Des bactéries commensales modifiées
reprogramment les cellules intestinales en cellules
sécrétant de l'insuline sensibles au glucose pour le
traitement du diabète
Objet d’étude :
Des études se sont concentrées sur la reprogrammation de cellules non β en
cellules β ou en cellules ayant un potentiel de sécrétion d'insuline. Ces études
ont exploré divers domaines, notamment la génération cellulaire in vitro à partir
de cellules pancréatiques et hépatiques en vue d'une transplantation et la
conversion in vivo de cellules pancréatiques ou d'autres cellules spécifiques de
tissus en cellules β. Suzuki et al. ont découvert que la longueur totale du GLP-
1(1-37), auparavant considéré comme inactif, pouvait stimuler l'épithélium
intestinal du rat à devenir des cellules sensibles à l'insuline, notamment via la
voie de signalisation Notch. L'étude a également démontré l'inversion du diabète
de type 1 causé par la streptozotocine chez le rat adulte après une implantation
chirurgicale de jéjunum embryonnaire (E14.5) incubé avec du GLP-1(1-37) in
vitro.
Cependant, l'étude a également souligné la difficulté d'administrer ce composé
bioactif par injection et chirurgie. La forme active du GLP-1 est le GLP-1(7-37),
dont la demi-vie biologique dans le sang est courte. Ceci pourrait expliquer les
taux de reprogrammation plus faibles observés chez le rat adulte, car il
nécessiterait une circulation sanguine plus longue pour atteindre les cryptes
intestinales.
D'autres méthodes d'administration de composés bioactifs au niveau de la
lumière intestinale ont été publiées, utilisant des bactéries commensales
intestinales capables de sécréter des signaux spécifiques. Des études antérieures
ont montré que des cultures bactériennes modifiées peuvent administrer du
GLP-1(1-37) aux carcinomes intestinaux humains et stimuler la sécrétion
d'insuline. L'étude visait à reprogrammer des cellules intestinales de rat en
cellules insulino-sensibles par administration quotidienne par voie orale de
bactéries GLP-1(1-37) modifiées.
Conception et méthodes de recherche
1 Construction de la souche :
Pour transformer Lactobacillus gasseri ATCC 33323 (L) en une souche
sécrétant du GLP-1(1-37), des techniques constitutives standard ont été utilisées.
N.B : Nous avons appelé les intégrants positifs LG.
Les études ont été menées conformément aux protocoles approuvés par le
comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'université
Cornell. Toutes les expériences sur les rats ont été répétées deux fois, avec six
rats par groupe de traitement.
2 Procédure :
Les rats ont été mis à jeun pendant 6 heures avant de recevoir une injection
intrapéritonéale de STZ (la streptozotocine ) à la dose de 70 mg/kg de poids
corporel dans un tampon froid de citrate de sodium 0,1 mol/L, pH 4,2. La
glycémie a été surveillée tous les 3 jours jusqu'à l'atteinte d'une glycémie
diabétique (> 350 mg/dL). Une fois que les rats ont maintenu une glycémie
supérieure à 350 mg/dL, ils ont été inclus dans l'étude.
3 Alimentation bactérienne :
Lors de cette étude, les rats ont reçu de l'eau traitée à l'ampicilline (1 g/L)
pendant 18 h . Des souches de Lactobacillus LG (2 µg/mL d'érythromycine) ou
L ont été cultivées dans un milieu MRS. Le culot obtenu a été redissous dans du
MRS stérile avec 1 % de saccharose. Les rats ont été nourris avec 1,6 mL/kg de
poids corporel de MRS avec 1 % de saccharose contenant 10 10 UFC/mL de souches de
Lactobacillus cultivées en MRS séparément (L ou LG). Tous les rats nourris
avec la souche bactérienne ont été nourris avec des bactéries 2 fois par jour
pendant 90 jours.
Test de tolérance au glucose et ELISA
Après 51 jours d'alimentation bactérienne, les rats traités au STZ ont été mis à
jeun pendant 10 heures, pesés et un échantillon de sang a été prélevé dans la
veine caudale à l'aide de tubes capillaires à microhématocrite héparinés (Fisher,
PA). Ils ont ensuite reçu par voie orale 1 g de glucose/kg de poids corporel, et
des échantillons de sang ont été prélevés à 0,5, 1, 1,5 et 2 heures. La glycémie a
été mesurée à l'aide du système de surveillance de la glycémie Breeze2.
L'insuline plasmatique a été mesurée à l'aide du kit ELISA Rat/Mouse Insulin
(Millipore, MA) conformément aux instructions du fabricant.
Homogénéisation des tissus du pancréas et de l'intestin supérieur,
prélèvement sanguin et test ELISA
Après 90 jours d'alimentation bactérienne, les rats ont été sacrifiés. Leur
pancréas et leurs intestins ont été prélevés et congelés à −80 °C jusqu'à l'analyse.
Pour chaque rat, le pancréas et la partie supérieure de l'intestin ont été pesés et
homogénéisés séparément à l'aide d'un mortier réfrigéré contenant du PBS 1×.
L'insuline a été dosée pour le pancréas et la partie supérieure de l'intestin à l'aide
du kit ELISA Rat/Mouse Insulin (Millipore, MA), conformément aux
instructions du fabricant.
Dénombrement des colonisations bactériennes
Après 90 jours d'alimentation, les rats ont été transférés dans de nouvelles cages
pendant 3 jours. Les excréments ont été collectés dans les nouvelles cages et les
rats ont été euthanasiés. Trois rats de chaque traitement ont été disséqués et leurs
voies digestives supérieures (GI) ont été prélevées. Chaque voie digestive
supérieure a été pesée et homogénéisée dans 2 mL de milieu MRS frais. Le tissu
homogénéisé a été étalé sur MRS avec de l'érythromycine (2 µg/mL) par
dilutions successives. Les boîtes ont été incubées toute la nuit à 37 °C et leurs
colonies ont été comptées.
Immunofluorescence
L'étude consistait à fixer des tissus de l'intestin grêle, du pancréas et du foie de
rats nourris avec L ou LG pendant 90 jours, et à examiner les cellules IEC-6.
Les tissus ont été fixés et disséqués, et les lames ont été étuvées au citrate. Après
lavage dans du PBS, une solution de blocage à 10 % a été appliquée pendant 1
heure à température ambiante. Deux cents microlitres de formaldéhyde ont été
ajoutés aux cellules IEC-6 dans des plaques à six trous. Les cellules ont été
lavées trois fois dans du PBS pendant 5 minutes chacune, et une solution de
blocage à 10 % a été appliquée pendant 1 heure à température ambiante. Pour
tous les tissus et les cellules IEC-6, une dilution à 1:500 d'anti-PDX-1, d'anti-
insuline, d'anti-GLP-1, d'anti-HNF-6, d'anti-chromogranine A, d'anti-lysozyme,
d'anti-SOX-9, d'anti-saccharase isomaltase, d'anti-glucagon ou d'anti-FoxA2 a
été appliquée sur les cellules bloquées. Après quatre lavages en PBS, un
anticorps conjugué à un fluorochrome a été appliqué sur les blocs pendant 1,5
heure à température ambiante. Les blocs ont ensuite été montés avec du
Vectashield avec DAPI et examinés immédiatement à la longueur d'onde
d'excitation appropriée pour chaque fluorophore. Les images ont été prises avec
un microscope confocal Zeiss 710.
RT-PCR
L'ARN total a été isolé des intestins de rats nourris avec LG ou L, ainsi que du
pancréas et du foie de rats témoins sains à l'aide du kit RNAqueous (Life
Technologies, NY). L'ADNc a été synthétisé par le kit SuperScript III First-
Strand (Invitrogen, CA).
Culture cellulaire IEC-6 avec GLP-1(1-37) et petit ARN interférent et ELISA
Des monocouches confluentes à 60 % de cellules IEC-6 dans des lames de culture à
quatre compartiments ont été recouvertes de 1 ml de DMEM avec 10 % de FBS et
10 µg/mL d'insuline, incubées à 37 °C avec 5 % de CO 2 . La transfection par petit
ARN interférent (siRNA) a été réalisée conformément au manuel du fabricant. Après
24 h, 200 nmol/L, 400 nmol/L ou 2 μmol/L de GLP-1(1-37) (Bachem, King of Prussia,
PA) ou 1× PBS ont été ajoutés séparément dans différents puits. Après une
incubation de 16 h, les cellules ont été lavées trois fois avec du DMEM contenant 10
% de FBS, puis 1 ml de DMEM contenant 10 % de FBS plus 200 nmol/l, 400 nmol/l
ou 2 μmol/l de GLP-1(1-37) ou de GLP-1(7-37) a été ajouté aux cellules, complété
par 0,4 % de glucose pendant 2 h supplémentaires. Le milieu a été retiré des
cellules, complété par de la leupeptine (10 ng/ml), du fluorure de
phénylméthylsulfonyle à 0,2 mmol/l et de l'aprotinine (10 ng/ml) ; centrifugé (12 000
tr/min ; Eppendorf 5804 R, Westbury, NY) ; et conservé brièvement à 4 °C avant
l'analyse ELISA pour l'expression de l'insuline.
L'insuline a été mesurée à l'aide du kit ELISA Rat/Mouse (Millipore, MA)
conformément aux instructions du fabricant. Les cellules IEC-6 traitées ont été
utilisées pour la RT-PCR ou l'immunofluorescence pour l'expression génétique
spécifique.
4 Analyse statistique
L’étude a comparé les donnés du test de tolérance au glucose par voie orale
(HGPO) et de la glycémie à jeun ont été comparées à l’aide d’estimations de
l’aire sous la courbe (ASC) sur la période spécifiée. Plus précisément, les
données de l’Aire Sous la Courbe des rats dans des différents conditions ont été
regroupées en intégrants positifs (LG) ou L , ensuite elles ont été comparées à
celles des rats témoins à l’aide d’une ANOVA à facteur ; qui permet l’analyse
de variance à travers des modèles statistiques. Le test de Dunnett est dans
l’utilité pour les comparaisons multiples avec un groupe témoin, il a été utilisé
pour déterminer les différences significatives , ces dernières ont été considérées
« significatives » lorsque α < 0,05 ( n = 6).
5 Résultats
Sécrétion bactérienne de GLP-1(1-37) dans le tractus intestinal supérieur
du rat
Il a été conçu pour sécréter GLP-1(1-37) en utilisant le promoteur SlpA et
l'étiquette de sécrétion USP45-LEISS (SEC)(LG). Une étiquette polyhistidine
(HIS) a été ajoutée à l'extrémité N-terminale (pour le Western blot) séparée par
un site entérokinase afin que la protéine soit séparée de l'étiquette une fois
sécrétée dans l'intestin. La sécrétion de GLP-1(1-37) a été vérifiée en culture. La
fraction sécrétée de GLP-1(1-37) a été récupérée du milieu de culture (milieu) et
comparée à celle qui était encore dans le culot cellulaire (cellules).
Les rats ont été nourris deux fois par jour avec du L( Lactobacillus gasseri) , du
LG( intégrants positifs) ou un milieu stérile pendant 90 jours. À la fin de
l'expérience, les intestins de chaque rat ont été homogénéisés et des numérations
bactériennes ont été effectuées afin d'établir le niveau de colonisation du tractus
gastro-intestinal supérieur et de le comparer aux numérations dans les fèces. Ces
données montrent clairement que les souches bactériennes ont colonisé les
intestins. Il n'y avait aucune différence entre L et LG dans la colonisation des
selles. Il convient de noter que L n'était pas résistant aux antibiotiques ; les
numérations sont donc bien plus élevées que LG en raison de l'absence de
pression sélective. Pour compter les quantités totales de Lactobacillus présentes
dans les intestins supérieurs des rats, les homogénats ont été étalés sur des
géloses MRS (utilisée pour la culture et le dénombrement des bactéries
lactiques) qui sélectionnent principalement et sans antibiotiques les souches de
Lactobacillus . Pour les rats nourris avec du LG ou du L, les numérations étaient
presque identiques, ce qui indique que les deux souches n'ont que peu modifié le
nombre total de lactobacilles dans les homogénats. Pour sélectionner
uniquement LG, l'érythromycine a été utilisée comme marqueur de sélection.
Les numérations plus faibles sur les plaques d'érythromycine, comparées aux
plaques MRS indiquaient la différence de colonisation entre les lactobacilles
natifs cultivables du rat et LG.
Les rats diabétiques nourris avec du LG ont été colorés positivement pour le
GLP-1(1-37) dans leurs intestins supérieurs comme le révèle
l'immunofluorescence, utilisant des anticorps qui réagissent spécifiquement
avec les six premiers acides aminés du [Link] résultats du LG sont
présentés, tandis que les rats nourris avec du L ou du tampon n'ont pas présenté
de coloration similaire. La quantification de la couverture a été réalisée en
scannant des images de sections intestinales et en estimant le pourcentage de la
surface intestinale qui était colorée positivement pour le GLP-1(1-37). La
quantité de coloration de fond peut être observée avec le témoin L.
La capacité de la LG à restaurer partiellement l'euglycémie( taux normale de
glucose dans le sang) dans un modèle de rat diabétique médicamenteux a été
testée. Les résultats représentatifs de ces expériences sont présentés ci-dessous.
Réduction de l'hyperglycémie dans un modèle de diabète de type 1 à
médiation STZ
Des rats Wistar femelles âgés de six à huit semaines ont reçu une injection de
STZ afin de réduire spécifiquement leur masse de cellules bêta. Dès l'apparition
de l'hyperglycémie, les groupes de rats ont été nourris soit avec des bactéries
LG, soit avec des bactéries L et toutes les bactéries ont été administrées deux
fois par jour. À titre de contrôle euglycémique, un groupe témoin de rats n'a reçu
aucun traitement par STZ et a été nourri uniquement avec des milieux stériles
plutôt qu'avec des bactéries. Le poids des rats et leur glycémie à jeun ont été
surveillés pendant 90 jours. Les glycémies à jeun ont été comparées par des
calculs d'ASC.
Après 50 jours de traitement bactérien commensal, les rats ont été soumis à un
HGPO. Les données ont été comparées à l'aide de l'ASC et d'une ANOVA à un
facteur avec test de Dunnett pour la signification. Comparés aux rats témoins
non diabétiques, les rats diabétiques nourris au L présentaient à la fois une
glycémie plus élevée et une insuline plasmatique plus faible ( P = 0,0037 et
0,0059, respectivement). La glycémie et l'insuline plasmatique n'étaient pas
significativement différentes entre les rats nourris au LG et les rats témoins non
diabétiques ( P = 0,0903 et 0,9284, respectivement). À la fin de la période de
traitement de 90 jours, des pancréas et des intestins ont été prélevés sur les rats
de l'étude et les pancréas ont été fixés et immuno-colorés pour le glucagon.
Il y avait des différences significatives dans les ratios de cellules positives au
glucagon par rapport au total des cellules pancréatiques entre les rats nourris
avec LG et les rats témoins par rapport aux rats nourris avec L .Les pancréas ont
également été scannés pour le nombre de cellules Les rats nourris avec L avaient
légèrement plus de cellules β restantes que les rats nourris avec LG. On a estimé
que les rats témoins avaient plus de 17 fois plus de cellules β restantes que
les autres traitements. Les intestins et les pancréas de rat ont été homogénéisés
pour déterminer le niveau d'insuline dans chacun .Les mesures de l'insuline dans
l'intestin supérieur par gramme de tissu ont indiqué que seuls les rats nourris
avec LG exprimaient plus d'insuline dans leurs intestins que les rats témoins
normaux. En moyenne, les rats nourris avec LG présentaient des niveaux
d'insuline dans leurs tissus intestinaux supérieurs plus de cinq fois supérieurs à
ceux des rats nourris avec L ou des rats témoins. Dans le tissu pancréatique, il
n'y avait pas de différence dans les niveaux d'insuline par gramme de tissu entre
les rats nourris avec LG et L, mais jusqu'à trois fois plus d'insuline par gramme
de tissu chez les rats témoins par rapport aux rats diabétiques (LG et L ).
Lorsque les tissus de l'intestin supérieur et du pancréas ont été pesés, les
estimations de l'insuline totale ont indiqué que les rats nourris avec LG avaient
en moyenne 60 % plus d'insuline totale (intestins et pancréas combinés) que les
rats nourris avec L. Les rats témoins avaient presque deux fois plus d'insuline
totale dans ces tissus que les rats nourris avec LG.
Analyse in vitro de la stimulation de l'insuline épithéliale humaine et du
GLP-1 dans le sérum de rat
Pour exclure toute stimulation potentielle de la production d'insuline dans les
cellules intestinales par la forme active du GLP-1 [GLP-1(7-37)], un test in vitro
sur un épithélium humain a été développé pour comparer les niveaux relatifs de
production d'insuline , médiateur par le glucose après stimulation par GLP-1(7-
37) ou GLP-1(1-37). Il a été observé que le GLP-1(1-37) stimule les cellules
Caco-2 à sécréter de l'insuline en réponse au glucose d'une manière dose-
dépendante (bien que les différences ne soient pas significatives, les moyennes
ont évolué en fonction de la dose de GLP-1). Le GLP-1(7-37) n'a stimulé aucune
sécrétion significative d'insuline.
Le sang des rats représentatifs de tous les groupes de cette étude a été analysé
pour détecter la présence de GLP-1 et toute modification pouvant survenir suite
à l'alimentation de bactéries sécrétant du GLP-1(1-37). Les tests ELISA
(technique de dosage immunologique qui permet la détection d'un antigène ou
d'un anticorps dans un échantillon) ont indiqué qu'il n'y avait pas de différence
significative dans les taux sanguins de GLP-1(7-37) ou de GLP-1(1-37) (par
courbe de conversion) chez les rats des groupes LG, L ou témoins.
Discussion
L'utilisation de souches bactériennes pour administrer des composés au tractus
intestinal supérieur a fait l'objet de plusieurs études et articles de synthèse. Bien
que le succès dans ce domaine ait été limité, l'utilisation de bactéries
commensales modifiées pour modifier la différenciation des cellules intestinales
n'a pas encore été démontrée. Les travaux décrits ici démontrent le potentiel de
l'administration bactérienne d'un composé au côté luminal de l'intestin supérieur
afin de contrôler le devenir des cellules épithéliales. L'objectif de cette étude
était de tester l'hypothèse selon laquelle l'administration de la forme inactive du
GLP-1 [GLP-1(1-37)] au côté luminal de l'intestin supérieur à l'aide de souches
bactériennes commensales modifiées pourrait servir de traitement de
l'hyperglycémie.
Chez les rats ayant reçu une dose élevée de STZ pour ablater leurs cellules bêta
pancréatiques, l'hyperglycémie a été significativement réduite par l'ingestion de
bactéries sécrétant du GLP-1(1-37). Le mécanisme de réduction de la glycémie
semble provenir de cellules intestinales reprogrammées pour sécréter de
l'insuline en réponse au glucose, comme le montrent l'augmentation de l'insuline
intestinale la présence de cellules endocrines sécrétant de l'insuline dans
l'intestin la présence d'ARNm d'insuline dans le tissu intestinal et le résultat in
vitro selon lequel le GLP-1(1-37) convertit les cellules de rat en cellules
sécrétant de l'insuline. De plus, la sécrétion d'insuline chez les rats nourris avec
du LG a suivi la même cinétique et n'était pas significativement différente de la
sécrétion d'insuline chez les rats témoins sains, indiquant que leur capacité
accrue de production d'insuline est sensible au glucose, comme cela a été
démontré in vitro avec des cellules intestinales humaines.
L'épithélium intestinal de rat reprogrammé pour sécréter de l'insuline exprimait
d'importants marqueurs des cellules β PDX-1, MafA et FoxA2. Ces protéines
sont toutes essentielles au fonctionnement normal des cellules β et sont
exprimées de manière différentielle dans le tissu pancréatique en réponse au
glucose et à l'insuline De même, dans ce travail, il a été montré que les cellules
reprogrammées exprimaient divers niveaux de PDX-1 et, comme c'est le cas
pour les cellules pancréatiques et intestinales normalement, dans certains cas,
ne parvenaient pas à transloquer PDX-1 du cytosol au compartiment nucléaire,
indiquant un contrôle actif des niveaux d'insuline plutôt qu'un contrôle
constitutif. Ce phénomène a également pu être observé avec la production de
ChrA. Avec ChrA, comme avec PDX-1, les niveaux variaient entre les cellules
individuelles exprimant l'insuline. La régulation de PDX-1 par FoxA2 est une
partie importante du développement pancréatique chez les rongeurs et ajoute à la
complexité de l'expression de PDX-1.
Ces données suggèrent qu'au moins certaines cellules reprogrammées conservent
une fonction entéroendocrine et ont la capacité d'agir comme des cellules
endocrines multifonctionnelles avec une fonctionnalité de cellule β. Ce
changement est probablement médié par l'expression de HNF-6, qui est essentiel
au développement normal pour la transition précoce entre l'endoderme intestinal
et les cellules pancréatiques exprimant PDX-1. Cependant, l'expression continue
de HNF-6 dans les cellules β matures conduit à la perte de la fonction
pancréatique et à l'apoptose . Nos recherches in vivo suggèrent que l'expression
de HNF-6, qui n'a été observée que dans les cellules sécrétant de l'insuline dans
les cryptes de l'intestin, et non dans les cellules insulino-positives plus bien
différenciées le long de l'axe villeux, transforme les cellules entéroendocrines
potentielles en cellules de type β qui migrent ensuite normalement vers le haut
de l'axe tout en cessant d'exprimer HNF-6 à des niveaux détectables. Le fait que
la perte de la fonction du GLP-1R via l'ARN interférent élimine la
reprogrammation indique que le GLP-1R est essentiel à cet effet, bien que le
mécanisme exact d'activation du HNF-6 reste à déterminer.
D'après les données présentées ici, les auteurs concluent que l'administration de
bactéries sécrétant du GLP-1(1-37) à des rats diabétiques peut induire une
production d'insuline sensible au glucose, réduisant ainsi significativement la
glycémie. Bien qu'une caractérisation supplémentaire soit nécessaire, le
mécanisme de sécrétion d'insuline semble provenir de cellules endocrines
intestinales transformées. Étant donné que les rats ont été alimentés avec une
forme inactive de GLP-1 qui ne stimule pas la sécrétion d'insuline par les
cellules β, il est peu probable que cette approche ait entraîné une augmentation
de la production d'insuline par les cellules β restantes. L'analyse
morphométrique pancréatique a indiqué que le nombre de cellules β n'était pas
amélioré chez les rats nourris avec des bactéries sécrétant du GLP-1.
L'homogénéisation des tissus a révélé que l'insuline chez les rats nourris avec
des bactéries sécrétant du GLP-1 provenait de l'intestin. Des travaux
supplémentaires sont nécessaires pour mieux comprendre comment le récepteur
du GLP-1 stimule l'activation de HNF-6.