REPUBLIQUE DE GUINEE

Travail-justice-solidarité

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR DE LA RECHERCHE

SCIENTIFIQUE ET DE L’INNOVATION

Université Julius Nyerere de Kankan

FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE

DEPARTEMENT : BIOLOGIE

CONCENTRATION : BIOCHIMIE CLINIQUE

NIVEAU : SEMESTRE 5

ANNEE : 2024-2025
EXPOSE DU GROUPE VI
THEME : PURIFICATION ET STERISATION
ENZYMATIQUE

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 PLAN D’EXPOSE
Introduction
 Historique
 Définition
I. Détermination des méthodes de purification et
extraction enzymatique
1. Condition de détermination
2. Méthode de détermination
3. Utilisation des cofacteurs nicotinique
II. Détermination de l’activité de l’alanine amino-
transférase
III. Conclusion
Bibliographie

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 Introduction
 Historique :
La purification de l'eau a une histoire fascinante qui remonte à des milliers
d'années. Voici un aperçu des méthodes de purification de l'eau à travers les âges
:

Méthodes Anciennes

1. 4000 avant JC : Les premières méthodes de purification de l'eau

incluaient l'utilisation de minéraux naturels pour améliorer le goût et
l'apparence de l'eau.
2. Égypte Ancienne : Utilisation de sulfate d'aluminium et de sulfate de fer
pour extraire les solides en suspension.
3. Grèce Ancienne : Filtration de l'eau à travers un sac en tissu appelé la
manche d'Hippocrate avant de la faire bouillir.
4. Inde Ancienne : Utilisation de sable et de gravier pour filtrer l'eau avant
de la faire bouillir, comme décrit dans le manuscrit sanskrit Susruta
Samhita.

Méthodes Modernes

1. Distillation : Utilisée depuis l'Antiquité, cette méthode consiste à chauffer

l'eau pour la transformer en vapeur, puis à la condenser pour obtenir de
l'eau pure.
2. Filtration : Utilisation de filtres à sable, à charbon actif et à membranes
pour éliminer les impuretés.
3. Chloration : Ajout de chlore à l'eau pour tuer les bactéries et autres
micro-organismes.
4. Osmose Inverse : Utilisation de membranes semi-perméables pour
éliminer les ions, les molécules et les particules plus grosses de l'eau.

 Définition : La purification est un ensemble d’opérations visant à

enlever toutes les impuretés d’un extrait brut contenant l’enzyme
d’intérêt. En principe, n'importe quelle méthode destinée au
fractionnement de protéines peut être employée pour la purification
d'enzymes.
I. Détermination des méthodes de purification et
extraction enzymatique

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1. Extraction enzymatique

1.1. Préparation de l’échantillon

 Choix de la source enzymatique : Les enzymes peuvent être extraites de

micro-organismes (bactéries, levures, champignons), de plantes ou de
tissus animaux.
 Homogénéisation : Les tissus ou cellules sont broyés mécaniquement ou
chimiquement pour libérer les enzymes.
o Méthodes courantes : broyage mécanique, ultrasons, billes de verre,
ou congélation/décongélation répétée.

1.2. Solubilisation

 Utilisation de tampons : Un tampon approprié est choisi pour maintenir

un pH optimal et stabiliser l'enzyme.
o Exemple : Tampon phosphate ou Tris-HCl.
 Ajout de stabilisants : Agents tels que le glycérol, les sels ou les
inhibiteurs de protéases pour prévenir la dénaturation enzymatique.

2. Purification enzymatique

La purification vise à éliminer les contaminants (protéines, lipides, acides

nucléiques) tout en préservant l'activité enzymatique.

2.1. Méthodes basées sur les propriétés physiques

 Centrifugation :
o Séparation des particules en fonction de leur densité.
o Exemple : centrifugation différentielle pour éliminer les débris
cellulaires.
 Filtration :
o Utilisation de membranes pour séparer les macromolécules en
fonction de leur taille.
o Exemple : ultrafiltration pour concentrer l'enzyme.

2.2. Précipitation

 Précipitation par sels : Utilisation de sels comme le sulfate d'ammonium

pour précipiter sélectivement les enzymes.
 Précipitation isoélectrique : Ajustement du pH à celui du point
isoélectrique de l'enzyme pour la précipiter.

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2.3. Chromatographie

 Techniques essentielles pour obtenir une enzyme de haute pureté :

o Chromatographie sur gel (filtration sur gel) : Sépare les
molécules selon leur taille.
o Chromatographie par échange d’ions : Sépare les molécules en
fonction de leur charge.
o Chromatographie d'affinité : Utilisation de ligands spécifiques
pour capturer l'enzyme ciblée.
 Exemple : Immobilisation de substrats ou cofacteurs
spécifiques.
o Chromatographie hydrophobe : Basée sur les interactions
hydrophobes des protéines.

2.4. Dialyse et ultrafiltration

 Dialyse : Technique pour éliminer les sels ou petites molécules en

utilisant une membrane semi-perméable.
 Ultrafiltration : Concentration de l'enzyme en éliminant l'eau et les
petites impuretés.

II. Détermination de l’activité enzymatique

 La condition de détermination
La détermination de l'activité enzymatique nécessite de définir des conditions
précises pour obtenir des résultats fiables et reproductibles. Ces conditions
influencent directement la cinétique enzymatique et la mesure de l'activité. Voici
les principales conditions à considérer :

1. Facteurs influençant l’activité enzymatique

1.1. Température

 Température optimale : Chaque enzyme possède une température où

son activité est maximale.
o Généralement, les enzymes humaines fonctionnent à 37 °C.
o Pour les enzymes thermostables (issues de bactéries thermophiles),
la température optimale peut être bien plus élevée (50-80 °C).
 Effet de la température :
o Une augmentation modérée de la température accélère la réaction
enzymatique (selon la règle d'Arrhenius).
o Une température excessive provoque la dénaturation de l’enzyme.

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1.2. pH

 pH optimal : Chaque enzyme fonctionne dans une plage de pH

spécifique, souvent proche du pH naturel de son environnement.
o Exemple :
 Pepsine (enzyme gastrique) : pH optimal ≈ 2.
 Trypsine (enzyme pancréatique) : pH optimal ≈ 8.
 Effet du pH :
o Un pH inadapté peut altérer la structure tridimensionnelle de
l’enzyme et son site actif.

1.3. Concentration en substrat

 Cinétique Michaelis-Menten : L’activité enzymatique augmente avec la

concentration en substrat jusqu’à atteindre une vitesse maximale
(VmaxV_{\text{max}}Vmax).
 Paramètre clé : La constante de Michaelis (KmK_mKm), représentant la
concentration en substrat à laquelle la vitesse de la réaction atteint la
moitié de VmaxV_{\text{max}}Vmax.

1.4. Concentration en enzyme

 La vitesse de réaction est proportionnelle à la concentration en enzyme

tant que le substrat est en excès.
 Une quantité d’enzyme trop faible peut rendre la mesure difficile, tandis
qu’une quantité excessive peut saturer le substrat.

1.5. Présence de cofacteurs ou coenzymes

 De nombreuses enzymes nécessitent des molécules auxiliaires pour

fonctionner :
o Cofacteurs inorganiques : Ions métalliques (Mg²⁺, Zn²⁺, Ca²⁺).
o Coenzymes organiques : NAD⁺, FAD, ATP, etc.
 L’absence de ces éléments peut inhiber ou réduire l’activité enzymatique.

1.6. Présence d’inhibiteurs

 Les inhibiteurs enzymatiques peuvent fausser la mesure de l’activité :

o Inhibition compétitive : L’inhibiteur entre en compétition avec le
substrat pour le site actif.
o Inhibition non compétitive : L’inhibiteur se lie ailleurs sur
l’enzyme et modifie sa structure.

1.7. Durée de la réaction

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  La réaction enzymatique doit être mesurée dans une plage de temps
linéaire, où la vitesse est constante.
 Des mesures prolongées peuvent entraîner :
o Une dégradation du produit.
o Une inactivation de l’enzyme.

 METHODE DE DETERMINATION
La détermination de l'activité enzymatique implique des méthodes
expérimentales spécifiques pour mesurer la vitesse à laquelle une enzyme
catalyse une réaction. Voici un guide détaillé des principales méthodes
employées :

1. Méthodes spectrophotométriques

Ces méthodes sont parmi les plus courantes et permettent de mesurer

l’absorbance d’une substance (substrat ou produit) à une longueur d’onde
spécifique.

1.1. Principe

 Suivi de la variation de l’absorbance dans le temps, proportionnelle à la

concentration du produit formé ou du substrat consommé.

1.2. Exemples

1. Réactions avec NADH/NAD⁺ :

o La conversion du NAD⁺ en NADH (ou inversement) peut être
suivie à 340 nm (absorption spécifique du NADH).
o Exemple : Dosage des déshydrogénases.

2. Méthodes fluorimétriques

2.1. Principe

 Mesure de la fluorescence d’un produit généré ou d’un substrat

consommé. Les substrats ou produits doivent être intrinsèquement
fluorescents ou modifiés avec un marqueur fluorescent.

2.2. Exemples

 Détection de l’hydrolyse d’un substrat fluorescent pour les protéases ou

lipases.

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  Mesure des réactions redox utilisant des cofacteurs fluorescents (exemple
: FAD).

2.3. Avantages

 Très sensible, capable de détecter des concentrations faibles.

 Moins sujet aux interférences que la spectrophotométrie.

3. Méthodes chromatographiques

3.1. Principe

 Séparation et quantification des substrats et produits d’une réaction

enzymatique par chromatographie.
o Chromatographie liquide à haute performance (HPLC).
o Chromatographie en phase gazeuse (GC).

3.2. Exemples

 Analyse des acides gras libérés par une lipase.

 Mesure des sucres produits par des amylases via HPLC.

3.3. Avantages

 Haute précision et spécificité pour les produits cibles.

 Permet de détecter des molécules complexes ou mélanges réactionnels.

4. Méthodes électrochimiques

4.1. Principe

 Détection des variations de potentiel redox ou de concentration en ions

spécifiques dans le milieu réactionnel.
 Utilisation d’électrodes spécifiques pour mesurer des produits tels que
O2O_2O2, H2O2H_2O_2H2O2, ou H+H^+H+.

4.2. Exemples

 Détection de la consommation d’oxygène par une oxydase.

 Mesure de l’activité des catalases via la production de O2O_2O2.

4.3. Avantages

 Directe et très sensible.

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  Permet des mesures en temps réel.

5. Méthodes calorimétriques

5.1. Principe

 Mesure de la variation de chaleur dégagée ou absorbée par une réaction

enzymatique.
 Utilisation de calorimètres isothermes pour détecter les petits flux
thermiques.

5.2. Exemples

 Analyse des enzymes métaboliques dans des conditions physiologiques.

5.3. Avantages

 Permet de mesurer les réactions sans besoin de marquage ou d’absorbance

spécifique.
 Applicable à des réactions complexes.

6. Méthodes biologiques ou fonctionnelles

6.1. Principe

 Mesure de l'effet biologique ou fonctionnel de l’enzyme sur un substrat

naturel.
 Exemple : Mesure de la coagulation du lait par la présure.

6.2. Exemples

 Activité des amylases sur l’amidon suivie par la détection du glucose.

 Activité des protéases sur des substrats comme la caséine, détectée par des
précipités.

7. Méthodes par titration chimique

7.1. Principe

 Suivi des variations de concentration de produits ou substrats via des

réactions chimiques.
 Exemple : Titration acido-basique pour mesurer la production d’acides
lors d’une hydrolyse enzymatique.

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  Utilisation des cofacteurs nicotiniques
Les cofacteurs nicotiniques, principalement le NAD⁺ (nicotinamide adénine
dinucléotide) et le NADP⁺ (nicotinamide adénine dinucléotide phosphate),
jouent un rôle clé dans l’activité enzymatique en servant d’accepteurs ou de
donneurs d’électrons dans les réactions enzymatiques. Ils interviennent
principalement dans les réactions d’oxydoréduction, où ils facilitent le
transfert d’électrons et de protons entre les substrats.

1. Rôle des cofacteurs nicotiniques dans l’activité enzymatique

1.1. Transfert d’électrons

 NAD⁺/NADH et NADP⁺/NADPH agissent comme coenzymes pour les

enzymes de la famille des oxydoréductases.
 Le rôle consiste à accepter ou céder des électrons et des protons :
o NAD⁺ : Accepteur d'électrons, converti en NADH (forme réduite).
o NADPH : Donneur d'électrons, régénéré en NADP⁺ (forme
oxydée).

1.2. Participation aux réactions enzymatiques spécifiques

1. Catabolisme énergétique (NAD⁺/NADH) :

o Les enzymes du métabolisme énergétique utilisent NAD⁺ pour
catalyser des réactions d'oxydation :
 Glycolyse : Conversion du glycéraldéhyde-3-phosphate en
1,3-bisphosphoglycérate (enzyme : glycéraldéhyde-3-
phosphate déshydrogénase).
 Cycle de Krebs : Production de NADH via des enzymes
comme l’isocitrate déshydrogénase et l’alpha-cétoglutarate
déshydrogénase.
 Chaîne respiratoire : NADH transfère des électrons à la
chaîne de transport des électrons pour produire de l’ATP.
2. Biosynthèse et défense antioxydante (NADP⁺/NADPH) :
o Les enzymes impliquées dans les réactions biosynthétiques et les
défenses contre le stress oxydatif utilisent NADPH :
 Voie des pentoses phosphates : Production de NADPH via
la glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PD).
 Biosynthèse des lipides : Catalysée par des enzymes comme
la malonyl-CoA réductase.
 Réduction du glutathion : Régénération du glutathion réduit
(GSH) par la glutathion réductase.
3. Détoxification cellulaire :
10
 o Les cytochromes P450 utilisent NADPH pour catalyser
l’oxydation de composés étrangers (xénobiotiques).

2. Types d’enzymes utilisant les cofacteurs nicotiniques

2.1. Déshydrogénases

 Catalysent les réactions d’oxydation ou de réduction en transférant des

électrons et des protons au NAD⁺/NADH ou NADP⁺/NADPH.
 Exemples :
o Lactate déshydrogénase (LDH) : Conversion du lactate en
pyruvate, en oxydant NADH en NAD⁺.
o Malate déshydrogénase : Intervient dans le cycle de Krebs.

2.2. Réductases

 Utilisent le NADPH pour réduire des substrats spécifiques.

 Exemple :
o Glutathion réductase : Régénération du glutathion réduit (GSH) à
partir du glutathion oxydé (GSSG).

2.3. Oxydases et peroxydases

 Nécessitent NADH ou NADPH pour alimenter les réactions oxydatives.

 Exemple :
o NADPH oxydase : Génère des espèces réactives de l’oxygène pour
les fonctions immunitaires.

 Détermination de l'activité de l'alanine

amino-transférase
La détermination de l’activité de l’alanine aminotransférase (ALT),
également appelée transaminase glutamate-pyruvate (GPT), est une analyse
biochimique utilisée pour évaluer la fonction hépatique et détecter des atteintes
hépatiques. ALT est une enzyme clé dans le métabolisme des acides aminés,
catalysant la transamination entre l'alanine et l'alpha-cétoglutarate pour former
du pyruvate et du glutamate.

1. Principe de la méthode

L’activité de l’alanine aminotransférase est mesurée en suivant la formation ou

la consommation des produits de la réaction catalysée :

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La diminution de l'absorbance du NADH à 340 nm est proportionnelle à
l'activité ALT dans l'échantillon.

2. Matériel et réactifs

2.1. Équipements

 Spectrophotomètre réglé à 340 nm.

 Cuvettes adaptées.
 Pipettes et verrerie calibrées.
 Bain-marie à 37 °C.

2.2. Réactifs

1. Tampon de réaction : Tris-HCl 100 mM, pH 7,4.

2. Alanine : Substrat, 200 mM.
3. Alpha-cétoglutarate : 2 mM (préparé dans du tampon).
4. NADH : 0,18 mM.
5. Lactate déshydrogénase (LDH) : 1200 U/L.
6. Eau distillée : Pour diluer les réactifs.

2.3. Échantillons

 Sérum sanguin ou plasma, prélevé et conservé à 4 °C avant l’analyse.

3. Protocole expérimental

1. Préparation du mélange réactionnel :

o Dans une cuvette, ajouter :
 1 mL de tampon Tris-HCl (100 mM, pH 7,4).
 200 µL d'alanine (200 mM).
 200 µL d'alpha-cétoglutarate (2 mM).
 100 µL de NADH (0,18 mM).
 50 µL de lactate déshydrogénase (LDH, 1200 U/L).
 50 µL de sérum ou plasma (échantillon).
2. Mélange et incubation :
o Homogénéiser le mélange et incuber à 37 °C pendant 1 minute.
3. Lecture spectrophotométrique :
12
 o Mesurer l’absorbance initiale (A₀) à 340 nm.
o Laisser la réaction se poursuivre pendant 3 à 5 minutes, puis
mesurer l’absorbance toutes les minutes.

4. Résultats et interprétation

Valeurs normales

 ALT normale dans le sérum : 7 à 56 UI/L (variable selon les

laboratoires).

Augmentation de l’ALT

Un taux élevé d'ALT dans le sérum peut indiquer :

 Dommages hépatiques (hépatite, cirrhose, stéatose hépatique).

 Obstruction biliaire.
 Usage de médicaments hépatotoxiques.
 Infections ou inflammations systémiques.

5. Précautions et limites

1. Précautions techniques :
o Utiliser des réactifs frais et de haute pureté.
o Travailler à 37 °C pour mimer les conditions physiologiques.
o Éviter l’hémolyse des échantillons, car cela libère des enzymes
intracellulaires pouvant interférer avec le dosage.
2. Limites de la méthode :
o Non spécifique : Les élévations d'ALT ne sont pas exclusives à des
lésions hépatiques.
o Nécessite un équipement spectrophotométrique précis.

III. Conclusion générale

La purification et la stérilisation enzymatique sont des étapes fondamentales
pour exploiter pleinement le potentiel des enzymes, que ce soit dans des
contextes de recherche ou d’applications pratiques. Leur mise en œuvre exige
une maîtrise technique et une attention particulière pour garantir un produit final
de haute qualité, conforme aux exigences scientifiques et industrielles.

 Bibliographie :

13
1. Aebi, H. (1984). Catalase in vitro. Methods in Enzymology, 105, 121-
126.
o Cet article décrit des protocoles de purification et d'étude des
enzymes comme la catalase, y compris les méthodes pour maintenir
leur activité.
2. Scopes, R. K. (1994). Protein Purification: Principles and Practice.
Springer Science & Business Media.
o Un ouvrage de référence qui détaille les principes fondamentaux de
la purification des protéines et des enzymes, avec des descriptions
des techniques chromatographiques et de précipitation.
3. Walker, J. M. (2002). The Protein Protocols Handbook. Humana Press.
o Ce manuel fournit une collection de protocoles de purification et
d'analyse des enzymes, avec des explications pratiques pour chaque
étape.
4. Wilson, K., & Walker, J. (2010). Principles and Techniques of
Biochemistry and Molecular Biology. Cambridge University Press.
o Ce livre explore les techniques biochimiques modernes, y compris
la purification enzymatique et les méthodes de stérilisation par
filtration.
5. Eisenthal, R., & Danson, M. J. (2002). Enzyme Assays: A Practical
Approach. Oxford University Press.

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 LES MEMBRES DU GROUPE

N0 PRENOM ET NOM OBSERVATIONS NOTES

1 AMADOU KABA
2 SACKO TOURE
3 SORIBA KALLE
4 KANY KEITA
5 ABDOULAYE BAH
6 MASSANDJE TOURE
7 SARAN SACKO
8 SENY CAMARA

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