90-60-0015-A
Principe de l’amplification en chaîne
par polymérase
I. Vassias
La technique d’amplification en chaîne par polymérase (polymerase chain reaction [PCR]) permet
l’amplification d’une séquence d’acide désoxyribonucléique (ADN). Elle emploie des amorces d’ADN qui
s’hybrident spécifiquement à une cible. Une enzyme ADN polymérase permet de recopier l’ADN cible à
partir de ces amorces. Cette étape, répétée une trentaine de fois, aboutit à une amplification exponentielle
de la cible qui n’en devient que mieux détectable. La détection est réalisée a posteriori par les techniques
classiques d’hybridation moléculaire employant des sondes spécifiques, ou en temps réel à l’aide de mar-
queurs fluorescents. L’utilisation d’une transcriptase inverse qui transforme l’acide ribonucléique (ARN)
en ADN avant les cycles de PCR peut permettre l’amplification d’ARN (RT-PCR). Cette méthode mise au
point en 1985 a révolutionné le diagnostic des maladies infectieuses mais aussi des maladies génétiques
et des cancers.
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Mots clés : PCR ; Acides nucléiques ; ADN polymérase ; Transcriptase inverse ; PCR multiplexe ;
PCR spécifique d’allèle ; Nested PCR
Plan 1985, Mullis (Californie, États-Unis, Prix Nobel en 1993) décrit
une méthode d’amplification in vitro d’ADN : la technique de
■ Principes de la technique 1 polymerase chain reaction (PCR) ou amplification en chaîne par
■
polymérase (ACP), en français [1, 2] .
Préparation des ADN à amplifier 1
Elle est fondée sur l’utilisation d’une enzyme polymérase qui
■ Amplification proprement dite 2 permet de recopier à partir d’une amorce une séquence cible
Dénaturation de l’ADN 2 connue de façon exponentielle et donc de la détecter plus faci-
Hybridation des amorces 2 lement par des techniques d’hybridation moléculaire classiques.
Élongation des amorces 2 Cette enzyme, la Taq polymérase est la clé de cette technique
■ Détection des amplicons 2 car elle est très stable à des températures élevées. Elle reste fonc-
PCR en point final 2 tionnelle durant les nombreux cycles de la PCR. Plus tard, cette
PCR en temps réel 3 technique a été adaptée à l’amplification d’ARN.
■ Avantages et inconvénients 3
■ Quelques variantes de la technique de PCR 3
RT-PCR 3 Préparation des ADN à amplifier
« Nested » PCR 4
PCR multiplexe 4 De nombreux échantillons peuvent être utilisés pour
PCR spécifique d’allèles 4 l’amplification par PCR : sang total, plasma, sérum, biopsie,
urines, ponctions, écouvillonnage, expectoration, liquide cépha-
lorachidien, etc. La préparation de l’ADN sera différente suivant
le type d’échantillon. Cependant elle comporte toujours trois
étapes.
Principes de la technique Une première étape de lyse : l’ADN à amplifier doit être libéré des
cellules dans lesquelles il se trouve. Parfois une simple ébullition
La mise en évidence d’acides nucléiques dans un milieu suffit (comme pour un mycoplasme) ou bien un traitement plus
biologique a d’abord été réalisée grâce aux méthodes simples drastique doit être appliqué comme dans la préparation d’ADN
d’hybridation moléculaire : une séquence cible donnée est hybri- génomique ou de certains microorganismes. La technique la plus
dée avec une sonde complémentaire dotée d’un élément qui peut classique consiste à une lyse par la protéinase K en présence d’un
être facilement révélé. Néanmoins, ces techniques ne permet- détergent (SDS, Tween 20, Nonidet P40, etc.). Ceci a pour but
taient pas de détecter des faibles quantités de séquences cibles de dissocier les cellules, les tissus, les enveloppes et de libérer les
comme c’est souvent le cas en microbiologie. C’est pourquoi, en acides nucléiques.
EMC - Biologie médicale 1
Volume 90-60-0015-A 2012
doi:10.1016/S2211-9698(12)56773-7
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Ensuite les ADN sont extraits du mélange protéique le plus sou- salin adéquat, tous en large excès en regard de l’ADN cible. Le tube
vent par la méthode d’extraction phénol-chloroforme. Le lysat est placé dans un thermocycleur qui permet de monter le tube à la
est mélangé au phénol alcalin qui est un agent déprotéinisant. bonne température très rapidement. Chaque cycle dure environ
Après centrifugation, l’ADN se retrouve dans une phase aqueuse entre 1 et 3 minutes suivant le type d’appareillage.
dépourvue de protéines. Il est traité au chloroforme de façon à
éliminer les traces de phénol, puissant inhibiteur de la PCR. Cette
étape classique est remplacée dans de nombreuses trousses de Dénaturation de l’ADN
détection par l’utilisation d’agents adsorbant de l’ADN comme Elle permet de séparer par la chaleur les deux brins d’ADN. Le
de la silice, des particules de verre, des billes magnétiques ou des mélange réactionnel est amené à 94 ◦ C, température à laquelle les
résines anioniques sous forme de mini colonnes. Après adsorption deux brins d’ADN se séparent.
en tampon de haute force ionique et plusieurs lavages pendant
lesquels les protéines sont éliminées, l’ADN est élué en tam-
pon de faible force ionique. Ces méthodes alternatives éliminent Hybridation des amorces
l’utilisation de phénol qui est un produit toxique. Elles sont
plus rapides et permettent d’obtenir des acides nucléiques très Deux amorces d’ADN d’environ 20 bases s’hybrident de façon
purs. spécifique grâce à la complémentarité des bases, sur un brin
Enfin, dans le cas de la technique au phénol-chloroforme, d’ADN ou son complémentaire. Cette opération est réalisée à une
l’ADN est précipité en présence d’alcool et de sels de façon à température dépendante de la composition en bases puriques et
l’obtenir pur et concentré. pyrimidiques de ces amorces, en général entre 45 ◦ C et 65 ◦ C. Les
amorces encadrent la région à amplifier. Le choix des amorces est
déterminant, il doit tenir compte de nombreux paramètres afin
de permettre une hybridation spécifique. Il est souvent réalisé à
Amplification proprement dite l’aide de logiciels dédiés.
La technique de PCR est constituée d’une trentaine de cycles,
chacun d’eux comportant trois étapes (Fig. 1). Ces étapes sont réa- Élongation des amorces
lisées dans un tube dans lequel tous les protagonistes de la réaction
ont été ajoutés : ADN cible, oligonucléotides ou amorces spéci- Une ADN polymérase (la Taq polymérase est la plus utilisée)
fiques de la cible, Taq polymérase, désoxyribonucléotides, tampon allonge les amorces en y incorporant des bases complémentaires
de la séquence matrice. Cette opération est réalisée à 72 ◦ C,
température optimale pour l’action de la polymérase. Elle syn-
thétise l’ADN de l’extrémité 5-prime vers l’extrémité 3-prime. Les
polymérases utilisées en PCR sont extraites de bactéries vivant
naturellement à des températures élevées comme les sources
hydrothermales du fond des océans.
À la fin du premier cycle, deux copies de la séquence d’ADN
cible sont obtenues. Dès le troisième cycle, apparaissent les ampli-
cons, ADN double brin borné par les amorces, copies du fragment
d’ADN recherché. Ils seront largement majoritaires à la fin de
l’amplification. En 30 cycles (1 h 30 à 4 h), un grand nombre de
copies sont générées, théoriquement 230 copies de la cible.
Détection des amplicons
La détection des amplicons est différente suivant le type de PCR
mis en œuvre. On oppose aujourd’hui la PCR en point final qui
désigne la détection à partir du produit final de la réaction à la
PCR en temps réel qui consiste à mesurer la quantité d’ADN poly-
mérisé au fur et à mesure de l’amplification (temps réel) grâce à
un marqueur fluorescent.
PCR en point final
Historiquement, les produits d’amplification étaient visualisés
à l’aide du bromure d’éthidium qui s’intercale entre les bases et
est fluorescent sous illumination par des ultraviolets (UV) courts.
Les amplicons sont soumis à une électrophorèse en gel d’agarose.
La vitesse de migration est dépendante du nombre de bases de
l’ADN testé, la présence et la taille des amplicons pourra donc
être vérifiée (Fig. 2). Cette visualisation ne suffit cependant pas
car elle ne permet pas de certifier que la séquence de l’amplicon
est identique à l’ADN cible, même si sa taille est celle attendue.
On procède donc le plus souvent à une vérification à l’aide d’une
sonde spécifique reconnaissant la séquence cible. Elle se fait par
la technique de southern blot (cf. technique southern). La sonde
reconnaît la partie interne de l’amplicon et est constituée d’un
Figure 1. Principe de la technique de polymerase chain reaction (PCR). court morceau d’ADN simple brin (oligonucléotide) d’environ 20-
L’acide désoxyribonucléique (ADN) est dénaturé à 94 ◦ C puis les amorces 40 bases marqué avec une molécule qui sera ensuite facilement
spécifiques s’hybrident au deux brins complémentaires de la séquence détectable.
cible. La Taq polymérase peut alors procéder à l’élongation des amorces et Les industriels ont développé des trousses de détection
recopier le brin complémentaire à 72 ◦ C. Les fragments d’ADN néoformés des acides nucléiques plus rapides que la technique classique
servent de matrice lors des cycles suivants, assurant l’amplification du migration-southern blot. Elles emploient des sondes spécifiques
fragment cible. marquées. L’hybride amplicon-sonde est séparé des sondes libres
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Principe de l’amplification en chaîne par polymérase 90-60-0015-A
de fluorescence. Hybridées pendant l’amplification, les sondes
fluorescentes peuvent être détruites (système TaqMan) ou non
(système LightCycler), dans les deux cas il se produit une
émission de fluorescence. Cette production ou disparition de
fluorescence mesurée tout au long des cycles d’amplification est
proportionnelle à la quantité de séquence cible présente initial-
lement, rendant aisément quantifiable le processus. Elle permet
par son principe de faire des mesures quantitatives (expliquant
l’appellation PCR quantitative, qPCR) mais elle nécessite des ther-
mocycleurs particuliers.
Avantages et inconvénients
L’apparition de la PCR a représenté un progrès méthodolo-
gique décisif. Ces applications sont nombreuses en pathologie
(recherche de parasites, bactéries, virus, oncogène translocation,
etc.), en diagnostic anténatal ou comme étape vers une autre tech-
Figure 2. Visualisation des amplicons à l’aide du bromure d’éthidium. nique comme le séquençage.
Les produits d’amplification sont soumis à une électrophorèse en gel C’est une technique rapide, sensible et spécifique. Elle comporte
d’agarose. En présence de bromure d’éthidium, l’acide désoxyribonu- cependant des inconvénients qui en font une méthodologie déli-
cléique (ADN) devient fluorescent sous illumination par des ultraviolets cate à mettre en œuvre :
(UV) courts. La vitesse de migration est dépendante du nombre de bases • l’optimisation de la PCR en vue d’une meilleure spécificité et
de l’ADN testé, la présence et la taille des amplicons sont comparées à sensibilité est une étape importante. Elle dépend de multiples
un marqueur de poids moléculaire. Lignes 1 à 7 : échantillons ; ligne 8 : facteurs comme la composition en bases des amorces, de celle
témoin positif ; ligne 9 : témoin négatif. Il faut noter la présence d’une du tampon salin, de la température d’hybridation, du nombre
bande identique en taille (92 pb) à celle du témoin positif dans les échan- de cycles, etc. ;
tillons 1, 2, 5 et 6. M : marqueur de poids moléculaire. (Cliché du Dr • la propreté de l’ADN cible est prépondérante, une bonne extrac-
Pallier, CHU de Bicêtre). tion éliminant les inhibiteurs de PCR est donc indispensable ;
• enfin, le problème majeur consiste à éliminer tout risque de
contamination. En effet, si du produit amplifié contamine un
par sa capture sur une phase solide suivie de lavages. Puis l’hybride tube de PCR prêt à être amplifié, celui-ci sera automatiquement
est détecté de façon à générer un signal quantifiable : densité positif. Le contrôle de ces contaminations nécessite la présence
optique, luminescence, fluorescence. Les trousses peuvent être de contrôles négatifs lors de l’amplification, mais surtout une
génériques – elles s’appliquent à la détection de tout amplicon organisation rigoureuse au niveau des pièces et du matériel. En
– ou spécifiques – elles incluent l’étape d’amplification et ne per- effet les étapes d’extraction, préparation de l’amplification et
mettent de détecter qu’un type d’amplicon. Plusieurs systèmes de détection des amplicons doivent se faire dans des pièces sépa-
détection sont utilisés : rées avec des matériels distincts.
• la sonde est immobilisée sur le support. Elle peut être mar-
quée à la biotine et le support recouvert d’avidine. Une fois
la sonde immobilisée, l’amplicon dénaturé peut s’hybrider
à la sonde. Il peut être lui-même marqué par une enzyme Quelques variantes
grâce à l’incorporation d’un didésoxyribonucléotide (dNTP) de la technique de PCR
marqué ou d’une amorce marquée lors de l’amplification. Si
l’amplicon n’est pas marqué, il peut-être détecté par un anti- RT-PCR
corps anti-acide nucléique double brin lui-même marqué avec
une enzyme ou même par une deuxième sonde marquée avec Préparation des ARN à amplifier
l’enzyme ; L’extraction d’ARN est plus complexe que celle des ADN du
• l’amplicon est immobilisé sur le support. Il peut être marqué fait de la grande sensibilité des ARN à la dégradation par les
par la biotine grâce à l’utilisation d’une amorce biotinylée lors ribonucléases (RNases). Ces enzymes sont présentes partout. La
de l’amplification, le support est alors recouvert par l’avidine. manipulation d’ARN nécessite donc d’être réalisée dans des condi-
L’ajout d’une sonde marquée avec une enzyme permet la détec- tions stériles et d’utiliser du matériel jetable ou traité avec des
tion du complexe ; inhibiteurs de RNases. Comme lors de l’extraction d’ADN, trois
• l’hybride ADN-sonde est immobilisé par un anticorps. L’anti- étapes sont nécessaires pour obtenir des ARN purs. Une première
corps anti-acide nucléique double brin est fixé sur le support étape de lyse cellulaire permet de libérer les ARN. Elle se fait le
et capture l’hybride. Puis celui-ci est détecté par un deuxième plus souvent par le thiocyanate de guanidinium associé au -
anticorps marqué avec une enzyme. mercaptoéthanol assurant ainsi l’inhibition des RNases. Le lysat
Dans tous les cas, l’enzyme de marquage peut être la peroxydase est alors déprotéinisé par la technique du phénol-chloroforme
ou la phosphatase alcaline. Leur substrat est hydrolysé en produit comme dans le cas de l’ADN, exception faite que le phénol doit
le plus souvent coloré détectable par un spectrophotomètre. Elle être acide cette fois. Cette technique très longue est le plus sou-
peut être aussi un ester d’acridinium ou un dérivé du ruthénium vent remplacée par des trousses d’extraction rapide comme pour
qui sont responsables de la production de photons détectables par l’ADN.
un luminomètre.
Amplification des ARN
PCR en temps réel La technique de PCR ne permet d’amplifier que de l’ADN.
Toutefois, des ARN peuvent être détectés par cette technique
La PCR en temps réel (real-time PCR) est une révolution dans (Fig. 3). Il faut d’abord transformer l’ARN en son ADN complé-
l’utilisation de la PCR. Cette technique consiste à mesurer la mentaire (ADNc) à l’aide d’une enzyme transcriptase inverse
quantité d’ADN polymérisé à chaque cycle (temps réel) grâce (reverse transcriptase ou RT). Cette enzyme qui recopie la séquence
à un marqueur fluorescent (cf. article PCR quantitative). Elle de 5’ vers 3’ nécessite une amorce qui reconnaît l’ARN spécifique-
repose sur l’utilisation d’amorces ou de sondes fluorescentes. ment ou non (amorce oligo [dT], polymère de désoxythymidine
Intégrées durant l’amplification, les amorces fluorescentes abou- complémentaire de la queue de polyadénosine des ARNm).
tissent à l’émission (SYBR) ou l’extinction (système AmpliSensor) Ensuite, c’est l’ADNc qui sera amplifié par la technique de PCR
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Figure 4. Principe de la polymerase chain reaction (PCR) spécifique
d’allèles. Les amorces P1 et P2 diffèrent en 3’ d’une base. L’amorce P2
ne permettra pas l’amplification de l’allèle car le misappariement en 3’ ne
permet pas l’élongation de l’amorce.
identique pour être dans les mêmes conditions d’amplification
Figure 3. Principe de la technique de reverse transcriptase-polymerase mais suffisamment différente pour permettre leur détection.
chain reaction (RT-PCR) : amplification d’acide ribonucléique messager Cette méthode plus difficile à mettre au point peut être inté-
(ARNm). Une amorce oligo (dT), c’est-à-dire composée uniquement de ressante pour la mise en évidence de plusieurs séquences cibles
dTTP est capable de s’hybrider à la queue de poly A d’un ARNm. À partir en une seule fois comme par exemple des pathogènes géni-
de cette amorce, une transcriptase inverse peut recopier l’ARN en acide taux [3–5] . Elle rend ainsi le diagnostic plus rapide et moins
désoxyribonucléique (ADN). On obtient ainsi un ADN complémentaire de couteux.
l’ARN (ADNc). Celui-ci pourra facilement être amplifié par la technique de
PCR (cf. Fig. 1).
comme les ADN. Il est à noter l’utilisation d’une enzyme qui à la PCR spécifique d’allèles
fois a une activité RT et ADN polymérase : la Thermus thermophi- Elle permet de distinguer deux allèles distincts de quelques
lus (Tth) ADN polymérase. nucléotides, comme dans le cas d’une mutation. Elle est basée sur
Cette technique très sensible permet de détecter des traces un principe de misappariement d’une amorce en 3’ qui empêche
d’ARNm dans un échantillon biologique. Néanmoins la qualité l’amplification du fragment. Deux amplifications sont réalisées
du prélèvement est primordiale. L’extraction d’ARN reste délicate en parallèle. Une des amorces est commune aux deux amplifica-
à cause de la présence de RNases. De plus, il faut éliminer la pré- tions. La deuxième existe en deux versions, une spécifique de la
sence d’ADN dans ces extraits (à l’aide de DNases par exemple) de séquence normale et l’autre spécifique de la séquence mutante.
façon à éviter son amplification. Cette dernière est choisie de façon à ce que le dernier oligonu-
La technique de RT-PCR a permis de détecter de façon quan- cléotide en 3’ corresponde à la mutation. L’amplification de la
tifiable la présence d’ARN viraux. Elle est aujourd’hui utilisée séquence mutée ne peut avoir lieu (Fig. 4). Le couplage avec la
notamment pour le diagnostic des rétrovirus et des virus de technique de PCR multiplexe permet le diagnostic de plusieurs
l’hépatite. mutations liées à une même maladie (par exemple, l’amyotrophie
spinale) [6] .
« Nested » PCR Cet article a fait l’objet d’une prépublication en ligne : l’année du copyright peut
La PCR emboîtée ou PCR nichée (nested PCR) est une PCR en donc être antérieure à celle de la mise à jour à laquelle il est intégré.
deux étapes successives. Après la première étape de PCR classique,
une deuxième amplification de l’amplicon à l’aide d’un couple
d’amorces situé dans la partie interne de la séquence précédem-
ment amplifiée permet à la fois d’augmenter la sensibilité et la
spécificité de la méthode. Elle est très utilisée en virologie, par-
Références
ticulièrement pour la détection des virus à ARN qui possèdent
[1] Mullis KB. Target amplification for DNA analysis by the polymerase
une haute mutabilité. Le premier couple d’amorces est conçu pour chain reaction. Ann Biol Clin (Paris) 1990;48(8):579–82.
pouvoir accrocher les parties stables du génome viral, le deuxième
pour identifier le sous-type. [2] Saiki RK, Bugawan TL, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. Analysis
of enzymatically amplified beta-globin and HLA-DQ alpha DNA
with allele-specific oligonucleotide probes. Nature 1986;324(6093):
163–6.
PCR multiplexe
[3] Lee SR, Chung JM, Kim YG. Rapid one step detection of patho-
Elle permet l’amplification de plusieurs cibles simultanément genic bacteria in urine with sexually transmitted disease (STD) and
dans le même tube en utilisant plusieurs couples d’amorces. prostatitis patient by multiplex PCR assay (mPCR). J Microbiol
La longueur des différents amplicons doit être sensiblement 2007;45(5):453–9.
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[4] McKechnie ML, Hillman R, Couldwell D, Kong F, Freedman E, Wang [6] Baris I, Etlik O, Koksal V, Arican-Baris ST. Rapid diagnosis of
H, Gilbert GL. Simultaneous identification of 14 genital microorga- spinal muscular atrophy using tetra-primer ARMS PCR assay: simul-
nisms in urine by use of a multiplex PCR-based reverse line blot assay. taneous detection of SMN1 and SMN2 deletion. Mol Cell Probes.
J Clin Microbiol 2009;47(6):1871–7. Jun;24(3):138-141.
[5] Wang H, Kong F, Wang B, McKechnie ML, Gilbert GL. Multiplex
polymerase chain reaction-based reverse line blot hybridization assay Pour en savoir plus
to detect common genital pathogens. Int J STD AIDS. May;21(5):
320-325. [Link]
I. Vassias ([Link]@[Link]).
UMR 218 Institut Curie/CNRS, Centre de Recherche, 26, rue d’Ulm, 75005 Paris, France.
Toute référence à cet article doit porter la mention : Vassias I. Principe de l’amplification en chaîne par polymérase. EMC Biologie médicale 2012;7(1):1-5
[Article 90-60-0015-A].
Disponibles sur [Link]
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