DEPARTEMENT DE FORMATION

EN PROTECTION DES VEGETAUX

Niamey BP 12625 - Niger

Rapport de stage

DES TECHNICIENS SUPERIEURS

EN PROTECTWN DES VEGETAUX

1996

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THEME : INITIATION A LA NEMATOLOGIE : APPLICATION AUX

CULTURES MARAICHERES
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STAGIAiRF . Aiiou DIONGUE

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PERIODE : du 07-10-96 au 07- i2-96

RESPONSABLE &E STAGE : i>r. T. MATEILLE

Chercheur en Nématoins$e
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DEPARTEMENT DE FORMATION
EN PROTECTION DES VEGETAUX
Niamey BP 12625 - Niger

Rapport de stage

DES TECHNICIENS SUPERIEURS

EN PROTECTION DES VEGETAUX

1996

THEME : INITIATION A LA NEMATOLOGIE : APPLICATION AUX

CULTURES MARAICHERES

STAGIAIRE : Aliou DIONGUE

PERIODE : du 07- 1O-96 au 07- 12-96

LIEU DE STAGE : ORSTOM/LABORATOIRE de NEMATOLOGIE

DAKAIUSENEGAL

RESPONSABLE DE STAGE : Dr. T. MATEILLE

Chercheur en Nématologie

Fonds DocumentaireORSTOM
Cote: &6 IC, 312 Ex:
1.-t PL.-=
p/
 SOMMAIRE
***

-Remerciements
-Sigles et Abréviations
-Résumé

I/ INTRODUCTION 1

III GENERALITES 3

2. 1 Présentation du Sénégal 3

2. 1. 1 Gcographie - climat - hydrographie 3

2. 1. 3 Démographie et Economie

2. 2 Structure d’accueil 4

3-. 3-. 1 Présentation del’ORSTOM 4

3. 3. 2 L’Organigramme 5

3-. 3-. -3 Les centres de recherche 6

2. 2. 4 Présentation du laboratoire de nématologie 6

2. 3 Les principales contraintes phytosanitaires 7

III/ ETUDES REALISEES DANS LE CADRE DU THEME 9

3. 1 Revue bibliographique sur les nématodes parasites des cultures

maraîchères 9

3. 1. 1 Problématique nématologique 9

3. 1. 2 Nématodes à galles des cultures maraîchères: Cas de Mefoidogyne 10

3. 1. 2. 1 Introduction 10

3. 1. 2. 3 Description 10

3. 1. 2. 3 Position systèmatique 11

3. 1. 2. 4 Morphologie 11

3. 1. 2. 5 Biologie et cycle de développement 13

3. 1. 3. 6 Pathogénie 13

3. 1. 2. 7 La lutte 15
 - _.-

3. 2 Etudes pratiques: Techniques nématologiques 18

3. 3. 1 Diagnostic nématologique 18

3. 2. 3 Echantillonnage 1X

3. 3. 3 Extraction des nématodes 18

3. 2. 4 Identifïcation de quelques genres de nématodes au Stéréomicroscope 32

3. 3. 5 Comptage 23

3. 3. 5. 1 Résultats des analyses nématologiques sur les parcelles de

TROPICASEM 33

3. 3,. 5. 3 Distribution des genres de nématodes 33

3. 3. 5. 3 Discussion sur les résultats 33

3. 3. 6 Coloration des racines au Lactophénol l’uschine 36

3. 3. 7 Electrophorèse des estérases de Meloidogyrze 26

3. 3. 8 Montage pour collection de quelques specimens de nématodes 30

IV/ CONCLUSION GENERALE ET RECOMMANDATIONS 33

BIBLIOGRAPHIE

ANNEXE
--.-“-.-” -1

SIGLES ET ABRtiVIATIONS

C.D.H. Centre pour le Développement de I’Horticulture.

C.E.E. Communauté Economique Européenne

D.F.P.V. Dcpartement de Formation en Protection desvégétaux

D.R.P.F. Direction de Recherche et de Production Forestière

D.I.S.A. Division des Investigations et Statistiques Agricoles

D.P. V. Direction de la Protection des Végétaux

F.P.G. Formol-acide Propionique-Glycérine.

GIS-LINNÉ Groupement d’intérêt Scientifique- Lutte INtégrée et NÉmatologie

H30A Eau distillée.

1.E.R Insu tut d’Économie Rurale.

I.S.R.A. Institut Sénégalais de Recherches Agricoles

Jl, 52 Juvenile de premier stade , Juvénile de deuxième stade

P.I.B. Produit Intérieur Brut

M.A.A. Milieux et Activité Agricole

mA miiliampère.

O.P.A.N. Organismes Parasites et Antagonistes des Nématodes

O.R.S.C. Office de la Recherche ScientifiqueColoniale.

ORSOM Office de Recherche Scientifique d’ Outre Mer

ORSTOM Intitut Français de Recherche Scientifique pour le Développement en

Coopération

q.s.p. quantité suffisante pour

r. m. rythme de migration.

S.P.V. Service de la Protection des Végétaux

TROPICASEM : Société de Production des Semences Maraîchère.s@ariétéstropicales)

T.S.P.V. Technicien Supérieur en Protection des Végétaux

U.C.A.D. Université Cheikh Anta Diop

V Volt
 Remerciements

A tous ceux qui m’ont aidé durant l’élaboration de ce rapport, j’exprime ma profonde
reconnaissance.

Je prie Monsieur Ph. MATHIEU, représentant de 1’ORSTOM au Sénégal, de vouloir

bien agréer l’hommage de ma gratitude pour m’avoir accueilli au sein de l’institut.

J’exprime ma reconnaissance la plus vive à Monsieur T. MATEILLE, mon maître de

stage pour ses précieux conseils, ses suggestions et sa disponibilité qu’il n’a cessé de m’accorder
durant toute la durée du stage, malgré ses multiples occupations.

J’adresse à Monsieur S. B. NDIAYE, mes vifs remerciements, pour m’avoir éclairé des
enseignements profondément imprégnés d’une science qui a pour nom : la taxonomie.

Je dois à Mlle Ndéye Khady KEBE et à Mme Anna Marthe KONTE mes remerciements
pour la frappe et la présentation de ce rapport sous cette forme claire et ordonnée.

Que soient également remerciés tous les étudiants de 3éme cycle et tous les techniciens
du laboratoire pour leur collaboration franche et sincére durant tout le délai du stage.

Je pense notamment à :
M. T. DIOP, KH. SENGHOR, ND. NDIAYE, S. FOULD, E. PATE.
L. DIEDHIOU, J. LOPEZ, M. SAGNA, R. SARRA, H. DIOUF, Y. DIABANG, J.
H. DIEME.
Mais aussi et surtout à J. CHAUDRON pour sa disponibilté face à toutes mes
sollicitations matérielles.
 RESUME

Les nématodes du genre Meloidogyne (Goeldi, 1892) constituent un groupe important

dans les régions de production maraîchère du Sénégal où leur virulence et leur large spectre
d’hôte en font un parasite redoutable.

L’association de cette espèce à des baisses de rendement justifie l’attention particulière

qu’accorde le laboratoire de nématologie de l’Institut Français de la recherche Scientifique pour le
Développement en Coopération (ORSTOM) à une recherche d’alternatives nouvelles pour le
contrôle de ce nématode.

Ce stage fût orienté à l’étude (la description, la morphologie, la biologie, la lutte...) de ce

genre, ainsi que les techniques nématologiques appliquées depuis l’échantillonnage, l’extraction
jusqu’à la reconnaissance des espèces de Meloidogyne par électrophorèse monodimensionnelle
d’isoenzymes et des montages de spécimens sur Lame de Cobb.
 1

1. INTRODUCTION

A l’issue de la lère année d’études, le Département de Formation en protection des

Végétaux (DFPV) envoit ses étudiants dans leur pays respectif pour un stage de contact et
d’imprégnation.
C’est donc dans ce cadre que s’inscrit ce stage de neuf (09) semaines passé au laboratoire de
Nématologie de 1’ ORSTOM à Dakar.

Ce stage, effectué au Département Milieux et Activité Agricole (MAA) sous le

programme “Organismes Parasites et Antagonistes des Nématodes” (OPAN) avait comme thème
: INITIATION à la NEMATOLOGIE : APPLICATION aux CULTURES MARAICHERES.

L’application aux cultures maraîchères se justifie dans un pays comme le Sénégal où sa

production maraîchère annuelle de 120000 tonnes de légumes (source Ministère Développement
Rural du Sénégal) est fortement menacée par une population de Meloidogpne dont sa fréquence
et sa dominante dans les quatre grandes zones maraîchères du Sénégal (la région du Cap-Vert,
les Pays séréres, les Niayes et la Vallée occidentale du Sénégal) sont confirmées par une
prospection effectuée en 1993 par l’équipe du laboratoire de Nématologie.

Le programme OPAN s’applique à étudier les facteurs telluriques biotiques et abiotiques

auxiliaires des organismes parasites et antagonistes des nématodes phytoparasites mais aussi à
des études :
- D’estimation faunistique des nématodes parasites des cultures maraîchères et de caractérisation
des espèces.
- De contraintes parasitaires (nématodes, champignons, virus) en culture maraîchère.
- De la diversité des systèmes de cultures maraîchères et des contraintes d’application des
méthodes de lutte contre les nématodes.

Dans ce rapport sont étudiées et décrites certaines techniques nématologiques appliquées

au laboratoire pour l’étude des Meloidogyne , les résultats obtenus après l’extraction des
échantillons, la conclusion et les recommandations.

Toutefois en prélude sont décrits ces points suivants :

- Généralités sur le Sénégal
- La présentation de la structure d’accueil
- Les études bibliographiques de Meloidogyne spp
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.
II. GENERALITES

2. 1. Présentation du Sénégal

2. 1.1. Géographie - climat - hvdrowaphie

A. Situation géograuhiaue

Le Sénégal est situé à l’extrémité Ouest du continent africain entre le 12”30 et 16”30 de
latitude Nord et entre le Il”30 et le 17”30 de longitude Ouest.

Il est limité au Nord par la République Islamique de Mauritanie, à l’Est par la

République du Mali, au Sud par la République de Guinée et la Guinée Bissau, et à l’Ouest par
l’Océan Atlantique sur une bande de 700 km.
Sa superficie totale est de 197161km2.

A part la région du sud-est où le relief est quelque peu accidenté, sans que l’altitude ne
dépasse toute fois 581 m au point culminant des contreforts du Fouta Djalon, le Sénégal est un
pays plat ne s’élevant pas au-dessus de 130 m (Anonyme, 1984), les sols sont de type Dior
(sableux) ou Deck (argileux).

B. Climat

Le climat est caractérisé par l’existence de deux saisons :

une saison sèche, relativement longue s’étalant du mois de Novembre à Mai,
et une saison des pluies (Hivernage) qui s’étend de Juin à Octobre.

Il est fortement influencé par la latitude (pluviométrie) et la proximité de l’Atlantique

(atténuant les températures moyennes et les amplitudes thermiques). Les précipitations croissent
du Nord au Sud, déterminant ainsi différentes zones climatiques : (Annexe 1 a)
la zone côtière à 1’ Ouest qui est sous l’influence maritime,
la zone septentrionale à climat sahélien (moins de 350 mm),
la zone centrale à climat sahélo-soudanien (350-500 mm),
la zone sud-est (Sénégal oriental) au climat de type soudanien (500-800 mm),
et la zone méridionale avec un climat de type soudano-guinéen qui est la plus humide des
régions où les précipitations annuelles peuvent atteindre 1000m (Chamard et Sall. 1973).
 4

C. Hvdrogranhie

Les principales ressources en eau de surface sont (Gueye, 1992) :

- le fleuve Sénégal avec 700 km de long pour un volume d’eau mobilisable de 4 à 5 milliards de
m3 par an.
- le fleuve Gambie : 750 km dont seule la vallée moyenne est au Sénégal sur 300 à 400 km,
- la Casamance : 300 km entièrement à l’intérieur du territoire
- 1’Anambé : affluent dont une fraction seulement du bassin versant est au Sénégal
- le Sine et le Saloum : anciennes vallées mortes envahies par la mer sur plus de 130 km
- les mares temporaires qui se remplissent en hivernage constituent des sources d’eau non
négligeables.

2. 1.2. Situation démowanhiaue et économiaue

La population du Sénégal est estimée à environ 7 millions d’habitants (7.000.000) pour

une densité de 36 habitants au km 2 9 le français est la langue officielle. L’économie sénégalaise
est dominée par le secteur primaire où l’agriculture représente l’activité la plus importante. Elle
contribue à 25% au produit intérieur brut (P. 1. B) et mobilise 70% de la population active.
Les principales cultures pratiquées au Sénégal sont : l’arachide, le coton, les céréales (mil,
sorgho, maïs et riz), le niébé et les cultures maraîchères dont une grande partie est destinée à
l’exportation.

Ainsi la production s’élevait en 1994 à 718125 tonnes pour l’arachide, 38769 tonnes pour
le coton, 28928 tonnes pour le niébé et 943370 tonnes pour toutes les céréales confondues
(DISA, 1995).

2.2. Structure d’accueil

2.2.1. Présentation de I’ORSTOM

1943 marque la date de création de l’Office de Recherche Scientifique Coloniale

(ORSC). Il avait comme grands objectifs : orienter, coordonner et contrôler les recherches
scientifiques aux colonies par la mise sur pied d’un programme de recherche. Dans le domaine de
la production agricole figuraient la forêt, l’agriculture et l’élevage.
 5

Jusqu’aux années 50, les chercheurs et techniciens dc 1’ORSC puis de l’Office de la

Recherche Scientifique et Technique Outre-mer (ORSTOM) étaient envoyés en mission dans les
différents sites d’action de l’office. Mais de nos jours, une grande partie des activitks de recherche
de 1’ORSTOM est bas& sur des accords par des partenaires extérieurs (Instituts de Recherche,
Universités, Ministères, Organisations internationales ect...). Le travail des chercheurs de
1’ORSTOM à l’étranger est rkgi depuis 1%X) par des accords-cadres avec les pays concernés.
Présentement certains programmes sont menés dans lc cadre de conventions particulières et
touchant différents domaines de la recherche (syst2mc.s physiques, biologiques, ressources
naturelles, certaines maladies, systèmes sociaux, l’économie informelle etc..).

2. 2. 2. L’orc3nipraninie

Direction de I’ORSTOM au SENEGAL -

Nutrition

I , I

[Laboratoirys de recherche 1 Service administratif et financier

Secrètariat
Administration
Comptabilité
Personnel
Sewkariat comptable
Informatique

Sevices scientifiques
Ecologie Végétale colllIlllII1s

Microbiologie laboratoire commun d’analyse

Nématologie Electrc,niquc
Ornithologie Cartographie

Service de documentation
 6

2.2.3. Les Centres de recherche

En 1953,l’ORSTOM est en plein essor en Afrique noire. Les instituts de recherche sont
implantés en Afrique équatoriale, alors française, au Congo, au Tchad, au Cameroun... En
Afrique de l’Ouest, l’implantation principale est à Adiopodoumé (Côte-d’Ivoire). Deux centres qui
voient le jour à Dakar, l’un de pédologie et l’autre de géophysique. Mais présentement,
1’ORSTOM à Dakar s’est attaché à étudier un grand nombre de domaines (voir les différentes
sections de l’organigramme) répartis dans 2 sites : celui de Hann et celui de Bel-Air où nous
avons le laboratoire de Nématologie, lieu de mon stage.

2.2.4. Présentation du laboratoire de Nématologie

Historiaue

Le laboratoire de Nématologie de Dakar Bel-Air, situé dans le centre ORSTOM/ISRA a

été créé en 1970. 11 s’ est d’abord orienté vers l’inventaire des nématodes de la zone soudano-
sahélienne. Environ 70 espèces de nématodes phytoparasites ont été observées au Sénégal dont
20 y ont été décrites pour la première fois par des techniques telles que : la morpho-biométrie,
électrophorèse, les plaques périnéales et l’utilisation de gammes de plantes hôtes.

Le programme (défini dans le paragraphe “Introduction”)

Les structures de collaboration sont :

- La Faculté des Sciences de l’Université Cheikh Anta Diop (UCAD), Département de Biologie
Animale. La collaboration repose sur la taxonomie , l’ultrastructure, les techniques
électrophorétiques et des échanges d’idées dans le cadre du Groupement d’intérêt Scientifique-
Lutte Intégrée et Nématologie (GIS-LINNE).
- L’Institut Sénégalais de Recherche Agricole depuis 1980. La collaboration repose sur l’étude de
la typologie des systèmes de culture, l’étude des complexes parasitaires et l’application de
nouvelles techniques défavorables aux nématodes
* Le Centre pour le Développement de 1’Horticulture (CDH) : la collaboration repose sur la
mycologie, l’entomologie, la phytotechnie et la lutte intégrée.
* La Direction de la Recherche et de la Production Forestière (DRPF), la collaboration repose sur
des études microbiologiques.
- La Direction de la Protection des Végétaux (DPV) : dans le cadre du GIS-LINNE pour les
transferts de technologie
 7

- au Sahel le laboratoire collabore avec :

* L’Institut d’Economie Rurale (IER) au Mali dans le cadre du projet CEE biodiversité et
développement durable.
* Le service de la Protection des Végétaux (SPV) de Bobo Dioulasso au Burkina Faso dans le
cadre du projet CEE Biological contrôl of root-knot-nematodes.

2.3. Les r>rincbales contraintes Dhvtosanitaires

D’après le bilan de la campagne phytosanitaire 1995-1996 de la Direction de la

Protection des Végétaux (DPV). Le Sénégal se caractérise par la présence de nombreux
organismes nuisibles d’importance variable selon les zones agro-écologiques et la physionomie
des hivernages. Parmi ces principales contraintes on peut signaler :
- Des infestations de divers sauteriaux dont l’espèce la plus redoutée : Oedaleus senegalensis à
des densités de 30 individus/m2 dans la zone centre du pays. Elle est en association avec les
chenilles, les iules et les pucerons ; ils causent des défoliations en début et milieu de cycle des
cultures.
- Des pourritures et avortements de panicules causés par des attaques de mineuses, foreurs sur
céréales.
- Un dépérissement de certaines plantes dû à des attaques de pucerons et cochenilles.
- Des dégâts d’oiseaux granivores (Queleu quelea) sur céréales et sur parcelles de riz jouxtant le
casier sucrier (Richard-Toll) et les départements de Podor et de Matam.
- Quelques maladies cryptoganiques : charbon et mildiou du mil ont été observées sur des
superficies très réduites à Fatick.
- Des populations de rats sur tomate et riz maîtrisés grâce à une dératisation continue par
appâtage.

Une apparition brutale de la cochenille farineuse Rastrococcus invadens des arbres

fruitiers a été observée au cours de l’année dans la région de Dakar. Des prospections extensives
suivies de lâchers de deux ennemis naturels (Anagyrus mangicola et Gyranusoïdea tebygi) ont
été menés pour limiter les populations de cochenille.
- Les ravageurs des panicules (Pachnoda sp, Méloides), mineuse de l’épi (Heliocheilus
albipunctella) ont été signalés dans les régions de Tamba et Kolda sur des superficies assez
vastes atteignant parfois 15 individus/épi. Leur présence en mi-Août jusqu’à fin septembre a
coïncidé avec l’épiaison du mil.
- Enfin de campagne, Caryedon serratus et Aphanus sordidus sur arachide, Sitotroga cerealla
sur mil et Callosobruchus sp ont été notés sur les stocks de ces spéculations.
Ainsi le faible niveau de dégâts enregistrés dans l’ensemble du territoire s’ explique par
l’abondance de la végétation dans les jachères et l’efficacité des traitements phytosanitaires.
Tableau no 1 Situation des infestations et des traitements phytosanitaires camp, 1995-199’6 (source
DPV. bilan de la camnagne nhvtosanitaire. 1995-1996)

Superficies prospectées * 332.700 ha

:

Superficies infestées 103.000 ha

dont : cricwet pélerin 6.46% ha

Sauteriaux 72.128 ha
autres ravageurs 24.435 ha

oiseaux et rats non déterminés

--

Superficies traitées 70.320 ha

dont : criauet pélexin 2.610 ha
sauteriaux 4X.910 ha
autres ravageurs 18.800 ha

* tous ravageurs
 9

III, ETUDES REALISEES DANS LE CADRE DU THEME

3.1. Revue biblio?raphiaue sur les nématodes narasites des cultures maraîchères

3.1.1. Problématiaue nématologiaue

Le Sahel dépend toujours de son agriculture et celle-ci est toujours soumise à la forte pression
parasitaire ne lui permettant pas de répondre aux exigences économiques et financières attendues par
les producteurs. Malgré l’effort soutenu par la plupart des Gouvernements sahéliens pour essayer de
limiter l’hétérogénéité des hivernages, la consommation maraîchère actuelle dans les régions tropicales
est de l’ordre de 90 g de légumes/habitant/jour comparativement aux besoins optimaux moyens de
population mondiale qui sont de 250 g/habitant/jour (Fereol, 1995).

Cet écart entre les besoins et la satisfaction est dû aux conditions agro-climatiques et
pédologiques souvent défavorables mais aussi à un complexe parasitaire tel que : les oiseaux, les
insectes, les rongeurs, les bactéries, les champignons... et surtout les nématodes.

D’après Fereol (1995), sur ces 5 spéculations maraîchères tropicales ; ces espèces de
nématodes sont rencontrées dans les régions tropicales.

Choux Meloidogyne spp. Tylenchorhynchus brassicae ; Hisrchmanniella oryzae ;

Rotylenchus reniformis ; Paratrichodorus minor , Tylenchus brassicae
Laitue Meloidogyne spp. ; R. reniformis ; P. minor ; Longidorus africanus ;
Scutellonema cavenessi
Tomate Meloidogyne spp. ; R. reniformis ; Nacobbus aberrans ; Tylenchorhynchus
brassicae ; Xiphinema basiri ; HopZoZaimus indicus ; Radopholus spp.,
P. minor
Oignon Dylenchus dipsaci ; Meloidogyne spp. , N. aberrans ; Radopholus spp.. ; B.
longicaudatus ; P. minor ; Tylenchus filiformis
Aubergine Meloidogyne spp., R. reniformis ; T. brassicae ; X. basiri ; Radopholus spp., P.
minor

Les informations disponibles sur les nématodes et leurs dégâts sont plutôt maigres ou
inexistantes et leur action est plutôt grave et complexe dans les sols sableux et chauds du Sahel très
propice aux infestations de nématodes, surtout dans les périmètres irrigués des zones maraîchères à
culture continue.
 10

3.1.2. Nématodes à Palles des cultures maraîchères

La production maraîchère connaît une expansion dans de nombreux pays africains en raison
de sa très bonne rentabilité, de son intérêt du point de vue nutritionnel, du fait que les cultures
maraîchères s’intègrent bien aux systèmes de production traditionnels et qu’elles sont source de
devises. Cela constitue une alternative aux traditionnels produits tropicaux d’exportation dont les cours
actuels ne sont pas stimulateurs pour ces pays.

Mais la production maraîchère doit malheureusement faire face à de multiples problèmes

parasitaires dont les nématodes phytoparasites récemment décris, et leurs effets dépressifs sur la
production des principaux légumes sont considérables. Les estimations de pertes de production des
cultures maraîchères en régions tropicales sont de l’ordre de 17-20 % pour l’aubergine, 1833% pour le
melon, 24-38% pour la tomate et plus d’autres espèces (Sasser, 1979).

Par rapport à ces pertes générales dues aux maladies et ravageurs, les nématodes, en
particulier les Méloidogyne, principaux nématodes de la sous-région sont responsables de 30 à 60%
des pertes sur aubergine et de 50% sur melon et pastèque (Lamberti, 1979).
Au Burkina Faso les Méloidogyne peuvent causer sur tomate 60 à 80% de chute de rendement
(Sawadogo et al., 1993).

Au Sénégal, d’après la prospect ion du laboratoire de Nématologie en 1993, Méloidogyne spp.

constitue le principal parasite. Il est pratiquement aussi abondant dans toutes les zones maraîchères,
aussi bien dans le sol que dans les racines. Par contre sa fréquence est variable : c’est dans la vallée du
Sénégal qu’il est moins répandu, partout ailleurs, il y est très fréquent.
Il est plus souvent trouvé dans les racines que dans le sol. Ceci est particulièrement marqué dans la
région des Niayes. Il est rencontrézsur la tomate (90%) des échantillons de racines contenaient
Méloidogyne spp., sur l’aubergine, chou, pomme de terre, gombo, pastèque etc...

La population de Meloidogyne [Link] forte et homogène dans les racines de ces cultures (80
à 100 %) et hétérogène d’une culture à l’autre dans le sol (45 à 70%).
Cette importance au niveau du Sénégal fait que le programme du laboratoire de Nématologie de Dakar
s’est orienté à la recherche d’alternatives biologiques et culturales nouvelles pour le contrôle des
nématodes à galles ( genre Meloidogyne )

[Link]. Description d’un nématode phytonarasite

Le mot ” nématode ” est dérivé du nom grec ” nema ” qui veut dire fil.
 11

Les nématodes phytoparasites, également appelés anguillules sont des vers ronds allongés en
fuseau, non segmentés. Cependant chez certaines espèces le corps de la femelle adulte peut se renfler
et devenir plus ou moins globuleux (Prot, 1984). Ils vivent partout où pousse une plante aux dépens de
laquelle ils peuvent se nourrir dans les milieux et sous des climats très divers : des herbes de la toundra
sibérienne, aux arbres du désert, des plants épiphyte aux algues marines, et des plantes cultivées. Ils
sont de taille microscopique (0,3 à 5 mm de long et 15 à 50 ltrn de section), (Prot, 1984). Ce sont des
parasites obligatoires, pourvus d’un stylet, sorte de seringue buccale leur permettant de parasiter les
plantes en s’attaquant aux parties aériennes ou aux parties souterraines. Ils réalisent tout ou une partie
de leur cycle de développement dans le sol provoquant des dommages importants aux cultures.

[Link]. Position svstématiaue

Les nématodes du genre Meloidogyne appartiennent à l’embranchement des Nemathelminthe

(vers ronds) à la classe des Nematodu (pas de cils vibratiles, oesophage différencié, appareil excréteur
glandulairèl et à la sous classe des Phasmida.

D’après la révision de (Luc & Fortuner 1987) la systématique du genre se présente comme
suit :

Ordre Tylenchida Thorne, 1949

Sous-ordre Tylenchina Thorne, 1949
Super-famille Tylenchoidea orley, 1980
Famille Meteroderidae Filipjer &Schuurmans Stekhoven, 1941
Sous-famille Méloidogyne

Le genre Méloidogyne compte au moins une cinquantaine d’espèces ; leur étude taxonomique
repose sur : l’étude des figures périnéales, l’utilisation des gammes de plantes hôtes et l’étude
électrophorétique des protéines et des isoenzymes des femelles.

[Link]. MorDholo!Ge ( figure 2 )

Le mâle du MéZoidogyne est filiforme et long de 0,8 à 2 mm. A l’extrémité antérieure s’ouvre
la bouche, elle est pourvue d’un stylet de 2 fois la largeur des lèvres, mince avec des boutons (Jacob et
al., 1988). C’est grâce à ce stylet et que le nématode se nourrit.

Il possède 1 ou 2 testicules débouchant, avec l’intestin, dans un cloaque où se trouvent deux

spicules, ou organes copulateurs qui font saillie à l’extérieur.
 12

La femelle est globuleuse et mesure 0,44 à 1,3 /.rm. Deux ovaires, qui débouchent dans le vagin,
occupent la majeure partie du corps. Dans la partie postérieure se sont développées six glandes qui
débouchent dans le rectum. Ces glandes produisent une substance gélatineuse dans laquelle une partie
de oeufs est englobée.

Les larves de 2ème stade sont vermiformes, pointues à l’extrémité postérieure. Elles ont une
longueur variant de 0,3 à 0,5 mm et un diamètre d’environ 10 pm. Leur cavité générale est occupée
presque totalement par le système digestif qui comprend la bouche, s’ouvrant à l’extrémité antérieure.
l’oesophage, puis l’intestin qui débouche dans le rectum. La bouche contient un stylet creux et
protractile. (De Guiran et Netscher, 1970).
Les Méloidogyne sont pourvus aussi d’un système musculaire formé de quatre champs musculaires et
d’un système nerveux composé d’un anneau nerveux,de cordons nerveux, d’organes sensoriels tactiles
et de chimie-récepteurs.

Figure 2: Morphologie du juvénile (A), de la femelle (B), et du mâle (C) de MeZoidogyne spp.
( Netscher, 1970)
 13

3. 1. 2. 5. Biologie et cvcle de dévelowement Figure 3

L’adulte femelle pond ses oeufs dans une substance (enveloppe) gélatineuse fixée à
l’arrière de celle-ci et appelée “masses d’oeufs” ; cette substance est produite par des glandes
débouchant dans le rectum. Quelques heures après la ponte, l’oeuf subit une série de divisions
cellulaires aboutissant au juvénile de premier stade (Jl). Ce juvénile subit une première mue pour
donner un juvénile de deuxième stade (52) qui déchire la coque et émerge. A une température de
28°C le délai ponte-éclosion dure sept à neuf jours (Nestcher, 1970).

Le juvénile 52 est le stade infestant, il est vermiforme et mesure entre 0,3 et 0,5 mm de
longueur et environ 10 l-t de diamètre.

Le 52 oriente son déplacement par rapport à un gradient de substances émises par les
plantes, substances pour la plupart hydrosolubles et rémanentes (Prot, 1975).

Lorsqu’il rencontre une racine hôte, il y pénètre au niveau de la zone apicale et s’y
déplace intracellulairement (partie molle à intenses activités métaboliques) et se fixe sur le
cylindre central, la tête fichée dans le plérome sur les cellules duquel il se nourrit. Le juvénile de
deuxième stade devient alors sessile (immobile) et subit 3 mues successives qui conduisent à
l’adulte mâle ou femelle. Ce processus dure deux semaines.

Entre la deuxième et la troisième mue, il perd son stylet et ne se nourrit pas (De Guiran
et Netscher, 1970).

Le déterminisme sexuel dépend des conditions du milieu. En milieu défavorable les

juvéniles se développent préférentiellement en mâles. Tel est le cas en présence de fortes
infestations racinaires. Les mâles, absents ou rares quittent les racines et se déplacent librement
dans le sol. Ils ne sont pas fonctionnels (chez les espèces tropicales) : la reproduction de
Meloidogyne est parthénogénétique.

3. 1.2.6. PathoFénie

Les nématodes du genre Meloidogyne font partie du groupe des endoparasites

sédentaires : ils pénétrant dans la racine s’y sédentarisent et ne quittent plus le site choisi. Ainsi le
corps de la femelle devient piriforme et parfois fait saillie à l’extérieur de la racine (Prot, 1984).

Du point de vue port végétatif et stades phénologiques de la plante, il est difficile de

reconnaître une attaque de nématode, même lorsque les dégâts subis par les plantes sont évidents.
---____..-_. .. ..,

14

E~!U& : Cycle de développementde Meloidogyne spp. (Netscher, 1970).

1 : p&Aration desjuvkniles de deuxikme stade.
2 : tientarisation desjuAniles au niveau de sitesde nutrition.
3 : début de maturation desjuvkiles en adultes.
4 : diffkrenciation sexuelle desjuvéniles.
5 & 6 : libération des mAleset klosion des oeufs produits par les femelles.
..^--..-.,X...“.“- 4

15

Cependant pour Meloidogyne, son infestation induit à une formation de galles sur les racines et
tubercules des plantes attaquées par les juvéniles (52).

Ces manifestations provoquées par la sécrétion salivaire du nématode qui induit des
modifications anatomiques entraînant une déformation du tissu vasculaire provoquent la
formation de cellules géantes polynuclées et une hypertrophie des cellules corticales. Ces
déformations constituent les galles. Elles sont solidaires de la racine et situées dans un axe alors
que les nodules des Rhizobium ont une position excentrée par rapport à l’axe de la racine (Prot,
1984). 11y a aussi d’autres genres de nématodes qui provoquent des galles, comme les Nacobbus
mais celles-ci sont en général plus petites (Bakker, 1986).

D’autres dommages sont causés par les Meloidogyne :

- carences en potassium chez de nombreuses plantes (Bakker, 1986)
- détournement d’une partie du métabolisme de la plante à leur profit
- endommagement du système radiculaire par réduction et destruction des racines et radicelles de
la plante, et prolifération anormale de radicelles près des points de pénétration
- décoloration et flétrissement des feuilles
- interviennent en association avec d’autres micro-organismes
exemples :
** La résistance de cultivars de tomate au Fusarium oxysporium sp. Lycopersici est réduite en
présence de Meloidogyne (Fereol, 1995).
**Rhizoctoria associé au Meloidogyne provoque des dégâts sévères sur tomate et piment (Van
Gundy et al., 1977 ; Shall et al., 1993).
** Bon développement de Pseudomonas solanacearum sur des végétaux déjà endommagés
par de fortes pullulations de Meloidogyne (Bakker, 1986)..
** Attaque sévère de Fusarium quand les Meloidogyne sont présents sur le cotonnier (Bakker,
1986).

3. 1. 2.7. La lutte

Pour lutter contre les nématodes du genre Meloidogyne , plusieurs méthodes de lutte
culturale, physique, chimique, génétique et biologique sont préconisées.

Méthodes culturales :

Ces méthodes culturales visent à réduire la population de Meloidogyne dans le sol en

jouant sur la prophylaxie, les rotations culturalcs , les amendements organiques ou l’utilisation
des plantes pièges ou à pouvoir nématicide ; ainsi nous avons :
 16

A. la uronhvlaxie

Le contrôle approprié des mauvaises herbes souvent hôtes des nématodes.

La mise en place des pépinières sur des sites n’ayant pas précédemment abrités des
cultures hôtes de nématodes.

B. Les rotations culturales :

La succession culturale avec des cultures non-hôtes ou résistantes exemples une

alternance coton/arachide permet de mieux contrôler M. arenaria (Rodiguez Kabana et af.,
1987), une alternance aubergine avec arachide pour le contrôle de M. incogrzita (Netscher, 1983)
Une rotation arachideifonio ou arachidejtomate réduit l’action néfaste de Meloidogyne
(Sarret af., 1986).

C. Des amendements organiaues

L’utilisation sur concombre des composts issus de fientes de poules, à la dose de 10%
dans le sol permettent le contrôle de M. spp un jour après l’infestation des plantes par 3000 larves
(Zhemchizhina et al., 1989).
Des composts, feuilles broyées, résidus végétaux et toute partie de jacinthe d’eau et de
Neem à 30g/ha permettent le contrôle de M. incoginta aussi bien que l’aldicarbe à 2kg/ha (Pathar
et ai., 1988).

D. Extraits des mantes

Sur aubergine des tourteaux de graines d’arachides à raison de lOOg/500G de semence

permettent le contrôle de M. twognita (Singh et Singh, 1988).
Des extraits des feuilles de Neem ou d’Eucalyptus tereticornis constituent une matière
efficace pour le traitement par immersion de graines de tomate contre 44. javanica (Vats et
Nandal, 1993).

Méthodes phvsiaues :

Chauffage du sol à la vapeur d’eau (Chiba et Suzuki, 1990)

Solarisation du sol qui permet une réduction de près de 92% de la population de M. incognirn sur une
culture de patate douce (Stevens es al., 1988).
Submersion par l’eau (Sarr, 1988).
 17

Méthodes chimiaues :

Les produits chimiques sont classés en fumigants et non fumigants.

A. Les fumigants

Le dazomet (Basamide Gr) appliqué en pépinière à 40g/m2 contre M. incognita sur tomate, le
1, 3 - D améliore les rendements de tomate de l’ordre de 50% à un taux d’application de 1SOl/ha et de
12 1% avec 2001ka (Lamberti, 1979).

B. Les non fumigants

L’aldicarbe lOg/m2, le carbofuran 3gka, le phorate lOg/m2 (Verma et al., 1994). De même le
dichloropropéne 50-100 l/ha, le vibromure d’éthylène 2001/ha pour le contrôle de 44. incognita
(Mateille et al., 1988).

Méthodes génétiaues :

Elles reposent sur l’utilisation de variétés résistantes, exemple : Lycopersicum perusianunz

présente une résistance à M. incognito (Sakhuja et al., 1991) grâce à la présence du gène Mi.

Méthodes bioloeiaues :

La microflore de la plupart des sols est très dense et variée. Certaines micro-organismes qui la
constituent, sont utilisés par le contrôle des Meloidogyne.

L’actinomycètes parasite : Pusteuria penetrans (Sayre et Starr, 1985) ubiquiste et très inféodé
à Meloidogyne. Ses sporanges se fixent sur la cuticule des 52 et l’hyphe bactérien pénètre dans la cavité
générale des nématodes, huit jours après il se développe des thalles végétatifs dans le corps du
nématode. La femelle ne produit plus d’oeufs (Prasad et Mankau, 1969) et devient un “sac” de spores.

Les champignons prédateurs tel que Arthrobotrys oligospora (Cayrol et B’chir, 1979) qui
forme des pièges différenciés capables d’immobiliser et de tuer le nématode.

Méthodes intégrées :

Par une utilisation simultanée dans un cadre stratégique des differentes méthodes disponibles
contre les ennemis des cultures dans le but de maintenir leur population à un niveau bas pour que les
 18

dégâts occasionnés soient économiquement rentables. Cette méthode de lutte est la plus recherchée
présentement.

3.2. Etudes nratiaues : techniques nématolokmes

3.2.1. Diagnostic nématoloeiaue

A défaut d’un champ paysan, un diagnostic nématologique avait été effectué au niveau des
parcelles et serres de multiplication semencière du TROPICASEM, situées dans une zone maraîchère
à proximité du (CDH).
Il portait sur les cultures suivantes : aubergine, tomate, piment, gombo et oignon.
Aucun diagnostic précis sur feuillage ne nous permettait d’affirmer avec exactitude la
présence des nématodes malgré certaines zones de mauvaise croissance sur piment et aubergine.
Un échantillonnage de sol et de racine était donc obligatoire malgré la présence notoire de
galles sur certaines racines de piment.

3.2.2. Echantillonnaee

Des échantillons sont composés de sol et de racines prélevés sur les parcelles et dans les
serres. On prélève, sur une profondeur de 15 centimètres environ, des échantillons de sol et de
racines pour connaître les espèces de nématodes présentesdans le terrain et en évaluer leur
nombre. Ces échantillons, d’au moins 250 cm3 de sol, sont recueillis à l’aide de transplantsir rt
placés dans des sacs plastiques. Chaque sac porte la référence du prélèvement et fermé
hermétiquement par un bracelet en caoutchouc de façon à éviter le dessèchement. Les racines
sont placées dans le même sac que la terre et le tri est fait au moment de l’analyse.

La référence du prélèvement est tirée d’un carnet à souche où sont consignées toutes les
indications utiles concernant le prélèvement : lieu, date, état de la lutte, précédent cuitural, etc...

3.2.3. Extraction des nématodes

a). But
Cette opération consiste à séparer les nématodes de la terre et des racines pour les
identifier, les compter et éventuellement les récupérer pour collection.

b). Appareils utilisés

L’élutriateur de Seinhorst, 1962 (pour le soi), l’asperseur de Seinhorst, 1951 (pour les
racines) et les tamis.
 19

c). Princioe Dour le sol: {Figure 4 aj

C’est une opération qui consiste à séparer les particules de sol dont les nématodes en
fonction de leur poids moléculaire et d’un débit ascendant.
Préwration de l’échantillon
On fait passer 250 ml de sol à travers un tamis grossier (1 mm de maille) au-dessus d’un
entonnoir dans un erlen de 2 1 avec un courant d’eau
On remplit l’erlen d’eau à ras.
Extraction
On fait passer dans l’élutriateur un courant d’eau ascendant de 60 à 80 ml/mm (réglage avec un
débitmètre) pendant 20 min.
On récupère le trop plein dans un seau
Après 20 min., on arrête le courant d’eau, on verse dans le seau le contenu de l’erlen, puis remise
du courant d’eau pendant 10 min.
Récupération du contenu de l’élutriateur dans le seau
On laisse reposer le contenu du seau
Tamisage
On verse le seau sur 4 tamis superposés de 50 pm.
On recueille le refus du tamis dans un verre à pied de 250 cc.
Purification
Ensuite on verse le contenu du verre à pied sur un tamis grossier tapissé de 2 feuilles de kleenex
préhumidifiés et on pose le tout dans une boîte de Pétri ou une assiette.
Après 48 heures on verse le contenu de la boîte de Pétri dans un tube de comptage gradué.

d). Pour les racines: (Figure 4 b)

Cette opération consiste à faire quitter les nématodes des racines par un pourrissement de
ces dernières dans la chambre à brouillard et de piéger les nématodes dans un bocal contenant de
l’eau.
Les racines sont coupées au collet et découpées à des dimensions de 1 à 1,5 cm.
Elles sont placées dans la chambre à brouillard pendant 15 jours.
Deux extraits d’eau contenant dans le bocal sont récupérés à 7 et 14 jours.
On fait un tamisage de 48 heures (identique à celui du sol).
Les extraits sont mis dans des tubes de 25 cc.
On effectue un comptage à la loupe binoculaire.
 30

250 cm3 du sol

----
/- -.
\
:’
,i

Récupération des nématodes

dans des récipients

erc
& <----
Suspension
G
destinée
F
Purification de la suspension
pour le comptage par passage actif à travers un
des nématodes tamis tapissé de papier cellulose

Figure 4 a : Technique d’extraction des nématodes du sol (Seinhorst, 1%2)

 Tamis et kleenex

Racine

Tamis

Boite muni dun trop-plein Passaqe .actif

Fiq Techniques d'extraction des nematodes des racines (Seinhorst,l950)

(4W
I
3.2.4 Identification au stéréoscope de auelaues genres de nématodes

Par l’appui du technicien Samba Baidy N’Diaye taxonome de l’équipe, ces différents genres de nématodes ont été reconnus ti la
loupe binoculaire par des isolements cspCcc par espèce. L’identification s’arrCtait B une simple observation dc certains carxtèrcs
discriminants: longueur du stylet, forme de la tête, forme de la queue, forme du corps etc...

Tablcu. : caraclCristlqucs 177orphobiolnCtrlqLICsdc certains gcnrcs dc nkmatodcs ( J.J.S’ Jacob cl W.C.T. Middclplaals ).

Genre Criconemoid. Scuiellonema Meloidogyne Helicotylenct; Tylencho.

Sclérotisation non développée non clévelopp& bren dé~~elopl~e légèrement biendévclopJ~Celégkement ou bien déwloppée bien développée
“PhdiqUe développée bien développée

deus fois la une fois et

long, mince de long et robuste largeur des 2 fois la largeur 2 fois la largeur hicn développé [Link] demie à 4 fois
Stylet buccal 1:16à 1:4dela (4OOàlOO~m)ave lèvres, des lèvres, des lèvres avec avec des dcveloJ7Jk avec la longueur du
largeur du corps c b0ut011s fortement minces avec des des boutons boutons des boutons corps avec des
basaux dfveloppée avec boutons apparents apparents apparents boutons
des boutons apparents
apparents

généralement généralement souvent foncé foncé

foncd foncé

hémi sphérique
hémisphérique forme variable en pointe ou variable, allongée conique à effilée avec
Queue femelle à zigue cylindrique aigue non; la queue subaigue ventralement; arnmdie conique ronde pointe
allongée allongée est claire, les parfois inciske; extrémité
scutellas sont partie hyaline hémisphérique

Position de la ,,,,,, - 55-69 JO-60 75-80

vulve en %

Légende: Hemicycliophora spp. Meloidogyne spp. Pratylenchus spp

Criconemoides spp Helicotylenchus spp Pratylenchus spp

Scutelloneina cavenessi Tylenchorhynchus spp Hirschmaniella spp

 3.2.5. Comptage

[Link]. Résultats des analvses nématolopiaues

sur les uarcelles de TROPICASEM

Le comptage est fait au microscope stéréoscopique(grossissement 40X). Il est effectué dans

une petite plaque quadrillée et les nombres de nématodes sont ramenés au dm3 de sol ou au gramme de
racines. ( voir annexe 3 )

Les échantillons de sol sont comptés au laboratoire de I’ORSTOM tandis que ceux des racines
au laboratoire de la D. P. V.

[Link]. Distribution de genres de nématodes (sol et racine)

D’après le principe de Fortuner et Merny (1973), l’importance d’un genre est établie en
connaissant sa fréquence et son abondance ( tableau 5 )

La fréquence est égale au pourcentage d’échantillons dans lesquels le genre ou l’espèce a été
trouvée.

L’indice d’abondance est le logarithme décimal de la moyenne des effectifs du genre dans les
échantillons où ils ont été trouvés.
** Dans le sol : ( tableau 3 et figure 5 >
- Scutellonema cavenessi est peu fréquent et peu abondant.
- Helicotylenchus spp est peu fréquent et peu abondant
- Prutylenchus spp est très fréquent et peu abondant.
- Meloidogyne spp est très fréquent et très abondant.
- Hirschmaniella oryzae est peu fréquent et très abondant.
-TyZenchorhenchus spp est très fréquent et peu abondant.
**Dans les racines : ( tableau 4 )
- Meloidogyne spp est très fréquent et très abondant.
- Hoplolaimus spp est peu fréquent et peu abondant.

[Link] Discussion sur les résultats .

Nous avons aperçu que seules trois espèces sont très fréquentes:
Moloidogyne, Pratylenchus et Tylenchorhenchus, et 2 espéces très abondantes : Meloidogyne et
Hirschmaniella.
Tableau J : Calcul des moyennes, fréquence et abondance (sol)

Moyenne X Frequence ,L\bondance (log(x+ 1)

Scutellonemn cnvenessi 1,66 833% 0,-12-I

Helicotylenchus 5 25% 0,778

Prntylenchus 20 33$3% 1,959

Meloidogyne spp 382 41,66 25828

Hirschmcmiela oryae 138 259z 2,144

Tylenchorhenchus 65 58,33 LTr 1,81

Tableau I+: calcul des moyenne, fréquence et abondance dans les racines

Genre Moyenne X Fréquence Abondance

Meloidogyne z847 87 3,45

Hoplolaimus 3 35 1,415

Tableau 5 : structure d’un diagramme fréquencejabondance (Fortuner & Merny, 1973)

1,3 = limite d’abondance dans les racines(%) nématodcs/g)

$3 = limite d’abondance dans le sol (200 nématodes/dcm3)
30% = seuil de fréquence dans le sol et lesracines
1,3,3,4 = quadrants identifiés par les seuils de fréquences et d’abondance.
 Distribution des nématodes du soi

2.7
l Melo
2,4

271
Tylencho
4

076 +--
073 i---• CUt ---------t----
------
i -i--f
0
0 10 20 30 40 50 60
Fréquence (%)
-----1_-.--. “- .

26

Sur l’ensemble des échantillons prélevés, 7 ont montré une abondance pour au moins
une espéce soit 58,3% des échantillons, 2 pour une abondance de 2 espéces soit 16,7% des
échantillons.

Les échantiollons 221, 23 1, 236, ont montré une abondance très élevée en Meloidogyne
aussi bien dans le sol que dans les racines. Par contre dans l’échantillon 230 Meloidogyne est
abondant dans les racines et absent dans le sol.

3.2.6. Coloration des racines au lactophénol fuschine

Dans le but de voir les différents stades de développement des Meloidogyne (oeufs,
larves et adultes), les racines de tomate ont été colorées puis observées à la loupe binoculaire.

Principe (solution de base: annexe 4)

- Prélévement des racines de tomate qui ont été inoculées le 05/11/96.
- On fait bouillir le lactophénol prêt à l’emploi et on plonge les racines préalablement lavées et
égoutées pendant 2 min.
- On lave les racines à l’eau courante et on fait la coloration en les trempant pendant quelques
secondes dans une solution d’acide chlorhydrique à 1%0
- On conserve ensuite dans une boîte de Pétri contenant du lactophénol blanc.
- Les racines sont coupées et étalées entre deux plaques de verre.

A cet effet deux montages de racines colorées ont été effectués le 19/11 et le 20/11/96.
Les racines du ler montage n’ont pas été trempées dans une solution d’acide chlorhydrique
contrairement à la deuxiéme.

Et dans la deuxiéme plaque presque tous les stades de développement de Meloidogyne y

sont fixés : oeufs, larves de 2eme stade, larve de 3eme stade, larve de 4eme stade qui va devenir
femelle, larve de 4éme qui va devenir mâle, la femelle adulte.

3.2. 7. Electrophorése des estérases de Meloidomne: Etude d’un

svstéme enzymatiaue( iso-estérases ) par électrophorése sur gel de
polvacrvlamide.

[Link]. Principe de l’électrophorése

La technique de l’électrophorése est un moyen de distinguer les protéines par certaines

de leurs caractéristiques tels que le poids moléculaire et leurs charges électriques. Elle consiste à
 37

faire migrer les protéines sur un support inerte en l’occurence le polyacrylamide, qui permet un
déplacement plus ou moins facile des protéines en fonction de leur taille.

La combinaison de la charge électrique et de la taille permet ainsi une vitesse plus ou

moins rapide.

[Link]. Matériel et méthodes

A. Matériel vé&al

Les échantillons de tomates ont été prélévés dans la serre du laboratoire de nématologie
et dans les parcelles d’essai de neem du CDH pour une identification des différentes espéces de
Meloidogyne présentes dans les racines et également relancer l’élevage des espéces de M.
javanica et M. incognita du laboratoire.

B. Solution de base

La préparation des gels, du tampon cuve, ainsi que du tampon d’extraction figurent en
annexe, no 4 b
C. Les méthodes de I’électroDhorése

Les étapes de cette étude se résume à cinq phases:

. Extraction des femelles
. Coulage des gels
. L’électrophorése
. Révélation des estérases
. Fixation et séchage des gels
 - Extraction des femelles et prénaration des gels

Les femelles sont extraites des racines et placées dans des tubes micro- he’mathocrites
remplis du tampon d’extraction (5 ~1 de la solution Nonideù, à raison d’une femelle par tube.
Ces femelles sont écrasées au fond des tubes à l’aide d’un piston. Les broyats sont ensuite stockés
au réfrigérateur. Pendant ce temps, le gel de séparation est préparé. Dans un bêcher sont placés
1,5 ml de la solution A,=3 ml de la solution B; 1,5 ml d’eau distillée et 6 ml de la solution C. Ce
mélange est homogénéisé à l’aide d’une seringue. Le gel de concentration est ensuite préparé.

- Coulage des gels

. Les plaques de verre sont lavées avec un détergent mouillant puis rincées avec de l’eau
distillée. On applique les deux plaques de verre l’une contre l’autre, avec les espaceurs, le joint et
les pinces.
. A l’aide d’une séringue on injecte 1 mi de gel de migration pour éviter la formation de
bulles d’air.
. On ajoute de l’eau distillée en surface pour éviter un dessèchement du gel.’
. On laisse polymériser à température ambiante pendant 1 heure
. On retire l’eau à l’aide dune pointe de micropipette branchée à une trompe à vide
. On place le peigne
. On laisse polymériser pendant 1/2 heure.

Electronhorèse :

. Les peignes, les pincés et le joint sont retirés en maintenant les gels et les espaceurs
entre les plaques.
. On fixe les plaques sur la cuve avec les pinces
. On retire l’eau contenue dans les puits à l’aide d’une pointe de micropipette branchée à
une trompe à vide
. Les broyats de Meloidogyne sont injectés dans les puits, en ayant bien soin de rincer la
seringue entre les opérations avec le tampon cuve.
. On remplit le compartiment supérieur de la cuve avec le tampon de cuve auquel on a
rajouté quelques ml de colorant (bleau de bromophénol)
. Les puits aussi sont recouverts avec le tampon de cuve.
. L’appareil est fermé et placé dans le réfrigérateur, puis branché au générateur électrique
situé hors du réfrigérateur
 29

.Une prémigration de 15-20 mn à 40 V et 50 m A est effectuée, le voltage est ensuite

ajusté à 120 V (50 mA) pour fair migrer rapidement les protéines pendant 1 à deux heures,
. Dès que le front de migration aura atteint 5 à 6 cm, (voir la position de la bande du
bleu de bromophénol à la partie inférieure du gel) l’électrophorèse est arrêtée.

Révélation des estérases :

. La cuve du tampon est vidée

. Les plaques sont retirées dela cuve et décollés à l’aide d’un scalpel
L’angle inférieur droit des gels est coupé pourservir de repère
. On retire le gel de concentration
. Les’gels sont decollés des plaques et plongées dans des boîtes de pétri contenant le
révélateur
. Les gels sont placés dans une étude à 35°C pendant 30 mn pour révéler les phénotypes
enzymatiques des femelles de Méloidogyne

Fixation et séchage des gels :

. Les gels placés à l’étuve seront sortis au bout de 30 mn et lavés à l’eau du robinet
. Il-sont ensuite trempés pendant au moins 114 d’heure dans de l’acide acétique à 10%
. Ils sont rincés à l’eau et trempés dans la solution de déshydration (méthanol) pour
réduire la surface des gels et permettre une concentration des bandes (maximum 3 heures)
. Les gels sont déposés entre deux films cellophane transparents (type congélation
aliments) et entre deux plaques de verre et on laisse sécher.
. Après séchage les gels sont photocopiés et le calcul des Rm (ou RF) est effectué. Nous
rencontrons que la deuxième plaque, l’ensemble des femelles mises en électrophorèse étaient de
l’espèce Javanica. Les masses d’oeufs correspondant à cette deuxième plaque sont ensuite
rassemblées dans un éclosoir pour continuer l’élevage de cette espèce. (annexes 5)
 30

3. 2. 8 MontaPe pour collection de auelaues suécimens de nématodes

Dans le cadre toujours de l’étude taxonomique, des nématodes ont été montés sur des lames de
Cobb pour une observation plus poussée au microscope de certaines de leurs caractéristques
morpho-biométriques
Nombre de lames montées: 7
Nombre de genres consemés: 6
Caractéristiques des lames:
lame N” 00001: Tylenchorhynchus sulcatus : 5 femelles, 3 [Link] et 1 mâle
lame N” oooO2: Meloidogyne spp : 10 larves
lame N” 00(X)3: Xiphinema spp : 3 femelles
lame N” KXXl4: PraQlenchus spp : 6 femelles
lame N” 00005: Helicotylenchus spp : 5 femelles
lame N” (XXI06 Hemicycliophom spp : 5 femelles
lame N” 00007: Meloidogyne spp : 3 femelles, 1 LA (mâle), lL4 (femelle) et 1W

3. 2. 8. 1 Lc matériel utilisé
- Une loupe binoculaire
- Une canne à pêche fabriquée avec un fragment de bambou portant à son bout éffilé un poil de
porc
- Des lames portes objet de Cobb et des lamelles couvre objet de 16 à 23 mm de large rondes
- Des étiquettes inserrées à a lamelle
- Des calles qui servent de support entre lame et lamelle pour é\rter d’écraser les nématodes
- Des salières de conservation des nématodes
- Un dessiccateur, une étuve à 37” c
- Des solutions de fixation

3. 2. 8. 3 Technique de montage
- Les nématodes sont mis dans une salière contenant une fine goutte d’eau,
- on chauffe le fixateur (FFG) à 70 - 80” C et on le verse dans la salière pour tuer les nématodes,
- la salière contenant les nématodes est placé dans un dessiccateur pendant au moins 24 h,
- on retire le FPG et on le remplace par la solution S 1,
- on place la salière en position ouverte dans un dessiccateur fermé contenant de l’alcool à 95%,
- on place le tout à l’étuve à 37” C pendant au moins 13 h,
- on enlève ensuite la moitié de la S tet on rajoute la Sz à une quantité égale,
 31

- on remet la salière en position fermée directement à l’étuve pendant 3 jours pour permettre
l’évaporation de l’alcool contenu dans la S2,
- après évaporation complète de l’alcool on place la salière dans un dessiccatcur contenant du
silicagel pour poursuivre la dessiccation pendant 3 jours,
- sous la loupe binoculaire les nématodes contenus dans la salière sont pêchés et déposés dans
une goutte de glycérine sur la lame porte - objet,
- trois calles de diamètre conforme à celui des nématodes sont déposés en triangle dans la goutte.
- une lamelle est déposke lentement sur la goutte et l’excès de liquide qui déborde sous la lamelle
est éliminé avec un papier filtre,
- le bord de la lamelle est futé avec du “glyceel” ou vernis à ongles,
- la lame est étiquetée (genre, espèce, sese, localité, hôte, date) et conservée dans des boîtes de
collection pour séchage.

3. 2. 8. 3 Composition des solutions de fixation

- Composition du FPG:
1OOccdeformolà4O”C
15 cc (ou 30 cc) d’acide propionique
10 cc de glyckrine
+ qsp 100 ml d’eau distillée
+ quelques gouttes d’acide propionique (pour obtenir une coloration jaune citron)
- Formule du S 1:
200ccaholà95%
100 cc glycérine
qsp 1000 cc H?O distillée
- Formule du S2 blanc:
950ccalcoolà95%
95 cc de glycerine
Formule du S2 Orceïne:
950 cc alcool 95%
1 cc solution mère Orceïne
50 cc glycérine
 32
IV CONCLUSION GENERALE ET RECOMMANDATIONS

1. Conclusion générale

Ce stage d’initiation à la nématologie est d’un grand intérêt pour moi:

Il m’a permis de connaître l’impact des nématodes dans un complexe parasitaire des cultures
maraîchères au Sénégal, de bien cerner leur pathogénicité, d’assimiler certaines techniques
nématologiques appliquées au laboratoire pour l’étude et le contrôle des nématodes
phytopardsites, en particulier les ikfekkk?gyne . Il me permet de mieux aborder le cours de
nématologie de la 2e année. Mais aussi et surtout de comprendre comment est difficile la tâche
d’un nématologiste face à l’action néfaste de ces anguillules.

2. Recommandations

Au vu des résultats obtenus au ni\.eau des comptages des échantillons du TROPICASEM, il

serait souhaitable dans le cadre d’une collaboration scientifique au sein du GIS-LINNE que la
DPV, I’ORSTOM et le volet Génétique du TROPICASEM puissent continuer les essais dans ces
serres de multiplication.
De prendre en compte tous les facteurs biotiques et abiotiques nécessaires et d’anal).scr les
interactions possibles favorables pour prétendre avoir à une banque semencière nationale
résistante ou tolérante face aux agressions des nématodes phytoparasites.
Mais désormais, il demeure impératif que la TROPICASEM puisse dénématiser ces aires de
multiplication et adpoter une rotation adéquate.
 BIBLIOGRAPHIE

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ANNEXES
Annexe la: Car& de différentes zones climatiques du SENEGAL (Gueye, 1992)

---

- -
ZONE

-- --
OAKAi
L-
,

BAKEL 1

------ -_ - -j-m--- ‘J’)D

6
à.
.co
-y.. _- ...-

Annexe 2:

LABORATOIRE DE NEMATOLOGIE 1
N’ ~15001 fio d5001
Date : Recolt. :

Sol.: l /-----__- _-------

Plante : Va2 :

Aspect :

Lieu :

Exemple de carnet d'échantillonnage.

Annexe 3

( 10
L3
Rating schema for [Link] of root-knot infestatron (Zeck, 197 1)
o: Completc and healthy, root system, no infestation
1: Ver~, fcw galls cari only~bc detected upon close ewmination
3. Small galls as in ” 1” but more numerous and easy to detect
-.
3: Numerous small galls, some grown together, function of root net seriousl>, af Icctcd
3: Numerous small galls, some big gak, majority of roots still functioning
5: 25% of root system severely galled and not functioning
6: 50% of root system severely galled and not functioning
7: 75% of root system severely galled and lest for production
8: No healthy roots, nourishment of plant interrupted, plant still green
9: The completely galled root system is rotting, plant is dying
10: Plant and roots are dead
ANNEXES 4 :

Préparation et composition des produits utilisés Dow les montages de collection de spécimens de
nématode

- Lactophénol blanc:
* 500 cc de phénol cristallisé
* 100 cc d’acide lactique
* l(X)0 cc de glycérine

- Solution mère de lactophénol fuschine acide (ri 5% de colorant)

* on fait chauffer l(X) cc de lactophénol blanc dans un flacon de 5100 ml
* on y ajoute 30 g de fuschine acide et on agite
* on ajoute ensui te 300 cc dc lactophénol blanc

- Solution de lactophénol prète à l’emploi

* on ajoute 990 g ou 860 g de lactophénol blanc dans 10 g ou 9 cc de lactophénol
fuschine acide.
 Annexe5a: Composition des solutions utilisées pour l'électrophot&se
des -est&rases de Heloidowne spp.

A. SOLUTIONS MEEES

[Link] ET TAMPONS DE GEL

l Tampon cuve
Tris W Colorant tampon
Glycine 28th Tampon cuve 100ml
Eau dist. qsp llitre Bleu de Bromo. 20mg

* Gel de séparation

Sol. A Sol. B (gel 7%) sol. c

HC1 1N 20 ml Acrylamide 28 g Persulfate 0,014 g
Tris 12 g Bisacryl. 0,735 g Eau dist. qsp 10 ml
Temmed 0,23 ml Eau diet. qep 100 ml
pH(HCl) f3,4
Eau dist. qep 100 ml

* ~4 de concentration

Sol. D Sol. E Sucrose

Eau dist. 20 ml Acrylamide 10 9 Saccharose 49
HC1 40 ml Bisacryl. 2,5 g Eau dist. qsp 10 ml
Tris 5,98 g Eau diet. qsp 100 ml
Temmed 0,46 ml
pH(HCl) 6,7 Sol. F
Eau dist. qsp 100ml Persulfate 0,028 g
Eau dist. qsp 5 ml

[Link] DE REVELATION DES ESTERASES DU TYPE B

Solutions phosphat6es Tampon phospate pH 7,2

A = NaH2P04 15,6 g So1.A
Eau dist. qsp llitre So1.B
vérifier pH 7,2
B = Na2HP04 17,8 g
Eau dist. qsp llitre

ColorantFast Blue RR Substrat Naphtyl acét&e

Tampon phosphate 10 ml Acétone 1 ml
Fast Blue RR 300 mg Naphtyl ac 40 mg

B. PREPARATION DES TAMPONS ET DESGELS

* Tampon cuve.
solution mère 50 ml
eau dist. qsp 500ml

* Gel de séparation
Sol. A Sol. B Eau Dist. Sol. c
1,5 ml 3 ml 1,5 ml 6 ml

* Gel de concentration
Sol. D sol. E Sucrose Sol. F
0,5 ml 1 ml 2 ml 0‘5 ml

3. REVELATION DES ESTERASES

Tampon phosphate 48 ml
Faet Blue RR 1 ml
Naphtyl acétate 1 ml
[Link] ET CONSERVATION DES GELS
*Acide acetique 10ml
*Eau distillke qsp 100ml
-Solution de desydratation
*Metanol 30ml
*Eau distillke qsp 100ml
Annexe ‘3x Résultat de l’electrophorèse
.--“.I.i ._.^ ”

Annexe 5c:
PROFILS ESTERASIQUES DE MELOIDOGK’VESPP.
(donnees INRA)

Rf
arenaria chitwoodi graminicola hapla hispaniicc1 incoanita i .vanica
0,:

0,:

-mm
---
.---
--em
----
.--- -ms. w--.

O%f ---
.--- -a-.
-mm --mm
m---
m-m-

--- --- ---- ----

.--- ---- ---. ----- ---

--e. --- --a ---- .-mm

0,: ---. me- --- ----

---
m-w. -v-. --- ---- .-a-

mm-

OA ---. --- ,--- -mm- .--m

0,;

078
T

),51
0,58 034
0,58
0,44 038
0‘41
0,5
r0,4
0,45
0,47
1,47
i
0,48
0,55
036
0,9
- Bande épaisse
1 - Bande moyenne
Bande fine
Annexe 5d:
PROFILS ESTERASIQUES DE MELOIDOGYNE SPP.
(données de Mireille FARGEITE)

ESPÈCES D’AFRIQUE DE L’OUEST

Rm

0,4-
arenaria ir nanita

_---
iavanica

___-
----
mavaauensis

__--
0,5- - _-

___-
_-
0,6--'

0,7- -

W- 1
LM
0,9- -

l-
a1 a2 a3 a4 il i2 i3 i3 ml
0,79 0,79 0,75 0,65 0,71 0,65 0,86 0,69 0,69 0,69 0,51
0,85 0,79 0,71 0,76 0,71 0.81 0,81 0.89 0,56
0,85 0,89 0,89 0,65
0.71

, - Bande épaisse
- Bande moyenne
Bande fine

.ESPÈCES TEMPÉREES
Rm

0,4- hapla hispanica

0,5-

0,6,----- --
--
_---- --
OL---* --
----
08 -

W-J-

l-
ha1 hi1
0.74 0.59
O,%
0.71