III.5.4.

La chromatographie liquide à haute performance (HPLC)

Chromatographie liquide haute performance, souvent désignée par son
abréviation CLHP – HPLC en anglais –, constitue une technique
analytique très générale d’emploi. Elle dérive de la forme la plus
ancienne de la chromatographie liquide sur colonne dont les
performances, en termes de sélectivité et de résolution, se sont trouvées
grandement améliorées par la miniaturisation et l’utilisation de phases
stationnaires très élaborées. C’est une méthode de séparation
analytique dont développement de phases stationnaires a permis de
représenter les différents types de la chromatographie conventionnelle
(chromatographie dite basse pression). L’HPLC n'est pas un nouveau
type de chromatographie mais résulte de l'aboutissement des progrès de
l'instrumentation en ce sens qu'elle met en oeuvre des pressions de
pompage élevées, des colonnes de microparticules qui minimisent le
temps des cinétiques d'absorption, de partage, d'exclusion ou d'affinité
des molécules tout en augmentant la vitesse de flux de la phase mobile.
III.5.4.1. Principe
Ces phases, constituées de la réunion de micro-particules sphériques
dont le diamètre est compris entre 2 et 5 micromètres ou de matériaux
monolithiques poreux conduisent à une perte de charge importante
dans la colonne. Il faut donc exercer sur la phase mobile une forte
pression pour obtenir un débit convenable. Pour marquer cette
particularité de la technique, la lettre P du sigle CLHP a pendant
longtemps correspondu au mot pression. La migration forcée d’une
phase liquide au contact d’une phase stationnaire se retrouve dans
plusieurs techniques chromatographiques. La particularité de la CLHP
est de faire intervenir des mécanismes d’échange soluté/phase
mobile/phase stationnaire basés sur les coefficients d’adsorption ou de
partage.
III.5.4.2. Appareillage
Une installation de CLHP comporte divers modules spécialisés, qui se
présentent dans des boîtiers distincts ou intégrés dans un même châssis
pour des raisons de moindre encombrement. L’appareillage se compose
d’un réservoir contenant la phase mobile, d’un système de pompage,
d’un injecteur, d’une colonne chromatographique (éventuellement
thermostatée), d’un détecteur et d’un système d’acquisition des données
(avec un logiciel pour traiter les signaux)
Le réservoir de la phase mobile Il contient la phase mobile en quantité
suffisante. Plusieurs flacons d’éluant (solvant de polarités différentes)
sont disponibles pour pouvoir réaliser des gradients d’élution
(mélangede plusieurs solvants à des concentrations variables) à l’aide
de la pompe qui réalise le mélange demandé.
La pompe
Toute installation de CLHP comporte au moins une pompe pour forcer
le passage de la phase mobile à travers la colonne dont le remplissage
est très compact. Il en résulte une pression importante au niveau de
l’injecteur. Celle-ci peut atteindre 20 000 kPa (200 bars). Selon la
phase mobile on distingue deux types de chromatographie :
La chromatographie isocratique où la composition de la phase
mobile est maintenue constante pendant la séparation
La chromatographie en gradient où la composition de la phase
mobile varie progressivement ou par paliers
L’injecteur
L’injection de l’échantillon se fait de deux manières :
Manuelle : l’injecteur comporte une vanne à plusieurs voies
montée sur le parcours de la phase mobile, juste avant la colonne.
L’échantillon à analyser est introduit avec une micro-seringue dans
un petit volume tubulaire appelé boucle ; l’échantillon est ainsi
inséré avec un flux de phase mobile (FigIII.24).
Automatique : l’injection se fait automatiquement, l’injecteur
utilisé comporte une vanne à boucle d’échantillonnage d’une
capacité fixe, cette boucle permet d’introduire l’échantillon sans
modifier la pression dans la colonne
La colonne
La colonne se présente comme un tube, le plus souvent en acier,
dont la longueur et le diamètre présentent des différences selon les
modèles. Les colonnes « standard » dont le diamètre interne (DI)
est d’environ 4,5 mm et la longueur de 10 cm, sont de plus en plus
supplantées par des colonnes de plus faibles diamètres, baptisées
narrow-bore (DI 2-4 mm), micro-bore (DI 1-2 mm), capillaires
remplies (DI 0,1-1 mm). Ces modèles sont apparus suite à
l’évolution des phases stationnaires customisées et pour simplifier
les problèmes de couplage avec la spectrométrie de masse
(FigIII.26).
Phases stationnaires
La recherche d’une bonne résolution chromatographique et par voie
de conséquence d’une efficacité élevée, a conduit à la création de
phases stationnaires de nature et de structures variées. Pour
raccourcir les temps d’analyse, il faut tenter d’accélérer dans la
colonne les transferts entre les phases mobile et fixe. Parmi tous les
matériaux qui ont été ou sont actuellement utilisés pour la confection
des phases stationnaires, le gel de silice tient une place prépondérante
Le détecteur
Les systèmes de détection doivent avoir une sensibilité suffisamment
haute et stable pour mesurer une quantité d'échantillon appliquée sur
la colonne souvent très faible. En outre, cette détection se faisant
dans une cellule de faible volume nécessite une énergie lumineuse
importante. Les modes de détection les plus courants reposent sur les
propriétés optiques des composés : absorption, fluorescence et indice
de réfraction.
L’enregistreur
L’enregistreur reçoit un signal électrique proportionnel à la
concentration de l’analyte qui traverse le détecteur. Ce signal est
traité, amplifié puis utilisé pour tracer le chromatogramme. Pour
qu’un pic soit exploitable, on considère généralement que le rapport
signal / bruit doit être au moins de trois.
Le bruit se traduit par des oscillations plus ou moins marquées
autour de la ligne de base, ce bruit de fond aléatoire provient de
diverses causes :
La variation de température
La pression
L’instabilité électronique
III.5.4.3. Les grandeurs caractérisant la qualité de séparation et la
performance de la colonne L’efficacité de la colonne L’efficacité
d’une colonne analytique d’une chaine HPLC peut s’exprimer par le
nombre N de plateaux théoriques. Plus le nombre des plateaux
théoriques N est élevé, plus la colonne est efficace. On définit
également HEPT, la hauteur équivalente à un plateau théorique, et L, la
longueur de la colonne. Plus la hauteur du plateau HEPT est faible, plus
la colonne est efficace. Il existe une équation dite équation de Knox en
chromatographie liquide à haute performance qui relie la hauteur
équivalente à un plateau théorique (HEPT) à la vitesse linéaire moyenne
de la phase mobile. L’efficacité N traduit la finesse des pics.
L’efficacité d’une colonne dépend de trois facteurs principaux :
De sa géométrie : plus une colonne sera longue et plus elle sera
efficace.
De son garnissage : plus les particules de silice seront fines et plus la
colonne sera efficace.
Du débit de l’éluant : Il existe un débit optimal d’utilisation d’une
colonne pour lequel son efficacité est la plus grande. Dans le cas où les
pics sont symétriques et gaussiens, le nombre de plateaux théoriques
sera calculé selon la relation:
Tr : temps de rétention.
ω : largeur de pic à la base.
ω 1 /2 : largeur de pic à mi-hauteur.
La résolution Rs
La résolution est une mesure de la qualité d’une séparation de point de
vue chevauchement de deux signaux consécutifs. Elle est exprimée à
partir des temps de rétention. La résolution est calculée à partir de la
relation suivante :
 Deux caractéristiques déterminent le degré de recouvrement des
pics: la distance séparant les sommets de deux pics mesurés par les
temps de rétention tr2 et tr1.
La largeur des pics à la base ω1/2 (pic1) et ω1/2 (pic2).
La Sélectivité α
On définit la sélectivité α d’une séparation par le rapport de facteur de
distribution (k1 et k2) de deux solutés. Plus k est grand, plus le
composé est adsorbé fortement dans la phase stationnaire et plus la
rétention est grande et inversement. La valeur de k dépend de la
structure du composé qui détermine son affinité pour chacune des
deux phases.
Les grandeurs de rétention
Temps de rétention Le temps de rétention est une grandeur
caractéristique d’un analyte dans des conditions opératoires données,
c’est le temps écoulé entre l’injection et le maximum du pic du
composé élué, noté tr et exprimé en minutes. On utilise ce paramètre
pour identifier les composés dans un chromatogramme. Il varie en
fonction du débit de la phase mobile et de leur composition, de la
température d'élution et de la nature de colonne utilisée.
Le temps de rétention tr d’un soluté est fonction de son affinité avec
l’éluant d’une part et avec la phase stationnaire d’autre part. A un
instant t, le soluté est à la concentration Cm dans la phase mobile et à
la concentration Cs dans la phase stationnaire, leur rapport est appelé
coefficient de partage noté K.