Dosage des Protéines par la Méthode du Biuret
1. Préparation de l’Échantillon :
*Prélever une quantité appropriée de l'échantillon (liquide, jus, solution, etc.).
*Si nécessaire, diluer l'échantillon avec de l'eau distillée pour obtenir une concentration de
Protéines dans la gamme de sensibilité de la méthode du Biuret (1-20 mg/ml).
*Filtrer l'échantillon si besoin pour éliminer les particules solides.
2. Préparation des Réactifs :
Préparer le réactif de Biuret :
*Dissoudre 3 g de sulfate de cuivre (CuSO4·5H2O) dans 500 ml d'eau distillée.
*Ajouter 9 g de tartrate double de sodium et de potassium (Rochelle Salt).
*Ajouter 5 g d'hydroxyde de sodium (NaOH).
*Compléter à 1 litre avec de l'eau distillée.
3. Préparation de la Courbe Étalon :
*Préparer une solution standard de protéines, comme le sérum bovin ou l'ovalbumine, dans
Une gamme de concentrations de 1 à 20 mg/ml.
*Préparer une série de tubes étalons avec des concentrations connues de protéines :
✓ 0 mg/ml (blanc)
✓ 2 mg/ml
✓ 4 mg/ml
✓ 6 mg/ml
✓ 8 mg/ml
✓ 10 mg/ml
4. Dosage des Protéines :
*Ajouter 1 ml de l'échantillon ou de la solution étalon dans un tube à essai.
*Ajouter 4 ml de réactif de Biuret dans chaque tube.
*Mélanger et laisser réagir pendant 10 minutes à température ambiante et à l'obscurité.
*Lire l'absorbance à 540 nm contre le blanc (tube avec 0 mg/ml de protéines).
Activité Antioxydante par la Méthode du DPPH
1. Principe :
Le DPPH est un radical libre stable de couleur violette qui absorbe à 517 nm. En présence de
Composés antioxydants, le DPPH est réduit et change de couleur en virant au jaune. La
Réduction du DPPH est mesurée par spectrophotométrie, ce qui permet de déterminer l'activité
Antioxydante de l'échantillon.
2. Protocole :
1. Préparation de la Solution de DPPH :
Préparer une solution de DPPH à 0,2 mm dans du méthanol.
2. Préparation de l’Échantillon :
*Mélanger 500 µl de chaque extrait avec 375 µl d'éthanol 95% et 125 µl de solution de
DPPH.
*Préparer un échantillon contrôle en mélangeant 500 µl d'éthanol 95% avec 125 µl de DPPH.
*Préparer un blanc pour chaque échantillon en mélangeant 500 µl de chaque extrait avec 500
µl d'éthanol.
3. Incubation :
Placer les mélanges à 25°C pendant une heure à l'obscurité.
4. Lecture de l’Absorbance :
Mesurer l'absorbance des échantillons à 517 nm à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Visible.
5. Calcul de l'Activité Antioxydante :
Calculer le pourcentage d'inhibition du DPPH en utilisant la formule suivante :
𝑝𝑜𝑢𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑎𝑔𝑒 𝑑′𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑡𝑖𝑜𝑛 = (A controle−A échantillon/A controle) *100
Dosage des Sucres Totaux selon la Méthode de Dubois et al. (1956)
1. Principe :
La méthode de Dubois utilise une réaction colorimétrique pour mesurer la teneur en sucres
Totaux dans un échantillon. Le réactif de phénol réagit avec les sucres en présence d'acide
Sulfurique concentré, produisant une coloration qui peut être mesurée par spectrophotométrie.
2. Protocole :
1. Préparation de la Gamme Étalon :
*Préparer une série de solutions étalons de glucose à différentes concentrations (par exemple,
0, 10, 20, 30, 40, 50 µg/ml).
*Chaque solution étalon sera utilisée pour créer la courbe étalon.
2. Préparation de l’Échantillon :
*Peser 1 mg de l'échantillon.
*Délayer l'échantillon dans 10 ml d'eau distillée.
*Séparer l’échantillon du culot et du surnageant si nécessaire.
3. Réaction Colorimétrique :
*Ajouter 200 µl de l'échantillon ou de chaque solution étalon dans un tube à essai.
*Ajouter 200 µl de solution de phénol à 5% à chaque tube et homogénéiser le tout à l'aide
D’un vortex.
*Ajouter 1 ml de H2SO4 concentré au mélange.
*Mélanger les tubes pendant 1 minute.
*Incuber les tubes pendant 5 minutes dans un bain-marie à 100°C.
*Laisser les tubes refroidir à température ambiante et dans l’obscurité pendant 30 minutes.
4. Lecture de la Densité Optique :
*Mesurer la densité optique des échantillons à 490 nm à l'aide d'un spectrophotomètre UV Visible.
5. Calcul de la Teneur en Sucres Totaux :
Utiliser la courbe étalon préparée avec les solutions de glucose pour déterminer la
Concentration en sucres totaux dans l'échantillon.
Dosage des Lipides par la Méthode de Folch
1. Préparation de l’Échantillon :
*Peser environ 1 g d'échantillon (ajuster selon vos besoins).
*Ajouter 20 ml d’un mélange méthanol-chloroforme (2:1, v/v) dans un tube ou un bécher
Contenant l'échantillon.
2. Homogénéisation :
Homogénéiser le mélange (manuellement ou avec un homogénéisateur mécanique) pendant
15 à 20 minutes à température ambiante.
3. Filtration ou Centrifugation :
*Filtrer le mélange à travers un papier filtre pour séparer les solides.
*Si vous avez une centrifugeuse, centrifugez à 2000 rpm pendant 10 minutes pour séparer les
Phases liquide et solide.
*Récupérer la phase liquide contenant les lipides.
4. Réextraction (optionnelle) :
*Si nécessaire, réextraire le résidu solide avec une nouvelle portion du mélange méthanolchloroforme.
*Combiner les deux extraits liquides.
5. Lavage de l'Extrait Lipidique :
*Ajouter environ 4 ml d’eau distillée ou de solution saline (NaCl ou KCl à 0.9%) pour chaque
20 ml d’extrait.
*Agiter doucement le mélange pour favoriser la séparation des phases.
*Laisser reposer ou centrifuger à nouveau pour séparer les deux phases :
✓ La phase inférieure (chloroformique) contient les lipides
✓ La phase supérieure contient les contaminants non lipidiques.
6. Récupération des Lipides :
*Récupérer la phase inférieure (chloroformique) contenant les lipides.
*Évaporer le solvant sous vide avec un évaporateur rotatif ou sous un flux d’azote jusqu’à
Obtenir un résidu lipidique sec.
Dosage des Polyphénols Totaux
1. Principe :
La concentration des composés phénoliques totaux est déterminée à partir d’une courbe
Étalon en utilisant l’acide gallique comme standard.
2. Mode opératoire :
*Préparer une solution d'acide gallique (1 g/L).
*Mélanger l'échantillon avec une quantité appropriée de réactif de Folin-Ciocalteu.
*Ajouter le carbonate de sodium (Na2CO3) et laisser incuber.
*Mesurer l'absorbance à 765 nm.
*La teneur en polyphénols est exprimée en mg d’équivalent d’acide gallique (EAG) par
Gramme d'extrait.
Dosage des Flavonoïdes
1. Principe :
La quantification des flavonoïdes est réalisée par la méthode de Lamaison et al. Cette
Méthode implique l'utilisation de chlorure d'aluminium pour former un complexe avec les
Flavonoïdes, ce qui produit une coloration mesurable.
2. Mode opératoire :
*Ajouter 1 ml d'AlCl3 (2%) à 1 ml de l'extrait dilué.
*Ajouter 1 ml d'acétate de sodium (5%) et 2 ml d'eau.
*L'absorbance est ensuite lue à 725 nm.
*Le dosage des flavonoïdes est calculé à partir de l'équation de la courbe étalon de la
Quercétine.
Activité antimicrobienne par la méthode de micro-dilution en milieu liquide
[Link] :
Cette méthode permet de déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) en exposant les
bactéries à différentes concentrations d’extrait de curcuma dans des microplaques.
[Link] opératoire :
[Link]éparation de l’inoculum :
*Préparer une suspension bactérienne ajustée à 0,5 McFarland (~10⁶ UFC/mL après dilution finale).
[Link]éparation de l’extrait :
*Diluer l’extrait de curcuma dans un solvant approprié (DMSO, éthanol, eau stérile) pour obtenir une
gamme de concentrations (ex. : 1, 2, 4, 8, 16 mg/mL).
[Link]éparation des microplaques :
*Ajouter 100 µL de bouillon Mueller-Hinton (ou Sabouraud pour les champignons) dans chaque puits
d’une microplaque 96 puits.
*Ajouter 100 µL de l’extrait de curcuma dans le premier puits, puis réaliser une dilution en série (1/2)
jusqu’au dernier puits.
[Link] de l’inoculum :
*Ajouter 10 µL de la suspension microbienne dans chaque puits sauf le témoin négatif (milieu seul).
*Inclure un témoin positif (antibiotique standard) et un témoin négatif (solvant seul).
[Link] :
*Incuber à 37°C pendant 18-24 heures pour les bactéries et 25-30°C pendant 48 heures pour les
champignons.
[Link] des résultats :
*Observer la croissance microbienne visuellement ou après ajout de réactif de resazurine (virage de
couleur bleu → rose en cas de croissance).
*Déterminer la CMI : c’est la plus faible concentration où aucune croissance n’est visible.