médecine/sciences 2020 ; 36 : 504-13

médecine/sciences Modèles alternatifs (8)

La levure modèle
et outil…
> La levure a été utilisée de façon empirique
ausi pour
pendant des millénaires pour la panification et la recherche
la fermentation des sucres en alcool. C’est seule- thérapeutique
ment à partir de 1857 que Louis Pasteur décrit le Stéphane Bach1,2, Pierre Colas1, Marc Blondel3,4
microorganisme à l’origine de ces deux activités
agroalimentaires majeures. Dès lors, les souches
de levure ont pu être sélectionnées et modifiées 1
Sorbonne Université, CNRS,
sur une base rationnelle pour optimiser leurs UMR8227, Laboratoire de
Biologie Intégrative des Modèles
usages agroalimentaires, permettant ainsi l’essor Marins, Station Biologique de
de la levure comme modèle biologique eucaryote. Roscoff, place Georges Teissier,
Cette utilisation a conduit à de très nombreuses 29680 Roscoff, France.
2
découvertes de biologie cellulaire fondamentale. Sorbonne Université, CNRS,
FR2424, Plateforme de criblage
Depuis une vingtaine d’années, la levure est KISSf, Station Biologique de
également utilisée comme modèle et outil pour Roscoff, place Georges Teissier,
la santé humaine. Ces approches s’étendent de 29680 Roscoff, France.
3
Univ Brest, Inserm, EFS,
la production de molécules thérapeutiques à UMR1078, GGB, F-29200 Brest,
la recherche de candidats-­médicaments et de France.
sondes chimiques, en passant par la mise au du musée du Louvre, dans laquelle 4
CHRU Brest, service de
point de tests diagnostiques et la découverte de des scènes de brasserie ou encore des génétique clinique et de biologie
pains fossilisés sont exposés, suf- de la reproduction, F-29200
nouvelles cibles thérapeutiques. Cette utilisation Brest, France.
fit à s’en persuader. Récemment les
de la levure en chémobiologie fait l’objet de la traces d’une brasserie de la période [Link]@[Link]
présente revue. < Natoufienne1 ont été découvertes en Israël, ce qui repousserait les
premiers signes de l’utilisation de la levure à plus de 13 000 ans [1].
Jusqu’aux travaux de Louis Pasteur, la théorie de la génération spon-
tanée, défendue principalement par des chimistes, prédominait. Selon
cette théorie, la fermentation était un processus chimique catalytique
En 1991, se tenait à l’Institut Pasteur de Paris le pre- et, même si différents naturalistes avaient observé au microscope et
mier colloque francophone « Levure Modèle et Outil » décrit la présence de nombreuses levures associées à la fermentation
(LMO) dont une des caractéristiques principales était alcoolique, l’hypothèse communément admise était que ces levures
de mêler, dans un même congrès, ces deux utilisations n’étaient rien d’autre que des substances chimiques complexes mais
de la levure : tant comme outil que comme modèle inertes, agissant comme des catalyseurs pour la conversion des
biologique. Depuis, ces conférences sont organisées sucres en alcool. Si cette vision de la levure était partagée par les
tous les deux à trois ans et se tiennent maintenant en plus éminents chimistes de l’époque, tels que l’allemand Justus von
anglais, mais toujours avec ce même fil conducteur Liebig (1803-1873), dès 1837, une hypothèse alternative, notamment
fondé sur sa dualité d’utilisation, dont il est frappant défendue par Charles Cagniard-Latour (1777-1859), commençait
de constater qu’elle est à l’origine même du développe- déjà à émerger : les levures seraient en fait des cellules vivantes se
ment du modèle levure. En effet, les premières traces de multipliant pendant le processus de fermentation. Cette hypothèse
l’utilisation empirique par l’espèce humaine de la levure reposait sur l’observation que la fermentation commençait avec
pour fermenter les sucres en alcool, ou comme agent l’apparition des levures, progressait en parallèle de leur multiplica-
de levage pour la panification, remontent à plus de tion et s’arrêtait en même temps que leur croissance [2]. C’est dans
5 000 ans. Une simple visite dans la section égyptienne
1
Le Natoufien est une culture de transition entre l’Épipaléolithique et le Néolithique, comprise entre
Vignette (Brancolevure - Photo © Marie-Louise Jung). – 14 500 et – 11 500 ans.

­504 m/s n° 5, vol. 36, mai 2020

[Link]
ce contexte que Louis Pasteur, alors en poste à Lille où il avait été vésiculaire [8] et sur les mécanismes de l’autophagie
sollicité par des brasseurs locaux afin qu’il les aide à comprendre et [9]. Une autre illustration spectaculaire de cette forte
solutionner les difficultés régulières qu’ils rencontraient dans leurs conservation de la levure à l’homme des mécanismes de
fermentations des sucres en alcool, commença à s’intéresser à cette biologie cellulaire et de leurs acteurs clés provient de la
question. En 1857, il publia la première [3] d’une série d’études qui tentative de remplacer de façon systématique une partie
non seulement confirmèrent que la levure correspondait effectivement (414) des quelques 2 000 gènes essentiels de levure, par

REVUES
à un organisme vivant, mais également servirent de fondement à la leurs homologues humains : près de la moitié de ces 414
microbiologie et à la pasteurisation. Dès lors, il devint possible, sur gènes essentiels de levure peuvent ainsi être « humani-
des bases rationnelles et scientifiques, d’optimiser le processus de sés », et ce pourcentage est même encore plus important
fermentation, par exemple en éliminant les bactéries contaminantes, pour certains complexes tels que le protéasome 26S pour
mais aussi en sélectionnant et modifiant les souches de levure elles- lequel 21 des 28 sous-unités humaines testées se sont
mêmes. L’utilisation de la levure comme modèle pouvait alors com- avérées capables de remplacer leur équivalent chez la
mencer à se développer, sur la base même de son utilisation comme levure [10]. Suite à la publication, en 1996, du génome
outil agroalimentaire. de la levure S. cerevisiae, il avait été estimé qu’au moins
À ce stade, une précision sémantique est nécessaire. En effet, la plupart 30 % des gènes humains impliqués dans des maladies

SYNTHÈSE
des biologistes, cédant à l’abus de langage courant, nomment « levure » présentaient un homologue fonctionnel chez la levure
la levure de boulanger (ou de brasseur) Saccharomyces cerevisiae. [11]. Toutes ces observations ont rapidement conduit à
En réalité, il existe de très nombreuses espèces de levures qui sont considérer que la levure, notamment S. cerevisiae, pou-
des champignons unicellulaires. Citons par exemple une autre levure vait représenter à la fois un modèle et un outil alternatifs
très utilisée comme organisme modèle (et aussi pour la fermentation et pertinents pour la recherche thérapeutique.
alcoolique, notamment en Afrique) : la levure de fission Schizosac-
charomyces pombe qui est ainsi parfois appelée « l’autre levure ». La La levure : un modèle pour la recherche
levure S. cerevisiae, tout comme l’autre levure S. pombe, est un orga- thérapeutique
nisme unicellulaire eucaryote. Malgré sa simplicité (elle ne contient
qu’environ 6 200 gènes et l’épissage alternatif y est peu développé, ce La forte conservation des mécanismes cellulaires de
qui limite également son répertoire protéique [4]), elle n’en représente la levure à l’espèce humaine, ainsi que la capacité de
pas moins un prototype de cellule eucaryote dans lequel sont présents la nombreux gènes humains à complémenter la fonction
plupart des grands mécanismes régissant la vie mais aussi la mort [5] de gènes de levure homologues mutés, ont rapidement
des cellules des eucaryotes supérieurs. Cet aspect essentiel, combiné été exploitées. En effet, la fonctionnalité, par rap-
à la grande facilité de manipulation de cet organisme (la levure est port à l’allèle sauvage, de mutations suspectées être
un eucaryote aussi facile à manipuler qu’une bactérie prototype telle la cause de différentes maladies humaines peut être
qu’Escherichia coli), a conduit à son essor comme l’un des organismes déterminée en réalisant des tests de complémentation
modèles eucaryotes majeurs. S. cerevisiae fut ainsi le premier eucaryote dans des levures déficientes pour le gène correspon-
dont le génome a été intégralement séquencé et la divulgation de cette dant (Figure 1). Parmi les premiers exemples, se trouve
séquence, en 1996, a permis le développement de la plupart des tech- l’analyse de mutations du gène CBS humain codant la
niques globales (de « -omique ») largement utilisées chez la levure, cystathionine bêta-synthase et responsables d’une
et dont la plupart des résultats sont accessibles librement2. La levure maladie métabolique rare (l’homocystinurie, également
a ainsi permis des découvertes et avancées majeures dans la compré- facteur de risque pour des athéroscléroses prématu-
hension du fonctionnement général de la cellule eucaryote, comme en rées). Cette étude a été effectuée dans une souche
atteste la présence régulière de « levuristes » dans la liste des réci- de levure dont le gène CYS4, l’homologue de CBS, est
piendaires des prix Nobel (en particulier de physiologie ou médecine) : inactivé [12]. Dans la lignée de cette méthode, l’une
citons, par exemple, Roger Kornberg, prix Nobel de chimie 2006 pour ses des premières utilisations de la levure à des fins de
travaux sur les bases moléculaires de la transcription chez la levure [6] ; diagnostic médical est le test FASAY (functional analy-
Paul Nurse et Lee Hartwell, co-récipiendaires du prix Nobel de physio- sis of separated alleles in yeast) qui vise à déterminer
logie ou médecine 2001 pour la découverte des complexes CDK (cyclin- le degré de fonctionnalité des très nombreux allèles
dependent kinase)/cyclines, les régulateurs centraux du cycle cellulaire mutants du gène suppresseur de tumeur P53 [13]. Une
eucaryote, respectivement chez S. pombe et S. cerevisiae [7] ; ou, plus adaptation de ce test a récemment été développée
récemment, Randy Schekman et Yoshinoro Ohsumi, tous deux lauréats du afin de déterminer la dominance éventuelle des allèles
prix Nobel de physiologie ou médecine, en 2013 pour le premier et 2016 mutés de P53 les plus couramment retrouvés dans les
pour le second, pour leurs travaux séminaux, respectivement sur le trafic cancers (mutants hotspot), ainsi que de certaines
des isoformes principales de p53 et de deux protéines
2
Voir notamment le site du Saccharomyces Genome Database ([Link] apparentées, p63 et p73. Les résultats ont suggéré

m/s n° 5, vol. 36, mai 2020 ­505

 Pas d’homologue
Un homologue fonctionnel Pas d’homologue
fonctionnel du gène
du gène impliqué dans la fonctionnel du gène
impliqué mais un gène de
pathologie existe chez la impliqué mais expression
levure a un comportement
levure (ex. : CBS/CYS4) hétérologue chez la levure
similaire (ex. : prions)

Obtention dans la levure d’un phénotype pertinent

par rapport à la pathologie d’intérêt

Tests de Recherche de modificateurs

fonctionnalité de ce phénotype (criblage)
d’allèles mutés

Par criblage pharmacologique : Par criblage génétique :

IDENTIFICATION DE : IDENTIFICATION DE :
– Candidats-médicaments – Gènes modificateurs potentiels
– Sondes chimiques pour explorer – Nouveaux acteurs des mécanismes
les mécanismes physiologiques physiopathologiques
⇒ Nouvelles cibles thérapeutiques ?

Validation en système mammifère (culture cellulaire 2D/3D, modèles animaux)

Identification des cibles des composés Construction de nouveaux modèles fondés
par criblage inverse sur ces nouvelles cibles thérapeutiques

Figure 1. Vue d’ensemble de l’utilisation de la levure comme modèle de maladies humaines. Le point crucial est d’obtenir un modèle levure pré-
sentant un phénotype pertinent par rapport à la pathologie d’intérêt. Des modificateurs de ce phénotype peuvent ensuite être recherchés par des
criblages tant pharmacologiques que génétiques.

que la plupart de ces mutants et certaines de ces isoformes étaient ont ensuite été revisités par Reed Wickner qui, peu de
dominants, ce qui expliquerait le maintien d’hétérozygotie observé temps après l’émergence du concept prion, suivant
pour le locus P53 chez de nombreux patients porteurs de ces mutations une intuition brillante, a démontré que ces éléments
hotspot [14]. La levure a également servi de modèle pour des aspects « bizarres » d’hérédité cytoplasmique non mendélienne
inattendus de la biologie des eucaryotes supérieurs, tels que les prions chez la levure correspondaient en fait à des prions
ou le vieillissement. [17]. Un nouveau champ d’étude extrêmement actif
Les prions ont, en fin de compte, été initialement découverts chez fondé sur la levure pour étudier la biologie des prions
la levure, par des expériences de génétique classique réalisées dans et élucider ses mystères, venait ainsi d’être créé. Les
les années 1960-1970 (donc longtemps avant la connaissance de la apports majeurs à mettre au crédit de ces études ont
séquence des gènes et des protéines concernées, et surtout bien avant été la découverte du rôle crucial de chaperons de pro-
la définition même du concept prion de protéine infectieuse !), et téines dans le maintien et la propagation des prions
astucieusement interprétées [15, 16]. Les résultats de ces expériences [18], ou encore parmi les premières démonstrations

­506 m/s n° 5, vol. 36, mai 2020

formelles de l’hypothèse « protéine seule » à la base du modèle prion Maladies à prions
[19, 20]. S’agissant du vieillissement, il a longtemps été perçu comme Parmi les tout premiers exemples de criblages phar-
spécifique des organismes pluricellulaires avant qu’il ne soit démontré macologiques à visée thérapeutique pour des mala-
que ce phénomène concernait également les microorganismes unicel- dies humaines s’appuyant sur la levure, se trouve une
lulaires, comme les bactéries ou la levure S. cerevisiae, cette dernière méthode de criblage de molécules antiprion [25, 26].
présentant clairement des éléments génétiques et physiologiques de L’hypothèse à l’origine de cette approche était que

REVUES
contrôle du vieillissement communs avec les eucaryotes supérieurs, les mécanismes de « prionisation » pouvaient être
tels que l’accumulation de cercles d’ADN ribosomique ou l’effet anti- conservés de la levure à l’homme.
vieillissement de la restriction calorique [21]. Ce pari s’est avéré validé puisque (➜) Voir la Synthèse
de Cécile Voisset et
Dans la lignée des tests d’analyse fonctionnelle, des modèles et des les petites molécules actives Marc Blondel, m/s
outils chémobiologiques fondés sur l’utilisation de la levure (prin- contre les prions de levure [PSI+] n° 12, décembre 2014,
cipalement S. cerevisiae, mais aussi S. pombe) et permettant des et [URE2] [61] (➜) dont cette page 1161
approches thérapeutiques innovantes, voient régulièrement le jour méthode a permis l’identification,
depuis une vingtaine d’années. Ces approches reposent le plus sou- se sont par la suite révélées actives contre le prion de
vent sur la mise au point d’un modèle levure présentant un phénotype mammifère in cellulo [25] mais également in vivo dans

SYNTHÈSE
pertinent pour une pathologie considérée (Figure 1). Pour ce type de un modèle murin de maladies à prion [27, 28]. Ainsi, non
modélisation, différents cas de figure sont envisageables : du plus seulement ce modèle fondé sur les deux prions les plus
simple et direct (existence d’un homologue fonctionnel), au plus étudiés de la levure permettait d’isoler des molécules
artificiel (expression hétérologue d’un gène humain ou de pathogène actives contre le prion de mammifère, mais il apportait
sans homologue chez la levure), en passant par des situations inter- en plus la preuve qu’au moins certains des mécanismes
médiaires (dans lesquelles un gène de levure sert de prototype). Ce de « prionisation » étaient conservés de la levure à
modèle peut alors servir pour différents criblages phénotypiques afin l’homme. Ces mécanismes conservés ont ensuite été
d’identifier des modificateurs capables de supprimer ou d’exacer- identifiés par une approche de criblage inverse qui a
ber le phénotype préalablement obtenu. Ces modificateurs peuvent montré que le domaine V du grand ARN ribosomique
être n’importe quels objets biologiques (gènes, anticorps, etc.) ou (ARNr 25S chez la levure, 28S chez l’homme) possédait
chimiques (petites molécules, oligonucléotides, etc.) qui pourront une activité chaperon de protéine, ciblée par les molé-
représenter des pistes pour développer des candidats-médicaments cules antiprions isolées chez la levure, et qui est impli-
et/ou des outils originaux pour sonder des mécanismes biologiques quée dans le maintien et la propagation des prions, au
et physiopathologiques nouveaux ou mal connus. Dans le cas de moins chez la levure [23, 29].
criblages pharmacologiques, puisqu’il s’agit de criblages phéno-
typiques, des criblages « inverses » nécessiteront d’être réalisés, Autres maladies neurologiques
afin d’identifier les cibles cellulaires des composés actifs isolés. Ils Un certain nombre de modèles levure ont été dévelop-
permettront non seulement d’appréhender le mécanisme d’action pés pour d’autres maladies neurodégénératives, telles
de la « touche » (ou hit en anglais) obtenue, mais aussi ses effets que les maladies de Parkinson [30] ou de Huntington
secondaires potentiels. Il existe de nombreuses façons de réaliser ces [31]. Dans ces deux exemples, respectivement l’α-
criblages inverses, notamment par des méthodes biochimiques, telles synucléine et la huntingtine mutée, deux protéines
que la chromatographie d’affinité sur drogues immobilisées [22, 23]. humaines dépourvues d’homologues chez S. cerevisiae,
Des méthodes génétiques utilisant la levure elle-même, telles que les ont été surexprimées chez la levure dans laquelle elles
cribles d’haplo-insuffisance3, de surexpression ou encore de létalité s’agrègent et induisent une toxicité qui emprunte des
synthétique4 (pour revue voir [24]), ainsi que le triple-hybride (voir mécanismes similaires à celle observée dans les neu-
plus loin), ont également été développées (Figure 2). Ces méthodes rones de patients. Ces modèles ont, là encore, permis
sont toutes automatisables et exploitent la puissance génétique d’identifier des molécules actives dans des modèles
du modèle levure. Ainsi, outre le fait qu’elles offrent la possibilité animaux pour ces pathologies chroniques, validant une
d’identifier d’éventuels candidats-médicaments, les approches de fois de plus ces approches de chémobiologie utilisant
chémobiologie qui utilisent la levure peuvent également permettre la levure. Ils ont également permis de découvrir de
la découverte de leurs cibles cellulaires, et donc potentiellement nouvelles voies, et donc de nouvelles cibles thérapeu-
définir de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter les maladies tiques, le plus souvent insoupçonnées, pour combattre
correspondantes. ces maladies pour lesquelles peu ou pas de traitements
efficaces n’ont encore été découverts. Ainsi, un cri-
blage génétique réalisé en utilisant un modèle levure
3
Situation dans laquelle le produit d’un seul allèle, bien qu’actif, est synthétisé en quantité insuffisante
pour permettre le fonctionnement optimal de la cellule.
de maladie de Huntington a identifié la kynurénine
4
La létalité synthétique est la mort cellulaire due à la déficience simultanée de 2 gènes. 2,3-monooxygénase, une enzyme conservée de la levure

m/s n° 5, vol. 36, mai 2020 ­507

 Figure 2. Méthodes fon-
dées sur la levure d’iden-
Criblage Méthodes fondées sur le dosage génique tification des cibles de
phénotypique (Croissance) composés (sondes) iso-
A Profilage lés dans des criblages
d’haplo- pharmacologiques phé-
insuffisance (–)
? notypiques. Quatre
méthodes génétiques
B Profilage de la de profilage de compo-
?
létalité (–) sés actifs sont présen-
synthétique
tées dans cette figure.
? A. Profilage de souches
? diploïdes haplo-insuf-
(+)
Cible(s) cellulaire(s) ? C Profilage par fisantes chacune pour
surexpression
un des ~ 2 000 gènes de
levure qui sont essen-
tiels (donc pour les-
Recherche quelles le dosage
de cibles génique pour le gène
cellulaires D Méthode 3H : utilisation de sondes fonctionnalisées
considéré est d’environ
Sonde fonctionnalisée avec bras espaceur 50 %). Cette méthode
permettant son couplage à une autre molécule
permet de repérer les
La sonde fonctionnalisée doit conserver son activité biologique
Identification de gènes essentiels dont
nouvelles cibles l’haplo-insuffisance
thérapeutiques Triple-hybride (3H)
conduit à une hypersen-
« Appât » « Proies » (banque d’ADNc fusionné à GAL4-AD)
DHFR-LexA-DBD sibilité au composé étu-
dié, donc codant pro-
LexA-DBD bablement des cibles de
ce dernier. B. Profilage
: Cible cellulaire : Méthotrexate
de la sonde de souches haploïdes
: Sonde
Criblage haut-débit chacune délétée d’un
Interaction HIS3 des ~ 4 000 gènes de
GAL4-AD levure non-essentiels
LexA-DBD
Gène rapporteur HIS3 (+) (donc pour lesquelles le
dosage génique pour le
gène considéré est de
0 %). Cette méthode
permet l’identification
de tous les gènes non-
essentiels dont l’inactivation totale conduit à une sensibilité accrue au composé d’intérêt, donc potentiellement impliqués dans la résis-
tance à ce dernier. C. Profilage de souches de levure surexprimant chacune un des ~ 6 000 gènes de levure (donc pour lesquelles le dosage
génique pour le gène considéré est >100 %). Cette méthode permet d’identifier tous les gènes dont la surexpression confère une résistance
au composé étudié et donc codant des cibles potentielles de ce dernier. Il est important de noter que ces trois méthodes sont fondées
sur la toxicité générale de la molécule considérée pour la levure (puisque le paramètre mesuré est l’effet du composé sur la croissance
des souches de levures), et donc sur l’inférence que son effet toxique implique les mêmes cibles cellulaires que sa capacité à modifier
le phénotype pathologique, ce qui n’est pas nécessairement le cas. D. L’approche triple-hybride (3H) est fondée sur la création d’une
chimère entre la sonde étudiée et une autre petite molécule dont la cible est connue (par exemple l’interaction méthotrexate/dihydro-
folate réductase, DHFR). Une étude structure-activité préalable est nécessaire afin de contrôler si la sonde fonctionnalisée est toujours
biologiquement active. L’approche triple-hybride est fondée sur l’utilisation de banques de levure exprimant des fusions protéiques entre
un domaine d’activation de la transcription (AD) et les protéines cibles à tester d’une part, et, d’autre part, la fusion entre la DHFR et un
domaine de liaison à l’ADN (DBD) d’un facteur de transcription. Les levures sont ensuite traitées avec la sonde fonctionnalisée. Seules les
levures exprimant la cible de la sonde pourront se développer sur un milieu dépourvu d’histidine (+), dans cet exemple de gène rapporteur.

­508 m/s n° 5, vol. 36, mai 2020

à l’homme, dont l’inactivation contrecarre la toxicité de la huntingtine par l’expression du gène homologue LmjIPBCS des para-
mutée, tant chez la levure que dans des cellules humaines ou dans sites du genre Leishmania, responsables de la leishma-
des modèles animaux [31]. Plus récemment, un modèle levure pour le niose, ou, comme contrôle, par le gène AUR1 lui-même.
retard mental lié à la trisomie 21 a été créé. Ce modèle est fondé sur Des composés affectant spécifiquement l’enzyme para-
la surexpression du gène CBS, qui fait partie, avec DYRK1a (dual spe- sitaire, donc a priori moins susceptible de présenter des
cificity tyrosine phosphorylation regulated kinase 1A)5, des principaux effets secondaires chez les patients, ont ainsi été isolés

REVUES
gènes du chromosome 21 dont la surexpression, du fait de la triplication [44]. Une telle approche avait déjà été utilisée pour
de ce chromosome, serait responsable du déficit cognitif observé chez rechercher des inhibiteurs affectant spécifiquement
les patients trisomiques. Il a permis d’identifier le disulfirame, un prin- l’une ou l’autre des kinases dépendant des cyclines,
cipe actif médicamenteux déjà administré depuis des décennies pour le CDK1 ou CDK2, humaines, en tirant profit du fait que
traitement de l’alcoolisme, qui s’est avéré capable de supprimer le phé- chacune d’entre elle est capable de complémenter l’ab-
notype lié à la surexpression de CBS chez la levure, mais également les sence de croissance d’une souche de levure délétée pour
troubles cognitifs de souris modèles pour la trisomie 21 [32], faisant le gène CDC28 qui code la principale CDK de la levure S.
de ce composé un candidat à un repositionnement thérapeutique pour cerevisiae [45]. Notons que de telles approches fon-
améliorer les troubles cognitifs des patients trisomiques. dées sur la complémentation d’un mutant de levure par

SYNTHÈSE
l’un ou l’autre gène homologue de parasites ou humain
Maladies métaboliques peuvent être multiplexées, de façon à identifier, en un
Des modèles levures pour différentes maladies métaboliques d’origine seul criblage, des molécules spécifiquement actives sur
génétique, en particulier mitochondriales, ont également été dévelop- la cible d’intérêt, tout en ne présentant pas (ou peu)
pés avec succès chez S. cerevisiae mais aussi chez S. pombe [33-35]. d’activité sur un gène proche dont l’inactivation pourrait
La levure S. cerevisiae s’avère en effet particulièrement pertinente induire des effets secondaires qui limiteraient l’applica-
pour modéliser les maladies mitochondriales liées à des mutations tion thérapeutique de tels composés.
dans l’ADN de cet organite, en raison de la possibilité de réaliser de la Tous ces exemples ne représentent qu’une fraction
mutagénèse dirigée sur le génome mitochondrial du champignon [36]. minime de toutes les utilisations réalisées ou possibles
Des approches de criblage inverse ont, là encore, permis d’identifier de la levure comme modèle pour des maladies humaines.
les cibles de certaines molécules potentiellement actives contre ces Ils illustrent néanmoins la polyvalence de tels modèles
maladies [37]. et leur intérêt, dès lors qu’ils présentent un phéno-
type pertinent par rapport à la pathologie étudiée : le
Infections virales et parasitaires fait de pouvoir réaliser, le plus souvent en parallèle,
La levure a également été très utilisée pour explorer le monde des virus des criblages pharmacologiques et génétiques qui se
et leur impact sur les espèces animales et végétales (pour revue, voir nourrissent mutuellement. Il faut toutefois garder en
[38]), en particulier dans le domaine des cancers viro-induits, notam- tête les limites de la levure qui ne représente qu’un
ment liés à l’oncovirus d’Epstein-Barr (EBV) (pour revue, voir [39]). modèle eucaryote simplifié (notamment du fait de son
Ainsi a été développé un modèle levure reproduisant le mécanisme qui unicellularité). Il est ainsi nécessaire de valider tous
permet à l’EBV d’échapper au système immunitaire [40, 41]. Ce modèle les modificateurs de phénotypes identifiés dans des
a non seulement permis d’isoler, grâce à un criblage pharmacolo- systèmes eucaryotes supérieurs, tels que des cultures
gique, des molécules candidates permettant au système immunitaire en deux ou trois dimensions de cellules de mammifères,
de cibler les cancers liés à ce virus [41], mais également, grâce à un ou dans des modèles animaux, lorsque ceux-ci existent.
criblage génétique, des gènes de la cellule infectée impliqués dans la Enfin, la possibilité de pouvoir réaliser, relativement
furtivité d’EBV au système immunitaire [42]. De la sorte, a été identi- aisément, des criblages inverses (notamment par des
fiée la nucléoline, une protéine humaine très conservée chez la levure, approches génétiques utilisant la levure) pour identifier
qui représente une nouvelle cible moléculaire potentielle pour le trai- les cibles des molécules actives, représente un autre
tement des cancers liés à l’EBV. Cette cible a elle-même permis d’isoler argument fort en faveur d’approches de chémobiologie
de nouvelles molécules actives [42, 43]. intégrée fondées sur la levure (Figure 2).
Un autre type d’approche très fructueuse fait appel à l’expression de
cibles thérapeutiques (humaines ou parasitaires par exemple) dans une La levure : un outil pour la recherche
souche de levure délétée du gène homologue et complémentée par le thérapeutique
(ou les) gène(s) hétérologue(s). Citons pour exemple l’utilisation d’une
souche de levure délétée de son gène AUR1 (aureobasidin resistance) Si la levure offre des modèles pertinents pour de nom-
codant l’inositol phosphorylcéramide synthase (IPS) et complémentée breuses pathologies humaines, elle est également très
utilisée en tant qu’outil au service de la recherche
5
Qui code une kinase impliquée dans le développement du système nerveux. thérapeutique. Elle est couramment exploitée pour la

m/s n° 5, vol. 36, mai 2020 ­509

 production de molécules d’intérêt, que ce soient des protéines recom- et post-génomique [51]. La méthode double-hybride
binantes ou différentes molécules d’intérêt prophylactique ou thé- transcriptionnelle et ses nombreuses évolutions offrent
rapeutique, telles que des vaccins, l’hormone de croissance humaine de nombreuses applications à la recherche thérapeu-
ou encore l’hydrocortisone. La production de cette dernière molécule tique (Figure 3) (pour revue, voir [52]). La découverte
d’intérêt majeur pour l’industrie pharmaceutique mais très compliquée facilitée de partenaires d’interaction de protéines,
à synthétiser, dans une souche de levure S. cerevisiae multi-modifiée dont le dysfonctionnement provoque des pathologies,
génétiquement et à partir d’un substrat peu onéreux (le glucose ou permet notamment d’identifier de nouvelles cibles thé-
l’éthanol), représente un magnifique et spectaculaire exemple de rapeutiques potentielles, qu’il s’agisse du partenaire de
l’incroyable polyvalence de la levure [46]. Dans le domaine des vac- l’interaction ou de l’interaction elle-même. Des ligands
cins, non seulement la levure est utilisée depuis longtemps pour la protéiques combinatoires (tels que des aptamères
production de protéines antigéniques, mais elle est également, depuis peptidiques), sélectionnés par double-hybride pour leur
peu, utilisée comme adjuvant du fait de la forte immunogénicité de capacité à reconnaître spécifiquement une protéine
certains sucres de sa paroi, absents chez les mammifères. Certaines cible donnée, représentent des outils de choix permet-
approches très récentes visent ainsi à combiner les deux avantages de tant de valider des cibles thérapeutiques. Ils intro-
la levure (polyvalence pour la production de protéines recombinantes duisent en effet des perturbations similaires à celles
antigéniques et immunogénicité inhérente de sa paroi) en l’utilisant produites par des petites molécules thérapeutiques,
directement (sous forme vivante ou inactivée par chauffage) comme contrairement aux approches de génétique inverse plus
vaccin pour un usage, pour le moment, uniquement vétérinaire (pour communément utilisées. Ces molécules combinatoires
revue, voir [47]). Toutes ces approches dans lesquelles la levure est peuvent également guider la découverte de petites
utilisée comme « usine » de production de molécules thérapeutiques molécules bioactives [53].
sont d’autant plus facilitées que la levure appartient à la catégorie De nombreuses variantes de la méthode double-hybride
des organismes inoffensifs, dits GRAS (generally recognized as safe), transcriptionnelle ont permis le développement d’essais
un concept créé en 1958 par la FDA (food and drug administration) de criblage à haut débit dans le but de découvrir des
américaine [48]. Enfin, notons que l’utilisation de la levure en tant petites molécules inhibitrices d’IPP. Ces variantes
qu’outil a régulièrement été enrichie par les découvertes fondamen- portent essentiellement sur la mise en œuvre de gènes
tales obtenues grâce à son utilisation en tant que modèle. C’est, par rapporteurs différents, codant, par exemple, des luci-
exemple, le cas pour la production de protéines recombinantes hété- férases, qui permettent de suivre les levures dans
rologues dont le rendement peut être grandement amélioré par des lesquelles a eu lieu l’interaction, ou des protéines
mutations altérant le ratio entre les deux sous-unités du ribosome toxiques, ce qui permet une sélection positive des inhi-
[49]. biteurs d’IPP (pour revue, voir [52]). Des méthodes de
type « triple-hybride » ont été développées afin d’iden-
La levure : un outil pour la recherche sur les interactions tifier les cibles de petites molécules bioactives (voir la
protéine-protéine méthode de criblage inverse présentée sur la Figure 2).
Le principe consiste à coupler de façon covalente la
Terminons par l’un des principaux apports de la levure en tant qu’outil molécule d’intérêt à une autre molécule capable de
pour l’étude des interactions protéine-protéine (IPP), notamment reconnaître une protéine « appât ». Des banques d’ADN
grâce aux méthodes dites de double-hybride ou de bioluminescence. complémentaires, exprimés comme « proies », sont
Les fondements de la méthode double-hybride ont été établis en 1989 alors criblées afin d’identifier les cibles potentielles du
par la démonstration qu’une IPP pouvait être détectée en co-expri- composé exposé par l’« appât » [52].
mant dans la levure deux protéines chimériques (ou hybrides), obte- L’approche double-hybride s’avère également très puis-
nues en fusionnant aux deux partenaires participant à l’interaction, sante pour caractériser des formes mutantes de protéines
des modules impliqués dans la transcription génique : un domaine associées à des pathologies humaines. Ainsi a récem-
de liaison à l’ADN, pour « l’appât », et un domaine activateur de ment été développé l’« edgotypage », une approche qui
transcription, pour « la proie ». L’interaction entre les deux parte- consiste à déterminer la capacité d’une protéine mutée
naires protéiques reconstitue alors un facteur de transcription actif, à interagir, ou non, avec l’ensemble des partenaires
capable de transcrire un gène rapporteur conférant à la levure un d’interaction connus pour la forme sauvage de la pro-
phénotype facilement détectable [50]. La méthode double-hybride téine. La pertinence de cette approche repose sur le fait
a rapidement connu un succès et des évolutions considérables. Elle que : 1) plus de la moitié des mutations responsables de
représente encore aujourd’hui une approche de premier choix pour pathologies mendéliennes sont des mutations faux-sens
découvrir et caractériser des interactions protéiques. Il n’est pas exa- (provoquant des substitutions d’acides aminés), et une
géré de considérer que le double-hybride compte parmi les méthodes grande proportion d’autres types de mutations peuvent
ayant produit le plus fort impact sur la biologie de l’ère génomique permettre l’expression de formes protéiques tronquées ;

­510 m/s n° 5, vol. 36, mai 2020

 Figure 3. Le double-hybride (2H)
A et ses évolutions au service de la
Y AD recherche thérapeutique. A. Repré-
IDENTIFICATION DE CIBLES X CRIBLAGES DE BANQUES D’ADNc
THÉRAPEUTIQUES DBD → DÉCOUVERTE D’IPP sentation schématique du 2H clas-
rapporteur sique qui permet de découvrir de nou-
velles interactions protéine-protéine
B (IPP) par criblages systématiques

REVUES
AP AD CRIBLAGES DE BANQUES de banques d’ADN complémentaire
VALIDATION DE CIBLES X D’APTAMÈRES PEPTIDIQUES
THÉRAPEUTIQUES DBD → LIGANDS SPÉCIFIQUES (ADNc) (DBD : domaine de liaison
rapporteur
à l’ADN ; AD : domaine d’activation
de la transcription). B. Le 2H permet
C d’identifier des aptamères pepti-
Y AD
CRIBLAGES DE CHIMIOTHÈQUES diques (AP) interagissant spécifique-
DÉCOUVERTE CONTRE UN PHÉNOTYPE 2H
X
DE CANDIDATS → INHIBITEURS D’IPP ment avec une protéine d’intérêt, qui
THÉRAPEUTIQUES DBD
rapporteur permettent parfois de la valider en

SYNTHÈSE
tant que cible thérapeutique. C. Le 2H
permet également de rechercher des
D
inhibiteurs d’IPP sur la base de leur
CRIBLAGES 3H DE
IDENTIFICATION BANQUES d’ADNc capacité à empêcher la formation
DE CIBLES DE MOLÉCULES Figure 2 du complexe 2H. D. le triple-hybride
→ CIBLES CANDIDATES
THÉRAPEUTIQUES
(3H) permet d’identifier des cibles
potentielles d’un composé actif. E.
E L’edgotypage, qui est souvent basé
CARACTÉRISATION sur le 2H, permet, au sein d’un réseau
EDGOTYPAGE PAR ESSAIS 2H
DE MUTATIONS → IDENTIFICATION D’IPP d’IPP, l’identification des interactions
PATHOGÈNES PERTURBÉES (edges) spécifiquement affectées par
des mutations pathogènes.

2) différentes mutations affectant un gène donné peuvent produire l’enzyme donneuse d’énergie, Renilla Luciférase, RLuc,
des effets pathologiques très différents. Une étude magistrale faisant et la Green Fluorescent Protein, GFP) ont permis d’ouvrir
appel à la méthode double-hybride a été menée sur près de 3 000 formes le champ d’application du BRET à l’étude des IPP. Dans
mutantes faux-sens concernant plus de 1 100 gènes associés à des cette méthode, l’utilisation d’une enzyme « donneuse »
pathologies mendéliennes variées. Les deux tiers de ces mutations ont d’énergie qui est transférée par résonnance à un fluoro-
présenté un edgotype perturbé (c’est-à-dire présentant des altérations phore « accepteur » spatialement proche (moins de 10
d’interaction avec les partenaires de la forme sauvage), de façon seule- nm), évite les conséquences néfastes de l’excitation du
ment partielle pour la moitié d’entre elles [54]. De telles analyses per- donneur qui est utilisée dans les méthodes FRET. Le don-
mettent ainsi de mieux comprendre les effets biologiques de certaines neur et l’accepteur sont fusionnés aux deux protéines
mutations, ce qui pourrait conduire à une meilleure prise en charge des d’intérêt dont l’interaction peut ainsi être détectée.
patients concernés. C’est en 1999 que ce potentiel a, pour la première fois,
L’utilisation du BRET (transfert d’énergie de bioluminescence par réso- été exploité pour l’étude de protéines clés du rythme
nance) a également été développée chez la levure pour y étudier des circadien chez la cyanobactérie Synechococcus sp. (pour
IPP. Le BRET dérive des méthodes fondées sur le transfert de fluores- revue voir [55]). Le BRET sera mis en œuvre l’année
cence (appelées FRET) initiées par Theodor Förster en 1946. Il s’agit d’un suivante dans des cellules de mammifères pour l’étude
phénomène de bioluminescence naturelle, telle que celle produite par de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) [55]. Le
la pensée de mer (Renilla reniformis)6. L’identification puis le clonage BRET a ensuite été employé pour mettre en évidence
des acteurs moléculaires à l’origine de cette luminescence (tels que des molécules d’intérêt thérapeutique par criblage (par
exemples des ligands de récepteurs de neuropeptides
6
La bioluminescence est la production active de lumière par des organismes vivants. La luciférase est à
Y) [55]. C’est en 2006 que le BRET est utilisé pour la
l’origine de la bioluminescence suite à l’activation d’un ensemble de processus biochimiques. première fois chez la levure pour caractériser l’oligo-

m/s n° 5, vol. 36, mai 2020 ­511

 mérisation du RCPG de la phéromone a [56]. En tenant compte des RÉFÉRENCES
avantages qu’offre le champignon, le BRET a ensuite été utilisé pour
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­512 m/s n° 5, vol. 36, mai 2020

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