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Extraction d'ADN par lyse alcaline

Le document présente une méthode d'extraction de l'ADN plasmatique d'E. coli, incluant des techniques de lyse cellulaire, dissociation des protéines, et élimination des ARN. Il décrit les étapes de préparation des solutions nécessaires et les réactions chimiques impliquées dans le processus d'extraction. Les résultats finaux sont obtenus par précipitation et lavage de l'ADN dans un tampon stérile.

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Extraction d'ADN par lyse alcaline

Le document présente une méthode d'extraction de l'ADN plasmatique d'E. coli, incluant des techniques de lyse cellulaire, dissociation des protéines, et élimination des ARN. Il décrit les étapes de préparation des solutions nécessaires et les réactions chimiques impliquées dans le processus d'extraction. Les résultats finaux sont obtenus par précipitation et lavage de l'ADN dans un tampon stérile.

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Compte rendu 1 : Génie génétique

Encadré par :
Mme. SOUMYA ELOBED

Réalisé par
- Salma el jebbari
- chaimae el karrouti
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But de TP :
Extraction de l’ADN plasmatique d’E. coli
Technique d’extraction d’ADN :
- Lyse des cellules
3 Méthodes possibles :
Physique : comme exemple la lyse hypotonique ou broyage
Chimique : comme la lyse détergente
Digestion enzymatique : comme protéinase K

- Dissociation des protéines


Utilisation d’un détergent comme SDS ou/et en faisant agir une protéase comme la
protéinase K

- Elimination des protéines et des lipides


Par traitement du phénol-chloroforme (solvant organique) qui dénature les protéines.
Apres mélange du lysat des cellules avec ces solvant et centrifugation on obtient :

Phase aqueuse

Phase
organique

- Précipitation de l’ADN
Dans une solution finale a 67% accélérer par le froid
Centrifugation et récupération de l’ADN sous forme de culot au fond de tube
Lavage de culot par l’éthanol 70% pour éliminer les sels et ensuite sécher pour éliminer
toute trace d’alcool
Récupération d’acide nucléique dans un tampon stérile a PH 7-8 additionne d’EDTA et
conserve au froid (4°C-20°C)

- Elimination de l’ARN par RNase


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Manipulation
Extraction d’ADN plasmide de E coli est réalisée par la technique de la lyse
alcaline
- Repiquer une colonie contenant le plasmide dans 5ml de LB contenant la
kanamycine (facteur de sélection) a (50 ug/ml). Incuber une nuit à 37 °C
- préparation de 3 solutions :

1- Solution de resuspension
Centrifugation 1,5 ml de la culture bactérienne obtenue 5 min a 5000 rpm dans
100ul de la solution 1 :
*Les rôles :
GLUCOSE 200 mM : empêche la lyse des cellules (isotonie), fragiliser un peu la
paroi des cellules
Tris HCl 10 mM : Empêche la dégradation de l’ADN par diminution d’activité de
nucléase
EDTA 100 mM : se lie a Mg2+ et bloqué son interaction avec le nucléase

INITIAL FINAL

Glucose 200mM glucose 50mM


EDTA 100mM EDTA 10mM
Tris Hcl 10mM Tris Hcl 25mM

[Link] = [Link] avec Vf =2ml


- Vi glucose= o,5 ml
- Vi Tris HCl = 0,5 ml
- Vi EDTA = 0,2ml
- Vi eau = 0,8 ml
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2- Solution de lyse alcalin Ph 13 :


On ajoute 200 ul de la solution 2 :
*Les rôles :
NaOH 0,2 M : dénaturation d’ADN plasmide reste circulaire
ADN se linéariser
SDS 1% : dégradation de membrane cellulaire, sort d’Adn

[Link] = [Link]
INITIAL FINAL SDS 1% : 1 → 100 ml
NaOH 5M NaOH 0,2 M X → 2 ml
SDS 2ml SDS 1% X=0,02 ml
Vi NaOH : 0,08ml
3- Solution de Neutralisation : rappariement :

- Ajoute de 150 ul d’acétate de potassium 5M pour rappariement des


brins du duplexe d’ADN puis centrifugation a 5000rpm pendant 5 min

- L’ajout d’1 volume (Solution 1 ‘100ul’ + Solution 2 ‘200ul’ + Solution 3


‘150’ =450 ul) de phénol-chloroforme alcool isoamylique qui sépare la
phase organique et aqueuse, puis centrifugation a 10000 rpm pendant 5
min

- L’ajout de 2 volumes = 900 ul d’éthanol pour précipitation d’ADN absolu


froid

- Incubation 30 min puis centrifugation

- Lavage a l’éthanol 70%

- Reprendre le culot dans de TE avec l’ARNase


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