Étude de la résistance aux antibiotiques de souches de

Vibrio parahaemolyticus isolées de produits de la pêche

Nicolas Helsens

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Nicolas Helsens. Étude de la résistance aux antibiotiques de souches de Vibrio parahaemolyticus
isolées de produits de la pêche. Sciences du Vivant [q-bio]. 2018. �dumas-02148585�

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N° d'ordre : ANNÉE 2018

THÈSE D'EXERCICE / UNIVERSITÉ DE RENNES 1

sous le sceau de l’Université Bretagne Loire

Thèse en vue du
DIPLÔME D'ÉTAT DE DOCTEUR EN PHARMACIE

présentée par

Nicolas Helsens

Etude de la
résistance aux Thèse soutenue à Rennes
le 01/10/2018
antibiotiques de devant le jury composé de :

souches de Vibrio Anne GOUGEON-JOLIVET

Professeur, Université de Rennes 1/ Président /
parahaemolyticus Directeur de thèse
Pierre-Yves DONNIO
isolées de produits Professeur, Université de Rennes 1
Sandrine BARON
de la pêche Chargée de projet scientifique, Anses/ examinatrice
2
3
 4

Remerciements

Je remercie très sincèrement :

Madame Anne JOLIVET-GOUGEON, Professeur à la Faculté de Pharmacie de Rennes, pour

avoir accepté d’encadrer cette thèse. Je vous remercie pour vos remarques, pour votre
bienveillance et votre indulgence, pour m’avoir aidé à conduire ces travaux dans les meilleures
conditions. Je vous remercie tout particulièrement pour m’avoir ouvert au monde de la
recherche et m’y avoir donné goût.

Madame Sandrine BARON, Chargée de Projets Scientifiques à l’Anses de Ploufragan-

Plouzané et Monsieur Pierre-Yves DONNIO, Professeur à la Faculté de Pharmacie de Rennes,
pour avoir accepté d’être membres de mon jury de thèse.

Madame Odile SERGENT, Professeur à la Faculté de Pharmacie de Rennes, pour m’avoir

guidé dans la recherche depuis le début de mon projet, pour vos conseils, votre aide précieuse,
vos remarques et vos remontrances toujours justifiées. L’étudiant naïf que j’étais vous doit de
l’avoir ramené sur terre, le doctorant que je suis vous doit de l’avoir poussé jusqu’ici.

Madame Graziella MIDELET-BOURDIN, Directrice de Recherche à l’Anses de Boulogne-

sur-Mer, pour avoir encadré la réalisation de ces travaux et pour m’avoir posé les bonnes
questions sur mon projet professionnel. Je pense qu’un stagiaire ne peut s’épanouir que s’il est
bien encadré, dans mon cas toutes les conditions étaient réunies pour que ce soit le cas. Je
remercie également Monsieur Arnaud BRIET, Doctorant (encore un peu) à l’Anses de
Boulogne-sur-Mer, même si c’est toi qui devrait me remercier d’avoir travaillé pour toi, pour
ta présence, tes discussions scientifiques ou pas, et plus généralement pour avoir réussi à
conserver mon envie de prendre le même chemin que toi.
D’une façon plus générale je remercie toute l’équipe du Laboratoire des Produits de la Pêche et
de l’Aquaculture de l’Anses de Boulogne-sur-Mer pour leur présence, leur compétence et leur
gentillesse, merci d’avoir rendu ce (trop court) passage si agréable.

Madame Isabelle MOREL bien évidemment, pour ses conseils, son soutien tout au long de
 5

mon parcours, avant et, j’en suis convaincu, après.

Je remercie également toute ma famille, mes parents et mon frère, pour leur soutien, leur
présence, leur tolérance dans les moments les plus durs, et leur indulgence. Je remercie tout
spécialement mes tantes qui ont pris le temps de venir me supporter lors de ma remise de
diplômes, pour leur soutien et leurs cadeaux si particuliers.

Je remercie très très très très chaleureusement mes amis pharmaciens, Arthur, Yanna, Cécile,
Pauline et Margot, Marion, Isabelle, Guillaume et Matthieu, d’être là toujours et j’espère pour
encore très longtemps, de me faire rire et même parfois de me trouver drôle, d’être des gens si
géniaux et surtout d’être détraqués. Je vous aime.

Je remercie bien évidemment Marie-Caroline d’être là, de me soutenir, de m’encourager, de me

motiver et de faire en sorte que tout aille si bien.

Pour finir je remercie tous les autres, tous ceux que je ne peux pas citer parce qu’il me faudrait
100 pages de plus, mes amis qui sont là depuis longtemps ou pas, mais qui sont bien là, ceux
qui m’apprécient, ceux qui me font rire, ceux qui sont toujours partants, mes collègues, tous
ceux qui m’ont à leur manière tous dirigé vers ce point. Merci à tous, je vous dois tout.

Et merci à Alain CHABAT d’être. Tout court.

 6

Serment de Galien

Je jure, en présence des maîtres de la Faculté et de mes condisciples :

D’honorer ceux qui m’ont instruit dans

Les préceptes de mon art et de leur

Témoigner ma reconnaissance en

Restant fidèle à leur enseignement.

D’exercer, dans l’intérêt de la santé

Publique, ma profession avec

Conscience et de respecter non

Seulement la législation en

Vigueur, mais aussi les règles de

L’honneur, de la probité et du

Désintéressement.

De ne jamais oublier ma responsabilité

Et mes devoirs envers le malade

Et sa dignité humaine ; en aucun

Cas, je ne consentirai à utiliser

Mes connaissances et mon état pour

Corrompre les mœurs et favoriser des actes criminels.

Que les hommes m’accordent leur

Estime si je suis fidèle à mes promesses.

Que je sois couvert d’opprobre et

Méprisé de mes confrères si j’y manque

 7

Table des matières

Remerciements ........................................................................................................................... 2

Table des matières ...................................................................................................................... 7

Liste des tableaux et figures ....................................................................................................... 9

Liste des abréviations ............................................................................................................... 10

Introduction .............................................................................................................................. 11

I. Vibrio spp...................................................................................................................... 12
a. Généralités ................................................................................................................. 12
b. Réglementations ........................................................................................................ 12
II. Prévalence et épidémiologie ......................................................................................... 13
a. Vibrio cholerae .......................................................................................................... 13
b. Vibrio parahaemolyticus............................................................................................ 13
c. Vibrio vulnificus ......................................................................................................... 15
III. Virulence et pathologie ................................................................................................. 15
a. Vibrio cholerae .......................................................................................................... 15
b. Vibrio parahaemolyticus............................................................................................ 16
c. Vibrio vulnificus ......................................................................................................... 17
IV. Méthodes d’identification ............................................................................................. 18
V. Résistance aux antibiotiques......................................................................................... 20
a. Mécanismes de résistance .......................................................................................... 20
b. Techniques d’antibiogramme .................................................................................... 21
c. Etude de l’antibiorésistance ....................................................................................... 22
d. Epidémiologie de la résistance aux antibiotiques chez Vibrio................................... 23
VI. Traitements ................................................................................................................... 26
a. Vibrio cholerae .......................................................................................................... 26
b. Vibrio parahaemolyticus............................................................................................ 26
c. Vibrio vulnificus ......................................................................................................... 26
VII. Présentation du sujet ..................................................................................................... 27
Matériel et méthodes ................................................................................................................ 28

I. Origine des souches ...................................................................................................... 28

II. Identification biochimique (Galerie API 20E) .............................................................. 29
 8

III. Identification moléculaire ............................................................................................. 29

a. Extraction d’ADN...................................................................................................... 29
b. PCR de du gène 16S rRNA ....................................................................................... 30
c. PCR temps réel R72H................................................................................................ 31
IV. Antibiogrammes ........................................................................................................... 32
V. Traitement statistique des données des antibiogrammes .............................................. 33
Résultats ................................................................................................................................... 34

I. Identification des souches bactériennes........................................................................ 34

II. Antibiogrammes des souches de Vibrio parahaemolyticus .......................................... 37
Discussion ................................................................................................................................ 43

Conclusion et perspectives ....................................................................................................... 50

Valorisation............................................................................................................................... 52
 9

Liste des tableaux et figures

Tableau 1 : Epidémies dues à Vibrio parahaemolyticus en France en 1995 et 2012 (24) ........ 14
Tableau 2 : Recommandations du CLSI (2016) pour déterminer les diamètres critiques
d’inhibition pour V. parahaemolyticus par la méthode de diffusion en milieu gélosé. R :
Résistant ; I : Intermédiaire ; S : Sensible ................................................................................ 23
Tableau 3 : Isolement sur milieu gélosé et identification des souches bactériennes par galerie
API 20E et/ou par PCR 16S et/ou par PCR R72H ; ND : Non Déterminé ; + : Identification de
V. parahaemolyticus ................................................................................................................. 36
Tableau 4 : Critères d'interprétation permettant de déterminer les populations normales et les
critères d’interprétation du CLSI (2015) pour les souches de Vibrio; ...................................... 40

Figure 1 : Coloration des colonies de V. cholerae et de V. parahaemolyticus sur gélose TCBS

([Link] ................................................................................................ 18
Figure 2 : Coloration de colonies de V. parahaemolyticus (mauve), V. cholerae (bleue), V.
vulnificus (bleue) et V. alginolyticus (blanc) sur milieu CHROMagar ([Link])
.................................................................................................................................................. 19
Figure 3 : Origine des souches de V. parahaemolyticus étudiées. a) Matrice alimentaire ; b)
Origine géographique du produit. ............................................................................................ 28
Figure 4 : Plan de la boite d’antibiogramme pour Vibrio parahaemolyticus. .......................... 32
Figure 5 : Exemples d’antibiogrammes obtenus sur milieu Mueller-Hinton a) Souche 15-2013 ;
b) Souche 16-0006. .................................................................................................................. 37
Figure 6 : Distribution des diamètres d'inhibition (en mm) par antibiotique mesurées pour 248
souches de Vibrio parahaemolyticus. ....................................................................................... 38
Figure 7 : Souches bactériennes de V. parahaemolyticus classées en fonction du nombre de
caractères atypiques.................................................................................................................. 41
Figure 8 : Répartition des origines (a.) géographiques et (b.) alimentaires des souches de Vibrio
parahaemolyticus ayant un profil atypique. ............................................................................. 42
Figure 9 : Poster présenté au congrès ARAE ........................................................................... 53
 10

Liste des abréviations

ARBAO: Antibiotic Resistance in Bacteria of Animal Origin
BCC : Bouillon-Coeur-Cervelle
BET : Bromure d’Ethidium
BLSE : Beta-Lactamase à Spectre Etendu
CDC: Center for Disease Control and Prevention
CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute
CMI : Concentration Minimale Inhibitrice
DGAL : Direction Générale des Aliments
ECOFF: Epidemiological Cut-off Value
EDTA: Éthylène Diamine Tétra-Acétique
EUCAST: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
GNS : Gélose Nutritive Salée
LNR : Laboratoire National de Référence
MB: Marine Broth
PCR: Polymerase Chain Reaction
SDS: Sodium Dodecyl Sulfate
TBE: Tris-Borate EDTA
TCBS: Thiosulfate-Citrate-Bile-Saccharose
TDH: Thermostable Direct Haemolysin
TIAC : Toxi-Infection Alimentaire Collective
TRH : TDH-Related Haemolysin
 11

Introduction
Entre 1996 et 2008, en France, les produits de la mer ont été responsables de 1112 foyers
déclarés de toxi-infections alimentaires collectives (TIAC), soit 12,4% du total des TIAC durant
cette période (Delmas et al. 2010). L’agent majoritairement incriminé est l’histamine et les
autres amines biogènes (67% des TIAC sont dues aux produits de la mer), mais les agents
bactériens représentent un risque non-négligeable, compte tenu de leur pathogénie et de leur
capacité à évoluer dans l’environnement marin. De plus, un grand nombre d’infections dues
aux aliments ne sont pas déclarées et l’agent mis en cause n’est parfois pas identifié voire pas
recherché, ce qui amène à penser que le risque bactérien est sous-estimé (1). Les principaux
agents responsables de TIAC sont les Staphylocoque aureus, Salmonella, Campylobacter,
Yersinia enterocolitica, Clostridium perfringens et Bacillus cereus ainsi que les entérovirus
([Link]). Les bactéries du genre Vibrio sont plus rarement responsables de TIAC.
Cependant, V. parahaemolyticus est le principal agent responsable de gastro-entérites
alimentaires liés aux produits de la mer (2,3). De plus on estime que ces bactéries seraient
responsables chaque année aux Etats-Unis de 80 000 infections, conduisant à 500
hospitalisations et 100 décès dont la plupart des hospitalisations et décès sont dus à Vibrio
vulnificus (4). Le traitement antibiotique est une part importante de la prise en charge
thérapeutique d’une infection bactérienne, c’est pourquoi il est important de s’intéresser à la
résistance aux antibiotiques chez ces bactéries pathogènes. Le nombre croissant de bactéries
pathogènes résistantes aux antibiotiques dirige la médecine moderne vers une ère post-
antibiotique dont la réalité se fait de plus en plus ressentir (5). Il est donc important de faire
l’état des lieux de l’antibiorésistance, notamment vis-à-vis des antibiotiques critiques en santé
humaine, chez les bactéries présentes dans le milieu marin, et plus particulièrement dans les
produits de la mer. Le milieu marin est un environnement peu étudié, et potentiellement
réservoir des gènes de résistance puisque de nombreuses bactéries s’y développent au contact
des antibiotiques résiduels relargués dans l’environnement. Les bactéries du genre Vibrio et
notamment de l’espèce Vibrio parahaemolyticus semblent être de bons modèles à étudier,
puisqu’elles sont présentes naturellement dans le milieu marin (6). Elles sont également
responsables de TIAC et sont susceptibles d’acquérir et de transmettre des résistances aux
antibiotiques grâce à leur capacité à échanger de l’information génétique avec les bactéries
 12

environnantes (7), dont des bactéries potentiellement pathogènes, ce qui représente un risque
sanitaire important.

I. Vibrio spp.

a. Généralités
La première description d’une bactérie du genre Vibrio a été faite en 1854 lorsqu’un
médecin italien, Filippo Pacini, observa au microscope des échantillons prélevés dans des tubes
digestifs de patients morts de l’épidémie de choléra qui sévissait alors à Florence. Sa conclusion
fut que cet organisme était responsable de l’épidémie, mais il se heurte à la théorie des miasmes
majoritairement admise à l’époque. Trente ans plus tard, en 1883, Robert Koch et son équipe
parviennent à obtenir des cultures pures de Vibrio cholerae et associent l’agent observé avec
les épidémies de choléra sévissant en Inde et à Alexandrie cette année-là. Ils observent
cependant que cette famille de micro-organismes était omniprésente dans les eaux et que bon
nombre de ses représentants ne provoquaient pas de maladie (8).

Les Vibrio sont des bactéries mobiles à Gram négatif, aéro-anaérobies et capables de
respiration, halophiles et généralement oxydase positive (9). Ils sont très largement répandus

dans les milieux aquatiques (6). Ils sont en forme de virgules et possèdent un flagelle polaire.

Il existe 146 espèces de Vibrio ([Link]) dont trois sont les plus souvent
retrouvées responsables de toxi-infections alimentaires chez l’Homme : Vibrio cholerae, Vibrio
vulnificus et Vibrio parahaemolyticus. Elles seraient responsables chaque année aux Etats-Unis
de 80 000 infections, conduisant à 500 hospitalisations et 100 décès dont la plupart des
hospitalisations et décès sont dus à Vibrio vulnificus (4).

b. Réglementations
Les règlementations européennes n°2073/2005 et 1771/2007 sur les critères
microbiologiques ne prévoient pas de méthode de détection des Vibrio pathogènes pour
l’homme dans les aliments. Il y est cependant noté que des méthodes pour sa détection sont à

développer. La Direction Générale des Aliments (DGAL) a donc repris des textes de la
règlementation européenne CE relatifs à la sécurité et l’hygiène des denrées alimentaires
 13

d’origine animale et a publié en 2004 puis en 2014 des notes de service contenant des
recommandations pour la détection des Vibrio dans les matrices alimentaires et la validation
des lots (10). La détection de Vibrio spp. pathogènes se fait selon la norme ISO 21872-1 :2017

relative à la recherche de Vibrio spp. potentiellement entéropathogènes dans les coquillages et

les produits de la pêche.

Les recommandations de la DGAL exigent que, sur cinq échantillons analysés issus d’un
même lot d’aliments, aucun ne contienne de V. parahaemolyticus producteurs de toxines
hémolytiques TDH (Thermostable Direct Hemolysin) et TRH (TDH-Related Hemolysin). Les
lots contaminés par une souche possédant au moins une des deux hémolysines sont déclarés
non conformes et doivent être retirés du marché et détruits. La présence d’une souche ne

possédant pas d’hémolysine n’est pas un critère de non-conformité d’un lot.

II. Prévalence et épidémiologie

a. Vibrio cholerae
V. cholerae est une bactérie aquatique autochtone de nombreuses zones à travers le
monde. Elle serait originellement endémique de certains pays d’Afrique et d’Asie du Sud
(11), mais est maintenant retrouvée dans des estuaires en Australie (12) et à Chesapeake Bay
(13). On la retrouve également fréquemment dans les produits de la mer (14), vecteur par lequel

elle est responsable d’infections alimentaires.

Vibrio cholerae est l’agent pathogène responsable du choléra, une maladie gastro-
intestinale très contagieuse transmise par les aliments ou des eaux contaminés par la bactérie,
se présentant sous la forme de diarrhées sévères, principalement répandue dans les pays en voie
de développement où sa prévalence est favorisée par les mauvaises conditions sanitaires.
Il est estimé qu’entre 1,3 et 4 millions de cas de choléra apparaissent chaque année,
responsables d’environ 95 000 décès par an (15).

b. Vibrio parahaemolyticus
V. parahaemolyticus est naturellement présent dans le milieu marin et dans un grand
nombre de produits de la mer. Cette bactérie a notamment été isolée dans des échantillons
 14

alimentaires prélevés sur des marchés dans le Sud-Est Asiatique (16,17). Elle a également été
isolée dans des crevettes en Thaïlande, qui est un pays producteur et exportateur majeur de
crevettes (18). Cette étude a rapporté la présence de V. parahaemolyticus dans 6 échantillons

sur 16 analysés, à des niveaux de contamination allant jusqu’à 6,3.106 micro-organismes/g.

Leur présence a aussi été rapportée dans des échantillons d’eau de mer, de crevettes et de coques
(144 échantillons positifs sur 400) prélevées en Malaisie (19), ainsi que dans des huîtres et des
palourdes prélevées à Taïwan (20) avec environ 70% d’échantillons positifs sur 120
prélèvements. Une étude menée sur des cultures d’huîtres en Alaska a noté la présence de V.

parahaemolyticus dans 31 échantillons sur 96 (21). V. parahaemolyticus est également retrouvé

dans les eaux et produits marins en Europe, avec notamment des souches isolées dans tous les
échantillons prélevés au cours d’une étude menée sur des crabes dans la Tamise (22) ainsi que
dans 35,3% des échantillons prélevés au cours d’une étude portant sur les eaux des côtes
galiciennes (117/331) (23).

V. parahaemolyticus est le principal agent responsable de gastro-entérites alimentaires

liés aux produits de la mer (2,3). La contamination se fait par consommation de poissons et

fruits de mer crus, insuffisamment cuits ou re-contaminés après cuisson (24) . Son pouvoir

pathogène est dépendant des deux hémolysines entérotoxiques TDH et TRH (25). Au Japon,
on estime que V. parahaemolyticus serait responsable de 20 à 30% des infections alimentaires
(26). En Europe, les « Vibrioses » non cholériques ne sont pas à déclaration obligatoire, leur
incidence est donc probablement sous-estimée, d’autant plus que cet agent pathogène est très
rarement recherché dans le cas de gastro-entérites. On rapporte cependant plusieurs toxi-
infections alimentaires collectives à V. parahaemolyticus en Europe entre 1995 et 2012 (Tableau
1). Une infection notable en France en 1997 impliquait 44 patients ayant consommé des

crevettes importées d’Asie (27).

Tableau 1 : Epidémies dues à Vibrio parahaemolyticus en France en 1995 et 2012 (24)

 15

c. Vibrio vulnificus
Comme les autres espèces du genre Vibrio, V. vulnificus fait partie de la flore
communément retrouvée dans les eaux d’estuaires (28) et dans les produits de la mer (29,30).

Sa concentration dans l’eau est relativement faible (< 10 UFC/ml) (31). Dans les produits de la
mer, et notamment les coquillages et mollusques, elle peut s’élever à 103 UFC/g de tissus (32)
à cause de la capacité de ceux-ci à filtrer l’eau. Cependant cette concentration varie en fonction

de la salinité de l’eau.
Cette espèce bactérienne a été trouvée dans 13,6% des huîtres de l’espèce Cassostrea
gigas échantillonnées en Nouvelle-Zélande (33). Il a également été observé qu’entre 37% et

69% des poissons prélevés dans le Golfe du Mexique étaient positifs pour V. vulnificus (34).
Dans cette étude il a été noté que la prévalence de V. vulnificus sur les poissons augmentait en
fonction de la température de l’eau et diminuait en fonction de sa salinité.

Vibrio vulnificus est responsable de 95% des décès dus à des infections alimentaires
liées aux produits de la mer au Etats-Unis, et est responsable d’un taux de létalité pouvant aller
jusqu’à 50%. Les affections chroniques ou immunitaires sous-jacentes sont un probable facteur

de risque (35). C’est le pathogène lié aux produits de la mer engendrant la plus grande dépense

de santé aux Etats-Unis, avec un coût annuel de 233 millions de dollars (36). La plupart des

patients atteints sont des hommes âgés de 40 ans ou plus. Cette disparité du sex-ratio pourrait
être due à un effet protecteur de l’œstrogène contre l’endotoxine bactérienne mais actuellement
aucune donnée ne permet d’expliquer le lien entre l’âge et la prévalence (37).

III. Virulence et pathologie

a. Vibrio cholerae
Les sérotypes de V. cholerae épidémiques pour l’homme sont les sérotypes O1 et O139,
retrouvés majoritairement dans les eaux stagnantes dans les pays en voie de développement.
Les autres sérotypes, appelés sérotypes non-O1, non-O139, sont ubiquitaires mais ne présentent
pas de risque épidémique, provoquant simplement des diarrhées simples et souvent non
 16

diagnostiquées. Les principaux vecteurs de contamination humaine sont l’eau et certains

organismes tels que les zooplanctons, certains insectes et les cyanobactéries.

Après ingestion, les germes prolifèrent pour tapisser la muqueuse intestinale et adhèrent
à la bordure en brosse par leur pilis grâce à une protéine codée par le gène tcpA (38). La
pathologie due à Vibrio cholerae est provoquée principalement par une toxine cholérique CT
codée par les gènes ctxA et ctxB (39). Cette toxine se fixe à un récepteur lipidique situé à la
membrane des entérocyte et active l’adénylate cyclase, ce qui augmente la production d’AMPc
intracellulaire et l’excrétion d’ions sodium, ce qui provoque une fuite d’eau et d’électrolytes
dans la lumière de l’intestin grêle.

b. Vibrio parahaemolyticus
Le pouvoir pathogène de V. parahaemolyticus est dépendant de deux hémolysines
entérotoxiques TDH (Thermostable Direct Hemolysin) et TRH (TDH-Related Hemolysin) (25)
qui sont responsables d’une β-hémolyse sur gélose au sang appelée Phénomène de Kanagawa
(KP). Ce phénomène est spécifique des souches pathogènes, puisque seules 0,2 à 2% des

souches environnementales possèdent les gènes codant pour ces toxines (40,41).
La toxine TDH se polymérise pour former des pores (42) dans la membrane des
érythrocytes, ce qui provoque une fuite d’eau et d’ions et la lyse des érythrocytes (43). De plus,
TDH et TRH semblent jouer un rôle dans l’induction de la diarrhée aqueuse provoquée par V.
parahaemolyticus. En effet, TDH et TRH se fixent à la membrane apicale des entérocytes et
induisent l’ouverture des canaux Cl- calcium-dépendant ce qui perturbe le flux d’ions et
provoque une libération d’eau et d’électrolytes dans la lumière du tube digestif (44).
De plus, on sait qu’il existe deux systèmes de sécrétion de type III (T3SS) récurrents
chez cette espèce (45), et il a été démontré qu’ils jouaient un rôle dans la pathogénie (46).
T3SS1 est apparenté au système de sécrétion Ysc de Yersinia et induit une cytolyse des cellules
cibles sous l’influence d’une élévation de la température et d’une diminution du taux de calcium
(47). T3SS2 est quant à lui similaire au système Hrp1 de Pseudomonas syringae (45) et joue
un rôle dans l’inflammation et la perturbation du cytosquelette et des voies de signalisation de
la cellule cible (21).
Le sérotypage de V. parahaemolyticus se fait grâce aux antigènes somatique O et de
capsule K. Actuellement, le principal clone pandémique est le clone O3:K6 (48). En Europe,
 17

les Vibrioses non cholériques ne sont pas à déclaration obligatoire, leur incidence est donc
probablement sous-estimée. On rapporte cependant plusieurs toxi-infections alimentaires

collectives à V. parahaemolyticus en Europe entre 1995 et 2012 (24).

c. Vibrio vulnificus
Le principal mode de contamination est la consommation d’huîtres crues ou mal cuites
qui concentrent les bactéries lorsqu’elles filtrent l’eau. Après une période d’incubation de 26h
environ, le patient développe une septicémie accompagnée de symptômes tels que des nausées,
fièvre, hypotension, frissons et douleurs abdominales, puis des lésions secondaires telles que
des nécroses cutanées et des lésions bulleuses, principalement aux extrémités (35). Une des
raisons serait que la température du corps y est plus proche de la température optimale de
croissance de ces bactéries (30°C). De plus, il a été rapporté que V. vulnificus était capable
d’engendrer des infections - et des décès – suite à des contacts entre des blessures ouvertes et
des eaux contaminées, ou du matériel souillé par de l’eau contaminée (49). On dénombre trois
biotypes de V. vulnificus, dont le biotype 1, principal pathogène pour l’Homme et impliqué dans
pratiquement toutes les infections dues à cette bactérie (31), et le biotype 3, responsable plus
rarement d’infections de blessures (50). Le biotype 1 est réparti en deux génotypes identifiables

par PCR, le génotype C et le génotype E (49). Le génotype E regroupe environ 85% des souches
retrouvées dans l’environnement, alors que les souches retrouvées dans des isolats cliniques
appartiennent presque exclusivement au génotype C (51). Cela pourrait expliquer le
relativement faible nombre d’infections dues à cette bactérie, en comparaison à sa présence
dans l’environnement. Une autre explication serait que V. vulnificus est un pathogène
opportuniste et qu’il nécessiterait une pathologie chronique pré-existante pour pouvoir
exprimer sa pathogénicité, comme démontré par Bross et al. en 2007 (52), notamment des

affections entraînant une augmentation du taux de fer sérique. En effet, le fer serait un élément

essentiel à la survie et la prolifération de V. vulnificus dans l’organisme (53). De ce fait, les

infections dues à V. vulnificus sont plus fréquents chez les patients atteints d’hémochromatose
(54).
La virulence de V. vulnificus repose sur trois éléments essentiels : la capsule
polysaccharidique permettant d’éviter la phagocytose (55), l’endotoxine lipopolysaccharide de
 18

surface (56) ainsi que la toxine RtxA (57). Cette toxine induirait une apoptose des cellules

épithéliales de l’intestin (58).

IV. Méthodes d’identification

Les bactéries du genre Vibrio peuvent être cultivées sur un milieu gélosé nutritif à 37°C.

On utilise généralement des milieux sélectifs pour les isoler. Par exemple le milieu Thiosulfate-
Citrate-Bile-Saccharose (TCBS) sur lequel les colonies sont colorées en fonction de leur
capacité à fermenter le saccharose. Sur ce milieu, V. parahaemolyticus donne des colonies
vertes (pas de fermentation du saccharose) et V. cholerae ainsi que V. vulnificus donnent des
colonies jaunes (fermentation du saccharose) (Figure 1). Des bactéries non-Vibrio peuvent
également pousser sur ce milieu, telles que Aeromonas hydrophila ou Pseudomonas spp
(colonies vert-bleues).

Figure 1 : Coloration des colonies de V. cholerae et de V. parahaemolyticus sur gélose TCBS ([Link]

On peut également utiliser le milieu chromogène CHROMagar Vibrio sur lequel V.

parahaemolyticus donne des colonies mauves et V. cholerae ainsi que V. vulnificus donnent des
colonies bleues (Figure 2).
 19

Figure 2 : Coloration de colonies de V. parahaemolyticus (mauve), V. cholerae (bleue), V. vulnificus (bleue) et V.

alginolyticus (blanc) sur milieu CHROMagar ([Link])

La norme ISO/TS 21872 concerne la détection de Vibrio spp., potentiellement

entéropathogènes, dans les produits de la mer. Elle contient une procédure de détection et
d’identification de Vibrio. Les échantillons à analyser doivent être homogénéisés dans de l’eau
peptonée tamponnée (EPT) de façon à être dilués au 1/10, puis incubés à 41,5°C pendant 6h.
La suspension obtenue doit à son tour être diluée au 1/10 dans de l’EPT et incubée à 41,5°C
pendant 18h. Des géloses TCBS et CHROMagar doivent ensuite être ensemencées à l’aide de
cette suspension et mises à incuber à 37°C pendant 24h pour être lues afin de rechercher des
colonies caractéristiques. Les colonies caractéristiques doivent ensuite passer une série de tests
biochimiques (oxydase, galerie API20E), puis les facteurs de virulence peuvent être recherchés
par des méthodes de biologies moléculaires (PCR tdh, trh etc…). La réglementation interdit la
présence de Vibrio spp. pathogènes dans les produits de la pêche mais ne concerne pas les
souches ne possédant pas de facteurs de virulence, qui sont donc tolérées.
La norme n’exige pas la mise en place de tests de biologie moléculaire pour
l’identification des Vibrio.
L’identification de bactéries du genre Vibrio peut néanmoins se faire grâce à
l’amplification de gènes tel que le gène toxR (59). Ce gène code pour l’activateur

transcriptionnel ToxR. Il est présent chez différentes espèces de Vibrio mais avec une faible
homologie entre les espèces (52% d’homologie entre le gène codé chez V. parahaemolyticus et
 20

chez V. cholerae) (60). Il permet de discriminer avec une grande sensibilité les espèces du genre

Vibrio (61).
La Polymerase Chain Reaction (PCR) en temps réel de la séquence R72H du génome
de V. parahaemolyticus permet d’identifier comme étant, ou non, V. parahaemolyticus puisque
cette séquence est spécifique de cette espèce (62,63). Cette séquence est composée d’un

fragment non-codant et d’un gène codant pour une phosphatydilsérine synthétase (64).
De même la PCR du gène 16S codant pour l’ARN ribosomique 16S de la petite sous-
unité du ribosome des procaryotes permet d’identifier des espèces bactériennes des espèces du
genre Vibrio, et notamment V. parahaemolyticus, de par sa structure. Il est composé de
fragments hyper-variables permettant la discrimination entre les souches et de fragments très
conservés permettant d’utiliser des amorces universelles pour être théoriquement amplifié chez
toutes les espèces bactériennes le possédant (65).

V. Résistance aux antibiotiques

a. Mécanismes de résistance
Chez les bactéries, la résistance aux antibiotiques est conférée par plusieurs
mécanismes : la production d’une enzyme de dégradation de l’antibiotique via un gène de
résistance, la modification de la cible de l’antibiotique, la production de pompes à efflux
permettant une évacuation de l’antibiotique du cytoplasme et la modification de la perméabilité
membranaire empêchant l’antibiotique de rentrer dans la cellule.
Chez V. parahaemolyticus, tout comme chez V. vulnificus, la résistance à l’ampicilline
est conférée par la production d’une pénicillinase codée par le gène blaTEM (66). D’autres gènes
de résistance ont également été trouvés chez V. parahaemolyticus, tels que sul2 (résistance aux
sulfamides), strA et strB (résistance à la streptomycine), tetG, tetB et tetH (résistance à la
tétracycline) (66). Il a également été observé chez V. parahaemolyticus la présence de
céphalosporinases de type blaPER-1 et blaCMY-2 (67).
Chez V. cholerae, une souche issue d’un prélèvement fécal réalisé chez un patient atteint
de choléra en Inde était résistante aux céphalosporines de troisième génération et possédait une
bêta-lactamase de type blaDHA et une carbapénèmase blaNDM-1 (68,69). Il a également été
observé la présence de gènes codant pour des carbapénèmases chez V. cholerae, tel que le gène
 21

VCC-1 (70). Dans une étude réalisée sur des V. cholerae issus de prélèvements d’eaux et de
produits de la mer, il a été observé une occurrence élevée de gènes de résistances tels que ermA
(97/99), sul1 (86/99) et sul2 (49/99) (71).
La plupart des acquisitions de résistance se fait grâce au transfert horizontal de
plasmides ou de transposons portant des gènes de résistance, au sein d’une même espèce ou
d’une espèce à l’autre (7).

b. Techniques d’antibiogramme
L’augmentation du nombre de bactéries pathogènes résistantes aux antibiotiques a
conduit à une volonté de regrouper les différents plans de surveillance. Dans ce but, une action
européenne, l’« Antibiotic Resistance in Bacteria of Animal Origin » (ARBAO) a été mise en
place en 2000. De cette action sont issues des recommandations ayant permis à plusieurs pays
européens de mettre en place des plans nationaux de surveillance de l’antibiorésistance chez les
bactéries d’origine animale (72). Ces plans de surveillance concernent des bactéries issues du
milieu terrestre, soit des bactéries zoonotiques pathogènes pour l’homme (Salmonella et
Campylobacter), soit des bactéries indicatrices, témoins de l’état d’antibiorésistance d’un
environnement, telles que Escherichia coli et Enterococcus faecium et faecalis. Il n’existe, en
revanche, aucun plan de surveillance et très peu de données portant sur l’antibiorésistance des
bactéries dans les produits issus de la mer.

La mesure de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries peut se faire par des
méthodes de dilution des antibiotiques en milieu liquide ou solide, ou par diffusion des
antibiotiques en milieu solide (73,74).
La diffusion par disque consiste à faire se développer un tapis bactérien en présence
d’un disque imprégné d’antibiotique à une concentration définie qui va diffuser dans la gélose
et inhiber la croissance des colonies à un diamètre plus ou moins grand autour du disque (75).
Ce diamètre correspond au diamètre d’inhibition permettant de déterminer la sensibilité ou la
résistance d’une bactérie à un antibiotique. Cette technique est utilisée en routine au laboratoire
et permet d’étudier sur un seul inoculum un grand nombre d’antibiotiques différents et de
déceler d’éventuelles synergies. Elle est en revanche limitée par les conditions de culture
spécifiques de certaines bactéries (bactéries intra-cellulaires, bactéries anaérobies) et par le fait
 22

que certains antibiotiques diffusent mal dans les milieux gélosés. De plus des variations des
conditions utilisées (densité de l’inoculum initial, pH, salinité…) peuvent conduire à interpréter
des sensibilités ou des résistances erronées. Les diamètres d’inhibition peuvent être sources de
biais puisqu’ils sont déterminés ou ajustés le plus souvent visuellement et qu’ils ne peuvent pas
être inférieurs à 6 mm (diamètre du disque) ce qui occulte certaines variations de résistance.
Il existe une méthode dérivée, appelée E-test, qui consiste à utiliser une bande de papier
imprégnée d’un gradient de concentration d’un antibiotique qui sera déposée sur un milieu
gélosé ensemencé avec la bactérie d’intérêt. Elle permet de déterminer plus précisément la

concentration minimale inhibant la croissance de la bactérie (CMI).

La méthode de dilution en milieu liquide reste une méthode de référence et consiste à
ensemencer une gamme de dilution de demi en demi d’un antibiotique avec un inoculum
standardisé. Il permet de déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) qui est la

concentration inhibant complètement la croissance bactérienne. Cette méthode permet de tester

un plus grand nombre de bactéries et d’antibiotiques différents mais l’écart parfois important
entre les dilutions successives la rend peu précise. De plus elle ne permet pas de déceler

d’interactions entre les antibiotiques et nécessite un essai par antibiotique à tester.

c. Etude de l’antibiorésistance
Pour réaliser et interpréter les antibiogrammes, il existe différents référentiels
standardisés. Par exemple le référentiel du CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)
aux Etats-Unis et le référentiel de l’EUCAST (European Committee on Antimicrobial
Susceptibility Testing) en Europe. Ces deux référentiels retiennent des critères d’interprétation
différents pour déterminer la résistance ou la sensibilité d’une souche bactérienne à un
antibiotique donné. De plus, les notions utilisées dans chacun des deux référentiels
(« breakpoint » et « cut-off » ou ECOFF pour « Epidemiological Cut-off Value ») sont à
prendre en compte. En effet, ces deux notions ne sont pas à utiliser dans le même contexte et

tendent à exacerber les différences d’interprétation.

Dans le milieu médical, on parle de « breakpoint » pour déterminer la résistance
antimicrobienne d’une souche clinique, en définissant des valeurs servant à classer les souches
comme Sensibles (S), Intermédiaires (I) ou Résistantes (R) afin de justifier la mise en place
d’un protocole thérapeutique. En épidémiologie, le terme « ECOFF » définit une valeur seuil
 23

servant à séparer une population microbienne en deux sous-populations : sauvage ou non-

sauvage en fonction du diamètre d’inhibition d’un antibiotique ou bien de sa concentration
minimale inhibitrice (CMI). Pour un antibiotique donné, les bactéries sauvages sont les souches
dont la sensibilité est égale ou supérieure à la valeur seuil et les bactéries non-sauvages sont les
souches plus résistantes à cet antibiotique. Ce référentiel permet d’observer une diminution de
la sensibilité d’une souche bactérienne à un antibiotique, ce qui ne signifie pas forcément
l’acquisition d’une résistance clinique.

Dans le cas de V. parahaemolyticus, l’EUCAST ne donne en 2018 pas de

recommandations pour la réalisation d’antibiogrammes (73). Les seules recommandations
existantes concernent la réalisation d'un antibiogramme par diffusion des antibiotiques et sont
données dans le référentiel du CLSI (Tableau 2) (76). Ces recommandations sont adaptées des

critères interprétatifs pour les Enterobacteriaceae et les Staphylococcus spp.

Tableau 2 : Recommandations du CLSI (2016) pour déterminer les diamètres critiques d’inhibition pour V.
parahaemolyticus par la méthode de diffusion en milieu gélosé.
R : Résistant ; I : Intermédiaire ; S : Sensible

Diamètres critiques d’inhibition (mm)

Antibiotique Charge du disque (µg)
R I S
Ampicilline 10 ≤13 14-16 ≥17
Amoxicilline-acide clavulanique 20/10 ≤13 14-17 ≥18
Cefotaxime 30 ≤22 23-25 ≥26
Cefoxitine 30 ≤14 15-17 ≥18
Ceftazidime 30 ≤17 18-20 ≥21
Gentamicine 10 ≤12 13-14 ≥15
Tetracycline 30 ≤11 12-14 ≥15
Ciprofloxacine 5 ≤12 13-15 ≥16
Cotrimoxazole 1,25/3,75 ≤10 11-15 ≥16
Chloramphénicol 30 ≤12 13-17 ≥18

d. Epidémiologie de la résistance aux antibiotiques chez Vibrio

V. parahaemolyticus présente fréquemment des résistances à l’ampicilline. On observe

également de fréquentes résistances à la colistine chez tous les Vibrio (77). Les Vibrio
 24

halophiles (V. parahaemolyticus et V. vulnificus) sont généralement résistants aux sulfamides et

aux céphalosporines de première et deuxième génération (76). Il n’existe pas de publication ni
de recommandations indiquant les résistances intrinsèques de V. parahaemolyticus qui
demeurent très peu décrites dans la littérature.

Une étude menée par Sahilah et al. (78) portant sur trente-sept isolats issus de coques
en Malaisie a démontré une émergence de résistance à la bacitracine (92%), à la pénicilline
(89%), à l’ampicilline (68%), au céfuroxime (38%), au ceftazidime (14%) et à l’amikacine
(6%). Il a également été rapporté des résistances multiples pour certains antibiotiques utilisés
en clinique (gentamicine, tétracycline), a fortiori lorsque les bactéries étaient issues d’un
biofilm (79). Tout comme les résistances intrinsèques, les résistances acquises par V.

parahaemolyticus sont très peu décrites et restent à déterminer.

De forts taux de résistance aux antibiotiques ont été décrits chez des Vibrio spp. (80),
notamment à l’ampicilline, à l’association ampicilline-sulbactame et à la tétracycline (100% de
résistances pour chaque antibiotique), à la ceftazidime (97,2%), au céfotaxime et à la
ciprofloxacine (91,7%), au cotrimoxazole (75%), à l’acide nalidixique (69,4%) et au
chloramphénicol (61,1%). Cette étude a été réalisée sur des V. cholerae et des V.
parahaemolyticus mais ne précise pas la répartition des résistances en fonction des espèces.

S’il y a peu de données portant sur la résistance aux antibiotiques chez V.

parahaemolyticus, un plus grand nombre d’études portent sur V. cholerae. V. cholerae est
généralement sensible aux pénicillines, on observe également de fréquentes résistances à la
colistine, comme chez tous les Vibrio (77).
Une étude a été réalisée sur des isolats de V. cholerae au cours d’une épidémie de choléra
au Ghana en 2014. Les V. cholerae isolées étaient de type O1 et présentaient de fréquentes
résistances au cotrimoxazole (95%), à l’ampicilline (90%) et à la ceftriaxone (75%), avec un
portage à 95% d’un élément mobile SXT porteur d’un grand nombre de gènes de résistances
(81). Une étude similaire portant sur des V. cholerae issus de selles de patients atteints de gastro-
entérites au Népal a permis d’observer des résistances au cotrimoxazole (100% de résistances),
à l’acide nalidixique (90%) et à l’ampicilline (67%) (82).
Les souches non-O1/O-139 ne sont pas responsables d’épidémies, néanmoins leur
omniprésence rend leur étude intéressante pour évaluer l’évolution des profils
 25

d’antibiorésistance des bactéries d’un environnement. Il a été rapporté plusieurs cas

d’infections par des bactéries non-O1/non-O139 multirésistantes. Entre 1995 et 2001, Tjaniadi

et al. (2003) (83) ont collecté en Indonésie des souches non-O1 pathogènes, résistantes à

l’ampicilline, au chloramphénicol, à la tétracycline et au cotrimoxazole. Entre 2000 et 2004, en

Inde, des souches pathogènes non-O1/non O-139 résistantes aux fluoroquinolones ont été
rapportées (84) et en 2002 en Inde également, des souches non-O1/non-O139 résistantes à
l’ampicilline, à l’acide nalidixique et au cotrimoxazole ont été identifiées (85). Une étude
réalisée sur des V. cholerae non-O1/non-O139 issus de l’environnement et de prélèvements
cliniques a permis d’observer 96% de résistances à la colistine et 22% de résistances à
l’ampicilline (86).
Bien que ne présentant pas nécessairement d’enjeu thérapeutique direct, ces acquisitions
de résistance peuvent poser problème étant donné la capacité des Vibrio à partager leurs
informations génétiques (87,88). Dans l’environnement ou dans le tractus digestif, ces
résistances peuvent être transmises à des bactéries avec lesquelles elles sont en contact et rendre
le traitement d’infections par d’autres germes plus difficile.

V. vulnificus présente fréquemment des résistances à l’ampicilline. Des résistances aux

sulfamides ont également été observées. Une étude portant sur 33 souches, isolées en Chine à
partir de crevettes destinées à la consommation, a mis en évidence des résistances au céfépime
(3,03%), à la tétracycline (6,06%), à l’aztréonam (24,24%), à la streptomycine (45,45%), à la
gentamicine (93,94%), à la tobramycine (100%) et à la céfazoline (100%) (89). Une autre étude
portant sur des souches de provenance similaire a mis en évidence des résistances acquises à
l’amikacine, à l’ampicilline, à la tétracycline et à la gentamicine (90). Baker-Austin et al. (91)
ont testé 350 isolats issus d’eaux et de sédiments de la côte sud-est des Etats-Unis, ainsi que
dix isolats cliniques, et ont mis en évidence des résistances multiples dans 17,3% des isolats
dont certaines concernant des antibiotiques utilisés pour le traitement des septicémies à V.
vulnificus.
Ces études associées suggèrent que l’environnement constitue un important réservoir de
bactéries résistantes qui pourraient à l’avenir être retrouvées en clinique humaine ou vétérinaire.
 26

VI. Traitements

a. Vibrio cholerae
Le traitement de la diarrhée cholérique implique une réhydratation d’urgence par voie
intraveineuse avec l’administration massive d’eau et d’électrolytes, ce qui permet au système
immunitaire de prendre en charge les Vibrio. Cependant, ce traitement prophylactique peut être
accompagné d’un traitement antibiotique composé d’une tétracycline ou de cotrimoxazole par
voie orale. Ce traitement réduit la durée des symptômes et la quantité ainsi que la durée
d’excrétion fécale de V. cholerae ([Link]

b. Vibrio parahaemolyticus
De même que pour les infections à V. cholerae, il n’est pas obligatoire de mettre en place
un traitement antibiotique pour soigner une infection à V. parahaemolyticus puisqu’une
réhydratation suffit jusqu’à la guérison spontanée de l’infection. Dans les cas les plus sévères
ou en cas de septicémie, il est en revanche possible d’administrer des antibiotiques tels que de
la tétracycline ou de la ciprofloxacine. Dans le cas de la diarrhée du voyageur, de nouvelles

recommandations préconisent un traitement à base d’azithromycine et de ciprofloxacine (92).

c. Vibrio vulnificus
Lorsqu’une infection par V. vulnificus est suspectée, le traitement doit être mis en place
durant les 72h suivant l’exposition, sous peine de voir le taux de létalité de la septicémie
atteindre 100% (93). Il comporte une antibiothérapie par doxycycline et une céphalosporine de
troisième génération ou par une association de cotrimoxazole associé à un aminoside en cas de
contre-indication (chez les enfants notamment) (94). Le cas échéant, le traitement peut
également comprendre un débridage de la zone nécrosée voire une amputation du membre
atteint pour les formes les plus sévères.
 27

VII. Présentation du sujet

V. parahaemolyticus est naturellement présente dans l’eau et les produits marins. Il

existe un potentiel risque d’augmentation de sa prévalence en raison du réchauffement
climatique qui élève la température des eaux et les rend plus propices au développement de
cette espèce (95). Actuellement, il existe peu d’études portant sur l’antibiorésistance des

bactéries isolées des produits de la mer, et notamment de V. parahaemolyticus. Sa pathogénicité

est souvent sous-évaluée et elle est capable d’échanger un grand nombre d’informations
génétiques avec les bactéries environnantes, conférant à cette bactérie un potentiel
intermédiaire permettant à des bactéries plus pathogènes d’acquérir des gènes de résistance (7).
Cela peut poser problème si les résistances acquises concernent des antibiotiques critiques en
santé humaine. Il semble donc intéressant de dresser un état des lieux permettant de mieux
évaluer les risques potentiels liés à cette espèce.
Le travail réalisé au cours de cette étude a consisté à réaliser l’identification bactérienne
de souches de Vibrio, isolées de produits de la pêche, par des tests biochimiques et par biologie
moléculaire, puis de réaliser des antibiogrammes pour déterminer la sensibilité de ces souches
à un panel d’antibiotiques. Il n’existe pas de recommandations officielles pour interpréter les
valeurs des diamètres d’inhibition obtenues par la méthode de l’antibiogramme par diffusion
en disques, et ce travail avait pour objectif de tenter de déterminer des critères d’interprétation
en testant de nombreuses souches. Afin de réaliser des antibiogrammes sur un nombre plus
important de souches et faciliter l’exploitation statistique des résultats, d’autres souches ont
également été analysées (isolées de produits de la pêche au laboratoire, au cours de précédents
travaux).
 28

Matériel et méthodes

I. Origine des souches

Deux-cent quarante-huit souches de Vibrio parahaemolyticus ont été étudiées. Les

souches ont été collectées au Laboratoire de Sécurité des Aliments de l’Anses, département des
Produits de la Pêche et de l’Aquaculture, situé à Boulogne-sur-Mer. Cette collecte a eu lieu
entre 2012 et 2016 dans le cadre de l’activité de prestations analytiques des produits de la pêche
du laboratoire, ainsi que dans sa fonction de Laboratoire National de Référence (LNR) de Vibrio
sp. dans les produits de la pêche. Ces souches ont été isolées à partir de différentes matrices

alimentaires provenant de diverses origines géographiques. Sur les 248 souches analysées, 180
ont été isolées de crevettes, 17 de gambas, 7 de poissons, une de calamar et 43 de matrices

a) b)

Figure 3 : Origine des souches de V. parahaemolyticus étudiées. a) Matrice alimentaire ; b) Origine géographique du produit.

alimentaires non définies (Figure 3). Les origines des produits de la pêche étaient pour 38 du
Vietnam, 26 d’Equateur, 14 de Madagascar, 12 d’Inde, 37 d’autres origines et 121 d’origine
géographique inconnue.
Les souches ont été isolées et identifiées selon la norme ISO/TS 21872 relative à la
recherche de Vibrio spp. potentiellement entéropathogènes dans les coquillages et produits de

la pêche. Elles ont ensuite été stockées à -80°C dans un milieu Bouillon Cœur-Cervelle (BCC)

ou Marine Broth (MB, Difco) supplémenté de 20% de glycérol (VWR, Radnor, USA).
 29

II. Identification biochimique (Galerie API 20E)

Des tests biochimiques ont été réalisés sur des souches à identifier. Des galeries API 20E
(Biomérieux, Marcy l’Etoile, France) ont été ensemencées avec les souches d’intérêt en
suspension dans de l’eau physiologique contenant 0,85% de NaCl puis incubées à 37°C pendant
18 à 24h. La lecture a ensuite été faite à l’aide d’un lecteur Biomic (Giles Scientific, Santa

Barbara, USA). Le code d’identification a été confronté à la banque de données interne de

l’appareil.

III. Identification moléculaire

a. Extraction d’ADN
Les ADN des souches d’intérêt ont été extraits grâce à un kit d’extraction DNeasy Blood
& Tissue Kit (Qiagen, Les Ulis, France). Les souches à analyser ont été repiquées sur des
géloses nutritives salées (GNS, Oxoid) contenant 2% de NaCl puis incubées à 37°C pendant
24h. Quelques colonies ont ensuite été prélevées et suspendues dans 180 µL de tampon de lyse
ATL (Animal Tissue Lysis) contenant du dodécylsulfate de sodium (SDS), dont le rôle est
d’éliminer les nucléases susceptibles de dégrader l’ADN. A cette suspension sont ajoutés 20 µL

de protéinase K permettant de lyser les protéines présentes dans la suspension. La lyse des

cellules se fait ensuite en portant le mélange à 56°C pendant 3h. Après la lyse, 4 µL de RNAse

sont ajoutés au mélange pour éliminer l’ARN bactérien. Puis 200 µL de tampon AL qui contient

des sels de guanidine pour faciliter la liaison de l’ADN à la colonne sont ajoutés à la suspension.
Le tampon AL ayant tendance à précipiter avec le SDS, 200 µL d’éthanol sont ajoutés au
mélange pour remettre le précipité en solution. Le tout est ensuite déposé sur une colonne de

silice puis centrifugé pendant une minute à 8000 rotation par minutes. Les débris cellulaires

sont élués et le pH acide des tampons permet à l’ADN de rester fixé sur la colonne. On opère
ensuite à deux lavages à l’aide de tampons AW1 et AW2 servant à éluer de la colonne les sels
et les protéines dénaturées. Le tampon AW1 contient de l’hydrochloride de guanidine, servant

à dénaturer les protéines. Le tampon AW2 contient 70% d’éthanol et sert à éluer les sels pour

purifier l’ADN fixé sur la colonne. Un dernier tampon AE est passé sur la colonne. Il contient
 30

de l’acide chlorhydrique et de l’EDTA (acide Éthylène Diamine Tétra-Acétique) à pH 9 qui

permet de détacher l’ADN de la silice.

b. PCR de du gène 16S rRNA

Les amorces utilisées sont les amorces ENV1 (Forward, 5’- AGA GTT TGA TII TGG
CTC AG -3’) et ENV2 (Reverse, 5’- CGG ITA CCT TGT TAC GAC TT -3’) (Olofsson, Ahrné,
and Molin 2007). Les extraits d’ADN des souches à identifier ont été déposés dans une plaque

96 puits avec le mélange réactionnel. Le volume final était de 50 µL par puits, soit 0,25 µL de
chaque amorce à 50 µM (Eurobio, Les Ulis, France), 0,25 µL de Taq polymérase (Hot Start Taq
DNA Polymerase, Qiagen) à 5 U/µL, 1 µL de désoxyribonucléotide-triphosphates (dNTP) à
10mM (Eurobio), 5 µL de tampon de PCR 10X (Qiagen), 2,5 µL d’extraits d’ADN et 43,25 µL
d’eau purifiée sans nucléase. Deux puits avec des témoins négatifs (mélange réactionnel et eau,

sans ADN) sont également préparés. L’amplification de l’ADN a été réalisée grâce à un

thermocycleur iCycler (Biorad, France). La réaction de PCR commence par une première phase
de 15 minutes à 95°C correspondant à une pré-dénaturation suivi d’une étape de dénaturation
de l’ADN double-brin (94°C, 45 secondes), d’hybridation des amorces (48°C, 45 secondes)
puis d’élongation des amplicons (72°C, 1 minute). Le cycle est répété 35 fois et se termine par

une dernière élongation à 72°C pendant 10 minutes. Les amplicons ont ensuite été stockés à

4°C pendant un temps maximum de 48h.

Avant le séquençage, ils sont déposés sur un gel d’agarose à 0,8% (m/v) avec du tampon
Tris-Borate EDTA (TBE, KD Medical) 1 X en présence de bromure d’éthidium (BET,
Invitrogen) à 1% (v/v). Le dépôt se fait avec 10 µL d’amplicons mélangés à 2 µL tampon de

charge 6 X (Eurobio). Le tampon de charge sert à augmenter la densité de la suspension

contenant l’amplicon pour l’aider à descendre dans le puit et à la colorer pour confirmer
visuellement la migration. La migration se fait à 125 V pendant 1h20. La distance de migration
est évaluée à l’aide d’un marqueur de taille DNA Ladder (BioLabs) échelonné tous les 100
paires de bases (bp).
Après migration, le gel a été observé et photographié sous UV avec un lecteur de gel
Quantum ST4 1100. La lumière UV permet de détecter le BET qui s’intercale entre les bases

de l’amplicon. Les amplicons attendus mesurent 1505 bp.

L’amplicon était ensuite envoyé pour séquençage à la société privée Genoscreen (Lille,
 31

France). La séquence du gène obtenue a été confrontée à la banque de données du site BLAST

([Link]). On obtient ainsi une identification accompagnée d’un

pourcentage d’homologie qui, lorsqu’il est supérieur ou égal à 97%, permet d’identifier avec
certitude la séquence d’intérêt.

c. PCR temps réel R72H

La PCR temps réel R72H nécessite les amorces Vp 32 (Forward, 5’-CGA ATC CTT
GAA CAT ACG CAG C-3’) et Vp 33 (Reverse, 5’-TGC GAA TTC GAT AGG GTG TTA ACC-
3’) et la sonde TaqMAN SVp 32-33 (FAM – CAC AGC AAG CGG GTA ATC TT – BBQ)
(62,63), ciblant la séquence R72H spécifique à cette espèce. Tout comme pour la PCR du gène
16S rRNA, les extraits d’ADN des souches à identifier ont été déposés dans une plaque 96 puits
avec le mélange réactionnel. Le volume final par puits était de 20 µL, dont 2 µL d’extraits
d’ADN, 0,4 µL de chaque amorce à 50 µM (Sigma-Aldrich, L’Isle d’Abeau Chesnes, France),
0,2 µL de la sonde TaqMAN à 5 µM (Eurofins, Nantes, France), 10 µL d’un mélange MasterMix
Quantitec probe PCR 2X (Qiagen) contenant les dNTP, le tampon de PCR et la Taq polymérase
et 7 µL d’eau purifiée sans nucléase. La sonde TaqMAN est constituée d’un fluorophore, la 6-
carboxyfluorescéine (FAM) en 5’ et d’un désactivateur ou quencher en 3’ (BlackBerry®
Quencher 650 nm BBQ-650).
L’amplification de l’ADN a été réalisée grâce à un thermocycleur iCycler (Biorad,
France). La réaction de PCR commence par une phase de dénaturation des double-brins d’ADN
à 95°C pendant 10 minutes, suivie de la phase d’hybridation et d’élongation à 60°C pendant 1
minute, répétée 45 fois. Pendant le cycle les mélanges réactionnels sont soumis à une
fluorescence d’excitation de 495 nm, ce qui correspond à la longueur d’onde d’absorption du
fluorophore FAM. La fluorescence émise est lue à 517 nm. La réaction est accompagnée d’une
gamme étalon d’ADN de V. parahaemolyticus extrait au laboratoire (de 10-1 ng/µL à 10-5
ng/µL). Les réactions sont également accompagnées d’un contrôle négatif de réaction sans
ADN et d’un contrôle négatif d’amplification avec de l’ADN non cible afin de tester la
spécificité de la réaction.
 32

IV. Antibiogrammes

Pour la réalisation des antibiogrammes, les souches, conservées à –80°C, sont

décongelées et ensemencées sur GNS à 2% de NaCl puis incubées pendant 24h à 37°C. Ensuite,
les colonies ont été suspendues dans de l’eau physiologique contenant 0,85% de NaCl et la
suspension bactérienne a été ajustée de façon à obtenir une densité de 0,5 McFarland. La

suspension obtenue a été étalée avec un écouvillon sur une gélose Mueller-Hinton. Les disques
contenant les antibiotiques ont ensuite été déposés sur la gélose ensemencée qui est incubée
pendant 16-18h à 35°C. La lecture a été faite grâce à un lecteur automatique de plaque Biomic

(Giles Scientific) et les diamètres d’inhibition ont été ajustés manuellement. Chaque lecture
était accompagnée d’un contrôle positif Escherichia coli ATCC 25922 qui a permis de valider
la qualité du lot de MH utilisé, ainsi que la diffusion des antibiotiques dans la gélose Mueller-
Hinton.

Figure 4 : Plan de la boite d’antibiogramme pour Vibrio parahaemolyticus.

Amp : ampicilline (10µg) ; Amc : amoxicilline-acide clavulanique (20/10µg) ; Tem : témocilline (30µg) ; Caz : ceftazidime
(30µg) ; Fox : cefoxitine (30µg) ; Ctx : cefotaxime (30µg) ; Cf : cefalotine (30µg) ; Azm : azithromycine (15µg) ; Na : acide
nalidixique (30µg) ; Cip : ciprofloxacine (5µg) ; Cl : colistine (10µg) ; Te : tétracycline (30µg) ; Sxt : triméthoprime-
sulfamétoxazole (1,25/3,75µg) ; S : streptomycine (10µg) ; Gm : gentamicine (10µg) et C : chloramphénicol (30µg)

Seize antibiotiques critiques en santé humaine ou recommandés par le référentiel CLSI

(2015) ont été choisis, de façon à mettre en évidence des résistances aux antibiotiques
préconisés lors de la prise en charge thérapeutique (azithromycine et ciprofloxacine
notamment), ainsi que des résistances aux grandes familles d’antibiotiques et éventuellement
des résistances croisées (bêta-lactamase à spectre étendu par exemple): ampicilline (10µg),
 33

amoxicilline-acide clavulanique (20/10µg), témocilline (30µg), ceftazidime (30µg), cefoxitine

(30µg), cefotaxime (30µg), cefalotine (30µg), azithromycine (15µg), acide nalidixique (30µg),
ciprofloxacine (5µg), colistine (10µg), tétracycline (30µg), triméthoprime-sulfamétoxazole
(1,25/3,75µg), streptomycine (10µg), gentamicine (10µg) et chloramphénicol (30µg) (Figure
4).

V. Traitement statistique des données des antibiogrammes

Les diamètres d’inhibition ont été entrés dans un tableur Excel de façon à compiler les
données souche par souche pour chaque antibiotique. Ces données ont été analysées et des
histogrammes ont été construits de façon à mettre en évidence les phénotypes majoritaires et
les phénotypes atypiques de résistance ou de sensibilité à un antibiotique donné. Cette
interprétation des données vise à déterminer des critères d’interprétation afin de différencier les
souches ayant des profils atypiques de la population normale. Elle s’est faite dans un premier

temps par examen visuel des histogrammes comme recommandé par Hombach et al. (96)

auquel s’est ajouté un traitement par le logiciel StatGraphics (Statpoint Technologies, Inc.,
Warrenpoint, USA) visant à appliquer une loi normale sur les données selon la technique NRI
(97,98).
 34

Résultats

I. Identification des souches bactériennes

Vingt-sept échantillons de produits de la pêche ont été analysés avant la réalisation de

ces travaux par le personnel de l’unité B3PA de l’Anses, pour la recherche de V.
parahaemolyticus selon la norme ISO/TS 21872. Entre 1 et 4 colonies par échantillon ont été
prélevées (pour un total de 39 souches), isolées et stockées à -80°C.
Pour la réalisation de ces travaux, les souches ont été ensemencées à nouveau sur des
milieux chromogènes (TCBS ou CHROMagar Vibrio). Vingt-six d’entre elles donnaient des
colonies caractéristiques, de couleur mauve sur milieu CHROMagar Vibrio ou verte sur milieu
TCBS (Tableau 3). Une première identification a ensuite été faite par des caractères
biochimiques pour 30 souches (galerie API 20E). Dix-neuf d’entre elles ont été identifiées
comme V. parahaemolyticus, et toutes avaient un aspect caractéristique sur les milieux
chromogènes. Trois colonies mauves sur milieu CHROMagar Vibrio n’ont pas été identifiées

comme V. parahaemolyticus par galerie API 20E. Une était un V. vulnificus et les deux autres

étaient des V. mimicus. Une colonie verte sur milieu TCBS a été identifiée comme V. cholerae.
Concernant les autres colonies non caractéristiques sur les milieux chromogènes identifiées par
ensemencement d’une galerie API 20E, 5 étaient des V. cholerae, une était un V. alginolyticus
et une était un Aeromonas hydrophila.
Après extraction de l’ADN de 33 souches, des PCR sur le gène 16S ont été réalisées
pour affiner et/ou confirmer l’identification bactérienne. Vingt-sept souches ont été identifiées

comme Vibrio sp., 2 souches comme V. parahaemolyticus, 2 comme V. metschnikovii, 2 comme

Proteus sp. et une comme V. cholerae. La PCR sur le gène 16S rRNA a permis une identification

au niveau du genre bactérien et plus rarement au niveau de l’espèce bactérienne. Une des deux
souches identifiées comme V. parahaemolyticus était mauve et l’autre était bleue sur le milieu
CHROMagar Vibrio. Les deux souches ayant été identifiées comme Proteus sp. avaient un
aspect caractéristique de V. parahaemolyticus sur milieu chromogène CHROMagar (colonies
mauves)
L’identification des souches bactériennes a été complétée en réalisant une PCR sur la
séquence R72H pour confirmer l’espèce V. parahaemolyticus. Au total, vingt-trois souches ont
 35

été identifiées comme V. parahaemolyticus, dont 21 donnaient des colonies caractéristiques sur
les milieux chromogènes TCBS ou CHROMagar Vibrio. Les deux autres souches identifiées
comme des V. parahaemolyticus donnaient des colonies blanches ou bleutées non
caractéristiques sur milieu CHROMagar. Plusieurs faux-positifs ont été observés puisqu’en
plus des 21 souches de V. parahaemolyticus, 5 autres souches ont fait des colonies
caractéristiques sur les milieux chromogènes. Une était un V. cholerae (vert sur milieu TCBS),

une était un V. vulnificus, deux étaient des V. mimicus et une était un Proteus spp. dont l'espèce

n'a pas pu être déterminée avec précision (mauve sur milieu CHROMagar Vibrio).
Les 23 souches, dont l’identification en tant que V. parahaemolyticus a été confirmée,
ont été ajoutées à un panel de 225 souches isolées précédemment lors de prestations analytiques
ou collectées au laboratoire dans sa fonction de LNR Vibrio. La résistance aux antibiotiques de

ces souches bactériennes (248 au total) a ensuite été étudiée.

 36

Tableau 3 : Isolement sur milieu gélosé et identification des souches bactériennes par galerie API 20E et/ou par PCR 16S et/ou
par PCR R72H ; ND : Non Déterminé ; + : Identification de V. parahaemolyticus

Numéro de la Milieu d’isolement et couleur Identification par galerie API Identification par PCR 16S Identification par
souche de la colonie 20E (score) (homologie) PCR R72H
12-4054 CHROMagar/Mauve V. parahaemolyticus (99,9%) Vibrio sp. (97%) +
13-615 CHROMagar/Mauve V. parahaemolyticus (99,9%) Vibrio sp. (98%) +
13-1876 CHROMagar/Mauve V. parahaemolyticus (99,9%) Vibrio sp. (97%) +
13-1968 CHROMagar/Mauve V. parahaemolyticus (99,9%) Vibrio sp. (96%) +
13-3038 CHROMagar/Mauve V. parahaemolyticus (99,9%) Vibrio sp. (97%) +
14-1029 M1 CHROMagar/Mauve ND V. parahaemolyticus (98%) +
1 CHROMagar/Mauve V. parahaemolyticus (99,9%) Vibrio sp. (98%) +
Proteus penneri / Proteus
14-1029 2 CHROMagar/Mauve ND ND
vulgaris (98%)
M4
Proteus penneri / Proteus
3 CHROMagar/Bleue ND ND
vulgaris (98%)
14-1029 M3 CHROMagar/Mauve V. parahaemolyticus (92,5%) Vibrio sp. (98%) +
15-177 J4 CHROMagar/Bleutée V. cholerae (94,6%) V. parahaemolyticus (97%) +
1 CHROMagar/Mauve ND Vibrio sp. (97%) +
15-0709 B2
2 CHROMagar/Bleue ND V. metschnikovii (98%) ND
1 CHROMagar/Bleue V. cholerae (74,5%) Vibrio sp. (98%) ND
15-1556
2 TCBS/Vert V. parahaemolyticus (99,9%) Vibrio sp. (97%) +
1 CHROMagar/Mauve V. parahaemolyticus (99,9%) Vibrio sp. (96%) +
15-1300
2 CHROMagar/Bleue ND Vibrio metschnikovii (98%) ND
15-1555 CHROMagar/Blanche ND Vibrio sp. (98%) ND
15-1771 CHROMagar/Mauve V. parahaemolyticus (99,9%) Vibrio sp. (98%) +
CHROMagar/Blanche V. cholerae (74,5%) Vibrio sp. (97%) ND
15-1770
TCBS/Vert V. parahaemolyticus (99,9%) ND +
1 TCBS/Jaune ND V. cholerae (99%) ND
2 CHROMagar/Blanche V. cholerae (74,5%) Vibrio sp. (98%) ND
15-1580 3 CHROMagar/Mauve V. vulnificus (93,9%) Vibrio sp. (96%) ND
Aeromonas hydrophila
4 CHROMagar/Blanche Vibrio sp. (98%) ND
(87,1%)
1 TCBS/Jaune V. cholerae (99,9%) ND ND
15-1662
2 TCBS/Vert V. parahaemolyticus (98,5%) ND +
1 TCBS/Vert V. cholerae (99,9%) ND ND
15-1932
2 TCBS/Vert V. parahaemolyticus (99,9%) ND +
15-2001 M 6h CHROMagar/Mauve V. parahaemolyticus (99,9%) Vibrio sp. (98%) +
16-0007 CHROMagar/Mauve V. parahaemolyticus (99,9%) Vibrio sp. (98%) +
16-0107 CHROMagar/Blanche V. alginolyticus (56,9%) Vibrio sp. (97%) ND
16-0113 CHROMagar/Blanche ND Vibrio sp. (89%) +
1 CHROMagar/Mauve V. mimicus (71%) Vibrio sp. (97%) ND
16-0155
2 CHROMagar/Mauve V. parahaemolyticus (92,5%) Vibrio sp. (98%) +
1 CHROMagar/Mauve V. mimicus (68,8%) Vibrio sp. (97%) ND
16-0159
2 CHROMagar/Mauve V. parahaemolyticus (99,9%) Vibrio sp. (99%) +
16-0160 CHROMagar/Mauve V. parahaemolyticus (99,9%) ND +
16-0192 CHROMagar/Mauve V. parahaemolyticus (99,9%) Vibrio sp. (99%) +
 37

II. Antibiogrammes des souches de Vibrio parahaemolyticus

a) b)

Figure 5 : Exemples d’antibiogrammes obtenus sur milieu Mueller-Hinton a) Souche 15-2013 ; b) Souche 16-0006.

Les antibiogrammes ont été réalisés sur un panel 248 souches de V. parahaemolyticus
isolées de produits de la pêche, dont les 23 souches identifiées précédemment.
Des résistances et des sensibilités différentes en fonction des antibiotiques et des
souches ont été observées (Figure 5). Les cercles rouges correspondent aux diamètres

d’inhibition déterminés par le lecteur de plaque et ajustés manuellement. Les diamètres

d’inhibition obtenus pour les 16 antibiotiques testés sur chacune des 248 souches de V.
parahaemolyticus ont été analysés pour mettre en évidence la distribution des profils de
résistance des souches (Figure 6). La population normale pour une espèce bactérienne par
rapport à un antibiotique correspond à la proportion de la population la plus importante en
fonction des diamètres d’inhibition. Les souches qui avaient un diamètre d’inhibition
significativement différent de ceux de la population normale étaient considérées comme
atypiques. Sur les graphiques (Figure 6), les souches avec un profil atypique correspondent aux

pics marqués en rouge sortant de la distribution normale des diamètres d’inhibition.

 38

80 a. 80 b. 80 c. 80 d.
70 70 70 70
Nombre de souches

Nombre de souches

Nombre de souches

Nombre de souches
60 60 60 60
50 50 50 50
40 40 40 40
30 30 30 30
20 20 20 20
10 10 10 10
0 0 0 0
11
16
21
26
31
36

11
16
21
26
31
36

10
14
18
22
26
30
34
38

11
16
21
26
31
36
6

6
Diamètres d’inhibition Diamètres d’inhibition Diamètres d’inhibition Diamètres d’inhibition

80 e. 80 f. 80 g.
80 h.
70
70 70 70

Nombre de souches
60
Nombre de souches

Nombre de souches

Nombre de souches
60 60 60
50 50 50 50

40 40 40 40
30 30 30 30
20 20 20 20
10 10 10 10
0 0 0 0

11
16
21
26
31
36
6
11
16
21
26
31
36

10
14
18
22
26
30
34
38

11
16
21
26
31
36
6

Diamètres d’inhibition Diamètres d’inhibition Diamètres d’inhibition Diamètres d’inhibition

80 i. 80 j. 80 k. 80 l.
70 70 70 70
Nombre de souches

Nombre de souches

Nombre de souches

Nombre de souches
60 60 60 60
50 50 50 50
40 40 40 40
30 30 30 30
20 20 20 20
10 10 10 10
0 0 0 0

26
11
16
21
26
31
36

11
16
21
26
31
36

10
14
18
22
26
30
34
38

6
10
14
18
22

30
34
38
6

Diamètres d’inhibition Diamètres d’inhibition Diamètres d’inhibition Diamètres d’inhibition

80 m. 80 n. 80 o. 80 p.
70 70 70 70
Nombre de souches
Nombre de souches

Nombre de souches
Nombre de souches

60 60 60 60
50 50 50 50
40 40 40 40
30 30 30 30
20 20 20 20
10 10 10 10
0 0 0 0
11
16
21
26
31
36
6

11
16
21
26
31
36
6
11
16
21
26
31
36

11
16
21
26
31
36
6

Diamètres d’inhibition Diamètres d’inhibition Diamètres d’inhibition Diamètres d’inhibition

Figure 6 : Distribution des diamètres d'inhibition (en mm) par antibiotique mesurées pour 248 souches de Vibrio parahaemolyticus.
a : Ampicilline ; b : Amoxicilline-acide clavulanique ; c : Témocilline ; d : Ceftazidime ; e : Céfalotine ; f : Céfoxitine ;
g : Céfotaxime ; h : Tétracycline ; i : Azithromycine ; j : Chloramphénicol ; k : Streptomycine ; l : Gentamicine ; m : Colistine ;
n : Cotrimoxazole ; o : Ciprofloxacine ; p : Acide nalidixique
 39

Les critères d’interprétation permettant de déterminer les populations normales sont

regroupés dans le Tableau 4. Les critères du CLSI ont été déterminés pour des souches
cliniques, or les souches étudiées sont des souches alimentaires ou environnementales, et donc
potentiellement plus sensibles aux antibiotiques. En comparant nos critères d’interprétation à
ceux du référentiel CLSI (2015), nous avons observé que les souches analysées étaient en
majorité cliniquement sensibles aux antibiotiques. La limite basse des critères du CLSI

correspond globalement à la limite haute des diamètres observés. Pour 6 antibiotiques (la
témocilline, la céfalotine, l’azithromycine, la streptomycine, la colistine et l’acide nalidixique)
le CLSI ne donne pas de critères d’interprétation. Il donne également des critères
d’interprétation pour l’ampicilline alors que l’étude de nos histogrammes ne permet pas de
déterminer visuellement un diamètre moyen qui pourrait correspondre à une CMI critique.
En observant les populations atypiques, on observe que certaines souches sont, selon les
critères déterminés pour des souches cliniques, résistantes à la tétracycline et au cotrimoxazole.
D’autres résistances phénotypiques existent (céfalotine, azithromycine, céfoxitine, céfotaxime,
streptomycine, acide nalidixique) mais en l’absence de critères correspondant il n’a pas été
possible de déterminer si ces faibles diamètres mesurés sont cliniquement pertinents ou non.
 40

Tableau 4 : Critères d'interprétation permettant de déterminer les populations normales et les critères d’interprétation du CLSI
(2015) pour les souches de Vibrio;

Antibiotique Diamètres observés (mm) Critères du CLSI 2015 (mm) R ≤ I ≤ S

Ampicilline ND 13 – 17
Amoxicilline-acide clavulanique 18 - 29 13 – 18
Témocilline 22 - 33 ND
Ceftazidime 21 - 33 17 – 21
Céfalotine 15 - 27 ND
Céfoxitine 16 - 26 14 – 18
Céfotaxime 27 - 39 22 – 26
Tétracycline 21 - 31 11 – 15
Azithromycine 18 - 29 ND
Chloramphénicol 23 - 37 12 – 18
Streptomycine 10 - 19 ND
Ciprofloxacine 20 - 35 12 – 16
Colistine 6 - 15 ND
Cotrimoxazole 19 - 30 10 – 16
Gentamicine 15 - 23 12 – 15
Acide nalidixique 24 - 33 ND
ND : non déterminé

Les populations normales regroupaient 100% des souches dans la zone des diamètres
critiques indiqués par le CLSI pour la témocilline, le chloramphénicol, la ciprofloxacine, la
colistine et la gentamicine, 99,6% des souches (247/248 souches) pour la ceftazidime,
l’amoxicilline-acide clavulanique et le céfotaxime, 99,2% des souches pour l’azithromycine
(246/248), 98,4% des souches pour l’acide nalidixique et la céfoxitine (244/248), 98% des
souches pour la streptomycine (243/248), 97,2% des souches pour la céfalotine (241/248),
95,6% des souches pour le cotrimoxazole (237/248) et 88,7% des souches pour la tétracycline
(220/248). Par ailleurs, dans le cas de l’ampicilline, la distribution des diamètres d’inhibition
empêchait de dégager un phénotype normal et donc de déceler de véritables modifications de
sensibilité.

Les antibiotiques pour lesquels des souches ont montré des caractères atypiques sont la
ceftazidime (1 souche sur 248 ; 0,4%), l’amoxicilline-acide clavulanique (1/248 ; 0,4%), le
céfotaxime (1/248 ; 0,4%), l’azithromycine (2/248 ; 0,8%), l’acide nalidixique (4/248 ; 1,6%
dont deux plus sensibles, diamètre d’inhibition supérieur à 33 mm ), la céfoxitine (4/248 ; 1,6%
dont trois plus sensibles, diamètre d’inhibition supérieur à 26 mm), la streptomycine (5/248,
2%), la céfalotine (7/248 ; 2,8%), le cotrimoxazole (11/248 ; 4,4%) et la tétracycline (28/248 ;
 41

11,3%). On note un très grand nombre de souches résistantes à la tétracycline (28 souches)

ainsi qu’au cotrimoxazole (11 souches). La résistance à ces deux antibiotiques est très souvent
associée puisque 10 des 11 souches résistantes au cotrimoxazole sont aussi résistantes à la
tétracycline.

Parmi les souches avec un profil atypique, seules cinq sur 39 ont une sensibilité plus
importante à un antibiotique, trois concernent la céfoxitine et deux l’acide nalidixique. Parmi

les 39 souches qui ont un profil atypique, on note plusieurs multi-résistances (Figure 7). La
souche 16-0263 présentait quatre résistances atypiques aux antibiotiques testés : l’acide
nalidixique, la tétracycline, le cotrimoxazole et la streptomycine. La souche 16-0006 montrée
précédemment (Figure 5) avait 8 résistances atypiques à la tétracycline, au cotrimoxazole, à la
streptomycine et à toutes les bêta-lactamines, à l’exception de la témocilline.

30
Nombre de souches

25
bactériennes

20
15
10
5
0
1 2 3 4 5 6 7 8
Nombre de caractères atypiques

Figure 7 : Souches bactériennes de V. parahaemolyticus classées en fonction du nombre de caractères atypiques

Concernant l’origine des souches étudiées, 180 souches sur 248 ont été isolées de
crevettes. Sur ces 180 souches, 32 (17,8%) ont un profil atypique. Ce ratio est supérieur à celui

des autres matrices (gambas : 1/17 ; poisson : 1/7 ; inconnue : 1/43).

Les souches ayant un profil atypique provenaient en grande majorité de crevettes
(32/39 ; 82%) mais sont souvent d’origine géographique inconnue (24/39 ; 61,5%). On observe

que les souches ayant des résistances à 4 ou 8 antibiotiques proviennent de crevettes (Figure 8).
 42

a. 30
25
Nombre de souches

20 Vietnam
Nicaragua
15
Madagascar
10 Indonésie
inconnue
5 Equateur

0
1 2 3 4 5 6 7 8
Nombre de caractères atypiques

b. 30
25
Nombre de souches

Inconnue
20

15 Rouget

10
Gambas

5
Crevette
0
1 2 3 4 5 6 7 8
Nombre de caractères atypiques

Figure 8 : Répartition des origines (a.) géographiques et (b.) alimentaires des souches de
Vibrio parahaemolyticus ayant un profil atypique.
 43

Discussion

La recherche de V. parahaemolyticus dans les échantillons de produits de la mer a nécessité des

isolements sur différents milieux sélectifs puis l’identification des souches isolées par des
techniques biochimiques et de biologie moléculaire. Sur les 39 souches analysées, 23 souches
ont été identifiées comme V. parahaemolyticus. Deux d’entre elles étaient des faux négatifs
puisqu’elles donnaient des colonies blanches ou bleutées non caractéristiques sur milieu
CHROMagar. Cinq autres souches étaient des faux positifs puisqu’elles donnaient des colonies

caractéristiques de V. parahaemolyticus sur les milieux chromogènes. Une était un V. cholerae

(vert sur milieu TCBS), une était un V. vulnificus, deux étaient des V. mimicus et une était un
Proteus spp., dont l'espèce n'a pas pu être déterminée avec précision (mauve sur milieu

CHROMagar Vibrio).

Ces données rejoignent les travaux de Di Pinto et al. (99) évaluant la pertinence de

l'utilisation de ces milieux pour isoler V. parahaemolyticus. En ensemençant les deux types de
milieux (CHROMagar Vibrio et TCBS) avec 47 échantillons contaminés, il a été observé 2 faux
positifs et 43 faux négatifs sur milieu TCBS, et 6 faux négatifs sur milieux CHROMagar Vibrio.
Les deux types de milieux chromogènes semblaient donc présenter des imprécisions, avec une
fiabilité plus importante du milieu CHROMagar Vibrio. Fabbro et al. (100) ont observé des
résultats similaires puisque seules 58% des colonies caractéristiques retenues sur milieu TCBS
avaient été confirmées comme V. parahaemolyticus par des méthodes biochimiques. De même,
Ghenem et al. (101) concluaient de leur étude que le milieu TCBS n’était pas assez sélectif pour
identifier avec certitude des V. parahaemolyticus et que d’une façon plus générale,
l’identification de V. parahaemolyticus ne pouvait être confirmée par des méthodes de
microbiologie.
La norme ISO/TS 21872, qui demande l'utilisation des deux milieux TCBS et
CHROMagar Vibrio pour l’isolement de Vibrio pathogènes dans les produits alimentaires est
actuellement en révision et pose la question de la pertinence de l'utilisation conjointe de ces
deux milieux.

Consécutivement à l’isolement des souches bactériennes sur les milieux chromogènes,

des tests biochimiques ont été réalisés (galerie API 20E). Les 19 souches identifiées V.
 44

parahaemolyticus par galerie API 20E ont été confirmées par PCR R72H. Un faux-négatif en
plus a été noté, une souche identifiée V. cholerae (94,5%) par galerie API 20E et positive comme
V. parahaemolyticus à la PCR R72H. Il a déjà été observé que la sensibilité des galeries API
20E pouvait poser problème dans une étude au cours de laquelle 7 faux-négatifs ont été observés
sur 21 souches testés, avec une sensibilité de 67% (100). Il semblerait que cette faible sensibilité
soit due aux conditions d’incubation des galeries qui pourraient ne pas correspondre aux
conditions de culture idéales de V. parahaemolyticus, ce qui pourrait inhiber l’expression de
certaines voies métaboliques (61). Ce problème semble pouvoir être contourné par l’inoculation
des galeries avec des suspensions bactériennes enrichies en sels (3% de NaCl), ce qui
correspondrait mieux aux conditions de cultures idéales de V. parahaemolyticus (100).
Les souches isolées sur milieux chromogènes ont ensuite été analysés par biologie
moléculaire. La PCR sur le gène 16S rRNA a permis d’identifier 26 souches sur 33 au niveau

du genre bactérien. Les 5 autres souches ont été identifiées au niveau de l’espèce (leur séquence
a > 97% d’homologie avec la séquence de la souche de référence) : V. parahaemolyticus (2
souches), V. cholerae (1 souche), V. metschnikovii (2 souches). Il semble donc difficile

d'identifier les espèces de Vibrio à partir d'une flore totale grâce à la PCR sur le gène 16S. Il a
même été observé que cette identification pouvait être fausse au niveau du genre puisque que
cette méthode pouvait confondre les genres Aeoromonas et Vibrio (102). En plus de la PCR sur
le gène 16S, réaliser d’autres tests tels que l’ensemencement de galeries API 20E, une PCR
ciblant des gènes de ménage ou une PCR ciblant la séquence R72H permettraient d’améliorer
l’identification de V. parahaemolyticus.
Devant les imprécisions des méthodes de microbiologie et de biochimie, le meilleur
moyen d’identifier V. parahaemolyticus semble donc être l’utilisation de méthodes de biologie
moléculaire. La PCR R72H par exemple cible une séquence spécifique chez V.
parahaemolyticus. Elle permet de confirmer l'identification de souches après orientation du
diagnostic microbiologique mais ne permet pas d’identifier une souche inconnue, seulement de
savoir si une souche d’intérêt est ou pas un V. parahaemolyticus (62,63). Le gène toxR peut
également être amplifié puis séquencé pour identifier l’espèce, puisqu’il est présent chez toutes
les espèces de Vibrio et permet de les discriminer grâce à sa faible homologie d’une espèce à
l’autre (61).
 45

Une fois l’identification des souches comme V. parahaemolyticus confirmée, les

antibiogrammes ont pu être réalisés.

Le choix des antibiotiques composant l’antibiogramme a été décidé avant l’étude. Ils
comprennent des antibiotiques critiques en santé humaine et certains antibiotiques
recommandés par le CLSI pour l’étude de l’antibiorésistance chez V. parahaemolyticus. Les
molécules utilisées pour le traitement des « Vibrioses » à V. parahaemolyticus sont les
fluoroquinolones telles que la ciprofloxacine, ainsi que la tétracycline dans certains cas et
l’azithromycine dans le cadre des diarrhées du voyageur, comme recommandé par le CDC
(Center for Disease Control and Prevention) (92). Il paraît donc intéressant d’étudier les profils
de résistance à ces antibiotiques, et plus particulièrement pour ce qui est de l’azithromycine qui
a fait l’objet de nombreux mésusages, conduisant à une augmentation du nombre de bactéries
résistantes (103). Les autres molécules testées représentent les grandes familles
d’antibiotiques : pénicillines (ampicilline, amoxicilline-acide clavulanique, témocilline),
céphalosporines (ceftazidime, céfalotine, céfoxitine et céfotaxime), aminosides (streptomycine
et gentamicine), chloramphénicol, colistine et les sulfamides avec l’association cotrimoxazole.
En l’absence de profils de résistance intrinsèque décrits par les référentiels, il semble intéressant
de déterminer les populations avec des profils normaux et celles avec des profils atypiques
parmi des souches alimentaires.
En l’absence de critères interprétatifs de référence il est difficile d’établir des limites
strictes et fiables pour déterminer les populations résistantes et sensibles à un antibiotique. C’est
pourquoi dans cette étude ces populations ont été déterminées par analyses statistiques en
confrontant les différents diamètres d’inhibition. L’objectif est de pouvoir compléter des

référentiels souvent incomplets.

L’étude de la distribution de la résistance à l’ampicilline ne semble pas être pertinente

dans la mesure où aucune population majoritaire n’a pu être identifiée. Les diamètres

d’inhibition s’étalent de 6 à 26 mm sans que l’on puisse déterminer des critères d’interprétation.
Les variations de résistance à cet antibiotique chez V. parahaemolyticus a déjà été observée
notamment par Han et al. (104) lors d’une étude portée sur des souches prélevées dans des

huîtres aux Etats-Unis. Sur 252 souches analysées, 95 étaient résistantes et 41 étaient
 46

intermédiaires vis-à-vis de l’ampicilline d’après les critères CLSI (105) pour les
antibiogrammes par la méthode de dilution, soit un total de 54% de souches non sensibles . Un
fort taux de résistance à l’ampicilline avait été rapporté dès 1979 par Blake et al. (106). La
résistance à l’ampicilline chez V. parahaemolyticus est conférée par les pénicillinases de type
ampC, fréquemment retrouvées dans les souches issues de l’environnement (107). Le nombre
élevé de variation des profils de résistance à l’ampicilline semble rendre compliquée la
détermination d’un phénotype normal.
La témocilline a été choisie car c’est un antibiotique de la famille des bêta-lactamines non
hydrolysée par les bêta-lactamases des entérobactéries (BLSE, AmpC…). L’inhibition de son
activité ne peut se faire que par la production d’une carbapénèmase de type métallo-bêta-
lactamase (108), en particulier la carbapénèmase de type OXA-48 qui est très résistantes à la
témocilline. Aucune souche résistante à la témocilline n’a été observée, ce qui est concordant
avec les données bibliographiques puisqu’au moment de l’analyse de ces données, aucune
carbapénèmase n’avait été décrite chez V. parahaemolyticus. Cependant Mangat et al. (70) ont
décrit chez V. cholerae une carbapénèmase appelée VCC-1 codée par le gène blaVCC-1. Par
ailleurs, une carbapénèmase blaNDM-1 a été retrouvée chez V. cholerae, conférant des résistances
aux céphalosporines de troisième génération (68). Ces études posent la question de la
dissémination de ce gène dans l’environnement bien qu’il soit pour l’instant restreint au
chromosome de V. cholerae. Il est cependant possible que de gènes de résistances aux
carbapénèmes puissent être acquis par V. parahaemolyticus étant donné la proximité
phylogénétique entre les deux espèces (69).
Concernant les céphalosporines, la souche de V. parahaemolyticus 16-0006 était
résistante aux quatre molécules testées. Cinq autres souches ont été trouvées résistantes à la
céfalotine, ce qui semble cohérent dans la mesure où cette molécule est une céphalosporine de
première génération couvrant un spectre bien moins large que les molécules des générations
plus récentes. La résistance aux céphalosporines chez V. parahaemolyticus est rare mais a déjà

été décrite, notamment par Li et al. (67). Cette étude a mis en évidence l’existence d’une bêta-
lactamase de type AmpC codée par le gène blaCMY-2 et d’une bêta-lactamase à spectre étendu
(BLSE) codée par le gène blaPER-1 chez des souches de V. parahaemolyticus isolées de produits
alimentaires chinois. Le gène blaCMY-2 était porté par le plasmide IncA/C qui est normalement
un plasmide conjugatif des Enterobacteriaceae (109), signe que les Vibrio peuvent acquérir des
plasmides d’autres espèces, et le gène blaPER-1 est normalement porté par un plasmide de type
 47

IncN (110). Ces deux enzymes confèrent des résistances aux céphalosporines de troisième,
voire quatrième, génération et pourraient être à l’origine de la multi-résistance décrite dans ces
travaux.
Une résistance à l’amoxicilline-acide clavulanique a été observée chez la souche 16-
0006. Ce type de résistance a déjà été décrit chez V. cholerae par Bier et al. (111). Les souches
de V. cholerae étudiées étaient résistantes aux pénicillines et aux carbapénèmes mais pas aux
céphalosporines de troisième génération. Le gène responsable n’a pas été identifié mais leur

conclusion indiquait qu’une carbapénèmase était suspectée. Il semble plus probable que la
résistance à l’amoxicilline-acide clavulanique observée pour la souche 16-0006 soit due à une
céphalosporinase, ces molécules étant résistantes aux inhibiteurs de bêta-lactamases.

L’antibiotique auquel le plus grand nombre de souches bactériennes étaient résistantes

était la tétracycline (28/248 souches). La distribution des diamètres d’inhibition de cet

antibiotique permet de bien séparer les souches résistantes et les souches sensibles. Cette

résistance a été décrite chez V. parahaemolyticus, notamment par Letchumanan et al. (112).
Dans cette étude, 17% des souches testées issues de crevettes étaient résistantes à la tétracycline
d’après le référentiel du CLSI (113). Le ou les gènes responsables de la résistance à la

tétracycline n’avaient pas été recherchés. Une autre étude portant sur des souches isolées dans
des fermes aquacoles au Japon a décrit des résistances à la tétracycline dues aux gènes tetB,
tetC, tetD, tetG, et tetY (114).

Concernant l’azithromycine, deux souches résistantes ont été observées. La résistance à

l’azithromycine n’a pas été rapportée chez V. parahaemolyticus mais a été décrite chez des V.
cholerae, notamment des souches pathogènes de type O1 (115). Ces souches ont été isolées

dans un hôpital indien chez des patients dont on suspectait qu’ils étaient atteints de choléra.
Chez V. cholerae, il a été observé que des gènes de résistances aux macrolides tels que
mphR, mrx, mph(K), mel et mph2 étaient portés par le plasmide IncA/C (116). Néanmoins, la
sur-prescription d’azithromycine dans les cas de diarrhées transitoires pourrait conduire à
l’émergence de résistances qui n’ont potentiellement pas encore été décrites.
 48

Parmi les souches étudiées, cinq étaient résistantes à la streptomycine dont la souche
16-0006, 11 étaient résistantes au cotrimoxazole et deux étaient résistantes à l’acide nalidixique.
La résistance à la streptomycine chez V. parahaemolyticus est un phénomène déjà retrouvé par
Shaw et al. (117) dans des souches issues de prélèvements d’eau aux Etats-Unis et surtout en

Inde par Sudha et al. (118) dans une étude au cours de laquelle 89% des souches de V.

parahaemolyticus et de V. vulnificus analysées ont montré une résistance à la streptomycine.

Des gènes responsables de la résistance à la streptomycine ont été trouvés chez V.
parahaemolyticus (66). Il s’agit des gènes strA et strB. Cette étude a également décrit deux

résistances au cotrimoxazole, portées par le gène sul2. La résistance à l’acide nalidixique chez
V. parahaemolyticus est due à un homologue des gènes de résistance aux quinolones qnr, la
séquence VPA0095. Cette séquence est probablement dérivée du gène qnrA présent chez les

Entérobactéries (119).

Les souches de V. parahaemolyticus étudiées sont résistantes à la colistine. Très peu

d’études portent sur la résistance de V. parahaemolyticus à la colistine, et la plupart d’entre elles
s’appuient sur des référentiels ne prenant pas en compte cette espèce ou cet antibiotique, ce qui
empêche de corréler les résultats obtenus avec des données bibliographiques. Parmi ces études,

Sudha et al. (118) ont observé 95% de résistance à la colistine et 100% de résistance à
l’ampicilline chez V. parahaemolyticus, en s’appuyant sur des critères interprétatifs fournis par
le fabricant des disques contenant les antibiotiques. Ces critères définissent la limite entre la
résistance et la sensibilité à la colistine à 10 mm pour les Enterobacteriaceae et pour
Pseudomonas aeruginosa. De même pour l’ampicilline, l’interprétation indiquée est différente
en fonction de l’espèce étudiée mais aucun critère ne concerne V. parahaemolyticus, ce qui pose
la question de la référence prise en compte pour interpréter les résultats (HiMedia Laboratories,
2012). Ces problèmes d’interprétation sont retrouvés dans la plupart des études portant sur

l’antibiorésistance chez V. parahaemolyticus.

L’acquisition par les bactéries de gènes de résistance aux antibiotiques peut se faire via
le transfert d’éléments génétiques mobiles (EGM) portant plusieurs gènes associés Les
bactéries peuvent ainsi acquérir des résistances à plusieurs antibiotiques grâce à un seul EGM.
Ainsi, un plasmide portant un intégron de classe 1 a été décrit chez V. parahaemolyticus (120).
Cet intégron contenait les gènes blaVEB-2, aadB, arr2, cmlA, blaOXA-10, aadA1 et sul1. L’analyse
 49

de la séquence de cet intégron et de son environnement génétique a révélé qu’il possédait une
forte similitude avec des intégrons trouvés chez Acinetobacter baumanii¸ Pseudomonas
aeruginosa et Escherichia coli. Ce résultat semble montrer que cet intégron peut être transféré
horizontalement d’une espèce à l’autre. Sur le plasmide a également été identifiée une région
de « multidrug-resistance » contenant les gènes floR, tetA, tetR, strA et strB ainsi que la cassette
qnrVC4.
Le plasmide portant l’intégron présentait une très forte homologie avec un plasmide de multi-
résistance décrit chez V. cholerae. Il semblerait donc possible qu’il ait été transféré chez V.
parahaemolyticus à partir d’une souche de V. cholerae.
De la même façon, d’autres EGM portant des gènes de résistance ont été décrits chez V.
parahaemolyticus, tels que présentés par Liu et al. en 2013 (121) avec un plasmide portant des
bêta-lactamases à spectre étendu ainsi que d’autres gènes de résistance aux antibiotiques (dfrA1,
qnrVC, aacA3, aadA1, blaPER-1) et notamment des séquences d’insertions et des intégrases à
proximité de cette région de « multidrug resistance ».

Des éléments similaires ont été décrits chez V. cholerae, avec notamment la description
d’un élément mobile contenant les gènes sul2, strA, strB, dfrA18 et floR ainsi que d’un intégron
de classe 1 contenant les gènes sul1 et qncEΔ1 (122). Etant donné la possibilité qu’ont V.
cholerae et V. parahaemolyticus à échanger des informations génétiques, la présence chez l’une
des espèces d’éléments mobiles a un intérêt pour l’étude de la résistance aux antibiotiques chez
d’autres espèces de Vibrio.
 50

Conclusion et perspectives

Si l’on prend en compte le panel de souches de V. parahaemolyticus testées, une

sensibilité à tous les antibiotiques testés à l’exception de l’ampicilline et de la colistine a été
observée. Les molécules utilisées en thérapeutique, telles que l’azithromycine, la ciprofloxacine

et la tétracycline demeurent globalement efficaces sur la plupart des souches testées.

Cette étude a permis de mettre en évidence 39 souches atypiques sur 248 souches
étudiées, dont une souche multi-résistante (8 profils de résistances supérieures à la moyenne).
L’augmentation du nombre de bactéries résistantes aux antibiotiques, ainsi que la capacité de
V. parahaemolyticus à intégrer des plasmides pouvant porter des gènes de résistance et transmis
par d’autres bactéries (123) laisse cependant penser que des résistances de plus en plus
fréquentes pourraient apparaître au fil du temps. Par ailleurs cette capacité à intégrer mais aussi
à transmettre de l’information génétique amène à considérer cette espèce non plus seulement
comme un agent pathogène potentiellement dangereux mais également comme un vecteur
de résistance. En effet, cette bactérie se développe dans le milieu marin, au contact de

nombreuses autres espèces. De plus, lorsqu’elle infecte un hôte elle transite dans son tube

digestif où réside un très grand nombre de bactéries commensales. Les souches de V.

parahaemolyticus pourraient donc transmettre des gènes de résistances aux antibiotiques à des
bactéries potentiellement plus virulentes ou déjà résistantes à des antibiotiques différents.
L’étape suivante dans l’étude de l’antibiorésistance chez V. parahaemolyticus serait de
chercher les gènes responsables des résistances observées. Comme expliqué précédemment,
plusieurs gènes de résistances aux antibiotiques ont été décrits chez V. parahaemolyticus ou
chez d’autres espèces du genre Vibrio. Parmi ces gènes on peut citer blaVCC-1 codant pour une
carbapénèmase chez V. cholerae (70), blaCMY-2 codant pour une céphalosporinase et blaPER-1
codant pour une BLSE chez V. parahaemolyticus (67). La résistance aux tétracyclines étant
portée par un très grand nombre de gènes dont la plupart sont retrouvés chez V.
parahaemolyticus, il semble difficile de tous les chercher. On peut néanmoins dans un premier
temps restreindre la recherche aux gènes décrits le plus souvent tels que les gènes tetB, tetC,
tetD, tetG, et tetY (114). Concernant l’azithromycine, l’inhibition de son activité
antimicrobienne se fait la plupart du temps via des mécanismes non enzymatiques tels que la
 51

surexpression de la cible (l’ARN ribosomique 23S de la grande sous-unité du ribosome),

l’expression d’une pompe à efflux de type ABC ou une mutation de la cible, le plus souvent par
une substitution d’une adénine en guanine en position 2058 ou 2059 (A2058G ou A2059G)
(115). Cette mutation en particulier est détectable par PCR temps réel, comme réalisé par Chen

et al. (124) lors d’une étude portant sur la résistance aux macrolides chez Treponema pallidum.
Les gènes de résistance à la streptomycine strA et strB, aux sulfamides sul2 et aux quinolones
VPA0095 décrits chez V. parahaemolyticus seront aussi intéressants à rechercher pour trouver
l’origine des résistances aux antibiotiques et évaluer leur potentielle dissémination.

La souche 16-0006 était porteuse de résistances phénotypiques à la céfoxitine, au

céfotaxime, à la ceftazidime, au céfuroxime, au céfépime et aux associations triméthoprime-
sulfaméthoxazole et amoxicilline-acide clavulanique. Suite aux travaux présentés dans ce
rapport, son génome a été séquencé à l’aide d’un séquenceur NextSeq (Illumina, USA) et les
gènes de résistance ont été recherchés via Resfinder. Il a été démontré que cette souche

possédait les gènes de résistance blaNDM-1, sul1, sul2, dfrA16, strA, strB, aadA2, floR et tetA. Le
gène blaNDM-1 code pour une carbapénémase conférant une résistance étendue aux bêta-
lactamines. Elle a déjà été observée dans des souches d’origine alimentaire telles que

Salmonella enterica et Enterobacter spp. (125,126) mais c’est la première description d’un

Vibrio d’origine alimentaire porteur de ce gène (69). La localisation du gène sur le génome est

pour l’instant inconnue, mais il a pu être transmis à E. coli via des tests de conjugaison. Il est à
noter que, bien que possédant un gène codant pour une carbapénèmase, la souche 16-0006 était
phénotypiquement sensible à l’imipénème. Cette observation renforce l’idée que des bactéries
peuvent posséder des gènes de résistances non-exprimés et les transmettre à d’autres bactéries
qui pourront exprimer une résistance aux carbapénèmes.
Par sa capacité à survivre dans l’environnement, les Vibrio, et en particulier V.
parahaemolyticus, pourraient donc servir de réservoirs de gènes de résistance, y compris les
gènes codant les carbapénèmases. Les gènes situés sur des intégrons pourraient également
favoriser le maintien et la dissémination de la multirésistance.
 52

Valorisation

L’ensemble des analyses réalisées sur cette souche a fait l’objet d’un poster présenté
lors du congrès Antimicrobial Resistance in Animals and the Environment (ARAE, Berlin, 26-
28 Juin 2018) (Figure 9) et d’une publication dans la revue Journal of Antimicobial
Chemotherapy (Impact Factor 2017=5.217) (69).
 53

Figure 9 : Poster présenté au congrès ARAE (Berlin, 26-28 Juin 2018)

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U.F.R. DE PHARMACIE DE RENNES
N°
HELSENS, Nicolas - Etude de la résistance aux antibiotiques de souches de Vibrio
parahaemolyticus isolées de produits de la pêche

51 feuilles, 8 illustrations, 4 tableaux, Thèse : Pharmacie ; Rennes 1; 2018 ; N° .

Résumé français : La résistance aux antibiotiques chez les bactéries pathogènes est un enjeu
de santé publique. Le milieu marin est peu étudié mais c’est un réservoir potentiel de
bactéries et de gènes de résistance. Vibrio parahaemolyticus est une bactérie pathogène
naturellement présente dans le milieu marin, et pouvant échanger des gènes avec les
bactéries environnantes. L’objectif de ces travaux était d’étudier la résistance aux
antibiotiques de souches de Vibrio parahaemolyticus isolées de produits de la pêche. Le
panel de souches étudiées comprenait 225 souches isolées au laboratoire et 23 souches
identifiées pendant l’étude par des tests biochimiques et de biologie moléculaire. Des
antibiogrammes ont été réalisés sur ce panel de souches. Sur les 248 souches étudiées, 39
possédaient 1 à 8 profils atypiques, dont une souche multi-résistante. Il semble donc que les
souches de V. parahaemolyticus issues des produits de la pêche soient majoritairement
sensibles aux antibiotiques mais que des résistances apparaissent.
Résumé anglais : Antimicrobial resistance of pathogenic bacteria is a public health issue.
Although being little studied, the marine environment contains many bacteria and
antimicrobial resistance genes. Studying Vibrio parahaemolyticus is pathogenic and
naturally present in the marine environment. It can also exchange genes with surrounding
bacteria. The aim of this work was to study antimicrobial resistance of V. parahaemolyticus
strains isolated from seafood. The pool of strains contained 225 strains isolated in the
laboratory and 23 strains identified during the study through biochemical and molecular
biology tests. Antibiograms were realised on these strains. Out of 248 tested strains, 39
showed 1 to 8 atypical profiles, of which one was multiresistant. It seems that strains of V.
parahaemolyticus isolated from sea products are mainly sensitive to antibiotics, but
antimicrobial resistance emerges.
Rubrique de classement : Microbiologie

Mots-clés : Vibrio parahaemolyticus ; antibiotiques ; résistance ; antibiogrammes ; produits de la mer

Mots-clés anglais MeSH : Vibrio parahaemolyticus ; antibiotic ; antimicrobial resistance ;

antibiograms ; seafood

Président : Madame Anne GOUEON-JOLIVET

Assesseurs : Mme Anne GOUGEON-JOLIVET [directeur de thèse]

JURY :
M Pierre-Yves DONNION

Mme Sandrine BARON