République algérienne démocratique et populaire

Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique

Université Mentouri Constantine -1-
Faculté de sciences exactes
Département de chimie

Master 1 chimie analytique

TP N°04

Séparation par Chromatographie sur

colonne, identification et dosage des
colorants contenus dans le sirop de menthe

Réalisé par :
❖ Boulham Amina

Année universitaire : 2023-2024

Introduction :
La chromatographie d'adsorption est une technique de séparation de composés basée sur la
différence d'affinité existant entre ces composés, la phase mobile, qui entraîne les composés,
et la phase stationnaire. En effet, selon la plus ou moins grande affinité entre les solutés et la
phase stationnaire ou mobile, les constituants du mélange migrent à des vitesses différentes et
sont ainsi séparés.

La technique présentée ici est la chromatographie sur colonne, elle utilise une phase
stationnaire introduite dans une colonne de verre. C'est une technique très largement utilisée
notamment lors de réaction en chimie organique, pour séparer et purifier les différents
constituants d'un mélange. Elle fut découverte en 1906 par le botaniste russe Tswett, qui
montra que l'on pouvait séparer des colorants végétaux en faisant passer leur solution dans
l'éther de pétrole à travers une colonne remplie de carbonate de calcium.

Au cours de cette séquence nous verrons sur l'exemple d'un mélange de colorants, extraits du
sirop de menthe, le principe de cette technique en utilisant comme phase stationnaire la silice
(SiO2).

But de TP :
L'objectif de ce TP est :

 de séparer par chromatographie sur colonne les deux colorants contenus dans un sirop
de menthe (colorants alimentaires : le E102 et le E131).
 identifier et les quantifier par spectrophotométrie UV-visible.

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 Partie théorique :
1. Le sirop de menthe
Le sirop de menthe est une solution aqueuse contenant du sucre de canne, des extraits naturels
de menthe et deux colorants artificiels (qui n'existent pas dans la nature) :

 le jaune tartrazine, référencé sous le code E 102

 le bleu patenté, E 131

La Séparation et l’identification de ces deux colorants peut s’effectuer par des méthodes
chimiques déférents, dans cette pratique ont été intéressé dans le Chromatographie sur
colonne comme méthode de séparation et l’UV visible comme méthode d’identification.

2. Chromatographie sur colonne :

2.1. Définition :
La chromatographie sur colonne permet la séparation d’une plus grande quantité de produit et
purifier un produit de réaction. C’est la méthode standard de purification dans un laboratoire
de chimie organique.

2.2. Les types :

Deux types de chromatographie existent :

 Chromatographie par gravité : elle utilise des particules de silice de 70 à 200 m et

le solvant s’écoule au goutte-à-goutte. Cette technique est désuette car elle demande
une plus grande quantité de silice et de solvant.
 Chromatographie éclair (“flash”) : elle utilise des particules de silice de 35 à 70 m
et le solvant s’écoule sous pression d’air comprimé.
2.3. Description de la technique :
Le principe de fonctionnement de la chromatographie sur colonne s’apparente à celui de la
CCM. En effet, la séparation des composés d’un mélange repose sur la différence d’affinité
pour une phase stationnaire et pour une phase mobile.

 Phase stationnaire : comme pour la CCM, c’est le gel de silice qui est le plus
souvent utilisé. Cependant, il n’est pas étendu sur une plaque ; il est plutôt préparé en
une bouillie avec le solvant, et versé dans une colonne de verre (qui ressemble à une
burette, mais sans graduations) équipée d’un robinet.

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  Phase mobile : c’est toujours un éluant, mais qu’on verse par le haut de la colonne
pour le faire descendre dans la phase stationnaire. L’écoulement est assez lent. On
ajuste la polarité de l’éluant à l’aide de tests sur CCM. Cependant, puisqu’il faut
continuellement ajouter de l’éluant en haut de la colonne, il est possible de varier sa
composition, et ainsi ajuster la polarité de l’éluant selon le(s) composés(s) restant(s)
sur la colonne.
 Échantillon : le mélange à séparer est déposé délicatement sur le dessus de la phase
stationnaire. À l’aide de l’éluant, on le fait pénétrer dans la silice. Au cours de
l’élution, les molécules les plus polaires du mélange restent « collées » sur la silice,
alors que les moins polaires suivront l’éluant. On recueille les différents produits par
le robinet au bas de la colonne, dans des éprouvettes.
2.4. Inconvénients :
 Des grandes quantités d’éluant sont nécessaires;
 La durée de l’élution peut être longue, allant de quelques heures à quelques jours
 La détection des composés demande une attention constante.

Lorsque les conditions expérimentales gagnantes sont réunies, cette technique permet de
purifier efficacement de grandes quantités de produit.

3. Spectroscopie UV-Visible :
La technique de spectrophotométrie ou d'absorptiomètre est basée sur la propriété de la
matière, et plus particulièrement de certaines molécules, d'absorber certaines longueurs
d'ondes du spectre UV-visible. Elle permet de réaliser des dosages grâce à la loi de Beer-
Lambert qui montre une relation de proportionnalité entre l'absorbance et la concentration,
aussi bien qu'une étude structurale des complexes par l'étude des spectres d'absorption.

A = εlc = log (I0/ I) =log (1/T)

A : absorbance.

l : longueur de la cellule.

C: concentration de substance absorbante.

ε(λ) : coefficient d’absorption molaire (fonction de la nature de la substance, de la longueur

d’onde de la lumière λ, de la nature du solvant et de la température T.

Cette méthode est basée sur l'utilisation d'un spectrophotomètre qui détermine l'absorption
d'une solution pour une longueur d'onde donnée ou pour une plage de longueurs d'ondes
judicieusement choisie.

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 3.1. Principe :
Spectroscopie : Etude des interactions entre la matière et un rayonnement électromagnétique.
Une molécule absorbera une radiation de fréquence ν s’il existe des transitions nécessitant une
énergie : ΔE = hν (h = 6,63 10-34 Js, cte de Planck)

Absorption d’un rayonnement dans le domaine de l’UV-Visible : excitation d’électrons de

valence.

3.2. Une courbe d'absorbance A en fonction de la longueur d'onde :

Le domaine UV s'étale entre 10 et 400 nm mais la plupart des spectroscopes ont comme
limites 190 à 400 nm. De plus, ces appareils permettent aussi d'accéder aux longueurs d'ondes
visibles, entre 400 et 750 nm.

Avant de rentrer dans les détails, commençons en disant que les deux grandeurs
caractéristiques d'une molécule en spectroscopie UV-visible seront sa longueur d'onde
d'absorption maximale (Amax) et son coefficient d'absorption (αmax) à λmax donné.

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Précisons que la λmax correspond à la longueur d'onde la mieux absorbée par la molécule, et
e max l'aptitude plus ou moins importante à absorber les photons à cette longueur d'onde.

Ces deux valeurs caractérisent un site de la molécule, site dont la structure possède l’aptitude
à absorber les électrons UV ou visible. Ce site s’appelle un chromophore.

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 Partie expérimentale:
1. Les Matériel et les produits utilisés :

Matériel et verrerie Les Solutions

pipette pasteur
Sirop de menthe
colonne chromatographique ou, à défaut, une
burette de 25 ml
Silice en poudre
coton, sable
Éthanol
2 béchers de 50 mL

spectrophotomètre UV-visible et accessoires solution saturé NaCl

2. Mode opératoire :

2.1. Préparation de la colonne (Phase Fixe) :

L'opération de remplissage de la colonne conditionne l'efficacité de la séparation.

 Fixer verticalement la colonne à l'aide d'une pince.

 Déposer un petit morceau de coton dans le bas de la colonne
 Déposer un peu de sable pour rendre la surface plane.
 Peser environ quelque gramme de silice et délayer dans l'eau salée pour en faire un
gel.
 Introduire la silice dans la colonne.
 Tapoter la colonne afin d'obtenir une surface plane de silice
 Placer un bêcher sous la colonne.

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  Introduire doucement de l'eau salée (à l'aide d'une pipette plastique par écoulement de
long de la paroi de la colonne). Ajouter une quantité d'eau suffisante pour être environ
à 1/2 cm au-dessus de la surface plane de la silice.

2.2. Dépôt de l’échantillon à séparer :

 Déposer très doucement à l'aide d'une pipette, sans toucher les parois de la colonne, 1
ml de sirop de menthe : attention à ne pas déformer la surface de la phase stationnaire
pendant cette opération.

 Lorsque le dépôt à bien imprégné la silice, verser très doucement, à l’aide d’une
pipette, un peu d’eau salée (éluant 1) sur la paroi de la colonne .on remarquera qu’un
colorant jaune est bien entrainé par l’éluant.

 Lorsque le premier colorant arrive en bas de la colonne le récupérer dans un premier

erlenmeyer.

 Éluer ensuite avec un autre éluant : éthanol

 Lorsque le second colorant parvient en bas de la colonne, le récupérer dans un second

erlenmeyer.

 Mesurer les volumes de chaque colorant.

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2.3. Analyse des solutions recueillies :

A l'aide d'un spectrophotomètre, tracer les spectres d'absorption (A en fonction de la longueur

d'onde) des solutions recueillies.

3. Les résultats :

1- Mesure de volume :

Volume de solution Jaune 96 ml

Volume de solution Bleu 129 ml

2- Spectre d’absorption UV-visible :

 La solution Jaune :

λmax (nm) 434 nm

Abs 0.129

 La solution Bleu :

λmax (nm) 630 nm

Abs 0.136

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  La solution Verte :

Jaune Bleu
λmax (nm) 426 nm 634 nm
Abs 0.114 0.117

3- Courbe d’étalonnage de solution étalon :

 Solution étalon (Jaune) : Abs = f(C)

C (étalon Jaune) g/l 0.04 0.1 0.2 0.3
Abs 0.050 0.174 0.321 0.5

0.6

y = 1.6939x - 0.0098
0.5
R² = 0.997

0.4
Abs

0.3

0.2

0.129
0.1

0
0 0.05 0.076 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35

C (g/l)
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  Solution étalon (Bleu) : Abs = f(C)
C (étalon Bleu) g/l 0.4 0.6 0.8 1
Abs 0.115 0.137 0.196 0.277

0.3
y = 0.2725x - 0.0095
0.25 R² = 0.944

0.2
Abs

0.15
0.136
0.1

0.05

0
0 0.2 0.4 0.6
0.6 0.8 1 1.2

C (g/l)

4. La réponse :
1- Schéma annoté de la manipulation :

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 2- Le rôle du filtre dans la colonne :

Le filtre en verre fritté joue le rôle d’un agent filtrant permettant le maintien de la
phase stationnaire dans la colonne en évitent sont écoulement par l’effet de la phase
mobile.

3- Il ne faut pas qu'il y ait de bulles d’air :

Car on aurait alors des chemins préférentiels nuisant à une bonne séparation des composés.
Pendant la phase d'élution avec le solvant.

4- Les teintes des solutions recueillies :

Jaune et bleu patenté.

5- L’éluant du premier colorant :

Solution saturé de NaCl.

6- Le second colorant :
Est plus soluble dans l’éthanol.

7- Identification des phases mobiles et stationnaires dans les deux cas :

 Le colorant Jaune :

La phase mobile : La solution saturée de NaCl.

La phase stationnaire : La silice.

 Le colorant Bleu :

La phase mobile : L’éthanol.

La phase stationnaire : La silice.

8- Confirmer l’identité des deux colorant :

 Jaune :

λmax (spectre bibliographique) = 476 nm

λmax (spectre enregistré) = 434 nm

Par comparaison des spectres enregistrés avec les spectres bibliographiques le sirop de
menthe étudié contient un mélange de Jaune de Tartrazine.

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La différence entre les résultats théorique et pratique dépend d’erreur de mesure.

 Bleu :

λmax (spectre bibliographique) = 638 nm

λmax (spectre enregistré) = 630 nm

Par comparaison des spectres enregistrés avec les spectres bibliographiques le sirop de
menthe étudié contient un mélange de Bleu Patenté V.

La différence entre les résultats théorique et pratique dépend d’erreur de mesure.

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  Justification des couleurs :
- En réalisant le spectre d’absorption du Jaune de Tartrazine colorant absorbe pour un
maximum de λ = 476 nm, qui correspond à la couleur violet. Cela signifie que ce même
colorant diffuse très bien dans la couleur complémentaire de celle qui peut parfaitement
absorber à savoir dans ce cas, la couleur jaune (complémentaire de violet).

- En réalisant le spectre d’absorption du Bleu Patenté V, nous pouvons observer que ce

colorant absorbe pour un maximum de λ = 638 nm, qui correspond à la couleur orange. Cela
signifie que ce même colorant diffuse très bien dans la couleur complémentaire de celle qui
peut parfaitement absorber à savoir dans ce cas, la couleur bleue (complémentaire de
l’orange).

9- Calcule de la concentration :

 Détermination de Cthéo :

A=ε (λ) lC C=A/ ε (λ) l

Jaune de Tartrazine : Cthéo = (450*10-3) / (40*1) = 11.25*10-3 g/l

Bleu Patenté : Cthéo = 1.38 / (160*1) = 8.625*10-3 g/l

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  Détermination de Céxp :

Par projetant sur courbe d’étalonnage on trouve :

Jaune de Tartrazine : Abs = 0.129 ⇒ Céxp = 0.076 g/l

Bleu Patenté : Abs = 0.136 ⇒ Céxp = 0.6 g/l

 Comparaison :

Jaune de Tartrazine : Céxp > Cthéo

Bleu Patenté : Céxp > Cthéo

{à cause des erreurs expérimentales}.

10- L’explication de l'utilité de l'addition de ces deux colorants

dans le sirop de menthe :
Nous allons, dans cette manipulation, mettre en évidence la présence de deux colorants dans
le sirop de menthe : La Jaune Tartrazine et le Bleu Patenté. Le mélange de ces deux
colorants (jaune + bleu = vert) donne la coloration Verte intense (et non naturelle) de ce
produit.

11- L’effet du dilution :

L’allure d’un spectre est modifié par la présence de liaisons hydrogènes entre les molécules,
lorsque la solution devient plus concentrée, les liaisons hydrogène peuvent se former et
modifier le spectre, la bande devient plus large et se décale vers des plus petits.

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Conclusion :
La chromatographie sur colonne est une technique expérimentale qui permet de séparer les
constituants d’un mélange. Ici, la chromatographie a permis de séparer deux colorants d’un
sirop de menthe. Dans ce cas la chromatographie sur colonne peut être utilisée couplée à un
moyen de détection, comme par exemple une spectroscopie UV – visible ou une
spectrométrie de masse et on obtient ainsi une chaîne complète automatisable d'analyse.

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