T.
P n°5
d’immunologie et
de technologie
immunologique :
Purification
des
anticorps
polyclonaux
Réalisé par :
Fatma Ezzahra
Jilani
2024/2025 Hamdani Amal
Bio 2 G3A
INSAT
Plan :
1) Différentes méthodes de purification
d’anticorps
2) Les techniques de clonage des
anticorps
3) la production des anticorps
monoclonaux
4) Fonctions des Ig
1. Différentes méthodes de
purification d’anticorps
1) La chromatographie d’affinité :
La chromatographie d’affinité est largement utilisée dans
l’industrie pour la purification des anticorps monoclonaux. Elle
repose sur l’interaction spécifique entre les anticorps et des
protéines bactériennes comme la protéine A, mais aussi G et L, qui
servent de ligands.
Ces protéines sont issues des parois cellulaires de bactéries : la
protéine A provient de Staphylococcus aureus, tandis que les
protéines G et L sont dérivées de certaines souches de
streptocoques. Elles ont une masse molaire d’environ 50 000
g/mol et présentent une forte affinité pour le fragment Fc des
anticorps de type IgG, qu’ils soient monoclonaux ou
polyclonaux.
Pour exploiter cette affinité, les protéines A, G ou L (souvent
**produites de façon recombinante par E. coli **) sont fixées sur
un support poreux sous forme de billes, généralement constitué
de gel d’agarose ou de résine de polystyrène-divinylbenzène.
Ce système permet d’obtenir un grand nombre de sites de
fixation par unité de volume, ce qui contribue à réduire la taille
des installations tout en maintenant une efficacité de purification
élevée.
Spécificités des protéines utilisées :
• La protéine A se lie fortement aux IgG1, IgG2 et IgG4 humaines,
mais peu ou pas aux autres types d’immunoglobulines, comme
IgG3, IgA, IgD, IgE ou IgM.
• La protéine G a un spectre de liaison plus large, puisqu’elle
peut fixer un plus grand nombre de sous-classes d’Ig, tout en
excluant l’albumine, ce qui en fait un outil complémentaire à la
protéine A.
• La protéine L, quant à elle, se lie à la région variable kappa des
chaînes légères (d’où son nom), ce qui lui permet d’interagir
avec certains anticorps ou fragments d’anticorps qui ne sont pas
reconnus par les protéines A ou G.
Chaque molécule de protéine A est capable de fixer deux molécules
d’IgG.
La liaison des anticorps au ligand se réalise à pH supérieur à 6,
généralement dans un tampon phosphate de sodium à 0,02 M, pH
7,0.
L’élution des anticorps est ensuite obtenue par abaissement du pH,
entre 3 et 6, à l’aide d’un tampon acide citrique à 0,1 M, pH 3,0, ce
qui permet de rompre les interactions entre anticorps et ligand.
Avantages Inconvénients
Haute spécificité (pureté >95 % en Coût élevé des résines (ex : protéine
une étape) A)
Rendement élevé Risque de dénaturation lors de
l'élution acide
Adaptée aux grandes échelles Nécessite un ligand stable
(industrielle) (dégradation possible)
jjnjhvjkbn
2)La chromatographie échangeuse d’ions :
Elle repose sur l’interaction électrostatique entre des groupes
chargés sur la surface de la résine chromatographique (appelée phase
stationnaire) et les groupes chargés sur les protéines (comme les
anticorps).
Deux types :
• Échangeuse d’anions (AEX) : capte les protéines chargées
négativement.
• Échangeuse de cations (CEX) : capte les protéines chargées
positivement.
3. Stratégies courantes :
1. Échange de cations (CEX) – très courant après la protéine A :
• pH < pI de l’anticorps → anticorps chargé positivement → il se
lie à une résine CEX.
• Impuretés qui ne se lient pas sont éliminées en flux direct.
• Élution par augmentation du sel ou changement de pH.
2. Échange d’anions (AEX) :
• Utilisé pour enlever les impuretés acides, l’ADN, les
endotoxines, etc.
• L’anticorps peut s’écouler en flux direct sans se fixer (mode
"flow-through").
Avantages Inconvénients
Haute capacité (bonne pour Moins spécifique que l'affinité
production)
Coût modéré (résines réutilisables) Optimisation nécessaire (pH, force
ionique)
Élimine les agrégats et contaminants Peut nécessiter une étape
supplémentaire (dialyse/é[Link])
3)Purification d'anticorps à l'aide de protéines se liant
aux anticorps :
Pour purifier les anticorps, on utilise souvent des protéines comme la
protéine A, la protéine G ou la protéine L. Ces protéines sont issues
de micro-organismes et ont la capacité de se lier spécifiquement aux
immunoglobulines (Ig) des mammifères.
• Protéine A et Protéine G : elles se fixent avec une grande
affinité sur la région Fc des Ig, en particulier les IgG, chez
différentes espèces.
• Protéine L : elle se lie différemment, en interagissant avec la
chaîne légère kappa des anticorps.
Ces protéines sont très utiles pour purifier, capturer ou détecter les
anticorps. En laboratoire, on les fixe généralement sur des supports
solides comme des billes de sépharose ou billes magnétiques, ce qui
permet de les manipuler facilement lors des étapes de purification.
Purification avec la protéine G
Cette méthode est très efficace pour purifier aussi bien les anticorps
monoclonaux que polyclonaux, quelle que soit leur origine.
Elle permet d’obtenir plus de 90 % de récupération de la fraction IgG
à partir de sérum, de liquide d’ascite ou de surnageant de culture
cellulaire.
Purification avec la protéine A
La méthode utilisant la protéine A est assez similaire à celle avec la
protéine G. Elle permet aussi de récupérer environ 90 % des IgG.
Le choix entre protéine A ou G dépend surtout de l’isotype de
l’anticorps que l’on souhaite purifier, ainsi que de l’espèce d’origine
(par exemple : souris, lapin, humain…).
2. Les techniques de clonage des
anticorps
Technique Principe Source Type de Avantages Inconvénie
d’anticorps clonage nts
Hybridome Fusion d’un Souris (le In vivo Production stable Nécessite
lymphocyte plus d’anticorps immunisati
B avec une souvent) monoclonauxTec on
cellule de hnique bien animalePas
myélome établie directement
humain
Clonage par RT-PCR des Humain ou In vitro Production Nécessite
ADNc (cDNA) gènes animal rapideCompatibl des cellules
VH/VL à (sang, rate) e avec expression B viables et
partir recombinante bien
d’ARNm des caractérisée
cellules B s
Phage display Affichage de Bibliothèque In vitro Très grande Nécessite
fragments synthétique/ diversitéSélectio criblage in
d’anticorps à humaine n cibléeSans vitroFragm
la surface de immunisation ents (non
phages Ig
complètes)
Clonage à Séquençage Cellules B In vitro Permet d'obtenir Technique
cellule unique des gènes humaines des anticorps coûteuse et
d’Ig d’une isolées naturels très complexeB
cellule B spécifiques (ex : asée sur
isolée post-infection) technologie
(FACS + s avancées
RT-PCR)
Clonage par Modification Gènes In vitro Permet Requiert
recombinaiso ciblée des clonés ou l'ingénierie fine expertise
n/CRISPR gènes d’Ig lignées (affinité, en biologie
pour cellulaires humanisation, moléculaire
humanisatio etc.) Plus long et
n ou technique
optimisation
Les techniques in vitro permettent un meilleur contrôle, souvent sans recours aux animaux.
Les méthodes modernes (phage display, single-cell) sont essentielles pour le
développement d’anticorps thérapeutiques humains (ex : anticorps contre le SARS-
CoV-2).
Le clonage recombiné permet l’ajout de mutations pour améliorer spécificité ou stabilité.
3. La production des anticorps
monoclonaux
C’est quoi un anticorps monoclonal ?
Un anticorps monoclonal est un anticorps identique, produit
par un seul clone de cellules. Il reconnaît un seul épitope (c’est-à-
dire une seule zone spécifique d’un antigène).
Contrairement aux anticorps polyclonaux (mélange d’anticorps
reconnaissant plusieurs épitopes), les monoclonaux sont très
spécifiques et reproductibles — parfaits pour la recherche, le
diagnostic ou la thérapie.
Les étapes :
Étape Description
1. Immunisation de L’animal (généralement une souris) reçoit plusieurs
l’anima injections de l’antigène ciblé afin de stimuler la
production d’anticorps spécifiques.
2. Prélèvement des Après une réponse immunitaire suffisante, on prélève la
lymphocytes B rate de l’animal. Elle contient des lymphocytes B
producteurs d’anticorps.
3. Fusion cellulaire Les lymphocytes B sont fusionnés avec des cellules
(formation des tumorales (myélome) immortelles à l’aide d’un agent de
fusion (ex : PEG). Cela donne des hybridomes : cellules
hybridomes)
capables de produire un anticorps spécifique et de se
diviser indéfiniment.
4. Sélection dans le Le mélange cellulaire est cultivé dans un milieu sélectif
milieu HAT (HAT). Ce milieu ne permet la survie que des cellules
fusionnées (hybridomes).
5. Isolement des Chaque hybridome est isolé dans un puits séparé
clones (clonage) (souvent par dilution limite) pour s’assurer qu’il
provient d’un seul clone cellulaire.
6. Dépistage (screening) On teste chaque clone pour vérifier qu’il produit un
anticorps spécifique à l’antigène (par ex. avec un test
ELISA). Seuls les clones positifs sont gardés.
7. Expansion des clones Les hybridomes producteurs d’anticorps d’intérêt sont
multipliés pour produire l’anticorps à plus grande
échelle, en culture cellulaire.
8. Purification des Les anticorps monoclonaux sont purifiés (souvent via
anticorps chromatographie sur protéine A ou G). On obtient un
produit pur et fonctionnel.
9. Humanisation Si l’anticorps est destiné à une application thérapeutique
(option) chez l’humain, on peut modifier sa structure pour la
rendre plus “humaine” afin d’éviter des réactions
immunitaires.
4 . Fonctions des Ig
Classe Localisation Fonctions majeures Remarques
d’Ig principale
IgG Sang, lymphe, liquide - Neutralisation des toxines/virus- La plus abondante
extracellulaire Opsonisation- Activation du dans le sang (~75%)
complément (voie classique)-
Passage transplacentaire
(protection fœtale)
IgA Muqueuses (intestin, - Immunité des muqueuses- Forme dimérique
voies respiratoires, Neutralisation sans inflammation- dans les sécrétions
salive, larmes, lait Protection du nouveau-né via lait (avec chaîne J)
maternel) maternel
IgM Sang, lymphe (peu - Première réponse immunitaire- Pentamérique dans
dans les tissus) Forte activation du complément- le sérum → forte
Récepteur BCR sur les avidité
lymphocytes B naïfs
IgE Fixée sur les - Défense antiparasitaire Dégranulation des
mastocytes et (helminthes)- Médiation des mastocytes :
basophiles (tissus) réactions allergiques (type I) histamine, etc.
IgD Surface des - Co-récepteur du BCR (avec Très faible
lymphocytes B IgM)- Rôle encore mal compris concentration
immatures sérique
IgG = mémoire immunitaire, opsonisation, complément, passage placentaire.
IgA = barrière muqueuse, sans inflammation.
IgM = première ligne de défense, complément.
IgE = allergies, parasites.
IgD = maturation des lymphocytes B (fonction encore étudiée).