FACULTE DES SCIENCES BIOLOGIQUES (FSB)
Cours de Génie génétique
Option : Microbiologie et Contrôle de Qualité
Les vecteurs de clonage
Dr ABBAS-TOUMIAT
UNIVERSITE DES SCIENCES ET DE LA TECHNOLOGIE 1
HOUARI BOUMEDIENE
Vecteur de clonage
• Petit élément génétique à réplication autonome
• Utilisé pour produire une multitude de copie d’un gène d’intérêt
(clonage)
• Dérive en générale de plasmides ou de virus
• Spécialement conçu pour permettre l’intégration d’un gène (portion
d’ADN) exogène dans un site spécifique sans que cela n’affecte sa
propre réplication
• Plusieurs types de vecteurs existent, pouvant introduire des
molécules d’ADN recombiné dans les bactéries, les levures, les
cellules végétales, les cellules de mammifères et humaines
Caractéristiques
• Origine de réplication fortement amplifiable
• Petite taille
• Présence de gènes de sélection
• Présence de sites de restriction localisés dans les gènes de sélection
• Stabilité
Vecteurs bactériens
• E coli est la bactérie la plus utilisée en clonage moléculaire; l’ADN
recombinant peut être introduit sous 3 formes différentes:
Les plasmides
Les phages
Les cosmides
Catégories de vecteurs
1. Vecteur de clonage :
2. Vecteur d’expression :
I/ Les plasmides
• Molécules d'ADN bicaténaire circulaire, extrachromosomique
pouvant être présentes en plusieurs centaines de copies au sein
d'une même cellule bactérienne
• Capables de se répliquer indépendamment de la cellule hôte
(Présence de la séquence ORI), transmissibles à la descendance de
façon stable
• Petite taille: 2 à 5 kb (le chromosome d'E. coli fait 4700kb)
• Sites de restriction à l'intérieur des gènes de sélection
• Ils sont facultatifs
I/ Les plasmides
• Les activités biologiques apportées par les plasmides naturels
concernent 3 domaines principaux :
la résistance aux antibiotiques et aux métaux lourds
le pouvoir pathogène
le métabolisme
• Les plasmides naturels possèdent dans leur génome un locus nommé
« par » qui fonctionne à la façon du centromère des chromosomes
des eucaryotes
Contrôle la répartition précise des plasmides parmi les cellules filles
lors de la division cellulaire
Classes des plasmides
• Les plasmides de première génération :
-
- ColE1, RSF 2124, pSC 101
• Les plasmides de deuxième génération :
plasmides « artificiels »
Les plasmides pBR
• Les plasmides de troisième génération :
- Plasmides pUC
Exemple de plasmides
bactériens
Exemple de plasmides bactériens
• Plasmide pBR322
Petit plasmide de 4361 paires de bases
Origine de réplication : colEl (origine de réplication d'un
plasmide de E. coli)
Présent à raison de 10 à 20 copies par cellule dans des
conditions standards de culture
2 gènes de résistance : tétracycline (tetr 86-1276) et
ampicilline (ampr 3293-4153) qui peuvent servir l'un et
l'autre comme marqueur de transformation
de nombreux sites uniques de restriction répartis sur toute la
séquence
Le plasmide pBR322
Exemple de plasmides bactériens
• Plasmide pUC
Nouvelle famille de plasmides qui ne nécessitent plus qu'une
étape de repérage des clones : les pUC (2700pb)
C’est un plasmide pBR dans lequel on a remplacé le gène de
résistance à la tétracycline (qui sert à repérer les plasmides
recombinés) par un gène bactérien lacZ qui code la
galactosidase
Cette enzyme a pour propriété d'hydrolyser le lactose en
glucose et galactose
Un produit non toxique pour la cellule bactérienne est
également substrat de la galactosidase : le Xgal
Exemple de plasmides bactériens
Exemple de plasmides bactériens
• Plasmide pUC (suite)
Dans le gène lacZ, un site multiple de clonage (polylinker) a
été introduit, contenant toute une série de sites de coupures
Le fait que ce polylinker soit inséré dans le gène lacZ qui
intervient dans le catabolisme du lactose, permet de révéler
facilement l’intégration d’un insert par inactivation
insertionnelle
un plasmide pUC natif apportera le gène lacZ fonctionnel et
une bactérie qui le portera, cultivée sur milieu additionné de
Xgal deviendra bleue
Un pUC recombiné aura perdu l'intégralité de son gène lacZ et
la bactérie qui le portera donnera un clone qui restera blanc
On utilise des souches délétées pour l'ensemble de l'opéron lac
Exemple de plasmides bactériens
• Carte génétique du plasmide pUC
Exemple de plasmides bactériens
• Plasmide pUC (pUC8-pUC19)
Les pUC (pUC8 à pUC19) ne différent que par le nombre de
nucléotides et par l’emplacement du polylinker
II/ Les bactériophages
• Les vecteurs phagiques présentent 2 avantages essentiels par rapport
aux vecteurs plasmidiques:
taille
transfert du gène
II/ Les bactériophages
• Les phages sont des virus qui infectent les bactéries
• Deux phages sont très utilisés comme vecteurs: le phage lamba et le
phage M13
• Le phage lambda (Enterobacteria phage λ) est un virus bactériophage
qui infecte la bactérie Escherichia coli. Ce bactériophage est un virus
à ADN double brin
• Le bactériophage M.13 est un phage dont la forme libre est
constituée d’une membrane entourant un ADN simple brin de 6,4 kb
II/ Les bactériophages
• Le bactériophage λ:
Virus infectant E coli
Peut alterner phase lytique et lysogène selon certaines
conditions:
Pendant le cycle lytique: l’ADN circulaire est répliqué en
grande quantité dans la bactérie, des progénies viraux sont
formés, conduisant à la mort de la cellule hôte
Pendant le cycle lysogène: le génome du bactériophage
infectant, est intégré dans le chromosome bactérien, et sera
transmit à la descendance. La réplication se fait alors au
rythme des divisions de la cellule hôte
II/ Les bactériophages
• Génome du bactériophage λ:
ADN double brin de 48 502 paire de bases
cos: Des éléments important pour la réplication et l'encapsidation de bactériophage λ
II/ Les bactériophages
• Bactériophage λ dans le clonage: Dérivés du phage λ
Afin d’être utilisé dans le clonage, des modifications sont apportées au
phage λ :
1. Réduction du nombre des sites de restriction identiques par
mutation sans changer les protéines codées par les gènes (mutations
silencieuses)
2. Délétion des parties non essentielles : la longueur de l’ADN étranger
à insérer est limitée. Pour insérer un fragment d’ADN plus long, des
parties de l’ADN du phage sont éliminées (il s’agit essentiellement
des parties responsables de la lysogénie et la recombinaison et qui
ne sont pas nécessaires à la reproduction lytique du phage)
Deux types de vecteurs λ
• Vecteur d’insertion:
• L’ADN phagique est préalablement coupé en un site unique par une
endonucléase de restriction, donnant des bouts cohésifs
• Une phosphatase agira sur ses extrémités pour éviter une éventuelle
« soudure »
• L’ADN à introduire doit avoir une taille ≤ 12 Kb
Deux types de vecteurs λ
• Vecteur de substitution:
• Les parties non essentielles de l’ADN du phage sont remplacées par
l’ADN insert (taille de l’insert ≈ 20kb)
II/ Les bactériophages
• Le bactériophage M13:
• Virus à ADN simple brin infectant E coli (6.407 kb)
• Une fois dans la cellule, le brin complémentaire de l’ADN phagique
est synthétisé (forme réplicative ou RF qui est un ADN db)
• La forme réplicative présente toute les qualités des vecteurs
plasmidiques.
• Cette forme sert de matrice à la synthèse d'ADN simple brin qui peut
être encapsidé et par conséquent facilement isolable.
II/ Les bactériophages
• Le bactériophage M13:
• Pour être utilisé au clonage, le phage M13 a subit les modifications
suivantes :
1. Introduction des sites d’insertions multiples (polylinkers) +
suppression des sites de restrictions identiques
1. Insertion du gène lacZ’ (permettant le criblage coloré).
II/ Les bactériophages
• Le bactériophage M13:
• Les cosmides:
III/ Les cosmides
Vecteurs artificiels : phage lambda-plasmides
IV/ Les Chromosomes Artificiels de levure : YAC
• Le vecteur YAC:
Avantage de Saccharomyces cerevisiae:
• Eucaryote unicellulaire
• Croit sur milieux simples et bien définis
• Petit génome (12Mb) entièrement séquencé
• Clonage de grands fragments (jusquà 1000 Kb)
IV/ Les Chromosomes Artificiels de levure : YAC
• Le vecteur YAC:
C’est une molécule linéaire organisée comme un chromosome de
levure:
• Un télomère à chaque extrémité (TEL)
• Une origine de réplication (ARS1)
• Un centromère (CEN4)
• Deux gènes marqueurs de sélection (TRP1, URA3)
• L’ADN est cloné entre les deux bras d’un vecteur, chaque
bras contenant un gène de sélection (SUP4) qui intervient
dans la synthèse d’adénine
• Les fragments clonés peuvent atteindre 1000 kb
V/ Les Chromosomes Artificiels Bactériens : BAC
• Rappel:
1/Le plasmide F d’E coli:
Très grand plasmide (≥ 100Kpb), très stable
Naturellement présent à une copie par génome
Origine de réplication
Un grand nombre de gènes impliqués dans ses fonction de
facteur sexuel (synthèse de pilus, conjugaison et transfert)
Peuvent être délétés sans affecter la réplication
2/Les souches Hfr:
Haute fréquence de recombinaison. Une souche Hfr
résulte de l’intégration du facteur F dans le chromosome
V/ Les Chromosomes Artificiels Bactériens : BAC
V/ Les Chromosomes Artificiels Bactériens : BAC
2/Les souches Hfr:
Haute fréquence de recombinaison. Une souche Hfr
résulte de l’intégration du facteur F dans le chromosome
V/ Les Chromosomes Artificiels Bactériens : BAC
Marqueur de criblage blanc/bleu
• Le vecteur BAC:
Marqueur de sélection
Répartition du
vecteur dans les
cellules filles
Origine du facteur F
Bon fonctionnement d’oriS