Filière: Biotechnologie Agroalimentaire (BA)
Semestre 5
Module : Biologie Moléculaire
Travaux pratique
TP
Introduction
L’ADN est la molécule essentielle de tous les organismes vivants. Elle porte l’information
génétique faisant d’un organisme ou d’une cellule ce qu’elle est. La structure de l’ADN (acide
désoxyribonucléique) est composée de groupement phosphate lié à un sucre (le désoxyribose) qui
est lui-même fixé à une des 4 bases azotées, A (adénine), C (cytosine), G (guanine), T thymine).
Un groupe « phosphate-sucre-base azotée » constitue un nucléotide. Les nucléotides sont liés les
uns aux autres pour former un brin d’ADN. L’ADN est donc un polymère de nucléotides. Deux
brins d’ADN interagissent entre eux par les bases azotées formant une molécule d’ADN double
brin. Cette molécule est similaire à une échelle dans laquelle les groupements phosphate-ribose
constitueraient les montants et les bases azotées formeraient les barreaux. Les deux brins d’ADN
dans cette échelle sont en orientation opposées (antiparallèle). Cette échelle est torsadée donnant
la fameuse forme de double hélice à l’ADN double-brin.
La distance entre 2 résidus est de 0.34 nm (0.34 x 10-9 m). 1 tour d’hélice contient 10 paires de
bases (3,4 nm). Le diamètre de l’hélice d’ADN est de 2 nm. La taille d’un génome humain est de
3.2 milliard de paires de bases par génome haploïde soit 6.4 milliard de paires de bases réparties
sur les 23 paires de chromosomes. Mis bout à bout, cela donne plus de 2 mètres d’ADN par cellule
! Pour empaqueter tout cet ADN dans le noyau, l’ADN est fortement replié et compresser avec
l’aide de protéines pour former la chromatine. L’empaquetage extrême de l’ADN forme les
chromosomes mitotiques.
Figure 1 : La structure de l’ADN (acide désoxyribonucléique).
Expérience et l’objectif du TP
Il existe de nombreux protocoles pour extraire simplement de l’ADN de différents organismes
vivants. Nous allons vous en présenter 2, l ’un à partir de banane et l’autre à partir d’oignon. Ces
expériences ne nécessitent aucun appareillage particulier et peuvent être effectuées à l'aide de
produits achetés en grandes surfaces. Il est à noter que l’ADN obtenu n’est pas d’excellente qualité.
Il ne permettrait pas d’effectuer des expériences fines de biologie moléculaire. L’ADN ainsi
purifier est en effet encore contaminé par d’autres molécules (comme des protéines) et est
probablement partiellement dégradé par des nucléases. Cependant ces protocoles permettent de
visualiser facilement son propre ADN et d’apprécier l’aspect filamenteux de cette molécule.
Protocole
1) Purée de banane et d’oignon
Peler une banane
Couper la banane en 2
Écraser la moitié de la banane avec une fourchette dans un bécher
Cette étape permet de désagréger les tissus et de fragiliser les parois cellulaires.
2) Lyse des cellules
Ajouter 50 ml d’H20, 2 cuillères à café de sel de cuisine et une cuillère de liquide vaisselle.
Mélanger délicatement avec la fourchette afin d’obtenir une mixture homogène.
Le détergent permet de lyser les cellules en dissolvant les membranes cellulaires. L’ADN est ainsi
libéré. Le détergent permet également de débarrasser une partie des protéines liées à l’ADN. Le sel
permet de neutraliser les charges négatives (portées par les groupements phosphates) de l’ADN en
éliminant les molécules d’H2O qui entoure la double hélice. Cela permettra ainsi sa précipitation
dans l’alcool.
3) Elimination des débris
Passer le mélange à travers un filtre à café. Le mélange est très visqueux. Pour faciliter la
filtration il convient de presser le filtre pour faire passer la solution.
Récupérer le filtrat
Refiltrer une deuxième fois à travers un nouveau filtre à café comme précédemment.
Récupérer le filtrat.
La filtration permet de retenir les débris cellulaires et les morceaux de tissus non désagrégés.
4) Précipitation de l’ADN
Prélever 3 ml de filtrat et les transférer dans un tube 12 ou 15 ml.
En inclinant le tube, ajouter délicatement 8 ml d’alcool à bruler.
L’alcool reste au-dessus du filtrat. Ne pas secouer le tube.
5) Visualisation de l’ADN
L’ADN précipite en formant une « pelote », qui remonte lentement à la surface.
A l’aide d’un cure-dent il est possible de prélever la pelote et de se rendre compte de l’aspect
visqueux des filaments d’ADN.
L’alcool est de densité plus légère que l’eau reste au-dessus. L’ADN, insoluble dans l’alcool, va
précipiter, formant un amas blanchâtre de filaments qui s’échappe de la phase inférieure. Tourner
ou incliner délicatement le tube si l’ADN n’arrive pas sortir de cette phase. Il s’agit ici de millions
de filaments d’ADN provenant de nombreuses cellules.
6) Coloration d’ADN
Ajouter une goutte de vert de méthyle pour colorer la molécule d’ADN