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République Algérienne Démocratique et Populaire

* + ‫ ا‬,- ‫ * وا‬/ ‫ ا‬0 + 1 ‫وزارة ا‬
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
1‫ ة‬+ ‫ا‬ ‫ﻣ‬/‫ﺟ‬
Université Blida 1

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Biologie et Physiologie Cellulaire

Mémoire
Présenté en vue de l’obtention du Diplôme de Master 2 en :
Ecosystèmes aquatiques

Thème

Evaluation du stress chez des poissons d’eau

douce : Tilapia rouge (Oreochromis sp) exposés à des
résidus de pesticide à base de (l’oxyfluorfène)

Soutenu par:
MmTIDAFI Naima Mm Bekhti Souheyla

Devant le Jury :

Mme Boulahya Imène MAA U.S.D. Blida-1 Présidente

Mme Djellouli Naima MCB U.S.D. Blida-1 Examinatrice

Mme Belmeskine Hayet MCA U.S.D. Blida-1 Promotrice

Mr Meknachi Abdellah Chercheur permanent CNRDPA Co-Promoteur

Le 18 /O7 /2019
 REMERCIEMENTS
Avant tout, nous tenons à remercier notre bon Dieu qui nous a donné la patience, le
courage et la force pour réaliser ce travail.
Au terme de ce mémoire, nous remercions tous ceux qui, par leur aide, leur compétence et leur
disponibilité, ont contribué à son aboutissement. L’expérience acquise, tant sur le plan technique
que sur le plan humain, nous a été très précieuse.

Nous remercions vivement Mr. ANNANERachid, le directeur du CNRDPA qui nous a

accueillies dans son établissement et nous a permis de réaliser ce travail dans les meilleures
[Link] remerciements vont aussi aux membres du jury pour avoir accepté de juger
notre travail : la présidente MmeBOULAHYAImène, maître assistante Aet l’examinatrice Mme
DJELLOULI Naima, maître de Conférences B à l’université Blida1.
profonde gratitude s’adresse tout particulièrement à notre promotrice MmeBELMESKINE
Hayet, maître de conférences A à l’université Blida 1, pour l'aide qu'elle nous a apportée, pour
sa patience, sa confiance, son encouragement, et son œil critique qui nous ont été très précieux
pour structurer le travail.
Notre profonde gratitude s’adresse tout particulièrement à notre Co-
[Link] Abdellah,chercheur permanent au CNRDPA-Bou Ismail
([Link]),pour ses précieux conseils et sa disponibilité,sa confiance dans l’élaboration de ce
mémoire,qu’il trouve
Ici l’expression de notre profonde reconnaissance.

Un grand merci à tous les membres de laboratoires physico-chimie : Nabila, Yasmine,

Lamia pour leur aide, bonne humeur et de leur soutien.

Merci à tous ceux qui nous ont aidé durant ce stage, de prêt ou de loin, et qui nous ont aidé à
arriver à cette fin. Qu’ils trouvent ici l’expression de nos remerciements les plus vifs.

Merci à tous.
 Dédicaces

Je dédie ce travail :

A mes chers parents, que Dieu les garde et les protège.

protège

Je dédie
édie ce travail spécialement à mes chères sœurs, la source du sourire dans ma
vie, qui me donne l'espoir de viv
vivre
re et de réussite dans mes études,
études

À mes frères, nièces et neveux

Ainsi qu’a tous mes collègues et ami(e)s, en particulier Laalia et Sid Ahmed

Sans oublier tous ceux que jee connais, que j’aime et que j’apprécie énormément
énormé
leur aide et leur soutien
soutien,, que je ne pourrai citer.

NAIMA
 Dédicaces

Je dédie ce travail à La lumière de mes yeux mes très chers parents; mon
père Ahmed qui s’est sacrifié pour me voir réussir,

A ma mère Aicha qui a veillé les nuits pour me voir grandir que Dieu me les
garde.

A mon cher frère Mohammed.

A mes chères sœurs Fatima, Sabrina, Meriem, Feriel et Dallel

A mes belles nièces Jana et maria

A mon neveu Iyad

A toute ma famille

A tous
us mes amies spécialement Hamida et Siham

A tous
ous ceux qui me connaissent de loin ou de prés.

SOUHEYLA
 Résumé

La présente étude a pour objectif d’évaluer le stress chez le poisson d’eau douce tilapia rouge
(Oreochromissp) exposées aux résidus de pesticides

Il s'est intéressée à un herbicide maracana dont la substance active est l’oxyfluorfène,ce

dernier est toxique de manière aiguë et chronique pour diverses espèces aquatiqueset vise à
évaluer l'impact de ce pesticide sur des poissons d'eau douce le tilapia rouge (Oreochromissp)
stockés dans des aquariums de 60*40*40 cm.

Notre travail s'est basé sur la dilution de différentes doses de ce pesticide (0,1mg/l ,0,3 mg/l et
0,5 mg/l) dans l'eau de divers lots.
Des dosages enzymatiques (catalase,protéase) sont réalisés, en plusde la mise en évidence de
l’influence de ce pesticide sur la biométrie et le métabolisme bioénergétique.

Les résultats des dosages montrent que l'exposition des poissons aux trois doses de ce polluant
induit une perturbation du système antioxydant qui se traduit par une augmentation de
l’enzyme catalase chez les tilapias exposés à l’oxyfluorfène et la non réversibilité des
mécanismes physiologiques pour le retour à l’homéostasie, et une inhibition de l’activité
protéase qui mène auralentissement de la croissance surtout chez les tilapias exposés à des
concentrations de 0,3 et 0,5 mg/l et de la reproduction avec un impact possible sur le maintien
de la population.

Mots clé : oxyfluorfène,tilapia rouge, catalase, protéase,biométrie,métabolisme bioénergétique

 Abstract

Our experimentalstudyinvestigated a maracana herbicide, the active substance of

whichisoxyfluorfen, whichisacutely and chronicallytoxic to variousaquaticspecies and aims to
assess the impact of this pesticide on freshwaterfishred tilapia (Oreochromissp) stored in
aquariums of 60 * 40 * 40 cm.

Our workwasbased on the dilution of different doses of this pesticide (0.1 mg / l, 0.3 mg / l
and 0.5 mg / l) in the water of variousbatches.

Enzymaticassays (catalase, protease) are performed, in addition of the demonstration of the

influence of this pesticide on biometrics and bioenergeticmetabolism.

The results of the assays show that the exposure of fish to the three doses of
thispollutantinduces a disturbance of the antioxidant system whichresults in an increase of the
catalase enzyme in tilapias exposed to oxyfluorfen and the non-reversibility of the
physiologicalmechanisms for return to homeostasis, and inhibition of proteaseactivitywhich
leads to slowergrowthespecially in tilapia exposed to concentrations of 0.3 and 0.5 mg / l and
reproduction with possible impact on the maintenance of the population.

Key words:Oxyfluorfen, red tilapia, catalase, protease,biometrics, bioenergeticmetabolism

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 TABLE DE MATIERES

Remerciements

Résumés

Liste des figures

Liste des photos

Liste des tableaux

Abréviations

Sommaire

Introduction..................................................................................................page 1

Chapitre I : Revue bibliographique

I.1. Biologie de l’espèce d’étude Tilapia rouge ̏ Oreochromissp ̋ ................................page 3

I.1.1. Systématique et morphologie ……………………………………….……….… Page 3

[Link] et écologie ………………………………………………………….……page 4

I.1.2.1. Reproduction …………………………………………………………………..page 5

I.1.2.2. Croissance …………………………………………………………………….. page 5

I.1.2.3. Régime alimentaire …………………………………………………………... page 5

I.1.2.4. Exigences écologiques…………………………………………………………page 5

I.1.3. Habitat et répartition ………………………………………………………….. page 6

I.1.4. Choix de l’espèce en écotoxicologie …………………………………………... page 7

I.1.5. Outils d’évaluation en écotoxicologie………………………………………….page 7

[Link] stress chez les poissons ……………………………………………………….. page 8

I.2.1. Définition ……………………………………………………………………….. page 8

I.2.2. Système de défense antioxydante………………………………………………. page 8

I.2.3. Particularités de stress chez les poissons………………………………………..page 9

I.2.4. Facteurs inducteurs de stress…………………………………………………...page 10

I.2.5. Biomarqueurs de stress………………………………………………………… page 12

I.3. Les pesticides ……………………………………………………………………….page 13

I.3.1. Définition…………………………….…………………………………………. page 13

I.3.2. Classification des pesticides …………………………………………………….page 14

I.3.3. Voies de contamination des écosystèmes……………………………………… page 15

I.3.4. Contamination des eaux par les pesticides……………………………………..page 15

I.3.5. Le pesticide étudié ……………………………………………………………….page 16

Chapitre II : Matériels et méthodes

II.1. Période et lieu de stage…………………………………………………………. page 19

II.2. Matériels utilisés………………………………………………………………….page 19

II.2.1. Matériel biologique…………………………………………………………....page 20

II.2.2. Matériel non biologique …………………………………………………….....page 20

II.3.Méthodes…………………………………………………………………………..page 21

II.3. 1. Test de toxicité de longue durée ……………………………………………….page 21

II-3-2 Suivi et mesure des paramètres au cours des cycles expérimentaux………..page 22

II-3-2-1- Paramètres physicochimiques (Eau d’élevage)…………………………...page 22

II-3-2-2 Paramètres biométriques ……………………………………………………page 24

II-3-2-3 Paramètres bioénergétiques ………………………………………………...page 25

II-3-2-4 Les mesures biochimiques …………………………………………………page 27

II-3-2-4-2 Homogénéisation des tissus Foie et intestin ……………………………... page 28

II-3-2-4-3 Dosage de la protéase dans l’intestin …………………………………….page 29

II-3-2-4-4 Dosages de la Catalase dans le foie …………………………………….page 30

Chapitre III : résultats et discussions

III. 1. Résultats des analyses physico-chimiques et bactériologiques de l’aliment et de l’eau

d’élevage……………………………………………………………………………….. page 31

III. 1.1. L’aliment ……………………………………………………………………...page 31

III. 1.2. Paramètres physicochimiques de l’eau d’élevage…………………………..page 32

III. 1.2.1. Température………………………………………………………………….page 32

III. 1.2.2. pH……………………………………………………………………………..page 33

III. 1.2.3. Étude de l’effet de l’oxyfluorfène sur l’excrétion azotée et phosphorée…..page 34

III.2. Étude de l’effet de l’oxyfluorfène sur les paramètres bioénergétiques ……......page 36

III.2.1. Gain en poids journalier GPJ…………………………………………………..page 37

III.2.2. Ration maximale Rmx…………………………………………………………. page 37

III.2.3. Ration quotidienne de maintenance Rmt……………………………………….page 38

III.3. Étude de l’effet du polluant sur la biométrie…………………………………….page 41

III.4. Résultats des analyses biochimiques …………………………………………..... page 47

III.4.1. L’activité catalase ……………………………………………………………….page 47

III.4.2. La protéase ……………………………………………………………………… page 49

Conclusion………………………………………………………………….page 51
Références bibliographiques
Annexes
 INTRODUCTION

Au cours du siècle dernier, les activités anthropiques, poussées par les avancées
technologiques, ont conduit à des augmentations des niveaux de contaminants organiques et
inorganiques dans l’environnement. L'accumulation de ces polluants dans l'environnement
aquatique peut causer une dégradation des écosystèmes en induisant une toxicité sur de
nombreux organismes (Livingstone, 1998).Toutefois, l’agriculture est considérée comme une
source importante de pollution des écosystèmes en raison de l’usage généralisé de pesticides
pour protéger les cultures et améliorer leur rendement.

De ce fait, le gestionnaire manque d’informations sur l’urgence des mesures à prendre pour
améliorer l’état de santé de ces écosystèmes, ou protéger la biodiversité et l’intégrité de ces
derniers (Flammarion et al., 2000 ; Lagadicet al., 1997,1998 ; Barillet., 2007 ; Casas, 2005 ;
Nakhlé., 2003)

Les stratégies de surveillance développées actuellement sont diverses; l’utilisation de mollusques

fixés et de poissons relativement sédentaires est la plus couramment développée dans les
programmes de surveillance environnementale. En effet, les moules et les poissons présentent
des caractéristiques qui en font d’eux de bons bio indicateurs (Casas, 2005 ; Amiard et
Amiard, 2008).

Les tilapias constituent le groupe de poissons qui a connu la plus forte croissance ces dix
dernières années toutes espèces aquatiques confondues. Il est produit aujourd’hui dans plus de
100 pays avec un rythme élevé: ou 3,7 millions de production mondiale de Tilapia ont été
enregistrés durant l’année 2010 (FAO, 2012).

D’autresstratégies d’utilisation des biomarqueurs sont largement étudiées et utilisés pour

établir un diagnostic de l’état de dégradation des environnements aquatiques. En milieu naturel,
les polluants sont généralement présents sous forme de mélanges complexes renfermant
plusieurs catégories de contaminants. Si les polluants chimiques sont connus pour induire une
réponse de biomarqueurs, les stress physiques et biologiques peuvent également modifier cette
réponse.

L’objectif de l’étude est l’évaluation du stress chez des poissons d’eau douce tilapia rouge
Oreochromis sp., exposés à un herbicide contenant l’oxyfluorfène comme substance active. Elle

1
 INTRODUCTION

vise l’évaluation des paramètres biométriques et bioénergétiques ainsi que l’impact sur les
biomarqueurs de stress oxydant tel que, la catalase et la protéase.

Pour répondre à cette problématique, nous allons réaliser une étude in vivo au niveau
deCNRDPA sur l’exposition chronique de tilapia rouge à l’oxyfluorfène.

Le présent travail comporte trois chapitres organisés comme suit :

• Le premier chapitre est consacré à la revue bibliographique dans laquelle sont présentée
l’espèce d’étude, le stress et le pesticide visée par notre étude.
• Le deuxième chapitre est réservé à la présentation du matériel et méthodes
• Le troisième synthétise les résultats et la discussion de ces derniers.

2
 Chapitre I : Revue bibliographique

I.1. Biologie de l’espèce d’étude Tilapia rouge ̏ Oreochromis sp ̋

Le tilapia est un terme utilisé pour désigner un groupe de poissons de consommation,
d'importance commerciale appartenant à la famille des cichlidae (Chapman, 2000), en
particulier les espèces des trois genres Tilapia, Sarotherodon et Oreochromis (Malcom et al.,
2000).
Le premier hybride de tilapia rouge appelé tilapia rouge taiwanais, a été obtenu à Taiwan, à la fin
des années 1960, issu d’un croisement entre une femelle orange rougeâtre, T. mossambicaet un
mâle normal, T. nilotica (Galman et Avtalion, 1983).
En raison de leur biologie évolutive complexe, la classification et la dénomination des
cichlides sont confuses et en constante modification.

I.1.1. Systématique et morphologie

Embranchement :chordata

Sous embranchement : vertebrata

Super classe : osteichtyes

Classe : actinopterygii

Sous classe :neopterygii

Super ordre : acanthopterygii

Ordre : Perciformes

Sous ordre labroidei

Famille : Cichlidae

Genre :Oreochromis

Espèce : Oreochromissp [oreochromis niloticus] (Linnaeus, 1758), X oreochromis

mossambicus (Peters, 1852)

- La morphologie : Les espèces de cette famille se reconnaissent par:

 Une forme trapue,

 Tête portant une seule narine de chaque côté,

3
 Chapitre I : Revue bibliographique

 Os operculaire non épineux,

Photo 1 : Tilapia Rouge Oreochromis sp (CNRDPA, 2012) (originale).

 Corps comprimé latéralement, couvert essentiellement d'écailles cycloïdes et parfois

d'écailles cténoïdes
 Longue nageoire dorsale à partie antérieure épineuse ;
 Nageoire anale avec au moins les 3 premiers rayons épineux ;
 Incubation buccale avec garde uniparentale maternelle.
En plus le Tilapia hybride ou rouge a un corps comprimé, avec une teinte soit de couleur grise,
albinos, rose, rouge-orange (Moralee et al., 2000) et des fois ayant des taches grise sur la
poitrine

[Link] et écologie

Le tilapia est un poisson d'eau douce appartenant à la famille des Cichlidés. Les
Cichlidae font partie des plus importantes ressources halieutiques des systèmes aquatiques
continentaux en Afrique tropicale (Fryer et Iles, 1972) et sont de loin les plus abondants dans la
faune ichtyologique continentale, avec près de 143 genres et 900 espèces (Lévêque et Paugy,
2006). Elles représentent une part importante des pêches artisanales continentales avec plus de
50% des captures annuelles (Ayoade et Ikulala, 2007). Ils sont originaires d’Afrique, mais ils

4
 Chapitre I : Revue bibliographique

ont été introduits dans beaucoup de régions tropicales, subtropicales et tempérées du monde
pendant la deuxième moitié du 20ème siècle (Pillay, 1990).

En élevage, seul le genre Oreochromis est représenté par cinq espèces principales :
Oreochromis niloticus, Oreochromis mossambicus, Oreochromis aureus, Oreochromis
hornorum et le tilapia rouge issue du croisement :[Link] X [Link].

I.1.2.1. Reproduction
Les tilapias sont connus par leur maturité sexuelle à une petite taille, environ 8-10 cm.
Oreochromis sp est une espèce qui pratique l’incubation buccale (Legendre et coutin, 1989).
Dans les régions tempérées, la saison de frai du tilapia commence habituellement pendant les
mois de printemps, lorsque la température de l'eau augmente, soit supérieure à 22 ° C.
En milieu naturel, les nids pour le frai sont construits sous la forme de fosses peu profondes au
fond de l’étang. Une fois que la femelle a libéré ses œufs et que la fécondation a eu lieu, la
femelle les récupère et les incube dans sa bouche.
L’incubation, l'éclosion et les soins aux jeunes peuvent durer environ trois semaines.
Après l’absorption du vitellus, les jeunes tilapias se nourrissent activement d’une alimentation
variée, telle que plancton et détritus (Chapman, 2000).
I.1.2.2. Croissance
Le taux de croissance du tilapia est influencé par une variété de facteurs; température de
l'eau, sexe, alimentation, et la densité de stockage (Chapman, 2000).
Dans les populations de tilapia, les mâles grandissent plus vite et ont une taille plus uniforme que
les femelles. En fonction de son régime alimentaire, le tilapia peut atteindre la taille marchande
de 400 g en 8 mois.
I.1.2.3. Régime alimentaire

Le tilapia est un poisson à croissance relativement rapide, son régime alimentaire est
principalement basé sur l’utilisation de produits et de sous-produits végétaux ou d’aliments
composés.
I.1.2.4. Exigences écologiques
Les tilapias sont plus tolérants, que les poissons d'eau douce les plus couramment élevés, à
une salinité élevée, une température élevée de l'eau, une faible teneur en oxygène dissous et des
concentrations élevées en ammoniac (Pullin et lowe, 1982 ; Popma et Masser, 1999).
[Link]érature : Les tilapias sont des poissons thermophiles et leur distribution
géographique est étroitement déterminée par la température. Reflétant leur origine tropicale, la

5
 Chapitre I : Revue bibliographique

température optimale pour l’activité biologique de la plupart des espèces de tilapia est comprise
entre 25 et 28 ° C. En effet, sa reproduction s'interrompt à 22 ° C et ne se nourrit pas au-dessous
de 15 °C (Malcolm et al., 2000). Dans les conditions de laboratoire, oreochromis sp, tolère des
températures jusqu’à 40 °C (Balarin et Hatton, 1979).

[Link]é : Plusieurs espèces de tilapias sont euryhalines, capables de vivre et se

reproduire à des salinités supérieures à 30‰.
Les tilapias hybrides rouges ont une croissance et une grande tolérance pour les eaux salines.
Cette tolérance varie par espèce et par âge (Malcom et al.,2000) de 0,015 et 30 %. La tolérance à
la salinité des alevins de tilapia hybrides commence à augmenter 7 jours après l'éclosion.
[Link]ène dissous : Les observations disponibles dans la nature et dans les étangs,
les cages et les réservoirs suggèrent que les tilapias sont très résistants aux faibles niveaux
d'oxygène dissous (OD) (Balarin et Hatton, 1979).
Le taux d’oxygène nécessaire pour oreochromis sp est de 3 mg/l et l’optimal est de 4 à 5 mg/l
(Malcom et al.,2000).
I.[Link]. Potentiel d’hydrogène : Pour les tilapias,les niveaux mortels inférieurs et
supérieurs du pH sont 4 et 11 (Chervinski , 1982). Pour d’autres, le meilleur niveau pour la
croissance est à pH neutre ou légèrement alcalin (Popma et Masser , 1999 ; lovshin , 1998).
La tolérance à la variation de pH est très grande puisque l’espèce se rencontre dans des eaux
présentant des valeurs de pH allant de 5 à 11 (Malcolm et al, 2000) et le pH optimum varie de 8
à 11 (Gorge, 1996).

[Link]és azotés : Selon Balarin et Hatton (1979), la concentration létale en NH3-

NH4+ chez les tilapias est supérieure à 4 mg/L à pH 7,3 - 7,5.

I.1.3. Habitat et répartition

Le Tilapia est un poisson d'eau douce qui présente une répartition originelle strictement
africaine couvrant les bassins du Nil ; du Niger ; des Volta et du Sénégal. Il a été introduit à des
fins commerciales dans de nombreuses régions d’Asie comme, par exemple, l’Indonésie, la
Malaisie, la Thaïlande et les Philippines. Actuellement, les tilapias sont cultivés dans le monde
entier (production aquaculture). La famille des Cichlidae regroupe des poissons particulièrement
adaptés aux eaux douces et saumâtres. Ils peuvent coloniser divers types d’habitats permanents
ou temporaires, différents types de cours d’eau, de lacs, d’estuaires et de lagunes (Trewavas,
1982).

6
 Chapitre I : Revue bibliographique

I.1.4. Choix de l’espèce en écotoxicologie

Les espèces de tilapia sont utilisées dans de nombreux travaux de recherche en toxicologie
et écotoxicologie aquatique (Wu et al., 2007 ; Aldoghachi1 et al., 2016 ; Hagar, 2019 ;
Nurulnadia et al., 2018). En effet, ils sont reconnus pour leur maturité précoce, résistance aux
maladies et à une large gamme de tolérance au sel et densité (Watanabe et al., 1989 ; Vovener,
2012 ).
La majorité de ces études se sont focalisées sur le genre Oreochromis qui se caractérise par une
relative tolérance aux polluants (Gadagbui et al, 1996; Almeida et al., 2002; Shailaja et
D'Silva, 2003).
Le tilapia hybride rouge (O. mossambicus *O. niloticus) a une popularité auprès des
consommateurs en raison de ses caractéristiques favorables telles que la facilité de gestion de la
culture et sa grande acceptabilité en tant que source de protéines.

I.1.5. Outils d’évaluation en écotoxicologie

L’évaluation du risque environnemental peut se faire au laboratoire, via des bioessais ou

autres expérimentations.
Les bioessais sont réalisés au laboratoire, sous conditions contrôlées avec des modèles
biologiques connus (ex : daphnie, poisson, etc.), pour observer les effets d’un polluant sur les
traits d’histoire de vie d’un organisme (croissance, reproduction, survie) (Van der Oost et al,
2003). Ces outils permettent de connaître les doses nocives d’un polluant pour cet organisme
modèle. Ces tests de toxicité ou bioessais, se distinguent en deux types :
 Les tests de toxicité aiguë qui se réalisent sur une durée très courte. Leurs avantages sont
leur rapidité et leur faible coût. Ces tests impliquent généralement des concentrations
élevées du polluant; de ce fait, les effets à long terme des faibles concentrations ne sont
pas mis en évidence.
 Les tests de toxicité chronique se déroulent sur une durée relativement longue. Ils sont
plus longs et plus coûteux que les tests aigus, mais ils permettent de mettre en évidence
des effets à long terme d'un polluant (Geffard , 2001 ; Geffard, 2001).

7
 Chapitre I : Revue bibliographique

[Link] stress chez les poissons

I.2.1. Définition

Plusieurs définitions ont été données au terme stress. Selon (Seyle, 1950), le stress est la
somme des réactions physiologiques par lesquelles un animal essaye de maintenir ou de restaurer
son métabolisme normal quand il doit faire face à une force extérieure chimique ou physique
(Roberts, 1979).

Il est définit aussi comme étant « Réponse hormonale d’un organisme vivant provoquée
par une perturbation de l’état physiologique normal au repos et de l’homéostasie de cet animal
par des facteurs environnementaux ou extérieurs » (Bartelme, 2004).
Cette réponse hormonale est à l’origine de changements d’ordre biochimiques, physiologiques et
comportementaux destinés à protéger l’organisme d’une agression, au sens large du terme.

De plus, le stress oxydant est défini comme un déséquilibre de la balance oxydante, qui
met en relation d’un côté les activités pro-oxydantes, et de l’autre les activités antioxydantes.
Sans stress, cette balance est à l’équilibre, avec des activités pro-oxydantes naturelles, comme la
respiration mitochondriale, parfaitement contrôlées par les activités antioxydantes (Favier,
2003).Cependant, de nombreux mécanismes et polluants peuvent faire pencher cette balance et
donc créer un stress oxydant via une surproduction de ROS et une altération des fonctions
antioxydantes.
Parmi les phénomènes précurseurs de ROS, la respiration mitochondriale est le plus
important. Le terme d’espèces réactives de l’oxygène (communément appelées ROS en anglais)
inclut les différentes formes actives de l’oxygène (comme le radical hydroxyle (OH•) ou l’anion
superoxyde (O2•-)) et le peroxyde d’hydrogène (H2O2), ainsi que les espèces radicalaires qui
peuvent en être les initiateurs (Barillet, 2007).

I.2.2. Système de défense antioxydante

De point de vue biologique, les antioxydants sont toutes substances qui, présentes à faible
concentration par rapport à celle du substrat oxydable, retardent ou inhibent significativement
l’oxydation de ce substrat et dont les produits de la réaction entre l’oxydant et l’antioxydant ne
doivent pas être toxiques (Zdenka, 2008). Pour se protéger des effets délétères des ROS,
l’organisme dispose d’un ensemble complexe de défenses antioxydantes (Haleng et al.; 2007) ,
enzymatiques et non enzymatiques exogènes (Tableau 1).

8
 Chapitre I : Revue bibliographique

Tableau 1 : Systèmes antioxydants de l’organismes (Delattre et al., 2005)

Systèmes antioxydants enzymatiques Système antioxydants d’origine alimentaire

endogènes
1. Superoxyde dismutase 7. Vitamine C
2. Catalase 8. Vitamine E
3. Glutathion peroxydase 9. Caroténoïdes
4. Glutathion réductase 10. Flavonoïdes
5. Lipase, protéase, endonucléases 11. polyphénols
(éliminent les molécules oxydées)
6. Albumine, ferritine (complexent les ions
divalents)

Il nous semble important de rappeler ici que notre étude expérimentale vise deux
composantes du système de défense enzymatique, soient :

 La catalase (CAT):
La catalase est une enzyme héminique capable de transformer le peroxyde d'hydrogène en
eau et en oxygène moléculaire. Elle est essentiellement présente dans les peroxysomes, les
érythrocytes, les hépatocytes et les reins (Hudson et al, 2005).

2 H2O2→ 2 H2O + O2

 La protéase : Les protéases sont des enzymes qui catalysent l'hydrolyse des protéines, en
scindant la liaison peptidique qui lie deux acides aminés dans une chaîne [Link]
protéases sont divisées en deux groupes selon leur site d'action, soit les protéases
intracellulaires ou extracellulaires (KALISZ, 1988).

I.2.3. Particularités de stress chez les poissons

Selon (Pasnik et al, 2010 ; Weber, 2011), Le stress est un processus complexe,
dynamique et graduel. Par souci de clarté, plusieurs types de stress, aux conséquences différentes
sur l’organisme, ont été distingués : stress aigu ou chronique d’une part et stress intense ou
modéré d’autre part. Si un facteur de stress est présent ou s’intensifie, la réponse du poisson

Passera par différentes phases :

9
 Chapitre I : Revue bibliographique

- une réponse initiale comportementale rapide (quelques secondes à quelques minutes) qui
vise pour le poisson, lorsque c’est possible, à se soustraire au facteur de stress par un
comportement de fuite ou d’agression.

- une réponse primaire hormonale qui se traduit par la libération dans le flux sanguin de
cortisol, d’épinéphrine et de norépinéphrine. Ces hormones stimulent le métabolisme général
(augmentation du rythme cardio-respiratoire, mobilisation et redistribution des apports
energétiques aux différents organes).

- une réponse secondaire dont les conséquences portent sur la composition sanguine
(hyperglycémie, acidose lactique), le métabolisme des glucides et des lipides ainsi que sur
l’osmorégulation. Elle se met en place en quelques minutes à quelques heures en cas de stress de
longue durée ou même chronique.

- une réponse tertiaire lors de stress chronique. Elle apparaît quelques heures après le début
du stress. Elle se manifeste par des effets sur la nage, le comportement général (coloration, repli
des nageoires, prostration, anorexie...), le métabolisme dans son ensemble, l’immunité, la
croissance et la reproduction. C’est la forme de stress la plus facilement identifiable.

I.2.4. Facteurs inducteurs de stress

Nous retrouvons dans la littérature plusieurs dénominations pour qualifier ce terme : agents
stressants, stresseurs ou stressors selon le terme anglo-saxon (Bensabat, 1980 ; Boudarene et al,
1997). Les facteurs de stress tels qu’on les définisse dans la terminologie francophone,
représentent l’ensemble des situations qui peuvent constituer des agressions ou qui sont vécues
comme telles. Ils sont multiples et de différentes origines :

I.2.3.1. Origine abiotique : On peut séparer les stress abiotiques ; d’ordre physique ou chimique
et les stress biologiques ou ressentis. Les stress physique sont liés à des modifications rapides ou
au –delà des limites de tolérance de l’organisme des conditions abiotiques du milieu telles que la
température, la pression osmotique ou encore l’oxygénation de l’eau.

Les stress chimiques sont généralement dus à une détérioration de la qualité de l’eau en raison
d’une acidification du milieu ou de la contamination par des polluants. Les pressions exercées
par les congénères, la prédation, le parasitisme ou encore les manipulations expérimentales
(confinement, manipulation) sont considérées comme des stress biologiques.

10
 Chapitre I : Revue bibliographique

I.2.3.2. Origine anthropique :

Les principaux facteurs de stress liés à l’activité de vente et susceptibles de dégrader la santé
des poissons sont cités ci-dessous (Crosby et al., 2007 ; Brydges et al., 2009 ; Floyd, 2009 ;
Pasnik et al., 2010 ; Pizzinat, 2012).
a-Transport
- Confinement et densité lors du transport depuis le grossiste dégradent la qualité de l’eau,
- Un trajet de longue durée accentue la pollution de l’eau
- Présence éventuelle d’additifs dans l’eau de transport (antiparasitaires, antibiotiques, sédatifs...)
qui perturbent les mécanismes d’osmorégulation et abîment les branchies.
b-Acclimatation
- Technique utilisée : présence de manipulations (des poissons à l’épuisette, au sac), pas d’équilibre
progressif des qualités d’eau,
- Durée de l’acclimatation trop courte
c-Qualité de l’eau
- Cause la plus fréquente de mortalité et de maladies chez les poissons d’ornement,
- Paramètres physico-chimiques inadaptés ou trop différents,
- Pollution importante, forte biomasse, changements d’eau et nettoyage des masses filtrantes trop
espacés, excès d’alimentation,
- Présence d’agents pathogènes favorisée par une hygiène insuffisante (nettoyage du fond des
aquariums, ramassage des morts).

d-Pêche des poissons

- Utilisation d’une épuisette : l’extraction du milieu aquatique est considérée comme le stress le plus
intense qui soit pour un poisson. De plus l’épuisette lèse la peau (pertes de mucus, perte d’écailles)
et peut occasionner des blessures (peau, yeux, nageoires). Pêcher un poisson sans le sortir de l’eau,
avec un récipient ou un sac en plastique transparent percé est moins stressant mais semble
difficilement réalisable en pratique.
e-Gestion des populations de poissons
- Densité et nombre de poissons inadaptés : concurrence alimentaire, augmentation de l’agressivité
de certaines espèces si densité trop faible comme chez les cichlides, besoin d’interactions sociales
pour les espèces grégaires.
- Confinement trop important par rapport aux besoins des poissons.

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 Chapitre I : Revue bibliographique

f-Traitements

- Les traitements thérapeutiques peuvent se révéler stressants pour le poisson et doivent être
raisonnés.
g-Alimentation
- la qualité de l’alimentation (peu souvent à l’origine de troubles dans les faits).

I.2.5. Biomarqueurs de stress

Les substances chimiques dispersées dans l’environnement représentent un risque pour les
organismes vivants et la santé humaine.
Afin de préciser les risques potentiels d’une substance chimique il est important d’évaluer sa
toxicité sur diverses espèces représentatives des écosystèmes aquatiques (effets sur la survie, la
reproduction, la croissance etc.),pour cela des outils de diagnostic ont été développés.
Dans le domaine de l’environnement, un biomarqueur se définit comme : « un changement
observable et /ou mesurable au niveau moléculaire, biochimique, cellulaire, physiologiques ou
comportemental, qui révèle l'exposition présente ou passée d’un individu à au moins une
substance chimique à caractère polluant » (Lagadic et al, 1997).
D’après (Gestel et Brummelen, 1996), le biomarqueur est défini comme toute réponse
biologique à un contaminant chimique environnemental à un niveau infra-individuel,mesuré dans
un organisme ou dans ses « produits » (urine,féces,poils,plume, …), indiquant un changement
par rapport à l’état normal qui ne peut être détecté chez l’organisme sain (Fig.1)(Gaujous,
1995).

I.2.4.1. Les différents types de biomarqueurs: ils sont subdivisés en trois classes
- Biomarqueurs d'exposition: couvrant la détection et la mesure d'une substance exogène ou de
son métabolite ou du produit d'une interaction entre un agent xénobiotique et une molécule ou
cellule cible mesurée dans un compartiment de l'organisme,
- Biomarqueurs d'effet, y compris les altérations biochimiques, physiologiques ou autres,
mesurables dans les tissus ou les fluides corporels d'un organisme, qui peuvent être reconnues
comme étant associées à une altération de la santé ou à une maladie établie ou éventuelle,
- Biomarqueurs de susceptibilité indiquent la capacité inhérente ou acquise d'un organisme à
répondre au défi de l'exposition à une substance xénobiotique spécifique, y compris des facteurs
génétiques et des modifications des récepteurs qui modifient la sensibilité d'un organisme à cette
exposition.

12
 Chapitre I : Revue bibliographique

Les biomarqueurs peuvent être qualifiés selon deux critères (Bonnomet et al, 2004) :
- Soit d’indices de stress généraux traduisant une réponse de l’organisme à un ensemble
de polluants sans permettre de déterminer la nature même de ces polluants.
- Soit d’indices de stress spécifiques indiquant une réponse de l’organisme à une famille
de polluants.

Figure 1 : Place des biomarqueurs dans l'évaluation de la contamination de l'environnement

(Lagadic et al ,1997)

 Intérêts des marqueurs du stress oxydant

Au cours de la dernière décennie, l'utilisation de biomarqueurs pour étudier les effets de produits
chimiques spécifiques a augmenté, ces marqueurs permettent d’évaluer les causes (production de
ROS), les conséquences (dommages oxydatifs) et les réponses de l’organisme (système
antioxydant) au stress oxydant. En effet, cette vision multiparamétrique permet plus facilement
la relation entre les biomarqueurs et la pollution (Ruas et al ,2008).

I.3. Les pesticides

I.3.1. Définition
Un pesticide est défini comme «toute substance ou association de substances qui est
destinée à repousser, détruire ou combattre les ravageurs (y compris les vecteurs de maladies
humaines ou animales) et les espèces indésirables de plantes ou d'animaux causant des
dommages ou se montrant autrement nuisibles durant la production, la transformation, le
stockage, le transport ou la commercialisation des denrées alimentaires, des produits agricoles,

13
 Chapitre I : Revue bibliographique

du bois et des produits ligneux, ou des aliments pour animaux, ou qui peut être administrée aux
animaux pour combattre les insectes, les arachnides et les autres endo- ou ectoparasites…»
(FAO, 2003).

I.3.2. Classification des pesticides

I.3.2.1. Classification chimique : il existe trois catégories de pesticides (Calvet et al, 2005)

Les pesticides inorganiques : ils sont peu nombreux mais certains sont utilisés en grande
quantités comme le soufre ou le cuivre. Ce sont des pesticides très anciens dont l’emploi est
apparu avant la chimie organique de synthèse. De cette époque ne subsiste qu’un seul herbicide
employé en tant que désherbant total (chlorate de sodium) et quelques fongicides a base de
soufre et cuivre.

Les pesticides organo-méttaliques :Ce sont des fongicides dont la molécule est constitué par un
complexe fait d’un métal comme le zinc ou le manganèse et d’un anion organique
dithioarbamate (exemple : mancozèbe avec le zinc, manèbe avec le manganèse).

Les pesticides organiques : ils sont très nombreux et appartiennent à diverses familles chimiques
(une famille chimique ou classe chimique correspond à l’ensemble des molécules dérivées d’un
groupe d’atomes qui constituent une structure de base). Il existe actuellement plus de 80 familles
ou classes chimiques dont les plus connues sont les Organophosphorés, Uraciles, Carbamates,
Diphényl éther…, mais leurs appellations sont parfois arbitraires et peuvent donc être différentes
d’un ouvrage à un autre.

I.3.2.2. Classification biologique

Selon les organismes visés, trois grandes classes se distinguent : les insecticides, destinés à
éliminer les insectes nuisibles, les herbicides, destinés à éliminer les adventices des cultures, les
fongicides, destinés à lutter contre les parasites et champignons pathogènes. D’autres classes
mineures correspondent à des substances actives destinées à combattre des cibles spécifiques :
acaricides (acariens), nématicides (nématodes), corvicides (oiseaux ravageurs), rodonticides
(rongeurs) et molluscicides (limaces et escargots).

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 Chapitre I : Revue bibliographique

Classification selon l’usage

Les pesticides sont utilisés dans plusieurs domaines d’activités pour lutter contre des organismes
vivants nuisibles. Il existe six catégories de pesticides selon leur destination de traitement, à
savoir : les cultures, les bâtiments d’élevage, les locaux de stockage des produits végétaux,
les zones non agricoles, les bâtiments d’habitation, l’homme et les animaux.

I.3.3. Voies de contamination des écosystèmes

Les sources de contamination peuvent être ponctuelles ou diffuses (Lundberg et al, 1955).
Une contamination ponctuelle par des pesticides utilisés pour des besoins agricoles est due à un
emploi incorrect du produit. Une élimination insuffisante des solutions non utilisés et le
nettoyage du matériel de pulvérisation comporte un risque de contamination.
Il peut aussi se produire une dérive de brouillard de dispersion pendant l’application, ou
encore le produit peut être pulvérisé en des lieux inappropriés, tels des fossés ouverts. La
manipulation du produit inutilisés et des emballages est également importante.
Une contamination diffuse des eaux de surfaces peut être consécutive à une application
normale des pesticides. Outre, les autres facteurs telle la nature du sol et les conditions
climatiques, dans ce cas, la contamination est due aux propriétés intrinsèques du pesticide qui lui
confèrent une certaine mobilité. Les propriétés les plus importantes dans ce contexte sont la
dégradabilité, la volatilité et la mobilité dans le sol
Voies d’exposition aux pesticides : cutanée (et oculaire), la voie digestive (ou orale) et la voie
respiratoire.

I.3.4. Contamination des eaux par les pesticides

Le milieu aquatique est le récepteur ultime de nombreux contaminants toxiques d’origine
anthropique. L’agriculture est actuellement à l'origine d'une pollution de l’eau préoccupante dans
beaucoup de pays dont les pays méditerranéens (keddal, 2007). Les pesticides et leurs résidus
sont parmi les composés qui affectent le plus les écosystèmes et les organismes aquatiques
(Shahidul et Tanaka, 2004) , et qui peuvent entraîner la présence de produits de transformation
dans les écosystèmes aquatiques présentant un risque potentiel ou réel similaire ou plus élevé
que le pesticide d'origine.

15
 Chapitre I : Revue bibliographique

I.3.5. Le pesticide étudié

I.3.5.1. Description

MARCANA : est un herbicide à base de l’oxyfluorfène de contact agissant sur la plupart de

dicotylédones et graminées annuelles, sélectif sur oignon.

L’oxyfluorfène est une substance phytosanitaire de la famille des éthers de diphényle, à usage
herbicide agissant sur les dicotylédones et quelques graminées annuelles au cours de leur
émergence ainsi que sur les jeunes plantules déjà levées.

Il a également une action frénatrice sur certaines plantes vivaces. Cette substance est sélective
par contact et est un inhibiteur de la protoporphyrinogène oxydase (ppo) menant à des
dommages irréversibles des membranes cellulaires.

Il a été évalué dans le cadre de la Directive 91/414/CEE (C.E., 1991). Le rapport d’évaluation
(DraftAssessment Report) proposé par l’Etat membre rapporteur (Espagne) est publiquement
disponible auprès de l’EFSA (EFSA, 2007; EFSA, 2010a) et les conclusions de l’EFSA ont été
diffusées (EFSA, 2010b).

L'évaluation est terminée et l’exclusion de l’oxyfluorfène à l’Annexe I de la Directive 91/414/CEE a été

prononcée dans la Décision de la Commission 2008/934/CE (C.E., 2008a).

Un rapport des Etats-Unis (US-EPA, 2002) est également disponible pour l’oxyfluorfène.

I.3.5.2. Devenir de l’oxyfluorfène dans l’environnement

a-La persistance

Hydrolyse : L’oxyfluorfène est stable à l’hydrolyse aux pH 4 à 9 (demi-vie supérieure à 28 jours)(EFSA,

2010).

Photolyse : L’oxyfluorfène est rapidement photolysable dans l’eau. Une demi-vie de 0,3 jour et un DT90
de 1 jour ont été observées à une latitude de 40°N et un pH de 7. Principaux produits de la photolyse :
RH45469, RH-123394, RH-35451 et RH-34670. L’écotoxicité de ces produits a été testée chez les
microalgues et algues d’eau douce (EFSA, 2010).

Biodégradabilité :L’oxyfluorfène n’est pas facilement biodégradable, d’après l’agence de

protection environnementale des Etats Unis l'oxyfluorfène avait des demi-vies de 291 à 294 jours
pour les sols limon argileux et 556-596 jours pour les sols sablo-limoneux, et l'Australie a

16
 Chapitre I : Revue bibliographique

signalé une demi-vie dans le sol de 119 jours pour un sol sableux dans un climat de type
méditerranéen(EFSA, 2010).

b-La distribution

Adsorption : Le Koc de l’oxyfluorfène varie entre 5450 et 12233 L/kg et la valeur de log Kow =
4,86 suggère que l’oxyfluorfène a une très faible mobilité. Il aura tendance à fortement
s’adsorber sur les sédiments et matières en suspension (EFSA, 2010b; Janaki, 2013).

Volatilisation : La valeur de la constante de Henry (2,382.10-2 Pa m3/mol) indique que

l’oxyfluorfène n’est pas une substance volatile (EFSA, 2010a).

Bioaccumulation : Une étude sur 54 jours a été réalisée sur (Lepomismacrochirus) avec une
exposition de 40 jours et une période de dépuration de 14 jours. Un BCF de 2200 (corps entier) a
été déterminé. La vitesse de dépuration des organismes est lente, elle est de 82% après 14 jours.
(EFSA, 2010a E.C., 2011)

I.3.5.3. L’éco toxicologie et la toxicité de l’oxyfluorfène

L’oxyfluorfène est un composé toxique, qui contamine l'environnement et affecte les organismes
non ciblés. Il est très toxique pour les plantes aquatiques et les poissons, il contamine l'eau de
surface par ruissellement, il provoque une toxicité chez les plantes par l’inhibition de la
photosynthèse.

Parmi les effets toxicologiques de l’oxyfluorfène, plusieurs études montrent que cette substance
est nocive pour la faune et la flore aquatique.

 Les effets d'une exposition à l’oxyfluorféne chez les algues d’eau douce (Navicula
pelliculosa), la concentration produisant 50% d'effets (EC50) dans exposition de 120h
statique est : 0,24 µg/L (Giddings JM 1990, cité par EFSA, 2007; EFSA, 2010a).
 Chez la plante Lemnagibba EC50 dans (14 jours) d’exposition est de 1,4 µg/L.
 Chez les invertébrés d’eau douce (Daphnia magna) la concentration produisant 50%
d'effets EC50 = 72 µg/L dans 48h d’exposition (Bell G 1996, cité par EFSA, 2007;
EFSA, 2010a).
 Concernant les poissons Les CL 50 pour trois espèces de poissons d'eau douce varient de
200 μg / L à 410 μg / L, en classifiant oxyfluorfène comme «hautement toxique» sur une
base aiguë.

17
 Chapitre I : Revue bibliographique

 Par exemple la concentration létale qui cause la mort de 50% de la population chez
(Oncorhynchusmykiss) dans des expositions de 96 h (statique) est de 250 µg/L et chez
(Lepomismacrochirus) La CL50 est de 210 µg/L (Graves WC, 1991)
 Selon ( Goldenthal et Wazeter,1977) , la NOAEL (No Observed Adverse EffectLevel)
chez la souris est de 0,3 mg/kgcorporel/j chez les mâles et 0,4 mg/kgcorporel/j chez les
femelles.
 D’aprèsFrey (2003), la CL50 de Canard colvert (Anas platyrhynchos) est ≥ 5000
mg/kg/jour.

I.3.5.4. Les effets de l’oxyfluorfène sur la santé humaine

 Cancérogenèse : La substance n’est pas inscrite à l’Annexe VI du règlement (CE) No

1272/2008. Par conséquent, elle ne fait pas l’objet d’un classement pour la cancérogenèse.
 Lors de l’étude expérimentale de (Goldenthal et Wazeter, 1977), sur la souris, il a été
constaté une augmentation de l’incidence globale d’apparition d’adénomes et de carcinomes
hépatiques.
 L’US EPA classe l’oxyfluorfène comme une substance possiblement carcinogène pour
l’homme.
 Effets endocriniens : L’oxyfluorfène n’est pas cité dans la stratégie communautaire
concernant les perturbateurs endocriniens (E.C., 2004 ; E.C., 2007) et dans le rapport
d’étude de la DG ENV sur la mise à jour de la liste prioritaire des perturbateurs endocriniens
à faible tonnage (Petersen et al., 2007).
 Mutagenèse : La substance n’est pas inscrite à l’Annexe VI du règlement (CE) No
1272/2008. Par conséquent, elle ne fait pas l’objet d’un classement pour la mutagenèse.
 Toxicité pour la reproduction : La substance n’est pas inscrite à l’Annexe VI du règlement (CE)
No 1272/2008. Par conséquent, elle ne fait pas l’objet d’un classement pour la reproduction.

18
 Chapitre II : Matériels et méthodes

II.1. Période et lieu de stage

Notre étude a été réalisé au Centre National de Recherche et de Développement de la Pêche et de

l’Aquaculture (CNRDPA) de Bou Ismail – Tipaza durant une période de 4 mois, au sein de la
division écosystèmes aquatiques.

Le CNRDPA est, depuis 2008, un établissement public à caractère scientifique et technologique

(EPST) à vocation sectorielle dont l’activité est centrée sur l’analyse des écosystèmes aquatiques
– marins et continentaux – exploités placé sous la tutelle du Ministère de l’Agriculture, du
Développement Rural et de la Pêche – MADRP.

Le CNRDPA est organisé en quatre divisions de recherche :

1-Divisionaquaculture : chargée de la mise en œuvre et l’exploitation des projets de
recherche/développement relatifs à la valorisation des ressources hydriques et maitrise des
techniques d’élevage en pisciculture continentale et marine.
2-Divisionpêche : a pour mission l’évaluation des ressources halieutiques a travers les
campagnes en mer, et elle œuvre aussi dans le développement des techniques des pêches.
3-Divisionindustrie et transformation des produits de la pêche et de l’aquaculture : a pour
objectif principal la valorisation et transformation des ressources aquatiques issues des activités
de la pêche et de l’aquaculture
4-Divisionécosystèmeaquatiqueoù on a effectué note étudeexpérimentale, et qui a pour mission
le suivi et la surveillance des écosystèmes, ainsi elle étudie l’impact de la pollution sur la
ressource aquatique.

II.2. Matériels utilisés

II.2.1. Matériel biologique
- Poisson Tilapia (Oreochromissp) : Hybride rouge résultant de croisement entre
l’Oreochromisniloticuset l’Oreochromismossambicus.

19
 Chapitre II : Matériels et méthodes

Acquisition et maintenance du poisson :

Trois cent individus du tilapia hybride rouge (Oreochromissp.) ont été obtenus de la
pépinièreGarden de Chéraga.
Lesindividus sont transportés vivants par la route, en utilisant un réservoir spécialisé (vivier). Le
transport provoque normalement du stress chez les animaux, qui peut durer plusieurs jours
(Davis et Parker, 1986 ; Chandrooet al., 2005 ; Jonssonnet al., 1999),pour cela les individus
ont été élevés durant 15 jours pour une période d’adaptation dans des aquariums ( 60 cm x 40 cm
x40 cm),contenant un volume d’eau de 70 litres ( 25 individus par aquarium).
L’eau des aquariums est renouvelée quotidiennement, la température a été maintenue entre 24 et
26 ° C. La nourriture était offerte trois fois par jour et consistait en une ration de granulés
flottants correspondant à 4 % du poids corporel.

Photo2 : unité d’élevage expérimentale

1 : diffuseur d’oxygène 2 : thermorégulateur

II.2.2. Matériel non biologique

La liste du matériel non biologique utilisé pour la réalisation de notre étude est présentée en
annexe-2.

20
 Chapitre II : Matériels et méthodes

II.3. Méthodes
II.3. 1. Test
st de toxicité de longue durée
Après l’etape d’acclimatation dans des conditions expérimentales semblables, les
individus sont exposés à l’oxyfluorfène à des concentrations de 0,1 ,0,3 et 0,5 mg /l
pendant 21 jours et comparés
omparés aux témoins ( 0 mg/l d’oxyfluorfène).chaque
d’oxyfluorfène
concentration est faite en triplicat
triplicat(photo3.).

photo
photo3 :opération de contamination

Courant électrique

Aérateurs Thermostats

Aquarium A1 Aquarium A2 Aquarium A3 Aquarium A4

Fig
Figure2 : dispositif expérimental

21
 Chapitre II : Matériels et méthodes

II-3-2 Suivi et mesure des paramètres au cours des cycles expérimentaux

Notre étude a porté sur deux matrices :

L’eau d’élevage pour l’étude physico-chimique (La température, la salinité,

l’oxygène dissout et le pH sont mesurés au moyen d’un Multiparametre) , et Suivi
de l’excrétion azotée et phosphorée .

Les poissons pour la mesure biochimique (catalase, protéase, ….) : à t=0 ,7,14,21
jours, trois individus de chaque aquarium ont été prélevés , anésthésiés, et ont été
utilisés pour récuperer les differents organes :gonades,intestin et foie sont
conservés dans des tubes secs a une température de – 80 °C .

II-3-2-1- Paramètres physicochimiques (Eau d’élevage)

Le suivi des paramètres physiques d’eau d’élevage a été réalisé quotidiennement. Dans le
but de s’assurer sa qualité convenable à la survie des poissons d’une part et d’autre part
pour minimiser au maximum toute sorte de stress. Nous avons utilisés le pHmètre pour
mesure le pH et un thermomètre pour la température.

Les analyses chimiques de l’eau (concernant les nitrites, l’azote ammoniacal et le

phosphore) sont réalisées au laboratoire de recherches au CNRDPA chaque jour.

II-3-2-1-1 Suivi de l’excrétion azotée et phosphorée

Chaque jours environ 500 ml sont prélevées de chaque aquarium pour être par la suite
filtrées à l’aide des papiers filtres et des entonnoirs. Le filtrat récupéré est destiné au
dosage du phosphore et des différentes formes d’azote dissous.

II-3-2-1-1-1 Dosage du phosphore

Selon la méthode adoptée ou(CNRDPA)

Principe

Les ions phosphates réagissent avec le molybdate d'ammonium, en présence

d'antimoine(III), pour former un complexe que l'on réduit par l'acide ascorbique ; cette

22
 Chapitre II : Matériels et méthodes

forme réduite, de coloration bleue, a un maximum d'absorption à 885 nm. Ce composé

bleu contient le phosphore. Les poly phosphates et le phosphore organique ne sont pas
dosés par cette méthode.

Mode opératoire

10ml du mélange-réactif phosphore (voir annexe 2), préparé à chaque série d’analyses,
sont ajoutés à 100ml de filtrat et on homogénéise aussitôt. Après 05minutes de repos la
lecture de l’absorbance des échantillons est faite à 885nm.

Dans le blanc l’eau distillée remplace les 100ml du filtrat.

II-3-2-1-1-2 Dosage de l’azote ammoniacal par la méthode au bleu d’indophénole

Principe

La méthode décrite mesure la totalité de l’azote ammoniacal, soit N-NH3 + N-NH4+,

symbolisé par N-NH3,4. Il s’agit de la méthode de Koroleff (1969) qui est simple et qui
offre une bonne précision ainsi qu’une bonne sensibilité.

2C6H5O- + NH3 + 3ClO- → O=C6H4–N=N–C6H5O- + 2H2O + HO- + 3Cl-+2NH3+.

Dans un premier temps, l'ammoniac forme une monochloramine avec l'hypochlorite en

milieu légèrement basique. Cette dernière réagit avec le phénol en présence d'un excès
d'hypochlorite pour former le bleu d'indophénolabsorbant à 630 nm.

Mode opératoire

Trois ml du réactif (1), solution de phénol-nitroprussiate(voir annexe (2)), sont

additionnés à 100ml du filtrat récupéré. Directement après homogénéisation, 03ml du
réactif (2) solution alcaline d'hypochlorite (voir annexe 2)sont ajoutés au mélange.

L’échantillon final homogénéisé est placé à l’obscurité pendant une nuit à température
ambiante. Ainsi l’absorbance est mesuré à 630nm.

Dans le blanc l’eau distillée remplace les 100ml du filtrat.

II-3-2-1-1-3Dosage de l’azote nitreux

23
 Chapitre II : Matériels et méthodes

Principe

Les ions nitrites forment un diazoïque avec la sulfanilamide en milieu acide (pH < 2)
selon la réaction :

NH2SO2C6H4–NH2 + NO2- + 2H+ → (NH2SO2C6H4–N≡N)+ + 2H2O

Puis le diazoïque réagit avec le N-naphtyl-éthylènediamine pour former le colorant :

(NH2SO2C6H4–N≡N)+ + C10H7–NH–(CH2)2–NH2 →

NH2SO2C6H4–N≡N–C10H6–NH– (CH2)2–NH2 + H+

Le colorant rose absorbe à la longueur d'onde de 543 nm.

Mode opératoire

01ml de réactif (3), solution de sulfanilamide (voir annexe 2), est ajouté à 50ml de filtrat.
Après homogénéisation, on laisse reposer 02 à 08 minutes et on ajoute 01ml de réactif (4)
solution de n-naphtyl-éthylènediamine(voir annexe 2) au mélange. Après au moins 10
minutes (sans dépasser les 02h) de repos la lecture de l’absorbance des échantillons est
faite à 543nm.

Dans le blanc l’eau distillée remplace les 50ml du filtrat.

La préparation des réactifs illustrée dans (l’annexe2).

II-3-2-2 Paramètres biométriques :

Chaque 7 jours pendant 42 jours, trois (03) individus de chaque aquarium sont prélevés et
anesthésiés par le Phénoxy-ethanol. Par la suite la taille et le poids sont mesurés avant de
procéder à la dissection et la séparation des différents organes, à savoir le foie et les
gonades, dans le but de calculer les rapports somatiques. Puis l’ensemble des individus
de chaque aquarium est pesé et mesuré.

24
 Chapitre II : Matériels et méthodes

Photo 4 : mensuration et pesée des individus

On choisit ces deux rapports car :

La récupération des organes est facile.

Ils sont des perturbateurs endocrinien car le factures la plus touché c’est la reproduction.

Rapport hépato somatique RHS :

Le RHS est le rapport entre le poids du foie et le poids du poisson éviscéré, en

pourcentage.

Il est donné par l’expression suivante (Lagadicet al, 1997 ; Lagadicet al,
1998 ;Dongmezaet al, 2006; Kojadinovic et al, 2006;Shaw et handy, 2006)

 Poids du foie 
%RHS =   × 100
 Poids du poisson 

Rapport gonado somatique RGS :

C'est le rapport entre le poids des testicules et le poids du poisson éviscéré, exprimé en
pourcentage. Il est considéré comme étant un bon coefficient de maturité des poissons
(Lahaye, 1980).

Il est exprimé comme suit (Pieters, 2004; Kojadinovic et al, 2006; Rad et al, 2006)

 Poids des gonades 

%RGS =   × 100
 Poids du poisson 

II-3-2-3 Paramètres bioénergétiques :

25
 Chapitre II : Matériels et méthodes

Gain en poids journalier GPJ

Le gain en poids journalier (gramme poisson/jours), peut être calculé par la relation
suivante (Glasser et Oswald, 2001) :

− 0 , 579
GPJ max = 17 . 10 −9 × T 4 , 785× P 3,397 ×T

Dans cette expression, la température (T) est exprimée en degré Celsius et le poids (P) en
gramme.

Ration maximale Rmx

La ration maximale (gramme d’aliment/jours) qui peut être absorbée par le poisson tilapia
est donnée par la relation énergétique suivante (Glasser et Oswald, 2001) :

Rmx = 0,192 × P 0 , 685

Ration quotidienne de maintenance Rmt

Elle est donnée par la relation suivante(Glasser et Oswald, 2001) :

Rmt = 0,035 × P 0 ,564

Contenu calorique C

Il est donné par l’expression suivante (Xieet al, 1997):

Ln C max = 1,45 + 0,42 Ln P

Le Cmax est exprimé en (KJ/J) et le poids P en (g).

Énergie liée a la respiration R

Chez le tilapia Oreochromissp, le métabolisme de l’oxygène peut être estimé par la

relation suivante :

26
 Chapitre II : Matériels et méthodes

M (O2 ) = 0,48 × P 0,7502

D’après Lemoset al(Lemoset al, 2006), 1mg (O2) correspond à une valeur énergétique de
14,06 J.

Énergie liée à l’excrétion U

Les valeurs mesurées en mg/l de l’excrétion azotée sont converties en valeurs

énergétiques en Joule. Selon Lemoset al(Lemoset al, 2006), 1mg/l N-NH3 correspond à
une valeur énergétique de 24,87J.

II-3-2-4 Les mesures biochimiques :

II-3-2-4-1 Préparation des échantillons tissulaires en vue des analyses des

biomarqueurs :

Les dosages biochimiques relatifs aux suivis de biomarqueurs nécessitent que les tissus
biologiques (foie et intestin) fassent l’objet préalable d’une homogénéisation et d’un
fractionnement subcellulaire (figure3) dans un tampon adapté, qui devra avoir les
propriétés physicochimiques permettant de maintenir la stabilité des molécules ou
organites qu’on désire étudier.

27
 Chapitre II : Matériels et méthodes

Poissons

Dissection et séparation des organes

Foie et branchies

Homogénéisation dans le tampon tris

Centrifugation

Couche lipidique

Fraction S 9

Le culot

Dosage :

protéase,catalase

Figure 3: Procédures expérimentales (dosages biochimiques).

II-3-2-4-2 Homogénéisation des tissus Foie et intestin :

28
 Chapitre II : Matériels et méthodes

Les branchies et le foie sont homogénéisés à raison de (1/10 P/V) dans le tampon tris
(tris(hydroxylméthyl)aminométhane) (20mM ; pH7,2) en utilisant un mixeur
déchiqueteur.

La centrifugation de l’homogénat est faite à 6 000g pendant 30 min à 4°C. Le surnageant

ainsi obtenu (Fraction S9) est utilisé pour doser la catalase, protéase.

II-3-2-4-3 Dosage de la protéase dans l’intestin :

Principe

L’approche du dosage de la protéase souvent utilisée est celle à temps fixe. Elle consiste
essentiellement à mélanger les composants de la réaction et à incuber durant un certain
temps. A la fin de l’incubation (généralement de 30min à 02h), on prélève des
échantillons. On y mesurera alors la quantité des sous-produits issus de la dégradation du
substrat (dans le cas de protéases la tyrosine est le sous-produit issus de la dégradation de
la caséine).

Mode opératoire

Le dosage de l’activité protéase est déterminé selon la méthode décrite par (Ranilsonet
al, 2005).

01 ml de la solution de caséine (01% P/V dans le Tris-HCl pH7.2) utilisée comme

substrat est incubée avec 01 ml de surnageant (source d’enzyme S9), préalablement dilué
à différentes rations(1/10 et 1/15), mixer et incuber dans un bain marie à une température
de 40°C pendant 10 minutes.

La réaction est stoppée en ajoutant 04 ml du TCA à 5% (Acide trichloroacétique). On

laisse reposer pendant 15 min et on effectuera une centrifugation à 6000g pendant 15min.

La coloration :

Prendre 1 ml de surnagent centrifugé, ajouter 2,5 ml de NaCo3 et 0,5 folin (1/4), mixer et
incuber à 40 °C pendant 15 minutes, et on fait une deuxième centrifugation à 6000 g
pendant 5 minutes. Ainsi la lecture de l’absorbance est faite à 660nm.

29
 Chapitre II : Matériels et méthodes

Le blanc contient 1 ml de l’eau distillée remplace le surnageant (la fraction S9).

II-3-2-4-4 Dosages de la Catalase dans le foie :

Principe :

L’acide acétique en présence de peroxyde d'hydrogène entraîne la réduction du

dichromate en acétate chromique et la formation d'acide perchromique.

H2O2 se sépare lors de la préparation de la catalase et la réaction est arrêtée avec

l'addition d'un mélange d'acide bichromate acétique.

Le peroxyde d'hydrogène restant est évalué en mesurant l'acétate chromique par

colorimétrie après avoir chauffé le mélange réactionnel.

Mode opératoire :

Dans des tubes à essais ,100µl de surnageant (source d’enzyme S9) ont été prélevés en
triple, ajouter 1 ml de tampon phosphate.

500 µl d'H2O2 ont été ajoutés aux tubes ci-dessus pour démarrer la réaction.

La réaction a été arrêtée immédiatement par addition de réactif dichromate acide

acétique (2 ml) à 0,30 et à 60 secondes d'intervalle dans chacun des 3 tubes.

Le blanc contient 1,6 ml de tampon phosphate et 2 ml de dichromate acide acétique.

Les tubes et le blanc ont été chauffés pendant 10 minutes dans un bain marie à 100 °C
pour développer une couleur verte, puis refroidis à température ambiante.

La lecture de l’absorbance a été faite à 570 nm.

30
 Chapitre III : Résultats et Discussion

Cette étude avait pour objectif d’examiner l’effet de l’herbicide oxyfluorfène sur la
croissance et les activités métaboliques traduisant l’état de santé du poisson « Tilapia rouge »
démontrés par les résultats expérimentaux.

III. 1- Résultats des analyses physico-chimiques et bactériologiques de

l’aliment et de l’eau d’élevage

Dans le but de minimiser au maximum les facteurs stressants tels que le pH, la
température..., l’assurance des conditions environnementales optimales pour l’élevage des
poissons tests était l’étape primaire avant de commencer les tests d’écotoxicité. En effet, et dans
le même contexte un contrôle de qualité physico-chimique et bactériologique de l’aliment et de
l’eau d’élevage était une étape cruciale.

III. 1.1. L’aliment

Les valeurs moyennes de %H, %MM, %MO et pH de l’aliment sont respectivement : 9,33 ; 24 ;
66,67 et 6,61 (voir annexe 3). Ces dernières valeurs montrent un taux moyen des matières
organiques assez suffisantes pour assurer les besoins énergétiques des poissons. La matière
organique étant la somme des matières grasses, des protéines et des glucides principalement.

Le tilapia est un poisson sauvage reconnu par sa résistance aux pathogènes(Zakaria et Hussein,
2006; Joyce et al, 2000; Saber et al, 2004) Mais cela ne traduit pas l’absence de stress dont la
résistance est le résultat direct de l’effet opposé à un effet gênant. Se défendre contre un
pathogène pourra probablement conduire à un changement des habitudes de s’alimenter de
respirer ou de nager, l’environnement devient stressant.

Le contrôle bactériologique (voir annexe 3), effectué sur l’aliment (Absence de : Coliformes
totaux et fécaux, Streptocoques et Salmonelles), nous a permet de confirmer la bonne qualité
hygiénique de ce dernier. L’absence de la flore fécale est un très bon indice de la qualité
microbiologique d’un produit donné.

Vu la qualité physico-chimique et bactériologique de l’aliment, on en conclu que ce dernier ne

présente pas un risque pour l’état de santé des individus.

31
 Chapitre III : Résultats et Discussion

Par ailleurs, les aquariums employés, sont à surfaces libres en contact direct avec l’air ambiant,
ce qui peut conduire à une contamination de l’eau des aquariums, par sédimentation des fines
particules de poussière en suspension dans l’atmosphère environnante (Les microorganismes
peuvent s’adsorber facilement à la surface des particules solides. Les conditions dynamiques de
l’air étant l’agent vecteur ou transporteur).

De plus le milieu aquarium évolue rapidement, et les débris d’aliment non consommés ou rejetés
s’accumulent sur le fond et forment un tapis en décomposition très propice au développement
des bactéries. De fait, le renouvellement journalier de l’eau des aquariumsavait pour objectif,
non seulement de minimiser les pertes en polluant et l’effet toxique des composés azotés, mais
également de régénérer la bonne qualité microbiologique du milieu environnant les Tilapia.

III. 1.2. Paramètres physicochimiques de l’eau d’élevage

L’eau destinée à l’élevage des poissons au CNRDPA (Division Aquaculture), est contrôlée
systématiquement. Subséquemment, elle présente une bonne qualité bactériologique dont les
résultats révèlent l’absence totale d’une contamination fécale pouvant infecter les poisons en
élevage et/ou induire un stress pathogénique. Les résultats expérimentaux relevés
quotidiennement sont illustrés par les figures (fig4 et 5) ci-dessous.

III. 1.2.1. Température

26
25
24
T°C

23
22
21
20
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

jour
T C1 C2 C3

Figure 4 : Evolution de la température durant tout le cycle expérimental.

32
 Chapitre III : Résultats et Discussion

D’après la figure(4), on constate que la variation des températures est presque identique pour
tous les groupes de test et durant tout le cycle expé[Link] oscille sur une plage de 23,5°C
minimum à 25,16°C maximum.

D’après le modèle de Martina Bocci(Martina Bocci., 1999), la croissance des tilapias entre 20 et
25°C est une fonction exponentielle. En dehors de ce gradient préférentiel la croissance est
ralentie. A une température de 25°C l’ingestion d’aliment est meilleure.

Les mécanismes de la bioaccumulation et de détoxification des polluants chez le tilapia sont

directement influencés par la température et le pH ( Umut et al,2007; Gülüzar et al,2006;
Gülüzar et al,2007; Ranilson et al,2005; Sarah et al,2006)

Pour ces raisons, la température de 25 °C est choisie pour optimiser la croissance du poisson en
créant un environnement adéquat afin que ce dernier puisse exercer ces activités métaboliques
d’une façon optimale.

A telle température les mécanismes de défense cellulaire sont à l’état extrême et l’agressivité des
individus entre eux est minime. Donc, dans notre étude la température n’est pas un facteur
stressant.

III. 1.2.2. pH

9
8,5
8
pH

7,5
7
6,5
6
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
T C1 C2 C3 jours

Figure 5 :Évolution du pH durant le cycle expérimental.

33
 Chapitre III : Résultats et Discussion

L’évolution journalière des valeurs du pH mesurés (figure 5) reste toujours dans l’intervalle de
tolérance des spécimens entre 7 ,83 et 8,6durant tout le cycle expérimental. D’après Billard et
Marcel, 1980, l’optimum de pH se situe entre 6 et 9. Ainsi le pH de l’eau d’élevage ne présentant
aucun effet stressant pouvant perturber l’état de santé des individus.

III. 1.2.3. Étude de l’effet de l’oxyfluorfène sur l’excrétion azotéeet phosphorée

Les variations des teneurs en nitrites, azote ammoniacal et phosphore en fonction des
concentrations testées de l’oxyfluorfène sont graphiquement indiquées dans les figures 6A, 6B
et6C ci-dessous.

0,07
concentrration mg/g

0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

T C1 C2 C3 jours

Figure 6A : Variation des taux des nitrites durant le cycle expérimental.

Les effets de l’exposition à l’Oxyfluorfène sur l’excrétion azotée des tilapias sont variables selon
les concentrations testées et varient entre déplétion, augmentation ou sans effets remarquables.
Ainsi, les faibles teneurs relevées (0.0043 mg/gde poissonminimum à 0,0561 mg/ gde poisson

maximum) en fonction de la charge rendre la discussion du résultat très difficile.

34
 Chapitre III : Résultats et Discussion

0,25

concentration mg/g
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

jours
T C1 C2 C3

Figure 6B :Évolution des taux de l’azote ammoniacale durant le cycleexpérimental.

L'excrétion ammoniacale varie en fonction de la quantité et de la qualité des protéines ingérées,

du nombre de repas, de la taille de l'individu, de la température et de la concentration
ammoniacale ambiante. D'autres paramètres comme l'état physiologique, le stress etc. entrent en
ligne de compte mais aucune donnée bibliographique n'y a trait (Meknachi, 2009;Garidou,
1994; Pagand,1999).

Dans le cas des individus témoins l’ingestion d’aliment est souvent intégrale contrairement aux
individus contaminés où l’aliment restant flotte en surface puis se sédimente au fond des
aquariums sous forme de fines particules.

Après chaque renouvellement de l’eau des aquariums on constate une très forte excrétion des
composés azotés dans le groupe des témoins, par la suite une diminution d’excrétion est
observée. Entre 0.6 et 02mg/l les composés azotés deviennent toxiques au tilapia pour des
courtes durées d’exposition (Saber,2004) ce qui probablement traduit le ralentissement
d’excrétion. La concentration ammoniacale ambiante devient un facteur gênant.

Dans le cas des individus soumis à la contamination l’excrétion est faible mais permanente ce
qui permet d’atteindre des valeurs proches de celles enregistrées chez les spécimens témoins.
Aussi, il est à noter que l’aliment en décomposition (libérations des bases aminées) au fond des
aquariums contribuera certainement à une augmentation des teneurs ammoniacales dans le
milieu d’élevage.

35
 Chapitre III : Résultats et Discussion

Lecycle de décontamination avait un effet curatif sur les poissons antérieurement contaminés.
Les teneurs ammoniacales relevées aux derniers jours étaient presque identiques pour
l’ensembledes groupes de tests. Du point de vue réversibilité des effets, il est probable que les
spécimens décontaminés ont repris progressivement leur état de santé.

0,025
concentration mg /g

0,02

0,015

0,01

0,005

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

jours
T C1 C2 C3

Figure 6C :Variation de l’excrétion phosphorée durant le cycle expérimental.

La contamination du poisson tilapia par l’oxyfluorfène ne semble pas avoir un effet clair sur
l’excrétion phosphorée des individus contaminés.

L’excrétion du phosphore dissous s’effectue sous forme d’orthophosphates par des processus
actifs liés essentiellement à l’activité rénale (Pagand,1999), le phosphore étant indispensable
aux réactions énergétiques, l’organisme économise cet élément et peut même le stocker dans les
tissus osseux.

Malgré un manque de recherche et de connaissance sur l’excrétion phosphorée des poissons, il

est fort probable que les facteurs stimulants cette excrétion soient les même que ceux influençant
l’excrétion azotée (Meknachi, 2009;Pagand, 1999).

III.2. Étude de l’effet de l’oxyfluorfène sur les paramètres bioénergétiques

Les différents résultats sont regroupés dansla (figure 7) et les tableaux (2,3 ,4 et 5)

36
 Chapitre III : Résultats et Discussion

III.2.1. Gain en poids journalier GPJ

Les valeurs obtenues sont graphiquement indiquées dans la figure 7.

12

10

8
GPj g/j

-2
1 2 3 5 6 7 8 9 10 13 14 15 16 17 20 21 22 23 24 26 27 28 29 31 33 34 35 36 37 38 40 41 42

jours
T C1 C2 C3

Figure 7 : Valeurs moyennesdu gain en poids journalier GPJ.

Parmi les outils de diagnostic, à la fois sensibles et précoces, ayant une pertinence écologique
pour estimer l’ampleur des altérations des écosystèmes aquatiques en lien avec la présence de
contaminants, apparaissent les réponses suborganismales révélatrices de l’état de santé des
organismes, en particulier celles liées aux métabolismes énergétiques et à la bioénergétique
(Lagadic et al., 1997; Amiardet al., 2008; Rocheet al., 2003). De fait, plusieurs paramètres en
lien avec le métabolisme énergétique sont recherchés.

Ainsi, dans notre étude le calcul des gains en poids journaliers (GPJ) chez les différents groupes
de tests, montre une tendance identique pendant le cycle d’adaptation. Cependant et durant le
cycle de contamination une nette différence est observée entre les spécimens témoins et ceux
exposés au polluant à différentes concentrations. Ces derniers ont montré de faibles gains en
poids et cela jusqu’à la fin du cycle de contamination.

III.2.2. Ration maximale Rmx

Les faibles gains en poids mesurés chez les poissons contaminés semblent être le résultat de
l’efficacité de l’ingestion traduite par le Rmx (Tab 02) dont les valeurs mesurées pendant le

37
 Chapitre III : Résultats et Discussion

cycle de contamination sont nettement inférieures à celles mesurées chez le groupe témoin.
Sachant que dans les milieux contaminés la diminution de l’ingestion limite la capacité d’une
espèce à maximiser sa prise énergétique, la conduisant à une conversion réduite de l’énergie
(Amiardet al., 2008). Selon (Hansen et al., 2004) l’inhibition de la croissance est
principalement due à la réductionde la conversion de l’énergie alimentaire en biomasse.

Tableau 02 : Valeurs moyennes de Rmx

Temps (j) 0 7 14 21 28 35 42

T 1,3311 1,5433 1,6437 1,7034 1,7642 1,8085 1,9517

C1 1,3430 1,5301 1,562 1,6136 1,6652 1,7164 1,8486

C2 1,2848 1,3766 1,3702 1,3381 1,3590 1,3718 1,5149

C3 1,3138 1,3989 1,4147 1,4005 1,3644 1,3750 1,4569

III.2.3. Ration quotidienne de maintenance Rmt

Tableau 03 : Valeurs moyennes de laRation quotidienne de maintenance Rmt

Temps (j) 0 7 14 21 28 35 42

T 0,1723 0,1946 0,2050 0,2111 0,2173 0,2218 0,2362

C1 0,1736 0,1933 0,1967 0,2019 0,2072 0,2124 0,2258

C2 0,1674 0,1772 0,1765 0,1731 0,1753 0,1766 0,1917

C3 0,1705 0,1795 0,1812 0,1797 0,1759 0,1770 0,1856

Idéalement le métabolisme énergétique est lié à l’énergie allouée aux fonctions de défense de
l’organisme et à celles allouées à la maintenance du métabolisme de base, de la croissance et de

38
 Chapitre III : Résultats et Discussion

la reproduction(Lagadic et al, 1997;Lagadic et al, 1998; Stellio, 2005; Amiard et l, 2008;

Virginie, 2005).

L’analyse énergétique peut révéler un déséquilibre de cette balance associée à l’exposition à des
toxiques (Amiard et al, 2008). Eneffet et, dans notre étude on a constaté par exemple une
diminution de l’énergie allouée à la maintenance du métabolisme de base, traduite par le Rmt
(Tab 03) chez les spécimens contaminés comparativement aux individus témoins. Cette
diminution de la maintenance peut être expliquée par le fait que la tolérance et la capacité des
organismes à faire face aux stress auxquels ils sont exposés dans leur environnement nécessite
une dépense supplémentaire de l’énergie allouée à la défense et cela par un système de
compensation vis-à-vis des autres besoins énergétiques le plus souvent ceux alloués à la
croissance puis ceux alloués à la reproduction(Lagadic et al, 1997; Amiard et al, 2008). Dans
notre expérience l’augmentation de la défense est confirmée par l’induction de l’enzyme de
défense antioxydante la Catalase (voir ci-après). Selon Amiardet al [08], les biomarqueurs de
défense permettent aux organismes de lutter et de survivre à la présence de polluants à des
niveaux raisonnables mais ceci a un coût énergétique pour l’individu. Ainsi, de nombreuses
études (Almeidaa et al, 2002; Ana Rosa et al., 2008; Gülüzar et Mustafa, 2007;Rocheet al.
2003; Almeida et al, 2001) confirment encore l’augmentation des taux métaboliques dans des
organismes exposés à des stress chimiques variés générant les différents biomarqueurs de
défenses.

Tableau 04 : Les valeurs de l’Énergie liée à la respiration R

Temps (j) 0 7 14 21 28 35 42

C1/T 1,0097 0,9906 0,9463 0,9424 0,9387 0,9443 0,9422

C2/T 0,9620 0,8823 0,8193 0,7677 0,7514 0,7388 0,7576

C3/T 0,9857 0,8980 0,8484 0,8069 0,7547 0,7407 0,7259

39
 Chapitre III : Résultats et Discussion

Tableau 05 : les valeurs de l’énergie liée à l’excrétion U

Temps (j) 0 7 14 21 28 35 42

C1/T 0,9829 1,2632 1,2219 1,4794 1,3284 0,8799 1,0289

C2/T 0,9170 1,3625 1,2334 0,7497 1,1318 0,5733 0,8510

C3/T 1,1357 1,2802 0,8956 1,0287 1,2690 0,7004 0,9520

Tableau 06 : les différentes valeurs de contenu calorique C

Temps (j) 0 7 14 21 28 35 42

C1/T 1,0111 0,9890 0,9367 0,9318 0,9271 0,9336 0,9304

C2/T 0,9568 0,8644 0,7920 0,7338 0,7146 0,6998 0,7176

C3/T 0,9837 0,8821 0,8246 0,7771 0,7181 0,7019 0,6826

En général, une tendance identique des valeurs mesurées chez tous les groupes de test est
observée pendant la période d’adaptation. Étant donné que les différents groupes de test sont
soumis aux mêmes conditions expérimentales, les différentes mesures à savoir le GPJ, Rmx, Rmt
et les rapports énergétiquesrelevées le long du cycle de contamination seraient donc le résultat
direct de l’effet du polluant (Oxyfluorfène) sur les spécimens contaminés. Par ailleurs, et durant
le cycle de décontamination, les paramètres énergétiques mesurés chez les individus témoins
restassent toujours supérieurs à ceux enregistrés chez les spécimens détoxiqués. De fait, le
rétablissementde l’équilibre de la balance énergétique semble être lent et la durée de

40
 Chapitre III : Résultats et Discussion

détoxification resta probablement insuffisante pour que les poissons puissent reprendre leur état
d’équilibre énergétique.

Selon (Amiardet al.,2008), plusieurs travaux relatent l’utilisation des biomarqueurs

bioénergétiques dans le cadre d’expérimentations en laboratoire ou d’études en milieux naturels
en démontrant la pertinence de les utiliser comme un signal précoce de l’altération de l’état de
santé des organismes et de la qualité des écosystèmes aquatiques (marins et continentaux).
Cependant, l’utilisation des biomarqueurs en relation avec le métabolisme énergétique en tant
que marqueur de contamination est relativement limitée et ce pour de multiples raisons. Quel que
soit le biomarqueur considéré, il apparaît clairement qu’indépendamment de tout effet de
contamination, des facteurs intrinsèques comme l’âge ou l’état reproducteur mais également des
facteurs environnementaux tels que la température influencent les réponses de ces biomarqueurs
(Lagadic et al., 1997; Amiard et al., 2008; Hélène et al., 2003). Une connaissance approfondie
des modèles biologiques employés est donc prérequise.

III.3. Étude de l’effet du polluant sur la biométrie

Des mesures biométriques peuvent être utilisées pour déterminer les indices de conditions chez
divers organismes tels que les poissons (Amiard et al, 2008; Pieterse,2004; Genevieve, 2003;
Kosmala, 1998). Ainsi, les indices biométriques offrent un grand intérêt pour évaluer les effets
chroniques despollutions. Les plus usuels sont les relations taille-poids (condition) et les indices
somatique RHS et RGS (Dongmezaet al., 2006; Kojadinovicet al., 2006; Benjamin et Handy
,2006; Ferit et al., 2006; Houck et Cech, 2004;Rocheet al., 2003).

La figure (8) représente les courbes hallométriques (relation tailles-poids) des tilapias étudiés
avant le cycle de contamination.

41
 Chapitre III : Résultats et Discussion

35
30
A B
30
y = 0,017x2,928 25 y = 0,014x3,038
25 R² = 0,915 R² = 0,947
20
poids (g)
20

poids (g)
15
15
10
10

5
5

0 0
0 5longueur (cm)
10 15 0 5 10 15
longueur (cm)

C 35
D 30
30 y = 0,012x3,091 25 y = 0,012x3,099
R² = 0,937 R² = 0,931
25
20
20
poids (g)

15

poids (g)
15

10
10

5 5

0 0
0 5 10 15 0 5 10 15
longueur (cm) longueur (cm)

Figure 8: Relation taille (L) - Poids (P) des tilapias en adaptation.

A : Témoin, B : 1er groupe, C : 2eme groupe, D : 3emegroupe

En général la variation du poids moyen (Pm) des poissons en fonction de la longueur moyenne
(Lm) peut être décrite par la relation Pm=a*Lmb(Jones et al., 1999; Irene et al., 2004). Le cas où
b=3 signifie que la variation taille-poids est isométrique traduisant le bon état de santé des
spécimens, ce qui est le cas dans notre étude chez les poissons maintenus en adaptation.

42
 Chapitre III : Résultats et Discussion

35 30
y = 0,028x2,780
30 R² = 0,995 25

poids moyen (g)

25
poids moyen (g)

20
20
15
15
10
10 y = 0,051x2,526
5 R² = 0,969
5

0 0
0 5 10 15 10 10,5 11 11,5 12 12,5
longueur moyenne (cm) longueur moyenne (cm)

(A) (B)

25 19,5

19
20
poids moyen (g)

poids moyen (g)

18,5
15
18
10
17,5
y = 0,136x2,079 y = 0,226x1,873
5 R² = 0,917 17 R² = 0,694

0 16,5

9,5 10 10,5 11 11,5 9,8 10 10,2 10,4 10,6 10,8

longueur moyenne (cm) longueur moyenne (cm)

Figure 9: Relation taille (L) - Poids (P) des tilapias pour les quatre groupes de test.

(A): groupe témoins ; (B) : groupes contaminés par C1 ;

(C) : groupes contaminés par C2 ; (D) : groupes contaminés par C3.

D’après la figure (9), il est constaté que les individus tilapia témoins gardèrent une croissance
toujours isométrique. L’effet de l’oxyfluorfène étant très clair en considérant la variation des
valeurs de l’indice b qui diminue proportionnellement avec le gradient concentration.

Le cas où b est inférieur à 3 implique que la variation enpoids est très faible contre la longueur
des individus conduisant à un retard de croissance avec amaigrissement des organismes.

43
 Chapitre III : Résultats et Discussion

La figure (10) confirme encore le résultat ainsi discuté. Une nette différence de croissance entre
les tilapias témoins et les tilapias exposées à l’oxyfluorfène est relevée. La faible concentration
en oxyfluorfène (C1) semble avoir un effet modéré par rapport aux concentrations C2 et C3. Ces
différences de croissance dans un groupe de poissons ayant presque un même poids initial
peuvent s’expliquer par le comportement face à l’aliment et/ou la génétique (Sumpter et
Jobling, 1995) et au stress dû à l’exposition au polluant. Selon, (Agbohessi et al., 2014), la
différence de croissance chez le poisson chat est fortement affectée par l'exposition aux
pesticides, quels que soient le type de pesticide et la dose testée.

35
14

taille moyenne (cm)

30
12
poids moyen (g)

25 10

20 8

15 6

10 4

5 2

0 0

0j 7j 14 j 21 j 28 j 35 j 42 j 0j 7j 14 j 21 j 28 j 35 j 42 j

durée de l'expérience (jours)

durée de l'expérience (jours)
temoin C1 C2 C3 temoin C1 C2 C3

Figure 10:Évolution des poids moyens (Pm) et taille moyenne (Lm) des tilapias rouges durant la
période d’étude.

En effet une diminution de la condition peut être due au déséquilibre de la balance

énergétiqueassociée à l’exposition au xénobiotique ‘oxyfluorfène’,sachant que, chez tous les
organismes vivants, l’ensemble des processus biochimiques et physiologiques est étroitement
dépendant de la quantité d’énergie disponible au niveau cellulaire.

Selon Amiardet al, une hausse des dépenses énergétiques pour lemétabolisme de base pour
faire face aux stress endurés peut conduire à une réduction de l’investissement énergétique
envers lacroissance et/ou la reproduction. Par ailleurs, sous l’effet d’un stress, y compris
d’origine chimique, la réaction de l’organisme se traduit par un accroissement de la dépense

44
 Chapitre III : Résultats et Discussion

énergétique liée à la mise en place de mécanismes de compensation physiologique (Lagadicet

al., 1997). Les contaminants chimiquespeuvent aussi intervenir lors de digestion de l’aliment en altérant
l’activité des enzymes digestives (dans notre cas la protéase) ce qui limitela capacité d’uneespèce
à maximiser sa prise énergétique (Almeidaa et al., 2002; Gülüzar et Canli, 2007; Qing et
al., 2003; Anulak etYongsawatdigul, 2005). Benjamin et Al(Benjamin et Handy, 2006), ont
constaté aussi des retardes de croissance chez des tilapias exposés au cuivre via la nourriture. De
même, Ann Houcket al(Houck et Cech, 2004), ont mesuré des taux de croissance très faibles
chez des espècesOrthodonmicrolepidotus exposées au méthylmercure (MeHg) comparativement
aux spécimens maintenus comme témoins. De par ailleurs, Marchand et al.,2004 dans
leursétudes ont révélé une diminution générale des facteursde conditions chez des poissons plats
Platichthysflesusprélevés dans desestuaires impactésen comparaison à ceux d’un estuaire de
référence.

La figure (11) montre l’effet de l’oxyfluorfène sur les rapports somatiques RHS et RGS.

3,5

3
RGS %

2,5

1,5

0,5

0
0 7 14 21 28 35 42
durée de l'expérience (jours)
temoin C1 C2 C3

(A)

45
 Chapitre III : Résultats et Discussion

5
4,5
4

RHS %
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0 7 14 21 28 35 42
durée de l'expérience (jours)
temoin C1 C2 C3

(B)

Figure 11 :Etude de l’effet de l’oxyfluorfène sur les rapports somatiques

(A) : Rapport gonadosomatique, (B) Rapport hépathosomatique

Aucune corrélation n’est relevée entre le RGS et les concentrations testées en Oxyfluorfène.
Aussi, les variations en fonction du temps sont très variables soit en présence ou absence du
polluant.

Par ailleurs, la dose en polluant et la durée d’exposition n’avaient pas un effet significatif sur le
RHS.

Pieterse(Houck et Cech, 2004)dans son étude observa une diminution du RGS de

Oreochromismossambicus, exposé au cuivre par rapport aux individus témoins(Kojadinovicet
al., 2006), dans ses études, ont relevé des corrélations à la foi positives et négatives entre les
rapports somatiques (RHS et RGS) et le niveau des métaux traces (Cd, Cu, Fe, Hg, Mn, Pb, Se,
Zn) accumulés chez différentes espèces de poissons (Espadon, Truite, Bonite…). De même, ils
n’ont relevé aucune dépendance entre le RGS mesuré chez la truite et le niveau d’accumulation
des différents éléments traces.

46
 Chapitre III : Résultats et Discussion

Les paramètres biométriques mesurés chez les poissons se sont révélés simples à utiliser dans
notre étude. Cependant ce type d’indices n’est pas considéré comme un biomarqueur au
sens strict de la définition. Ils ont été mesurés en première intention car ils sont simples à
réaliser, de faible coût et peuvent fournir des informations sur l’impact potentiel des
polluants(Fernandes et al.,2006; Kosmala,1998; Roche et al., 2003).

III.4. Résultats des analyses biochimiques

III.4.1. L’activité catalase

Les résultats relatifs au dosage de la catalase (CAT) aux niveaux du foie des poissons tilapias
sont représentés dans les figures (12)

En général, une augmentation de l’activité CAT est observée chez les individus exposés à
l’oxyfluorfène. Comparativement aux individus témoins, ces derniers n’ont montré aucun
changement significatif de leur activité CAT et cela le long du cycle expérimental.

140
activité catalase (µmols H2O2/min/ml)

120

100

80

60

40

20

0
0 7 14 21 28 35 42
temps (jours)

Fig 12:Étude de l’effet de l’oxyfluorfène sur l’activité de la catalase dans le foie des tilapias

Une augmentation proportionnelle de l’activité catalase (CAT) est observée au 7ème jour
d’exposition à l’oxyfluorfène. Ainsi, l’activité CAT (130,0268322 µMOLS H2O2/min/ml)
maximale est mesurée sous l’effet de la forte concentration C3.

47
 Chapitre III : Résultats et Discussion

Du 7ème au 21ème jour d’exposition à l’oxyfluorfène, la concentration C3 semble avoir un effet

inhibiteur sur l’enzyme antioxydante CAT.

L’induction CAT sous l’effet de la concentration C2 est proportionnelle avec la durée

d’exposition. Le maximum d’activité CAT est atteint à la fin du cycle de contamination 21j. Par
ailleurs, l’effet modéré de la concentration C1 sur l’induction de l’enzyme antistress oxydatif,
observé au 7ème jour d’exposition(CAT=98,37 µmols H2O2/min/ml), s’est amplifié au 14ème
(CAT=130,69 µmol H2O2/min/ml) et 21ème jour (CAT=110 ,49 µmols H2O2/min/ml). La
relation dose-durée/effet étant positive.

Par ailleurs, les activités CAT mesurées chez les poissons détoxifié des concentrations C1, C2, et
C3, restèrent identiques à celles relevées à la fin du cycle de contamination. Au 35ème jour de
l’expérience (14j de décontamination) l’activité CAT des groupes C2 et C3 se rapprocha à celle
des témoins, nonobstant, les valeurs relevées à la fin du cycle de décontamination démontrent la
non réversibilité des mécanismes physiologiques pour le retour à l’homéostasie. Le résultat étant
le signe d’une contamination précédente.

Dans les systèmes biologiques, les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont produites en
permanence par divers mécanismes impliquant des composés endogènes ou exogènes comme
des xénobioiques (Amiard et claude, 2008; Fernandes et al., 2006; Roche et al.,2003; Peixoto
et al.,2006). De plus les polluants chimiques sont d’importants producteurs de ROS(Gülüzar
et al.,2006; Fernandes et al., 2006; Gülüzar et Canli,2007). En effet les xénobiotiques connus
pour leurs propriétés redox, comme les métaux de transition, induisent la formation de peroxyde
d’hydrogène, des radicaux superoxydes…générant le stress oxydant(Gülüzar et al., 2006;
Gülüzaret Canli, 2007; Sanchezet al.,2005) . La catalase CAT (enzyme antioxydante) est une
hémoprotéine présente au niveau des peroxysomes qui participent à la défense contre les
dérivés de l’oxygène.

Vu les caractéristiques, la sensibilité de l’enzyme et la facilité du dosage de cette dernière,

plusieurs auteurs qualifient la catalase comme un biomarqueure sensible dans l’approches de
biomonitoring des écosystèmes aquatiques (Gülüzar et al., 2006; Gülüzaret, 2007; Peixoto et
al., 2006; Sanchez el al.,2005; Yuanyuan et al.,2006).

48
 Chapitre III : Résultats et Discussion

III.4.2. La protéase
Les résultats obtenus sont représentés dans la figure (12)

Le dosage de l’activité protéase dans l’intestin des poissons (fig 12), mit en évidence une
diminution d’activité de l’enzyme digestive chez les individus exposés au xénobiotique
(Oxyfluorfène) aux différentes concentrationsatteignant des activités inférieures à celles
mesurées chez les témoins et ce le long du cycle de contamination. La relation dose/effet n’étant
pas [Link], la déplétion de l’activité digestive continue jusqu’au 7ème jour de la
détoxification des poissons (28j) et la durée d’exposition semble avoir un effet considérable.

Du 35ème jour à la fin du cycle de décontamination, les individus tilapia antérieurement contaminés
montrent une reprise d’activité digestive. Néanmoins, la durée de détoxification ne semble pas suffisante
pour que la protéase retourne à la normale activité.

700
activité protéase (µg/l)

600

500

400

300

200

100

0
0 7 14 21 28 35 42
durée de l'expérience (jours)
temoin C1 C2 C3

Figure 13 : Variation de l’activité protéase durant la période expérimentale

Ranilson et al(Ranilson et al.,2005), dans leur étude sur les tilapias nilotica ont observé une
inhibition de l’activité protéase sous l’effet des ions Cd2+, Al3+, Hg2+, Zn2+ et Co2+, cependant
leurs expériences ont étés menées in vitro.

49
 Chapitre III : Résultats et Discussion

Par ailleurs, une synthèse des résultats expérimentaux regroupés par Amiard et al(Amiard et
Claude,2008), donne des exemples d’inhibition de différentes enzymes digestives de différents
organismes aquatiques exposés aux polluants métalliques et organiques y compris la
contamination mixte.

50
INTRODUCTION
 Chapitre I :
Revue bibliographique
 Chapitre II :
Matériels et méthodes
 Chapitre III :
Résultats et discussions
CONCLUSION
Annexes
Références bibliographiques
 CONCLUSION

Ce présent travail a été réalisé dans le but d’étudier l’impact d’utilisation de pesticides sur
la dégradation des milieux aquatiques et d’exploiter les outils biologiques (bioindicateurs,
biomarqueurs) dans le cadre du suivi de la santé l’environnement et des écosystèmes aquatique.

Le poisson tilapia d’eau douce « OreochromisSp » a été choisi dont l’objectif d’étudier l’impact
de la substance active «oxyfluorfène » sur son état physico-chimique, paramètres biométriques,
bioénergétiques et surtout la contribution à la recherche des biomarqueurs comme réponse
susceptible d’apporter une information intégrée sur l’état de santé de l’environnement.

D’après nos résultats, il ressort que :

Vu la qualité physico-chimique(%H, %MM, %MO et pHde l’aliment sont

respectivement ,9,33 ; 24 ; 66,67 et 6,61) et bactériologique de l’aliment, on en conclu
que ce dernier ne présente pas un risque pour l’état de santé des individus.
Que l’effet de l’oxyfluorfène été remarquable sur les excrétions azotées en particulier
l’azote ammoniacal Chez tous les groupes contaminés.

D’après les paramètres biométriques on remarque une diminution de la croissance chez

les groupes contaminés par apport ou témoin. C’est le résultat direct d’un déséquilibre de
la balance énergétique et de la diminution de la prise alimentaire, liée à l’effet de
l’oxyfluorfè[Link] fait, ces facteurs constituent les premiers paramètres à prendre en
considération, et ceci plus particulièrement dans le cadre des programmes de
biosurveillance de longue durée. Par ailleurs, il est recommandé d’intégrer aux
indicateurs bioénergétiques, la mesure (ou la détermination) d’indices généraux de
condition mais aussi le statut reproducteur des organismes.
la perturbation de l’enzyme digestive « protéase » est à l’origine de l’atteinte de la
biométrie et du métabolisme bioénergétique suite à l’exposition ou l’oxyfluorfène.
Aussi l’augmentation de l’enzyme antioxydante CAT chez les groupes contaminés a
montré des atteintes dans leur activité sous l’effet del’oxyfluorfène durant tout le cycle
expérimentale.

51
 CONCLUSION

Le suivi de l’impact potentiel des contaminants sur l’activité des enzymes digestives est un
paramètre intéressant présentant une pertinence écologique forte, car elles jouent un rôle crucial
sur les processus d’assimilation de la nourriture. Une diminution de la digestion pourra induire
une diminution de la croissance et de la reproduction avec un impact possible sur le maintien de
la population.

Pour terminer, il serait intéressant de poursuivre cette étude pour essayer d’étudier d’autres
biomarqueurs de stress.

52
 A

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 ANNEXE-1
Le pesticide étudié
MARCANA :est un herbicide à base de l’oxyfluorfène de contact agissant sur
la plupart de dicotylédones et graminées annuelles,Sélectif sur oignon

Leur composition : 240g/l d’oxyfluorfène

1.1. Identification de la substance

Substance chimique Oxyfluorfène

Autres 2-Chloro-1-(3-ethoxy-4-nitrophenoxy)-4(trifluoromethyl)
dénominations/synonymes benzène
Nom comerciel GOAL
Numéro CAS 42874-03-3

Formule moléculaire C15H11ClF3NO4

Code SMILES Clc2cc (ccc2Oc1ccc ([N+] ([O-])=O) c(OCC) c1) C(F) (F)
F
Status Usage général

1.2. Les propriétés physico- chimiques de l’oxyfluorfène :

Il est soluble dans la plupart des solvants organiques, et faiblement soluble dans l'eau (˂0,5 g/l à
25°C), il est fortement persistant dans le sol avec des temps de demi-vie qui diffèrent selon le
type de sol.
Tableau I : Les propriétés physico-chimiques du l’oxyfluorféne

Molécule Formule Propriétés physico-chimiques

Oxyfluorféne Poids moléculaire = 361.7 [g/mol].

Pression de vapeur =2,6.10-5 Pa à 25°C.

Coefficient d’adsorption = 5450[L/kg]

coefficient de partage Octanol-eau (log

Kow)= : 4,86 à 18°C.

Solubilité (eau) =: 0,116 mg/L à 25°C.

Constante de dissociation (pKa)= : Ne se

dissocie pas dans l’eau (99,2%).

La solubilité dans d’autres solvants :

facilement soluble dans la plupart des
solvants organiques.

La température de décomposition = 240

degrés C.
 ANNEXE (2)

Matériels non biologiques :

Bacs de dissection creusets Epuisette

Four à mouffle Trousse à dissection tubes à essais

Aquariums en verre Thermomètre pH-mètre

(60 c m x 40c m x 40 cm)
Agitateur/plaque chauffante Centrifigeuse bain Marie

Balance de précision dessicateur ichtyomètre

 Annexe (3)

Analyses physico-chimiques et microbiologiques de l’aliment

Analyses physico-chimiques
1- Taux d’humidité

L’humidité dans un produit est définie comme étant la quantité d’eau absorbée ou adsorbée
dans ce dernier, elle est déterminée selon le protocole ci-dessous

10g d’aliment (m0) préalablement broyés sont placés dans une capsule en porcelaine pesée
(mc) et tarée. L’ensemble est mis dans l’étuve à 105°C pendant 2h

L’échantillon séché est refroidi dans un dessiccateur avant de déterminer sa masse finale (mf)
.

 m f − mc 
Expression de résultat : % H =   × 100
 m0 
%H= 9,33 %

2- Taux de matière minérale (MM) et organique (MO)

La masse totale d’un produit est la somme des trois formes suivante :
M T = M eau + MM + MO
Pour déterminer le pourcentage de la matière minérale (taux de cendre) L’échantillon séché
(ou bien 10g d’un nouvel échantillon) est placé dans un four à moufle à une température °C
jusqu’à calcination totale de la prise d’essai.

La pesé de la capsule avec les cendre (Pf) est faite après refroidissement de ces derniers dans
un dessiccateur.
Le poids des cendre (MM) est :
MM = Pf − m c
  Pf − mc 
% MM =   × 100
 mo 
Donc :
MO = MT − (M eau + MM )
%MO = 100 − (% H + % MM )
%MM=24 %
%MO= 66,67 %

3-Détermination du pH

Le pH est déterminé par mixtion d’une certaine quantité d’aliment broyé (10%, 5% et 1%)
avec de l’eau distillée. Le pH-mètre employé est à électrode en verre.

pH=6,61

Analyse microbiologique de l’aliment

Préparation des dilutions

10g d’aliment sont broyés dans un Mix-bag avec 100ml d’eau distillée stérile, le filtrat
récupéré étant la solution mère.

La dispersion des cellules bactérienne est assurée par le TSE comme diluant.
Après répartition de 9ml de diluant dans des tubes à vis préalablement stérilisés, 1ml de la
solution mère (filtrat) convenablement homogénéisée, est introduit dans le premier tube , ainsi
est obtenue une dilution à (1/10).
1ml est prélevé de la première dilution pour être complété au 9ml du diluant pour obtenir une
dilution de (1/100). L’opération est reproduite pour la dilution (1/1000).

Recherche et dénombrement des coliformes totaux (CT) et fécaux (CF)

Tableau B.2 : Caractéristiques, milieux sélectifs et but de la recherche des CT et CF

Germe
Caractéristiques But de la recherche Les Milieux sélectifs
recherché
CT : Entérobactéries, Les coliformes sont des .Gélose DCLA
Gram(-), oxydase(-) , non bactéries vivants contient le
sporulés, aéro-anaérobies principalement dans les désoxycholate
facultatifs, fermentation de intestins et en abondance comme inhibiteur de
lactose à 30°C avec dans les matières fécales Gram+.
CT et CF
production de gaz et d’acide des animaux et de ce fait, .Bouillon VBL (vert
lactique. constituent des indicateurs brillant et la bile)
CF : croissance associée à fécaux de la première .Bouillon BCPL.
une production d’indole à importance.
partir du tryptophane à
44°C.

Technique En milieu liquide « BCPL » :

La technique en milieu liquide fait appel à deux tests consécutifs, à savoir :

test de présomption, réservé à la recherche des coliformes totaux.
test de confirmation, appelé encore test de Mac Kenzie, réservé à la recherche des
coliformes fécaux à partir des tubes positifs du test de présomption.

Test de présomption :

Le bouillon lactosé est de beaucoup le plus utilisé. En pratique, on ensemence des dilutions
successives de l’eau à analyser à raison de trois tubes de milieu de culture double et simple
concentration. Après inoculation on agite pour homogénéiser sans faire pénétrer d’aire dans la
cloche de Durham
Incubation : Se fait à 37°C pendant 24 et 48 heures.

Lecture et dénombrement : Les tubes positifs sont ceux qui présentent un virage au jaune, et
un dégagement de gaz d’au moins 1/10éme de la cloche.
Le dénombrement des coliformes totaux se fait par la table de Mac Grady.

Test de confirmation ou test de Mac Kenzie :

On fait un repiquage des tubes positifs sur milieu Schubert avec cloche de Durham.

Incubation :
Se fait à 44°C pendant 24 heures.

Lecture et dénombrement :
Les tubes positifs sont ceux qui présentent un trouble, et dégagement de gaz d’au moins
1/10éme de la cloche de Durham, avec une formation d’un anneau rouge après adjonction de 2
à 3 gouttes du réactif de Kovacs.
Le dénombrement des coliformes fécaux se fait par la table de Mac Grady.

3°-Recherche et dénombrement des streptocoques fécaux :

Tableau B.3 : Caractéristiques, les milieux sélectifs et le but de recherche des SF

Germe
Caractéristiques But de la recherche Les Milieux sélectifs
recherché
Cocci gram+, en chaînettes, Sa présence dans l’eau est milieu de
catalase négative et un signe de contamination présomption: Rothe,
SF possédant l’antigène de fécale plus ou moins contient de
groupe D récente. Leur présence l’azohydrate de
dans les produits sodium.
transformés (aliment) milieu de
 indique le plus souvent confirmation: Litsky,
non pas une contient de
contamination fécale, l’azothydrate de
mais une défectuosité du sodium et de l’éthyl
traitement thermique, de violet.
la technologie.

Technique

Les principes généraux de cette méthode sont ceux décrits dans le cas de la colimétrie en
milieu liquide.

Test de présomption :

Le test de présomption est réalisé dans le milieu de Rothe simple et double concentration

Incubation : L’incubation des tubes est faite à 37°C pendant 24 à 48h.

Lecture : Les tubes présentant un trouble microbien après incubation, sont considérés comme
positifs.

Test de confirmation :

A partir des tubes positifs, on transfert à l’aide d’une pipette stérile 3 à 4 gouttes sur le milieu
Litsky.

Incubation : L’incubation des tubes est réalisée à 37°C pendant 24h.

Lecture et dénombrement : les tubes présentant une pastille blanchâtre ou violette au fond du
tube avec un trouble microbien ; sont considérés comme positifs, donc présence de
Streptocoque fécaux.
L’expression des résultats se fait selon la méthode de NPP par référence à la table de Mac
Grady.
 Liste des photos

Photo 1 : Tilapia Rouge Oreochromis sp ……………… ……………………………page 4

Photo 2 : unité d’élevage expérimentale ……………………………………………..page 20

Photo 3 : opération de contamination…………………………………………………page 21

Photo 4: mensuration et pesée des individus ……………… ……..…………………page 25

 Liste des figures

Figure 1: Place des biomarqueurs dans l'évaluation de la contamination de 'environnement…..

……………………………………………………………………………………………page 13
Figure 2 : dispositif expérimental……………………………………………………....page 21

Figure 3 : Procédures expérimentales (dosages biochimiques)………………………...page 28

Figure 4 : Evolution de la température durant tout le cycle expérimental………..……page 32

Figure 5 : Evolution du pH durant le cycle expérimental…………………..………….page 33

Figure 6A: Variation des taux des nitrites durant le cycle expérimental……..………..page 34

Figure 6B : Evolution des taux de l’azote ammoniacale durant le cycle expérimental..page 35

Figure 6C : Variation de l’excrétion phosphorée durant le cycle expérimental….……page 36

Figure 7 : Valeurs moyennesdu gain en poids journalier GPJ………………………...page 37

Figure 8 : Relation taille (L) - Poids (P) des tilapias en daptation……………………page 42

Figure 9 : Relation taille (L) - Poids (P) des tilapias pour les quatre groupes de test…page 43

Figure 10 : Evolution des poids moyens (Pm) et taille moyenne (Lm) des tilapias rouges
durant la période d’étude……………………………………………………………….page 44

Figure 11 : Etude de l’effet de l’oxyfluorfène sur les rapports somatiques …………...page 46

Figure 12 : Etude de l’effet de l’oxyfluorfène sur l’activité de la catalase dans le foie des
tilapias..........................................................................................................................…page 47

Figure 13 : Variation de l’activité protéase durant la période expérimentale…………page 49

 Liste des tableaux

Tableau 1 : systèmes antioxydants de l’organisme ……………………………….…..page 9

Tableau 02 : Valeurs moyennes de Rmx …………………………..……………………page 38

Tableau 03 : Valeurs moyennes de la Ration quotidienne de maintenance Rmt ……..…page 38

Tableau 04 : Les valeurs de l’Énergie liée à la respiration R…………………………..page 39

Tableau 05 : les valeurs de l’énergie liée à l’excrétion U………………………………page 40

Tableau 06 : les différentes valeurs de contenu calorique C…………………………..page 40

 ABREVIATIONS

ROS : Reactive Oxygen Species

CAT : catalase

FAO : Food Organisation And Agriculture

CEE : Communauté Economique Européenne

EFSA : Autorité Européenne De Sécurité Des Aliments

C.E : Commission Européenne

US-EPA : U.S. Environmental Protection Agency

CNRDPA : Centre National de Recherche et de Développement de la Pêche et de

L’aquaculture

Nm : nanomètre

Mg : milligramme

Ml : millilitre

%H : teneur en eau

%MM : teneur de la matière minérale

%MO : teneur de la matière organique