Microorganismes producteurs de molécules d’intérêt
TP N°2
CRIBLAGE DE SOUCHES STREPTOMYCES PRODUCTRICES
D'ANTIBIOTIQUES, ET D’ENZYMES
Introduction
Depuis plus de 50 ans, l’antibiothérapie est le moyen de défense majeur contre les infections
microbiennes, et la production d’antibiotiques est devenue l’un des secteurs les plus importants.
Les Streptomyces représentent actuellement le groupe responsable de la majeure partie des
antibiotiques produits industriellement. Ce sont des bactéries filamenteuses à Gram positif, qui
sont rencontrées sur tous les substrats organiques. Les sols en sont le réservoir principal.
Actuellement une attention particulière est attribuée à ce groupe bactérien dans les applications
biotechnologiques qui est un résultat cohérent de leur grande diversité métabolique : en plus
d’être la source la plus importante des antibiotiques, elles sont également une source promotrice
d’une large gamme d’enzymes, des inhibiteurs d’enzymes, des immuno-modulateurs et de
vitamines.
L’objectif de ce TP est d’isoler à partir d’un échantillon de sol forestier des souches de
Streptomyces, et de mettre en évidence leur production d’antibiotiques et d’enzymes.
Mode opératoire :
1. Isolement et purification de Streptomyces à partir d’un échantillon de sol
1.1. Préparation de l’échantillon de sol
- Un échantillon de sol prélevé vers 5 à 10 cm en dessous de la surface du sol (en zone
aérobie) le plus stérilement possible.
- L’échantillon prélevé de sol est incubé pendant quelques jours à 30°C afin d’éliminer le
maximum d’humidité, puis à 50°C (chaleur sèche) pendant quelques heures afin
d'abaisser de nombreuses espèces bactériennes et fongiques concurrentes.
1.2. Isolement
- Broyer l’échantillon de terre traité à l'aide d'un pilon dans un mortier.
- Mélanger environ 1g de broyât à 9 mL de solution stérile de NaCl à 9g/L.
- Décanter quelques instants et utiliser le surnageant pour isoler les Streptomyces.
- L’isolement se fait sur milieu amidon-caséine (Milieu qui favorise la croissance des
Steptomyces, voir annexe) par étalement de 100 μL d’échantillon sur la surface de la
gélose.
- Incuber les boîtes de 7 à 15 jours à 28-30°C.
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1.3. Purification des souches de Streptomyces
- Sur la base de l’aspect macroscopique caractéristique des Streptomyces, 3 colonies
différentes sont repérées puis prélevées et repiquées par la méthode de stries sur le même
milieu jusqu’à obtention de souches pures.
- Les souches sont ensuite incubées pendant 3 à 6 jours à 28°C.
- La pureté des souches est contrôlée par des examens microscopiques directs, après
repiquage ; Les colonies sont observées directement sous microscope optique
(Grossissement X 10) (Figure1).
Figure 1. Photographie représentant les bords d’une colonie filamenteuse de Streptomyces
sous microscope optique (Grossissement X 10).
- Les souches de Streptomyces pures sont ensuite ensemencées :
En stries serrées sur une boîte de Pétri contenant le milieu amidon-caséine pour
mettre en évidence la production d’antibiotiques.
En touche sur une boîte de Pétri contenant le milieu amidon-caséine pour mettre en
évidence la production d’enzymes.
En touche sur une boîte de Pétri contenant la gélose au lait pour mettre en évidence
la production d’enzymes.
- Les boîtes sont incubées à 28°C pendant 7 jours, puis stockées au réfrigérateur à 4°C.
2. Criblage des souches de Streptomyces productrices d’antibiotiques
-Les souches tests utilisées
Les souches d’actinomycètes obtenus en cultures pures sont testées pour la production de
substances inhibitrices, vis-à-vis de cinq souches bactériennes de référence (trois Gram négatif
et deux Gram positif), et de deux souches de champignons filamenteux.
Les bactéries tests sont Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Staphylococcus aureus ATCC 25923, et Bacillus
cereus. Les champignons tests sont Aspergillus niger CIP 1431, et Fusarium oxysporum CIP
62572.
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2.1. Mise en évidence de l’activité antibactérienne
- Préparation des inoculums bactériens
Pour chaque bactérie test, un inoculum est réalisé à partir d’une culture de 24 heures, mis en
suspension dans de l’eau physiologique stérile de telle manière à obtenir une densité optique
comprise entre 0,08 à 0,1 pour une longueur d’onde de 625 nm (environ 108 UFC/mL) ou une
opacité équivalente à celle de 0,5 McFarland.
- Test des cylindres d’Agar
- A partir des boîtes de Pétri contenant des souches pures de Streptomyces stries serrées
(paragraphe 1.3), prélever grâce une pipette Pasteur ou un emporte-pièce, des cylindres
d’agar de 6 millimètres de diamètre.
- déposer les cylindres d’agar sur le milieu Mueller-Hinton (Annexe) préalablement
ensemencés par écouvillonnage par les bactéries-tests (Figure 2).
Figure 2. Technique des cylindres d’agar
- L’ensemble est placé dans un réfrigérateur à 4°C pendant 2 heures pour permettre aux
substances actives de diffuser dans la gélose,
- Les boîtes sont incubées à 37°C pendant 24 heures.
- Apres incubation, les diamètres des zones d’inhibition apparues sont mesurés.
2.2. Mise en évidence de l’activité antifongique
- Préparation des cultures fongiques
Les champignons filamenteux sont préalablement ensemencés en stries serrées sur des boîtes
de Pétri contenant le milieu Sabouraud (Annexe), et ils sont ensuite incubés à une température
de 28°C pendant 3 à 5 jours.
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- Méthode d’antagonisme « vivant contre vivant »
- à partir de cultures de Streptomyces ensemencées en stries serrées (paragraphe 1.3),
prélever des cylindres d’agar de 17 mm de diamètre suivant la technique des cylindres
d’Agar décrite ci-dessus, et de les déposer sur le milieu de Sabouraud stérile.
- Prélever un cylindre de 6mm de diamètre à partir de cultures des champignons
filamenteux le déposé au centre de la boîte de Pétri (Figure 3).
- L’ensemble est placé dans un réfrigérateur à 4°C pendant 2 heures, les boîtes sont
ensuite incubées à 28°C pendant 3 jours.
Figure 3. Méthode d’antagonisme « vivant contre vivant »
3. Criblage pour la production d'exo-amylases
- La révélation de la production d’amylase se fait sur une culture de Streptomyces
ensemencé par touche sur milieu amidon-caséine ;
- Verser 5mL de solution de lugol sur la boîte de Pétri, et laisser agir pendant 5min ;
- Aspirer le surplus de lugol de la boîte grâce un papier absorbant ;
- La production d’amylase se traduit par l’apparition d’un halo clair autour des cultures
de Streptomyces.
4. Criblage pour la production d'exo-protéases
- La révélation de la production de protéase se fait sur une culture de Streptomyces
ensemencé par touche sur gélose nutritive au lait ;
- La production d’exo-protéases se traduit par l’apparition d’un halo clair autour des
cultures de Streptomyces.
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ANNEXE
Composition des milieux de cultures
MILIEU AMIDON CASEINE
Amidon ………………………………… 5 g
Caséine ou peptone de caséine……….. 0,3 g
KNO3 ……………………………………2 g
NaCl ……………………………………..2 g
K2HPO4 ………………………………….2 g
Mix minéraux …………………………1 mL
Agar ……………………………………18 g
Eau distillée ……………………………...1L
pH 7,2
Le mix minéraux :
MgSO 4 ………………………………….5 g
CaCO3 …………………………………...2 g
FeSO4 ………….………………………...1 g
Eau distillée ……………………………..1L
MILIEU MUELLER-HINTON
Extrait de viande…………………………..2 g
Hydrolysat acide de caséine…………...17,5 g
Amidon……………………………….....1,5 g
Agar……………………………………...10 g
Eau distillée…………………………1000 mL
pH : 7,4
GELOSE NUTRITIVE
Extrait de viande………………………. 1,0 g
Extrait de levure……………………….. 2,5 g
Peptone………………………………… 5,0 g
Chlorure de sodium……………………..5,0 g
Agar……………………………………..15 g
Eau distillée …………………………1000 mL
MILIEU SABOURAUD
Glucose………………………………….40 g
Peptone………………….………………10 g
Agar……………………………………..15 g
Eau distillée…………………………1000 mL
pH : 7,0
SOLUTION DE LUGOL
Iodine…………………………………….1 g
Iodure de potassium……………………2 mL
Eau distillée …………………………100 mL