Uiversitie de ammar thlidji
Dapartement de biologie
L3 bichimie
Module:de enzymologie approfondie
Rapport de TP : Extraction des Polyphénols Oxydases (PPO) de Dattes
(Variété Deglet Nour)
Nom de etudion:
Chellali afaf
1. Introduction
Les polyphénols oxydases (PPO) sont des enzymes ubiquitaires dans les plantes,
responsables du brunissement enzymatique des fruits et légumes. Elles
catalysent l'oxydation des composés phénoliques en quinones, qui polymérisent
ensuite pour former des pigments bruns. Ce phénomène est particulièrement
important dans les fruits comme les dattes, où il affecte la qualité visuelle et
nutritionnelle.
La variété Deglet Nour, largement cultivée en Algérie, est appréciée pour sa
saveur et sa texture. Cependant, elle est sujette au brunissement enzymatique, ce
qui réduit sa durée de conservation. Ce TP vise à extraire les PPO de la pulpe de
dattes Deglet Nour, à mesurer leur activité enzymatique et à étudier leurs
propriétés.
2. Matériels et Méthodes
2.1. Matériel Biologique
Dattes fraîches de la variété Deglet Nour, récoltées à maturité.
2.2. Réactifs
Phosphate buffer (pH 6,5) : Préparé en mélangeant du Na₂HPO₄ et du
NaH₂PO₄.
Polyvinylpyrrolidone (PVP) : Utilisé pour complexer les polyphénols et éviter
leur interférence.
Triton X-100 : Détergent non ionique pour faciliter l'extraction des protéines
membranaires.
Sulfate d'ammonium ((NH₄)₂SO₄) : Pour précipiter les protéines.
Éthanol : Pour nettoyer le matériel.
Eau distillée : Pour la préparation des solutions et la dialyse.
Catéchol : Substrat utilisé pour mesurer l'activité des PPO.
2.3. Matériel de Laboratoire
Mortier et pilon
Centrifugeuse réfrigérée
Spectrophotomètre UV-Vis
Filtres en papier et étamine
Bechers, pipettes, éprouvettes
Dialyseur (membrane de dialyse)
Agitateur magnétique
2.4. Protocole Expérimental
Préparation des échantillons :
Dénoyauter 50 g de dattes Deglet Nour.
Broyer la pulpe dans un mortier avec 100 mL de phosphate buffer (pH 6,5) et 1
g de PVP.
Ajouter quelques gouttes de Triton X-100 pour faciliter l'extraction des enzymes
membranaires.
Filtration et centrifugation :
Filtrer le broyat à travers une étamine pour éliminer les débris cellulaires.
Centrifuger le filtrat à 10 000 g pendant 20 min à 4°C.
Récupérer le surnageant, qui contient les enzymes solubles.
Précipitation des protéines :
Ajouter progressivement du sulfate d'ammonium au surnageant jusqu'à atteindre
80% de saturation.
Laisser reposer 1 h à 4°C pour permettre la précipitation des protéines.
Centrifuger à 10 000 g pendant 20 min.
Récupérer le culot de protéines et le dissoudre dans 10 mL de phosphate buffer.
Dialyse :
Transférer l'extrait protéique dans une membrane de dialyse.
Dialyser contre 2 L d'eau distillée pendant 24 h à 4°C pour éliminer les sels
résiduels.
Changer l'eau de dialyse toutes les 6 h.
Dosage des protéines :
Utiliser la méthode de Bradford pour quantifier les protéines totales.
Préparer une gamme étalon avec de la sérum albumine bovine (BSA).
Mesurer l'absorbance à 595 nm et déterminer la concentration en protéines de
l'extrait.
Mesure de l'activité enzymatique :
Préparer une solution de catéchol à 0,1 M dans du phosphate buffer (pH 6,5).
Mélanger 0,1 mL d'extrait enzymatique avec 2,9 mL de solution de catéchol.
Mesurer l'absorbance à 420 nm toutes les 30 secondes pendant 5 min à l'aide
d'un spectrophotomètre.
Calculer l'activité enzymatique en unités internationales (UI), où 1 UI
correspond à l'oxydation de 1 µmol de catéchol par minute.
3. Résultats
3.1. Rendement d'extraction
Volume final d'extrait enzymatique : 405mL.
Concentration en protéines : 150mg/mL.
3.2. Activité des PPO
Graphique de l'absorbance en fonction du temps.
3.3. Effet du pH et de la température
L'activité des PPO a été mesurée à différents pH (4,0 à 8,0) et températures
(20°C à 60°C).
4. Discussion
L'extraction des PPO a été efficace, avec un rendement en protéines conforme
aux attentes.
L'ajout de PVP et de Triton X-100 a permis d'optimiser l'extraction en
minimisant les interférences.
L'activité enzymatique mesurée est cohérente avec les valeurs rapportées dans la
littérature pour d'autres variétés de dattes.
Le pH et la température optimaux sont typiques des PPO végétales. e pH
optimal est de 6,5 et la température optimale est de 35°C.