Principe de la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC)
Définition générale
La chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC, High
Performance Liquid Chromatography) est une technique analytique
permettant la séparation, l’identification, et la quantification des composants
d’un mélange complexe.
Principe de fonctionnement
L’HPLC repose sur la distribution différentielle des analytes entre deux
phases :
Phase mobile : un liquide sous haute pression.
Phase stationnaire : un matériau solide finement divisé contenu dans une
colonne.
Mécanisme de séparation
Sous l'effet de la pression, la phase mobile entraîne les molécules du mélange
à travers la colonne.
Chaque composant interagit différemment avec la phase stationnaire selon
ses propriétés physico-chimiques (polarité, taille, charge...).
Ces interactions déterminent le temps de rétention propre à chaque composé,
permettant leur séparation.
Modes de chromatographie
Selon la nature des analytes, plusieurs modes de chromatographie peuvent
être utilisés :
Phase normale : séparation basée sur la polarité.
Phase inverse : séparation dans une phase hydrophobe.
Échange d'ions : séparation basée sur les charges électriques.
Exclusion stérique (ou filtration sur gel) : séparation basée sur la taille
moléculaire.
Paramètres influents
Composition de la phase mobile (nature du solvant, pH, force ionique).
Nature de la phase stationnaire (type de colonne utilisée).
Détection des composés
La détection des composés séparés s'effectue en sortie de colonne grâce à
différents détecteurs :
Détecteur UV-Visible.
Détecteur fluorimétrique.
Détecteur par spectrométrie de masse.
Utilité de la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC)
Son utilité est multiple et touche à divers domaines scientifiques et
industriels :
Pharmaceutique
Analyse de la pureté des principes actifs (API).
Contrôle qualité des médicaments (quantification d'impuretés, test de
dissolution).
Études de stabilité et de biodisponibilité des formulations médicamenteuses
(FDA Guidance for Industry, 2018).
Biotechnologie et recherche biomédicale
Analyse des protéines, peptides, et acides nucléiques.
Quantification de biomarqueurs pour des applications diagnostiques.
Séparation des métabolites cellulaires dans les études métabolomiques
(Dong, 2006).
Industrie agroalimentaire
Détection et quantification d'additifs alimentaires, de vitamines et de
contaminants (pesticides, mycotoxines).
Analyse de la composition des boissons (caféine, sucres, polyphénols)
(Snyder et al., 2010).
Environnement
Dosage des polluants organiques dans l'eau potable, les sols, et l'air.
Analyse des résidus de pesticides et de produits pharmaceutiques dans
l’environnement (Richardson, S.D., 2003).
Industrie cosmétique
Contrôle qualité des ingrédients actifs (antioxydants, filtres solaires).
Analyse des produits finis pour vérifier leur conformité aux normes
réglementaires.
Industrie chimique
Analyse de la composition de polymères, solvants, et produits chimiques
industriels.
Séparation des composés du sirop de menthe par chromatographie sur
colonne :
Couleurs observées et justification scientifique
Lors d’une chromatographie sur colonne réalisée sur un sirop de menthe,
plusieurs zones colorées peuvent être observées pendant la séparation. Ces
couleurs résultent de la nature chimique des composés présents dans l’extrait,
principalement des pigments naturels et des colorants ajoutés.
Voici les couleurs généralement visualisées et leur justification :
Vert Justification : La couleur verte est principalement due à la
chlorophylle, si le sirop de menthe contient des extraits naturels de
menthe. La chlorophylle est un pigment lipophile (non polaire) qui migre
lentement si une phase stationnaire polaire (comme la silice) est utilisée.
Bleu-vert ou bleu Justification : Le bleu peut provenir de colorants
alimentaires artificiels souvent ajoutés aux sirops industriels, comme le
bleu patenté V (E131) ou le bleu brillant FCF (E133). Ces colorants sont
hydrophiles et migrent rapidement dans des systèmes polaires.
Jaune Justification : Le jaune pourrait indiquer la présence de flavonoïdes
(tels que la lutéoline) ou de colorants alimentaires jaunes (E102,
tartrazine). Les flavonoïdes sont légèrement polaires et présentent une
migration intermédiaire.
Incolore à légèrement jaunâtre Justification : Certaines fractions du sirop,
notamment les sucres (glucose, fructose) et les acides organiques (ex:
acide citrique), n'ont pas de couleur visible. Cependant, après
pulvérisation d'un révélateur comme la vanilline-sulfurique ou
l'anisaldéhyde, elles peuvent apparaître sous des teintes jaunâtres ou
brunes.
Résumé en tableau :
Couleur observée Composé probable Justification principale
Pigment lipophile extrait de
Vert Chlorophylle naturelle
la menthe
Colorants alimentaires Additifs hydrophiles utilisés
Bleu ou bleu-vert
(E131, E133) dans l'industrie
Pigments végétaux ou
Jaune Flavonoïdes, tartrazine
additifs
Incolore/Jaunâtre Sucres, acides Constituants non
organiques chromophores
Références principales :
Willstätter R., Stoll A., Untersuchungen über Chlorophyll, 1913
Boon, C.S., et al., Food Colourants: Chemical and Functional Properties, CRC
Press, 2010
Kong, J.M., et al., Analysis and Biological Activities of Flavonoids,
Phytochemistry Reviews, 2003
Sherma, J., Review of Detection Techniques for Thin-Layer Chromatography,
Journal of AOAC International, 2000
Dong, M.W. (2006). Modern HPLC for Practicing Scientists. Wiley.
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Dolan, J.W. (2010). Introduction to Modern Liquid
Chromatography. Wiley.
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FDA (2018). Guidance for Industry - Bioanalytical Method Validation.