'obtention d'un nodule (Bélanger, 1998). Arrivé dans la zone corticale, le
cordon se ramifie et envahit presque la totalité de la racine, la zone corticale réagit par
l’augmentation de taille mais aussi par la multiplication cellulaire activée par la libération de
cytokinines bactériennes; un méristème se forme ou différencie une excroissance appelée
nodule (Dupuy et Nougier, 2005).
La dernière étape de la formation du nodule consiste en un relâchement des
Rhizobiums à partir des cordons d'infection à l'intérieur des cellules corticales suivi de la
division et la différenciation des Rhizobiums en cellules fixatrices d'azote reconnues sous
le nom de bactéroïdes. Au sein de bacteroide grâce à un complexe enzymatique qui permet la
fixation de l’azote, ces derniers fournissent la machinerie génétique pour la synthèse de
nitrogénase : ce sont les gènes nif et fix. Les gènes fix plus qu’ils sont des gènes essentiels à la
fixation d’azote, ils sont nécessaire aux étapes plus tardives de la construction d’une nodosité
capable de fixer d’azote et ne sont présente que chez les fixatrice symbiotique (Broughton,
2000).
Les gènes nif codent pour la biosynthèse de complexe nitrogénase qui est très conservé chez
les bactéries fixatrices d’azote tant au niveau de sa séquence que de sa structure. Il est
constitué de deux métalloprotéines : le site de la réduction du substrat est la protéine
MoFe (composant I ou dinitrogénase) et le donneur d’électrons est la protéine Fe
(composant II ou dinitrogénase réductase).
Le composant I est un hétérotétramère de type α2β2 codé par les gènes nifD et nifK
et le composant II est un homodimère codé par le gène nifH (Howard et Rees, 2000).
La nitrogénase est un complexe enzymatique très sensible à l’oxygène, qui est rapidement
inactivé dans un environnement aérobie. La nodosité lui confère une niche protectrice grâce à
la présence d’une protéine végétale, la leghémoglobine qui fixe l’oxygène et permet de le
maintenir à faible pression partielle. Elle se lie à l’oxygène et permet ainsi de réguler la
diffusion de l’oxygène aux bactéroïdes (Ott et al., 2005).

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Chapitre I : Revue bibliographique

Figure 4: Etapes de la formation d'un nodule racinaire chez une légumineuse infectée par les rhizobia
(Madigan et Martinko, 2007).

Page 12
 Chapitre II
Matériels et méthodes
Chapitre II : Matériel et Méthodes

I-Isolement des bactéries et étude phénotypique des isolats

a)La collecte des nodules

La collecte est réalisée selon les techniques préconisées par Vincent, J.M. (1970) et
Somasegaran, P. et J. Hoben (1994). Il s’agit de creuser environ 15 cm autour de la plante et
20cm dans le sol pour extraire la plante et son appareil racinaire. Manuellement, on se
débarrasse de la terre au niveau des racines sans toutefois endommager les nodules. Les
racines avec leurs nodules sont lavées délicatement des restes de terre à l’eau de robinet

b) Conservation des nodules

Les nodules séchés au papier filtre sont conservés immédiatement au réfrigérateur à

4° C pour un usage immédiat. Pour une longue conservation, il est recommandé d’utiliser un
dessiccateur, le chlorure de Calcium (Ca Cl2) (Vincent, J.M., 1970) et la stérilisation des
nodosités (Figure 5)

Figure 5: Conservation des nodules (Vincent, 1970)

c)Stérilisation des nodules

Si les nodules sont conservés dans un agent dessicatif, ils sont auparavant mis dans
l’eau au réfrigérateur toute une nuit. Les nodules sont immergés 5 à 10 secondes dans
l’éthanol absolu puis transférés dans une solution de Chlorure de Mercure (HgCl2) acidifié à
0.1% (p/v) pendant 3mn, ensuite sont rincés 10 fois à l’eau distillée stérile
(Vincent, J.M.,1970).
d) Isolement des bactéries à partir des nodules
L’isolement est réalisé selon la méthode de Vincent, J.M. (1970). Les nodules stériles
sont écrasés individuellement dans une goutte d’eau distillée stérile dans une boite de Pétri
Page 14
Chapitre II : Matériel et Méthodes

stérile. L’opération est réalisée dans des conditions d’asepsie totale (hotte à flux laminaire,
pince flambée, …). A l’aide d’une anse de platine, flambée au bec Bunsen, le jus de nodule
est étalé sur boite de Pétri contenant un milieu spécifique, le milieu Yeast-Mannitol-Agar
(YMA, Vincent, J.M., 1970) additionné de rouge Congo (Annexes 1). L’ensemencement est
réalisé selon la technique des quatre cadrans de manière à avoir des colonies isolées et donc
faciles à caractériser.

Tableau 2: isolats et des souches de référence utilisée pour cette étude

Souches Plante- hôte Origine géographique Source

A ARhizobium sullae A6 Hedysarum Constantine, Algérie [Link]-

coronarium Constantine

Mez Mesorhizobium ciceri Cicer arietinum Constantine, Algérie S. Dekkiche- Cne

T1 Notre
V etude Phaseolus Skikda(Tammalous), Cette etude
coccineus Algérie
Notre etude Phaseolus Skikda(Tammalous), Cette étude
T2 coccineus Algérie
S1 Notre etude Phaseolus Guelma (Salah Salah Cette étude
coccineus Salah), Algérie

S2 Notre etude Phaseolus Guelma (Salah Salah Cette étude

coccineus Salah), Algérie

m1 Notre etude Phaseolus Guelma (Mdjez Cette étude

Coccineus Ammar), Algérie
m2 Notre etude Phaseolus Guelma (Mdjez Cette étude
coccineus Ammar), Algérie
B1 Notre etude Phaseolus El kol(benzouit), Cette étude
Vulgaris Algérie

b2 Notre etude Phaseolus Skikda(Benzouit), Cette étude

Vulgaris Algérie
z1 Notre etude Phaseolus Annaba (Boumaaza), Cette étude
Vulgaris Algérie

z2 Notre etude Phaseolus Annaba (Boumaaza), Cette étude

Vulgaris Algérie

Les bactéries isolées sont conservées sur milieu YMA (annexe 01) tamponné au CaCO3 à
4°C.

Page 15
Chapitre II : Matériel et Méthodes

I-2-Etudes des caractères morphologiques des isolats

I-2-1-Examen microscopique :

La coloration de Gram doit son nom au bactériologiste Danois Hans Christiane Gram
qui mit au point le protocole en 1884. Cette technique est l’une des méthodes de coloration les
plus utilisées, car elle permet de mettre en évidence les propriétés de la paroi bactérienne, et
d’utiliser ces propriétés pour les distinguer et les classifier : les bactéries dites Gram positif et
bactéries dites Gram négatif.

a) Etapes de la coloration des frottis

A partir des cultures fraîches en milieu YMB(Annexe 01) de chaque souche, la

préparation est étalée sur des lames en couche mince diluée dans une goutte d’eau distillée
stérile, séchée et fixée par la chaleur du bec bunsen sous la hotte .Puis colorer selon les étapes
suivantes :
-recouvrir la lame par un colorant basique le violet de Gentiane, laisser agir pendant 1min.
- Chasser le violet avec le Lugol pendant 30 secondes.
- Laver à l’alcool-acétone et le surplus de la solution décolorante est chassé par un lavage à
l’eau.
- Recouvrir la préparation par la Fuchsine, laisser agir durant 1 min.
-Un nouveau lavage à l’eau, puis on égoutte la lame sur du papier absorbant puis observer à
l’objectif 100 en mettant une goutte d’huile à immersion.

1 2-2 Examen macroscopique des isolats

a) La croissance des isolats sur le YMA

Le Yeast Mannitol Agar (YMA) et le YMA + rouge Congo sont des milieux
solides spécifiques pour la culture de Rhizobium (Vincent, 1970).
Les isolats et les souches de références sont cultivés sur ces deux milieux pour déterminer
leur aspect, la texture et la couleur des colonies.
Il est admis que seules les bactéries correspondant aux bactéries non différenciées en
bactéroïdes sont capables de pousser sur boîte de Pétri (Boivin-Masson et al. 2006).

Page 16
Chapitre II : Matériel et Méthodes

b) la vitesse se la croissance
Le bleu de Bromothymol est un indicateur coloré qui permet de mettre en évidence
une réaction acide ou basique dans une gamme de pH qui s’étend de 6 à 7.6. Une réaction
acide se traduit par le changement de coloration de BTB (annexe 01) vers le jaune, par contre
une réaction alcaline se traduit par le renforcement de la coloration bleu (El Hilali, 2006).

II-Recherche d’enzymes spécifiques à la nodulation

La recherche des enzymes spécifiques pour l’établissement de la relation symbiotique

(nitrate- réductase, uréase, pectinase et cellulase) et qui jouent un rôle lors du processus
d’infection (nodulation) des racines par les bactéries, elle est réalisée en cultivant les souches
sur milieux de culture contenant les substrats spécifiques de ces enzymes (Struffi et al., 1998)

II-1-Réduction des nitrates

Les bactéries sont mises en culture sur milieu liquide Tryptone-Yeast-Agar (TY)
(Behringer, 1974) (Annexes 01) contenant 0,1% de KNO3 (pv) pendant 5 jours avec
agitation. Au terme de l’incubation à chaque tube on ajoute les réactifs nitrate réductase 1
(Acide sulfanilique dans l’acide acétique 5M) et nitrate réductase 2 (-naphtylamine dans
l’acide acétique 5M). L’apparition d’une coloration rouge indique que les nitrates sont réduits
en nitrites. Un résultat négatif nécessite l’addition d’une pincée de zinc métallique et observer
après quelques minutes la teinte obtenue.

II-2-Hydrolyse de l’urée

Pour mettre en évidence la présence d’une uréase, les isolats et les souches témoins
sont cultivées sur le milieu YMA contenant 2% (p/v) d’urée et 0,012 g de rouge de phénol
comme indicateur de pH à 30 °C pendant 48 heures. La solution d’urée est stérilisée par
filtration (filtre 0,20µm) et rajoutée au milieu stérile maintenu à 45°C. La réaction positive est
indiquée par la présence de colonies alcalinisantes ou acidifiantes le milieu.

Page 17
Chapitre II : Matériel et Méthodes

II-3-Activité cellulosique

Les souches sont mises en culture sur le milieu YMA contenant 0.25% (p/v) de
Carboxy Methyl Cellulose (CMC) pendant 5jours .l’ensemencement sur le milieu YMA
se fait à partir de culture fraiche de YMB .Après incubation à 28°C, les colonies issues de ce
milieu sont rincées délicatement à l’eau courante puis remplies d’une solution de Rouge
Congo (1mg/ml) et incubées pendant 1h dans l’étuve à 28°C.
La solution colorante est remplacées par une solution de Nacl 1M, les boites sont laissées à
température ambiante pendant 30min puis vidées de cette solution.
Les colonies apparaissent sur fond rouge, avec un halo jaune orangé mettant en évidence
l’activité endoglucanasique.

II-4-Activité pectinolytique

Les souches bactériennes sont cultivées sur milieu YMA dont le mannitol est remplacé
par l’Inositol 0,1% et additionné de 0,2% de pectine (Na-polygalacturonate), puis sont
incubées à 28°C pendant 7 jours. Après incubation, les boites sont rincées délicatement avec
l’eau courante puis avec une solution de rouge de ruthénium 0,05% pendant 30mn. Un halo
décoloré autour des colonies indique une activité polygalacturonique.

III-la prestation symbiotique avec la plante hôte (test de nodulation)

II1-1-La croissance bactérienne

Des Erlens Meyers de 250ml contenant 120 ml de TY, sont stérilisés à l’autoclave à
120°C pendant 20mn. Une culture des souches est réalisée dans des Erlens Meyer de 250 ml
contenant 120ml de TY et qui serviront d’inoculums. Après incubation 5ml de cet inoculum
vont ensemencer 12 Erlens Meyers de 250ml contenant 100ml de TY.

La densité optique (D.O.600) est mesurée à chaque heure de temps durant 24h .l’étalonnage de
l’appareil s’effectue avec un milieu TY stérile (Somasegaran, 1994), la première mesure est
prise directement après l’inoculation du premier Erlen avec 5ml de la suspension bactérienne.

Par non disponibilité des Erlens Mayers, on a remplacé ces derniers avec par des flacons de
250ml (Figure 6).

Page 18
Chapitre II : Matériel et Méthodes

Figure 6: Flacons contiennent du TY

III-2 stérilisation des graines

Sous la hotte, les graines sont stérilisées à l’éthanol 95 % pendant 10 secondes, ensuite
la solution d’éthanol est remplacée par l’eau de javel diluée à 10% pendant 15 min. Les
graines sont ensuite rincées 10 fois avec l’eau distillée stérile. On les laisse imbibées dans le
dernier rinçage pendant 2 heures. (Figure 6)
Elles sont mises en germination sur des boites de Pétri en verre stériles contenant du coton
imbibé ; les boites enveloppées du papier aluminium et mises à germer dans l’obscurité à
température ambiante pendant 5 à 6 jours jusqu’un l’apparition des radicelles.

A B C

Figure 7:(A) : flacon remplis des graines de [Link] dans l’eau distillée stérile

(B): flacon remplis des graines de [Link] dans l’eau distillée stérile

(C): Boite de Pétri contient des graines stériles après leur scarification mécanique

Page 19
Chapitre II : Matériel et Méthodes

III-3 inoculation des jarres

La technique des jarres de Leonard selon la méthode de Vincent (1970) est utilisée
pour évaluer l’aptitude des isolats à former des nodules sur les racines de la plante hôte.

Ce test est réalisé en conditions bactériologiquement contrôlées, mettant en place les

deux partenaires « plante-bactérie » (Figure 9).

Dans cette étude, nous avons remplacée les jarres de Leonard par des flacons remplis
de la solution nutritive recouverts du papier aluminium pour favoriser l’obscurité totale.
Après une bonne germination des graines; ayant données des racines de 1 à 2 cm, sous la
hotte, les graines sont prélevées délicatement en utilisant une pince stérile et placées (graines)
dans chaque flacon à raison d’une graine par flacon contient d’une solution nutritive.

Enfin les flacons sont placés dans une chambre de culture à température ambiante avec
une luminosité contrôlée (Figure 8).

Figure 8: Flacon contient la solution nutritive

A l’apparition des premières feuilles, les plantes sont inoculées à raison de 1ml de la
suspension bactérienne en phase exponentielle de croissance (DO600≈ 1). Deux flacons ne
sont pas inoculés et serviront de témoin.

Page 20
Chapitre II : Matériel et Méthodes

On note que la plante en cause sera inoculée séparément par les souches de références.

Figure 9: flacon après leur inoculation

Page 21
 Chapitre III
Résultats et discussion
Chapitre III : Résultats et Discussions

I-Etudes des caractères morphologiques des isolats

I-1-Examen microscopique :
Pour vérifier que nos cultures bactériennes sont pures, une coloration de Gram est
réalisée, qui va permettre de visualiser les bactéries au microscope optique.
L’examen microscopique des cellules bactériennes révèle des cellules bactérienne
coccobacilles roses à Gram négatif (Beck, 1993) (Figure 10).

Figure 10: Observation microscopique des coccobacilles a Gram négatif (isolat S2) sous microscope
optique(x100)

1-2- Examen macroscopique des isolats

a)La croissance des isolats sur le YMA, YMA+ RC:

Après 24 heures d’incubation à 28°C, les isolats ainsi les souches de référence
présentent un aspect des colonies circulaire, convexe, légèrement relevé de texture crémeuse,
lisse et brillante (Figure A),d’autre part, les souches absorbent très peut le colorant tout en les
mettant sur milieu YMA+RC, Ceci est observé chez la plus part des rhizobia
(Jordan, [Link], 1970) (Figure 11 :B).

Figure 11: L’aspect des colonies :

(A): sur YMA (isolat Z2) (B): sur YMA+rouge Congo (isolat S2)

Page 23
Chapitre III : Résultats et Discussions

b) la vitesse de croissance

Tous nos isolats modifient le pH sur le milieu YMA+BTB après 24 heures

d’incubation, et cela s’est produit par l’acidification totale du milieu (virage au jaune), ce qui
indique que nos souches présentent une croissance rapide (Jordan, 1984 ; Beck et al, 1993;
Pagano, 2008) (Figure12).

Figure 12: test de la vitesse de croissance :

(A): avant incubation (Isolat T2) (B) : après 24h d’incubation

II-Recherche d’enzymes spécifiques à la nodulation

II-1-Réduction des nitrates

La transformation des NO-3 en ions NO-2 ne peut s’effectuer que sous l’action d’une
enzyme ; la nitrate réductase qui est présente chez tous les organismes susceptibles de
métaboliser le nitrate tels que les plantes, les champignons ainsi quelques espèces de levure et
les bactéries (Idrissi.2006).
Sur le milieu biologiques spécifique (TY+KNO3), touts les isolats ainsi les souches témoin
donnent une couleur rougeâtre, après l’addition des réactifs I et II du nitrate réductase, ou
incolore après l’ajout de la poudre de zinc. Ce qui prouve la présence de cet enzyme.
(Lindstrom et Lehtomâki .1988; Struffi et al 1998) (Figure 13).

Page 24
Chapitre III : Résultats et Discussions

Figure 13:test de nitrate réductase (résultat positive d’isolat m2)

II-2-Hydrolyse de l’urée

La mis en évidence de la capacité des Rhizobia à hydrolyser l’urée est initialement

décrit par Javis et al, 1977.
L’alcalinisation du milieu par les souches suite à une réaction hydrolytique d’urée qui se
traduit par un changement de couleur du milieu (rouge de Phénol est un indicateur de pH).
Le virage de couleur en rose violet indique que, tous nos isolats produisent une uréase sur
milieu spécifique additionné d’urée (Mobley, 1992) (Figure 14).

Figure 14:test de l’urease :

(A): boite témoin (B): résultats positive d’isolat T2

Page 25
Chapitre III : Résultats et Discussions

II-3-Activité cellulosique

Ce test permet de mettre en évidence la capacité des bactéries à décomposer la cellulose.

Une fois la solution de NaCl rejetée, un halo-jaune-orange apparais autour des colonies
indique la présence d’une endoglucanase (Lindstrom et Lehtomâki, 1988) (Figure A)
Ceci montre que les rhizobia produisent l’enzyme cellulase qui dégrade les ponts
glucidique de la paroi cellulaire des cellules végétales, ce qui facilité la pénétration des
rhizobia à travers les microfibres de la membrane cellulaire (Mateos et al, 1992.)
 Tous les isolats assurent une réaction positive sauf l’isolat m2 (Figure 15 :B)

Figure 15: test de pictinase

(A) : Résultats positif (isolat z2) (B): Résultats négatif (isolat m2)

II-3-Activité pectinasique

Après rinçage à l’eau et l’addition du rouge de ruthénium, tous les isolats possèdent
une activité polygalacturonasique (pectinase) qui se manifeste par l’apparition d’un halo
décoloré autour des colonies sur un fond rose fushia (figure16).
.

Figure16 : test de pictinase( résultats positif d’isolat z2)

Page 26
Chapitre III : Résultats et Discussions

III-La prestation symbiotique avec la plante hôte (test de nodulation)

III-1- Mesure de la croissance bactérienne

La détermination des courbes de survie nous a permet de prendre les isolats en leur
phase exponentielle dans une longueur d'onde de 600 nm qui peut être arrivée jusqu'à 1
(Beringer, 1974).

DO
D.O600

1,2

0,8

0,6

0,4 DO

0,2

0 t(h)
0 10 20 30 40 50 60

Figure 17: Courbe de croissance bactérienne de la souche témoin

- Mezorhisobium ciceri -
D.O600

1,2
DO
1

0,8

0,6
DO
0,4

0,2

0 t (h)
0 10 20 30 40 50 60

Figure 18: Courbe de croissance bactérienne de la souche témoin

- Rhizobium sullae -

Page 27
Chapitre III : Résultats et Discussions

D.O600
DO
1,2

0,8

0,6

0,4 DO

0,2

0 t(h)
0 10 20 30 40 50 60

Figure 19: Courbe de croissance bactérienne de la souche S2

DO
D.O600

1,4
1,2
1
0,8
0,6
DO
0,4
0,2
0
t (h)
0 10 20 30 40 50 60

Figure 20: Courbe de croissance bactérienne de la souche m2

Page 28
Chapitre III : Résultats et Discussions

DO

DO.600
1,2

0,8

0,6

0,4 DO

0,2

0
t(h)
0 10 20 30 40 50 60

Figure 21: Courbe de croissance bactérienne de la soucheT1

DO
D.O600

1,4
1,2
1
0,8
0,6
DO
0,4
0,2
0
t(h)
0 10 20 30 40 50 60

Figure 22: Courbe de croissance bactérienne de la souche B1

Page 29
Chapitre III : Résultats et Discussions

III-2-Test de nodulation

On note que les isolats donnent des nodules plus grands en forme de grappe alors les
autre souches rhizobiales: Mezo, donne très peut de nodules (1-3) et dont la taille réduite en
comparant avec les nodules produits par les isolats pour les deux espèces, alors A6 n’a
provoqué aucune infection racinaire (Figure 23)

Le résultat indique qu'il devrait être possible d’augmenter l’effet de nodulation et le

rendement du haricot en combinant des cultivars adaptés avec des souches appropriées de
rhizobia. Anthony et al, 2005.

Ce qui est prouvé par les travaux de Masson-Boivin et al. 2009 que la souche
bactérienne Sinorhizobium fredii capable de former des symbioses fixatrices d’azote avec
plus de 135 espèces des légumineuses.

(A) (B) (C)

Figure 23: (A):représentation des nodules chez la plante qu’il est inoculé avec la souche
-Mesorhizobium ciceri-
(B):représentation des nodules chez la plante qu’il est inoculé avec l’isolat B1
(C) : représentation des nodules chez la plante qu’il est inoculé avec l’isolat S2

Page 30
Conclusion
 Conclusion générale

Dans cette étude, nous avons procédé à une caractérisation des bactéries nodulant
deux espèces de la légumineuse de genre Phaseolus ([Link] et [Link]), provenant
des différentes régions algériennes. : Guelma, Skikda, Annaba, selon les techniques usuelles
propres aux rhizobia selon Vincent, 1970 ; Somasegaran et Hoben, 1994, Jordan, 1984.
Notre étude nous a permis de disposer d'une collection de 10 souches isolées de nodules
racinaires des plantes, qui ont été ensuite caractérisées en présence de deux souches de
référence.
L’ensemble des résultats obtenus concernant l’étude morphologique et culturale, ainsi
que l’examen microscopique, ont montré que l’ensemble des isolats présentent des caractères
comparables au genre Rhizobium.
En effet l’aspect, la couleur, la forme des colonies sur le milieu YMA, YMA+ rouge
Congo, la croissance rapide YMA+BTB peuvent nous orienter vers le genre Rhizobium
(Vincent, 1970 ; Jordan, 1984). Ces mêmes souches possèdent les enzymes nécessaires pour
infecter la plante et induire le processus de nodulation. Toutefois les prestations symbiotiques
ont montré toute une hétérogénéité dans la taille et la forme des nodules ainsi induits.
Les tests biochimiques montrent la disponibilité des enzymes spécifiques nécessaire
pour la symbiose chez les isolats examinées. Elles possèdent de la nitrate-réductase, enzyme
contribue à l’assimilation de l’azote minérale. Les souches sont pourvues d’une uréase ainsi
qu’une péctinase et une cellulase, qui sont impliqués dans le processus infectieux de la
symbiose Rhizobium-légumineuses, ils facilitent la pénétration des rhizobia à travers les fibres
par une dégradation des ponts glucidiques de la paroi cellulaire.
A travers ces résultats, nous pouvons admettre que nos isolats possèdent les enzymes
nécessaires pour la nodulation
Le test de nodulation a révélé que toutes les souches étudiées donnent des nodules au
niveau racinaires chez les deux espèces de la légumineuse (Phaseolus vulgaris et Phaseolus
coccineus), en revanche parmi les souches de références seule la souche Mezo a fait noduler
le genre Phaseolus.

Page 32
 Référence
bibliographique
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Référence webographique
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Page 40
Annexes
 Annexes

Annexe 01 :

Milieux de Culture et Solution Nutritive

Le milieu de culture YMB (Vincent, 1970) (g/l)

Mannitol 10

K2HPO4 0.5

Mg SO4 7H2O 0.2

NaCl 0.1

Extrait de levure 0.5

pH 6.8

°
La stérilisation du milieu se fait par autoclavage à 120 C pendent 20 min

Le milieu de culture YMA (Vincent, 1970) (g/l)

YMB 1000

Agar 18

pH 6.8

°
La stérilisation du milieu se fait par autoclavage à 120 C pendent 20 min

Le milieu de culture YMA + RC (Vincent, 1970) (g/l)

Solution stock de rouge Congo 10

YMB 1000

Agar 18

pH 6.8

Après l’ajustement de pH on ajoute 10 ml de rouge Congo (0.25 g rouge Congo dans 100 ml
d’eau distillée) puis on ajoute l’agar.
 Annexes

°
La stérilisation du milieu se fait par autoclavage à 120 C pendent 20 min

Le milieu de culture YMA + BTB (Vincent, 1970) (g/l)

Solution stock de BTB 10

YMB 1000

Agar 18

pH 6.8

Après l’ajustement de pH on ajoute 10 ml de bleu de Bromothymol (0.5 g BTB dans 100 ml

d’éthanol) puis on ajoute l’agar.

°
La stérilisation du milieu se fait par autoclavage à 120 C pendent 20 min

Le milieu de culture TY (Vincent, 1970) (g/l)

Tryptone 5

Extrait de levure 3

CaCl2 H2O 0.87

Agar 18

pH 6.8

°
La stérilisation du milieu se fait par autoclavage à 120 C pendent 20 min

La composition de la solution nutritive (Fahreus ,1957) g/l

CaCl2 0.100

MgSO4 7H2O 0.120

KH2PO4 0.100
 Annexes

Na2HPO4 2H2O 0.110

Citrate ferrique 0.005

*Solution stock des oligoéléments 1.0 ml

* Solution stock des oligoéléments : (g/l)

Solution des micro-éléments

H3BO3 2.86

MnSO44H2O 2.03

ZnSO47H2O 0.22

Cu5H2O 0.08

Na MoO42H2O 0.14

pH 6.8

°
La stérilisation du milieu se fait par autoclavage à 120 C pendent 20 min
 Annexes

Annexe 02 :

Tableau 3 : Mesure de la Croissance bactérienne(D.O600) de la souche témoin

- Mezorhisobium ciceri -

t(h) 0 2 4 6 8 24 26 28 30 32 48
DO 0,053 0,131 0,372 0,526 0,713 1,023 1,011 0,975 0,969 0,863 0,705

Tableau 4 : Mesure de la Croissance bactérienne(D.O600) de la souche témoin

- Rhizobium sullae -

t(h) 0 2 4 6 8 24 26 28 30 32 48
DO 0,043 0,114 0,379 0,507 0,749 1,027 1,04 1,047 1,048 1,044 0,862

Tableau 5 : Mesure de la Croissance bactérienne(D.O600) de l’isolat S2

t(h) 0 2 4 6 8 24 26 28 30 32 48
DO 0,06 0,134 0,414 0,589 0,666 1,073 1,064 1,06 1,054 1,046 0,891

Tableau 6 : Mesure de la Croissance bactérienne(D.O600) de l’isolat m2

t(h) 0 2 4 6 8 24 26 28 30 32 48
DO 0,01 0,107 0,33 0,468 0,695 1,143 1,149 1,153 1,162 1,152 0,903

Tableau 7 : Mesure de la Croissance bactérienne(D.O600) de l’isolat T1

t(h) 0 2 4 6 8 24 26 28 30 32 48
DO 0,044 0,161 0,434 0,578 0,653 1,02 1,04 0,976 0,905 0,894 0,754

Tableau 8 : Mesure de la Croissance bactérienne(D.O600) de l’isolat B1

t(h) 0 2 4 6 8 24 26 28 30 32 48
DO 0,042 0,109 0,352 0,549 0,734 1,147 1,183 1,198 1,2247 1,214 1,001
 Année universitaire : 2015/2016 Présenté par : Zouilekh Zahira
Ouadi Rayane

Détermination de la variabilité de l’effet de nodulation de la légumineuse Phaseolus

vulgaris et Phaseolus coccineus par différentes souches rhizobiales

Mémoire de fin de cycle pour l’obtention du diplôme de Master en Génétique Moléculaire.

Résumé

Parmi de nombreuses légumineuses, nous sommes intéressés au cours de ce travail à étudier la

biodiversité des bactéries nodulant les deux espèces du genre Phaseolus, ([Link] et [Link]), ce
dernier a une importance dans l’alimentation humaine vu sa richesse nutritionnelle.
Nous avons effectuées un isolement e t purification de 10 souches à partir des nodosités prélevés
de différentes régions de l’Est de notre payé.
La caractérisation des isolats porte sur une étude morphologique et culturaux suivie d’une caractérisation
phénotypiques qui basées sur la recherche d’enzymes spécifiques au processus de nodulation (le nitrate
réductase, l’uréase, le cellulase et le pectinase) en présence de souches témoins, Cette étude montre que toute
les souches présentent des caractères phénotypiques comparables aux Rhizobium.
Un test de nodulation est effectue en mettant en évidence l’aptitude des isolats et les souches de
références à noduler les racines de la plante hôte qui a montré après cinque semaines d’inoculation,
l’apparition des nodules au niveaux des racines secondaires des deux légumineuses([Link] et [Link])
les nodules ainsi induits montrent une hétérogénéité dans la taille.

Mots clés : Phaseolus, [Link], [Link], nodulation, Rhizobium, symbiose

Laboratoire de recherche : laboratoire de biotechnologie, Université des frères Mentouri

Constantine1
Jury d’évaluation :
Président du jury : Gharzouli Razika (Maitre de conférence classe B - UFM Constantine),
Rapporteur : Saoudi Mouna (Maitre assistante classe A - UFM Constantine),
Examinateur : Bechkri Sara (Maitre assistante classe A - UFM Constantine).

Date de soutenance : 21/06/2016