Partie 3 Chapitre 1 : Manipulation des acides nucléiques

III. Amplification des acides nucléiques par PCR

III.3 PCR conventionnelle (ADN génomique)
III.3.2 Les étapes de la réaction PCR
1. La dénaturation
La température dans le tube est réglée à 95°C. A ce moment là, l’ADN se dénature. En effet,
l’ADN perd sa structure caractéristique en double hélice, les liaisons hydrogène reliant les bases de
chaque brin d’ADN étant instables à cette température. L’ADN double-brin (2 brins) est dénaturé
en ADN simple brin (1 brin).

45
 Chapitre 1 :
Partie 3
Manipulation des acides nucléiques

III. Amplification des acides nucléiques par PCR

III.3 PCR conventionnelle (ADN génomique)
III.3.2 Les étapes de la réaction PCR
2. L’hybridation
Ensuite la température est descendue à la température dite d’hybridation. Cette dernière est
généralement comprise entre 50°C et 60°C et elle varie en fonction de la composition en
désoxyribonucléotides (dATP, dTTP, dGTP, et dCTP) des amorces. Les amorces reconnaissent et se
fixent à leurs séquences complémentaires en reformant des liaisons hydrogène. On dit que les
amorces s’hybrident au brin d’ADN.

46
 Chapitre 1 :
Partie 3 Manipulation des acides nucléiques
III. Amplification des acides nucléiques par PCR
III.3. PCR conventionnelle (ADN génomique)
III.3.2. Les étapes de la réaction PCR
3. L’élongation (extension)
Puis la température est réglée à 72°C, température idéale pour l’activité de la Taq polymérase. C’est
une enzyme très spéciale, puisqu’elle est dite thermorésistante. En effet, sa température optimale
d'action est de 72°C et elle est capable de résister à des températures allant jusqu’à 100°C. Cette étape
permet à la Taq polymérase de synthétiser le brin complémentaire à l’ADN matrice, grâce aux dNTPs
libres présents dans le milieu réactionnel.

47
Partie 3 Chapitre 1 : Manipulation des acides nucléiques
III. Amplification des acides nucléiques par PCR
III.3. PCR conventionnelle (ADN génomique)
III.3.2. Les étapes de la réaction PCR - un seul cycle de PCR –

95°°C
95

50 - 60
60°°C

72°°C
72

48
Partie 3 Chapitre 1 : Manipulation des acides nucléiques
III. Amplification des acides nucléiques par PCR
III.3. PCR conventionnelle (ADN génomique)
III.3.2. Les étapes de la réaction PCR
- Au cycle suivant, les nouveaux fragments synthétisés servent à leur tour de matrice pour la synthèse de nouveaux
fragments d’ADN. En théorie, à la fin de chaque cycle la quantité d’ADN cible est doublée.
- Le premier cycle est fini et voilà qu’un nouveau cycle recommence. Cela se reproduira 30 fois (en fonction du
protocole de PCR) comme vous pouvez le voir sur le schéma.
- A partir d’une copie d’ADN cible, on pourra donc obtenir 1 milliard de copie d’ADN cible.

49
 Chapitre 1 :
Partie 3
Manipulation des acides nucléiques

III. Amplification des acides nucléiques par PCR

III.3. PCR conventionnelle (ADN génomique)
III.3.3. Les contrôles réalisés dans la PCR
A. Contrôle endogène :
Il faut noter que dans toutes les techniques de PCR (conventionnelle, en temps réel ou RT-PCR), en plus du
gène cible, on amplifie dans un autre tube un gène de référence qui sert de contrôle endogène.
- Le gène de référence = contrôle endogène :
• donne une image de la quantité de matrice apportée (ADN ou ADNc),
• est présent en quantité constante dans tous les échantillons,
• normalise :
 les biais d’extraction et de contaminations par des inhibiteurs (ADN)
 les variations d’efficacité de transcription inverse

Les gènes de référence les plus utilisés sont les gènes des sous-unités 18S et 28S des ARN ribosomaux, des
gènes de structure tels que ceux de la b-actine ou de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase
(GAPDH), les gènes de l’albumine, de la cyclophyline et de l’hypoxanthine phosphoribosyltransférase (HRPT).

50
Partie 3 Chapitre 1 :
Manipulation des acides nucléiques

III. Amplification des acides nucléiques par PCR

III.3. PCR conventionnelle (ADN génomique)
III.3.3. Les contrôles réalisés dans la PCR
B. Contrôle négatif :

- Une réaction PCR n'est validée qu'en présence d'un contrôle négatif, où
l'eau remplace l’acide nucléique à amplifier (faire la PCR sans l’acide
nucléique). Cela permet d'identifier des contaminations par l'ADN de votre
matériel ou de vos solutions. La PCR étant une réaction de type
exponentielle, un petit grain de sable, formera une dune en fin de
réaction.

51
Partie 3 Chapitre 1 :
Manipulation des acides nucléiques

III. Amplification des acides nucléiques par PCR

III.3. PCR conventionnelle (ADN génomique)
III.3.4. Détection et analyse des produits PCR

- Le produit d’une PCR est constitué d’un ou de plusieurs fragments d’ADN (la ou les
séquences d’intérêt). La détection et l’analyse des produits peuvent être très
rapidement réalisées par électrophorèse sur gel d’agarose (ou d’acrylamide).

- L’ADN est révélé par une coloration au bromure d’éthidium. Ainsi, les produits sont
visibles instantanément par illumination aux ultraviolets. Des produits de très petite
taille sont souvent visibles très près du front de migration sous forme de bandes plus
ou moins diffuses. Ils correspondent à des dimères d’amorces et parfois aux
amorces elles-mêmes.

52
Partie 3 Chapitre 1 :
Manipulation des acides nucléiques

III. Amplification des acides nucléiques par PCR

III.4. RT-PCR conventionnelle (ARN)

- La PCR peut également servir à mesurer la quantité d’ARN particulier présent dans
une cellule à un moment précis.

- Dans ce cas, elle est précédée d’une étape de rétro-transcription qui permet, grâce à
l’utilisation d’une transcriptase inverse, de synthétiser de l’ADN à partir de l’ARN
extrait de cellules.

- On appelle cette technique la RT-PCR (reverse transcription – PCR)

- L’ADN obtenu est appelé ADN complémentaire (ADNc), pour le distinguer de l’ADN
génomique
53
Partie 3 Chapitre 1 : Manipulation des acides nucléiques

III. Amplification des acides

nucléiques par PCR
III.4. RT-PCR conventionnelle (ARN)
A. La rétro-transcription
B. La PCR (comme décrit précédemment)

54
 Chapitre 1 : Manipulation des acides nucléiques
Partie 3 [Link] des acides nucléiques par PCR
III.4. RT-PCR conventionnelle (ARN)

RT
(Reverse
transcription)

95°°C
95

50 - 60
60°°C
PCR

72°°C
72

55
Partie 3 Chapitre 1 : Manipulation des acides nucléiques

III. Amplification des acides nucléiques par PCR

III.4. RT-PCR conventionnelle (ARN)
Exemple d’un résultat d’une RT-PCR

Gène cible

Gène cible

Contrôle endogène

Le traitement des cellules avec TGF-b1 induit l’augmentation de

l’expression du gène MMP9 56
Partie 3 Chapitre 1 : Manipulation des acides nucléiques
III. Amplification des acides nucléiques par PCR

III.5. PCR et RT–PCR en temps réel (PCR quantitative, qPCR et qRT-PCR)

- Du point de vue enzymatique, il n’y a aucune différence théorique entre la PCR
conventionnelle et la PCR en temps réel.

- La différence fondamentale entre ces deux PCR est que dans la qPCR, l’ADN est
quantifiée à al fin de chaque cycle en temps réel alors que dans la conventionnelle, la
quantité d'ADN n'est mesurée qu'à la fin de tout les cycles de la réaction de la PCR.

57
Partie 3 Chapitre 1 : Manipulation des acides nucléiques
III. Amplification des acides nucléiques par PCR
III.5. PCR et RT–PCR en temps réel (PCR quantitative, qPCR et qRT-PCR)
- Le principe de la PCR quantitative en temps réel repose sur le suivi cycle par cycle de la réaction
d’amplification enzymatique au moyen d’une molécule reporter fluorescente capable d’émettre dans des
conditions bien définies un rayonnement fluorescent dont l’intensité sera directement mesurée à un moment
donné au cours de chaque cycle PCR. L’intensité de la fluorescence émise par la molécule reporter
augmente à chaque cycle PCR.
- Les systèmes permettant la détection des molécules d’amplicon générées après chaque cycle d’amplification
font appel :
1. soit à un agent intercalant se fixant directement sur l’ADN double brin,
2. soit à une sonde fluorogénique allant s’hybrider de manière spécifique sur le fragment cible
amplifié (exemple : les sondes TaqMan).

- Le système de détection le plus simple repose sur l’inclusion d’un agent intercalant, le SYBRTM Green I qui
se lie préférentiellement à l’ADN double brin nouvellement synthétisé. À chaque étape d’hybridation et
d’élongation d’un cycle PCR, le SYBRTM Green I s’intercale entre les bases nucléotidiques de l’ADN double
brin et peut émettre un signal de fluorescence lorsqu’il excité par des rayonnements ultraviolets. La mesure
de l’intensité du signal émis à la fin de chaque étape d’élongation permet le suivi cycle par cycle de la
réaction PCR. 58
 Chapitre 1 :
Partie 3 Manipulation des acides nucléiques
III. Amplification des acides nucléiques par PCR
III.5. PCR et RT–PCR en temps réel (PCR quantitative, qPCR et qRT-PCR)

59
 Chapitre 1 :
Partie 3
Manipulation des acides nucléiques

III. Amplification des acides nucléiques par PCR

III.5. PCR et RT–PCR en temps réel (PCR quantitative, qPCR et qRT-PCR)

60
 Chapitre 1 :
Partie 3 Manipulation des acides nucléiques
III. Amplification des acides nucléiques par PCR
III.5. PCR et RT–PCR en temps réel (PCR quantitative, qPCR et qRT-PCR)
- Par ce suivi en temps réel d’une réaction PCR, il est alors possible de tracer une courbe, de caractériser les différentes
phases de la cinétique PCR et de mesurer la quantité de produit d’amplification généré.
- La cinétique de la réaction PCR met en jeu en trois phases : une phase d’initiation, une phase exponentielle et une phase
plateau. Elle est construite à partir de plusieurs points d’amplification. Un point d’amplification est un point présentant
pour coordonnées le nombre de cycles PCR versus l’intensité de fluorescence émise.
- La ligne de base reflète l’intensité du bruit de fond de fluorescence.
- La ligne seuil correspond au seuil de détection optique au-delà duquel la variation en intensité de fluorescence suit une
loi exponentielle.
- Le point d’intersection de la courbe cinétique PCR avec la ligne seuil définit le cycle seuil Ct (threshold cycle) ou
Cp (crossing point) qui est le point de départ de la phase exponentielle et qui se trouve directement lié à la quantité de
cible initialement présente dans l’échantillon.

61
Partie 3 Chapitre 1 :
Manipulation des acides nucléiques

III. Amplification des acides nucléiques par PCR

III.5. PCR et RT–PCR en temps réel (PCR quantitative, qPCR et qRT-PCR)

Exploitation de la courbe de cinétique pour avoir la quantité exacte du gène étudié.

Il existe plusieurs méthodes de quantification à partir des données d’une courbe de qPCR. La

plus utilisée est la quantification relative.

La méthode de quantification relative permet d’analyser la quantité de cible relativement à un

gène de référence (contrôle endogène, décrit précédemment dans la diapo n°50) allant

normaliser les différences liées à la qualité et la quantité des acides nucléiques extraits et

détecter la présence d’éventuels inhibiteurs de la PCR.

62
Partie 3 Chapitre 1 :
Manipulation des acides nucléiques

III. Amplification des acides nucléiques par PCR

III.5. PCR et RT–PCR en temps réel (PCR quantitative, qPCR et qRT-PCR)
Exploitation de la courbe de cinétique pour avoir la quantité exacte du
gène étudié.

Etape 1: normalisation par rapport au contrôle endogène

Ct gène cible – Ct contrôle endogène = Ct

Etape 2: normalisation par rapport au standard

Ct échantillon - Ct standard = Ct

Etape 3: détermination de la variation du nombre de copie du gène cible

2-Ct 63
 Chapitre 1 :
Partie 3 Manipulation des acides nucléiques

III. Amplification des acides nucléiques par PCR

III.5. PCR et RT–PCR en temps réel (PCR quantitative, qPCR et qRT-PCR)
Exploitation de la courbe de cinétique pour avoir la quantité exacte du
gène étudié.
Exemple explicatif

Comparaison du gène cible avec le contrôle endogène

Rn
Contrôle endogène

Gène cible

Ct = 22 – 16 = 6

Ct=16 Ct=22 Cycle 64

Partie 3 Chapitre 1 :
Manipulation des acides nucléiques

III. Amplification des acides nucléiques par PCR

III.5. PCR et RT–PCR en temps réel (PCR quantitative, qPCR et qRT-PCR)
Exploitation de la courbe de cinétique pour avoir la quantité exacte du gène
étudié.
Exemple explicatif

t=0 t=2 t=4 t=7 t=14 t=21

-t0 ajout d’un traitement « x » aux cellules,

-t0 sera utilisé comme valeur standard

65
 Exemple explicatif, Comparaison de Ct

t0 t2
Rn Rn

Ct=16 Ct=32 Cycle Gène cible Ct=16 Ct=26 Cycle

Ctstandard = 32 – 16 = 16 Contrôle endogène Ctechantillon = 26 – 16 = 10

t4 t7
Rn Rn

Ct=12 Ct=22 Cycle Ct=15 Ct=26 Cycle

Ctechantillon = 22 – 12 = 10 Ctechantillon = 26 – 15 = 11
64
 Exemple explicatif, Comparaison de Ct

Etape 1: normalisation par rapport au Etape 2: normalisation par rapport au

contrôle endogène standard

Ct gène cible – Ct contrôle endogène = Ct Ct échantillon - Ct standard = Ct

Pour T0, Ctstandard = 32 – 16 = 16 Pour T0, Ctstandard = 16 – 16 = 0

Pour T2, Ctechantillon = 26 – 16 = 10 Pour T2, Ctechantillon = 10 – 16 = -6
Pour T4, Ctechantillon = 22 – 12 = 10 Pour T4, Ctechantillon = 10 – 16 = -6
Pour T7, Ctechantillon = 26– 15 = 11 Pour T7, Ctechantillon = 11 – 16 = -5

Etape 3: détermination de la variation du nombre de copie du gène cible

R=2-Ct
Pour T0, nombre de copie de gène cible R = 20 = 1
Pour T2, nombre de copie de gène cible R = 26 = 64
Pour T4, nombre de copie de gène cible R = 26 = 64
Pour T7, nombre de copie de gène cible R = 25 = 32

65
 Exemple explicatif, Comparaison de Ct

t0

Augmentation par x
t2
64 64 t4

t7
32

standard

Après 2h et 4h de traitement, les cellules expriment 64 fois plus

le gène cible par rapport à T0.
Après 7h de traitement l’expression du gène cible diminue mais
reste 32 fois plus importante qu’à T0

66
 Chapitre 1 : Manipulation des acides nucléiques
III. Amplification des acides nucléiques par PCR
III.7. domaines d’application de la PCR
La détection et la quantification d’ADN par PCR et d’ARN par RT-PCR trouve de très nombreuses applications.
En médecine : pour diagnostiquer des maladies génétiques (myopathie, mucoviscidose, etc), des infections
virales (SIDA, Hépatite C, SRAS), bactériennes (tuberculose) ou parasitaires (toxoplasmose), mais aussi
des cancers.

En médecine légale: pour identifier une personne par son empreinte génétique dans le cadre d’une
enquête judicaire ou pour un test de paternité.

En agroalimentaire: pour identifier des variétés ou des espèces végétales et animales, pour
sélectionner de nouvelles variétés de fruits et légumes, comme la tomate, pour le contrôle de la qualité des
produits agroalimentaires, détecter la présence d’OGM dans un aliment par exemple.

En histoire: Pour des études phylogénétiques sur des squelettes fossiles (ADN fossile), rechercher les
liens de parenté entre les individus (cas les plus célèbres: les enfants de Louis XVII, ou ceux du tsar
Nicolas II) pour l’étude des migrations des populations humaines et animales (en Islande, les indiens
d’Amérique), pour la détection d’infections virales, bactériennes et parasitaires sur des momies égyptiennes et
andines (par exemple H-C Li et son équipe ont montré la présence du virus HTLV-1, à l’origine du SIDA, dans
des momies de la Cordillère des Andes datant de plus de 1500 ans).
66
 Partie 3 : Techniques de base
de la biologie moléculaire

Chapitre 1 : Manipulation des acides nucléiques

I. Extraction et purification des acides nucléiques

II. Séparation des acides nucléiques par électrophorèse

III. Amplification des acides nucléiques par PCR

IV. Hybridation des acides nucléiques

V. Séquençage d’ADN

70
Partie 3 Chapitre 1 :
Manipulation des acides nucléiques

IV. Hybridation des acides nucléiques

IV.1. Définition

- L’hybridation des acides nucléiques est un outil de base en génétique moléculaire. Elle
repose sur la capacité des acides nucléiques simple brin, dont les séquences sont
partiellement ou totalement complémentaires, à former une molécule bicaténaire (double
brin) par appariements des bases les unes avec les autres (hybridation).

- Hybridation peut avoir lieu en solution ou en support solide (sur membrane, sur des
colonies bactériennes, sur un chromosome ou sur une coupe de tissus... ).

- Objectif : détecter la présence d'un acide nucléique d'une séquence donnée par
utilisation d'une sonde complémentaire
71
 Chapitre 1 :
Partie 3
Manipulation des acides nucléiques

IV. Hybridation des acides nucléiques

IV.2. Sondes
- Une sonde est un marqueur qu’on introduit dans un milieu biologique pour que ses propriétés vis-à-vis
des constituants de ce milieu soient révélées par l’émission d’un signal détectable par nos instruments
de mesure.

- Les oligonucléotides sont employés comme sondes parce

qu’ils peuvent s’hybrider spécifiquement avec une séquence
d’un acide nucléique dans un milieu biologique. Lorsqu’elles
sont marquées (atomes radioactifs, biotine, fluorochromes)
leur présence dans le milieu peut être suivie.

- Après lavage du milieu pour éliminer les oligonucléotides non-

hybridés avec le matériel biologique, la présence du marqueur
révèle les hybrides formés et permet de mettre en évidence la
séquence reconnue par la sonde.
72
 Chapitre 1 :
Partie 3
Manipulation des acides nucléiques

IV. Hybridation des acides nucléiques

IV.3. Conditions d’hybridation
- La température d’hybridation (Th) est légèrement inférieur (environ de 5°C) à la température de fusion
(Tm) :
- Un fragment d'ADN de séquence donnée a une Tm qui correspond à la température où 50% des
fragments sont sous forme simple brin. Tm dépend (formule mathématique à l'appui) de la longueur du
fragment d'ADN, de sa composition en bases, de la présence de certains ions dans le milieu.

Tm = 4(G+C) + 2(A+T)

73
 Chapitre 1 :
Partie 3 Manipulation des acides nucléiques
IV. Hybridation des acides nucléiques
IV.4. Applications
- Southern blot : visualiser et cartographier un fragment du génome (ADN)

- Northern blot : visualiser et cartographier un fragment d’ARN

- Dot blot : visualiser l’ensemble des acides nucléiques (mélange ADN et ARN)

- Hybridation in situ : est une technique morphologique permettant la détection et la

localisation de séquences nucléotidiques au niveau : d’une coupe de tissu, d’un étalement
cellulaire tel que une colonie de bactérie ou sur plage de lyse ou enfin sur un chromosome
métaphasique.

- Les puces à ADN ou DNA microarray : est un ensemble de molécules d'ADN fixées en
rangées ordonnées sur une petite surface qui peut être du verre, du silicium ou du
plastique. 74
 Chapitre 1 :
Partie 3
Manipulation des acides nucléiques

IV. Hybridation des acides nucléiques

IV.4. Applications
Southern blot :
- But: Détecter la présence de séquences d'ADN spécifiques dans un mélange. Edwin
Southern eut l'idée de transférer des fragments de restriction séparés dans un gel, sur
une membrane susceptible de subir le traitement d'hybridation

Hybridize with
labeled DNA
probe

75
 Chapitre 1 :
Partie 3
Manipulation des acides nucléiques

IV. Hybridation des acides nucléiques

IV.4. Applications
Les étapes de la technique Southern blot :

• Préparation de l'ADN à étudier : après extraction, l’ADN est digéré par une enzyme de
restriction adéquate,
• Séparation des fragments par électrophorèse sur gel,
• Dénaturation de l'ADN par incubation du gel d'électrophorèse dans une solution de soude
(NaOH),
• Transfert de l'ADN sur une membrane de nitrocellulose ou de nylon par un flux de
liquide entraînant l'ADN,
• Préhybridation Avant contact avec la sonde et avec la membrane, pré-incuber la
membrane avec de l'ADN pour en éliminer tous les sites qui n'ont pas été saturés par
l'ADN lors du transfert,
• Hybridation avec la sonde : ajouter la sonde dénaturée à la solution d'hybridation. La
température d'hybridation étant définie par la température de la sonde soit ~65°C pour une
sonde de + de 100 bases,
• Lavages,
• Autoradiographie : la membrane est mise en contact avec un film photosensible. 76
 Chapitre 1 :
Partie 3
Manipulation des acides nucléiques

IV. Hybridation des acides nucléiques

IV.4 Applications
Northern blot :
• Le principe est le même que pour le southern blot mais ici ce sont
les ARN qui sont étudiés donc plus besoin de digérer par enzyme de
restriction.
• La visualisation d'un ARN par une sonde permet de :

 analyser sa distribution dans les tissus,

 étudier son abondance relative,
 déterminer sa taille,
 détecter les intermédiaires de maturation et les différentes formes
d'épissage de l'ARN.

77
 Chapitre 1 :
Partie 3
Manipulation des acides nucléiques

IV. Hybridation des acides nucléiques

IV.4 Applications
Dot blot ou slot blot :
• Cette technique permet de quantifier un ARN ou fragment d'ADN donné
sans séparation préalable sur gel d'électrophorèse. Les produits PCR
peuvent après transformation en monobrins être hybridés avec des sondes
oligonucléotidiques fixées sur un support solide. Ces sondes
correspondent à des séquences normales et pathologiques (présence de
mutations ponctuelles par exemple) pour un gène donné. On différencie
deux techniques par la forme des dépôts (point ou trait) :

78
 Chapitre 1 :
Partie 3
Manipulation des acides nucléiques
IV. Hybridation des acides nucléiques
IV.4 Applications
Dot blot ou slot blot : - Exemple -

79
 Chapitre 1 :
Partie 3
Manipulation des acides nucléiques

80
 Chapitre 1 :
Partie 3
Manipulation des acides nucléiques

81
 Chapitre 1 :
Partie 3
Manipulation des acides nucléiques

82
 Chapitre 1 :
Partie 3
Manipulation des acides nucléiques

83
 Chapitre 1 :
Partie 3
Manipulation des acides nucléiques

84
 Chapitre 1 :
Partie 3
Manipulation des acides nucléiques

85
 Partie 3 : Techniques de base
de la biologie moléculaire
Chapitre 1 : Manipulation des acides nucléiques

I. Extraction et purification des acides nucléiques

II. Séparation des acides nucléiques par électrophorèse

III. Amplification des acides nucléiques par PCR

IV. Hybridation des acides nucléiques

V. Séquençage d’ADN

86
Partie 3 Chapitre 1 :
Manipulation des acides nucléiques

V. Séquençage d’ADN
V.1. Définition et historique

- Le séquençage de l'ADN, consiste à déterminer l'ordre d'enchaînement des nucléotides d’un fragment
d’ADN donné.

- Les premières techniques de séquençage ont été développées en parallèle au milieu des années 1970.
Les méthodes de Sanger (Grande-Bretagne) et Gilbert (Etats-Unis) ont toutes deux été récompensées
d'un prix Nobel de chimie en 1980.

- Le premier organisme a été séquencé en 1977. Il s'agissait du virus bactériophage ᵩX174, possédant
un ADN simple brin.

- Le séquençage est le processus utilisé pour la découverte de cette séquence. Plusieurs méthodes
existent, se développent et s'améliorent toujours plus avec le temps. Nous en sommes aujourd'hui à la
3ème génération de ces outils de séquençage.
87
 Chapitre 1 :
Partie 3
Manipulation des acides nucléiques

V. Séquençage d’ADN
V.1. Définition et historique

88
Partie 3 Chapitre 1 :
Manipulation des acides nucléiques

V. Séquençage d’ADN
V.2. les différentes générations de séquençage

A. Première génération : il s’agit de deux méthodes de séquençage, la méthode enzymatique de

sanger (1975-77) et la méthode chimique de Maxam et Gilbert (1977).

B. Seconde génération : Elle est apparue en 2005 en réponse au prix élevé et au faible débit du
séquençage de première génération. Ici, des dizaines de milliers de séquences sont traitées
ensemble, en parallèle. C'est l'apparition du séquençage haut-débit.

C. Troisième génération: La troisième génération de séquençage de masse est symbolisée par

le séquençage d'une seule molécule d'ADN (SMS ou "Single Molecule Sequencing" en
anglais). Contrairement à la seconde génération, aucune amplification de l'ADN (ou ARN) n'est
nécessaire pour effectuer les mesures. Une seule molécule est "lue". Plusieurs technologies et
méthodes sont ici à l’œuvre, avec chacune des avantages et des inconvénients.
89
 Chapitre 1 :
Partie 3 Manipulation des acides nucléiques
V. Séquençage d’ADN

V.3. Séquençage de Sanger

- Cette méthode a été la plus utilisée. Grâce au développement de la PCR, la méthode de sanger et la PCR
ont été combinées dans un procédé de séquençage.

V.3.1 Le principe
- Le principe de cette méthode consiste à initier la polymérisation de l’ADN à l'aide d'un petit oligonucléotide
(amorce) complémentaire à une partie du fragment d’ADN à séquencer. L’élongation de l’amorce est
réalisée par une ADN polymérase I dépourvue d’activité exonucléase 5’→3’. Les quatre
désoxyribonucléotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) sont ajoutés, ainsi qu’une faible concentration de l'un
des quatre didésoxyribonucléotides (ddATP, ddCTP, ddGTP ou ddTTP).

90
 Chapitre 1 : Manipulation des acides nucléiques
V. Séquençage d’ADN
V.3. Séquençage de Sanger
- Cette méthode a été la plus utilisée. Grâce au développement de la PCR, la méthode de sanger et la
PCR ont été combinées dans un procédé de séquençage.

V.3.1 Le principe

91
 Chapitre 1 :
Partie 3
Manipulation des acides nucléiques
V. Séquençage d’ADN
V.3. Séquençage de sanger
V.3.2 Les ddNTPs
- Ces didésoxyribonucléotides agissent comme des terminateurs de chaîne:

- Les ddNTPs n’ont pas de groupements hydroxyle

(OH) en position 3’. Quand un de ces nucléotides
est incorporé à l’extrémité d’un nouveau brin
d’ADN synthétisé, l’absence d’OH-3’ empêche la
polymérase d’ajouter un nouveau nucléotide et
entraîne la terminaison de la chaine.

- Les ddNTPs étant beaucoup moins concentré dans le mélange que les dNTP correspondant,
l’incorporation du ddNTP est rare et aléatoire, il peut être incorporé au début, au milieu ou même à la fin
d’une chaîne nouvellement synthétisée.
- Quelque soit le moment où le ddNTP est incorporé, la croissance de la chaine cesse à cet endroit. 92
Partie 3 Chapitre 1 :
Manipulation des acides nucléiques
V. Séquençage d’ADN
V.3. Séquençage de sanger
V.3.3 Les étapes de séquençage sanger
- il faut préparer 4 tubes contenant :
 le fragment qui doit être séquencé (ADN matrice)
 un petit morceau d'ADN dont la séquence est complémentaire à l'extrémité 3‘ du fragment à
séquencer = amorce (un seul amorce F ou R pas les 2 ensemble).
 l'ADN polymérase
 les 4 dNTP's (dCTP, dATP, dGTP, dTTP)
 dans chaque tube, de petites quantités d'un ddNTP radioactif --> son incorporation aléatoire
stoppant la synthèse. Chaque réaction comprend un nucléotide modifié différent qui, une fois
incorporé, constitue la fin d'une chaîne d'ADN, ce qui permet d'identifier la base finale.
- On obtient à la fin des réactions un ensemble de brins d'ADN de tailles variées, selon l'endroit
où un ddNTP se sera inséré et que la réaction aura ainsi été stoppée.
- À la fin l’électrophorèse sur gel permet la détection des fragments d'ADN. Les brins d'ADN peuvent
alors être vus à l'aide de la lumière ultraviolette.
- Lecture de la séquence nucléotidique : Pour lire le gel, vous commencez par le bas et regardez les
bandes (tirets noirs) afin de déterminer le séquençage du fragment d'ADN. 93
 Chapitre 1 :
Partie 3 Manipulation des acides nucléiques
V. Séquençage d’ADN
V.3. Séquençage de Sanger
V.3.3 Les étapes de séquençage Sanger

94
 Chapitre 1 : Manipulation des acides nucléiques

V. Séquençage d’ADN
V.3. Séquençage de Sanger
V.3.3 Les étapes de séquençage Sanger

95
 Chapitre 1 :
Partie 3 Manipulation des acides nucléiques

V. Séquençage d’ADN
V.3. Séquençage de Sanger
V.3.4 Evolution de séquençage Sanger
- La méthode de sanger a évolué. À la place des
ddNTPs radioactifs, on utilise des ddNTPs
fluorescents. Ici, chaque ddNTP (ddATP, ddTTP,
ddCTP, ddGTP) est marqué par un fluorochrome
différent dont le spectre d’émission est spécifique.
Une analyse spectrale va différencier les différents
fluorochromes, associer la base correspondante et
donc définir la séquence nucléotidique du brin
d’ADN initial.

- L’adaptation de la technique de Sanger à la

fluorescence permet d’effectuer la réaction de
séquence dans un tube unique.
96
 Chapitre 1 :
Partie 3 Manipulation des acides nucléiques
V. Séquençage d’ADN
V.3. Séquençage de Sanger
V.3.4 Evolution de séquençage Sanger

97
Partie 3 Chapitre 1 :
Manipulation des acides nucléiques

V. Séquençage d’ADN
V.3. Séquençage de sanger
V.3.5 Exemple de séquençage sanger : Mutation du gène VHL dans le tissu tumoral de rein

A: Vert
T: Rouge
C472G
C: Bleu
G: noir

N : Tissu normal du rein sain.

T : Tissu tumoral du rein.
98
 Partie 3 : Techniques de base
de la biologie moléculaire

Chapitre 1 : Manipulation des acides nucléiques

Chapitre 2 : Manipulation des protéines

Chapitre 3 : interaction entre Acide nucléique et

protéine

99