II.2.

3- Analyses phytochimiques

II.2.3.1- Analyse phytochimique qualitative

La phytochimie qualitative consiste en la mise en évidence des différentes classes de

composés bioactifs présents dans les extraits de plantes et ayant un intérêt pharmacologique
par la réalisation de réactions chimiques caractéristiques.

 Mise en évidence des phénols

Dans une solution de P. soyauxii (0,1 g de l’extrait + 1 mL d’eau distillée) ont été
ajoutées quelques gouttes de chlorure de fer 5 %. La formation d’une solution vert foncé du
mélange obtenu indique la présence des phénols (Mir et al., 2013).

 Mise en évidence des flavonoïdes

Dans une solution (0,1 g de l’extrait aqueux de P. soyauxii + 1 mL d’eau distillée) a été
ajouté 1 mL d’ammoniac dilué à 1%. Après filtration, 0,2 mL d’acide sulfurique concentré a
été ajouté à cette solution. La formation d’une coloration jaune qui disparait progressivement
indique la présence des flavonoïdes (Ayoola et al., 2008 ; Mir et al., 2013).

 Mise en évidence des saponines

L’extrait aqueux (0,1 g) a été dissous dans 1 mL d’eau distillée. La solution a été
vigoureusement agitée. La formation d’une mousse persistance au-delà de 10 minutes était le
signe de la présence des saponines dans l’extrait.

 Mise en évidence des glucosides

Ce test est basé sur la réaction de Keller-Kiliani. A 1 mL de l’extrait (0,1 g d’extrait de

P. soyauxii dissous dans 1 mL d’eau distillée), ont été ajoutés 0,4 mL d’acide acétique glacial
contenant une goutte de FeCl3 concentré à 1 % et 0,2 mL d’acide sulfurique. La présence des
glucosides est confirmée par la formation de deux phases, une colorée en brun rouge (acide
acétique) et la deuxième en bleu-vert (acide sulfurique) (Edeoga et al., 2005).

 Mise en évidence des tanins

Une masse de 0,1 g d’extrait de P. soyauxii a été dissoute dans 2 mL d’eau distillée. La
solution a été ensuite filtrée. Après ajout 2 à 3 gouttes de solution de chlorure ferrique FeCl 3 à
2%, l’observation d’une coloration vert-marron ou bleue-noir indique la présence des tanins
(Karumi et al., 2004).
  Mise en évidence des Alcaloïdes

Pour mettre en évidence les alcaloïdes dans un extrait, 0,1 g de cet extrait a été dissous
dans 10 mL d’alcool acide puis bouilli et filtré. A 5 mL de filtrat ont été ajoutés 2 mL de
d’ammoniac dilué, puis 5 mL de chloroforme ont été ajoutés doucement pour extraire la base
alcaloïde. La couche de chloroforme est extraite avec 10 mL d’acide acétique. La formation
d’un précipité rouge brun avec le réactif de Draggendorff est la marque de la présence des
alcaloïdes (Ayoola et al., 2008).

 Mise en évidence des stéroïdes

Deux cents milligrammes d’extrait ont été dissous dans 10 mL de chloroforme. Deux
millilitres d’acide acétique y ont été introduits et l’ensemble a été refroidi dans un bain de
glace. Quelques gouttes d’acide sulfurique concentré ont été ajoutées et la formation d’un
anneau bleu gris marquait la présence des stéroïdes (Sofowora, 1993).

 Mise en évidence des triterpènes

A 10 mL d’une solution d’extrait concentrée à 10 mg/mL, 2 mL de chloroforme ont été

ajoutés et l’ensemble a été homogénéisé. Trois millilitres d’acide sulfurique ont ensuite été
ajoutés afin de former deux phases. La formation d’une interface brune rougeâtre marquait la
présence des terpènoïdes (Trease et Evans, 1989).

 Mise en évidence des quinones

A 2 ml d’extrait de P. soyauxii, 2 à 3 gouttes de NaOH 10 % ont été ajoutées. Le virage

de la phase aqueuse au rouge traduisait la présence des quinones dans la solution (Dohou et
al., 2003).

 Mise en évidence des anthocyanes

Deux à trois gouttes d’ammoniac dilué ont été ajoutées dans 2 mL d’extrait aqueux de
P. soyauxii et l’apparition d’une coloration bleue traduisait la présence des anthocyanes
(Mamyrbékova-békro et al., 2008).

II.2.3.2- Analyse UHPLC-MS de l'extrait aqueux du duramen de Pterocarpus soyauxii

L'analyse UHPLC-MS a été utilisée pour identifier le profil phytochimique de l'extrait

de P. soyauxii dans une tentative de standardisation. Pour obtenir des spectres de masse haute
résolution de l'extrait, un spectromètre (QTOF Bruker, Allemagne) équipé d'une source
d'ionisation par électronébulisation chauffée (HESI) a été utilisé. Le spectromètre fonctionne
en mode positif (gamme de masse : 100-1500, avec une vitesse de balayage de 1,00 Hz) avec
un contrôle automatique du gain pour fournir des mesures de masse de haute précision avec
une déviation de 0,40 ppm en utilisant le formate de sodium comme calibrant. Une tension de
pulvérisation de 4,5 kV et une température capillaire de 200 °C ont été utilisées pour les
analyses. De l'azote a été utilisé comme gaz de gaine (10 L/min). Le spectromètre était attaché
à un système UHPLC Ultimate 3000 (Thermo Fisher, Allemagne) composé d'une pompe LC,
d'un détecteur à réseau de diodes (DAD) (λ : 190-600 nm), d'un échantillonneur automatique
(volume d'injection 10 µL) et d'un four à colonne (40°C). La séparation a été réalisée à l'aide
d'une colonne Synergi MAXRP 100A (50 x 2 mm, taille des particules 2.5 µ) avec un
gradient H2O (+0.1 % HCOOH) (A)/acétonitrile (+0.1 % HCOOH) (B) (débit 500 µL/min,
volume d'injection 5 µL). L'échantillon a été analysé en utilisant un programme de gradient
comme suit : 95 % A isocratique pendant 1,5 min, gradient linéaire jusqu'à 100 % B sur 6
min, après 100 % B isocratique pendant 2 min, le système est revenu à sa condition initiale
(90 % A) en 1 min, et a été équilibré pendant 1 min. Sur la base de la masse des composés
précédemment identifiés dans le genre Pterocarpus, l'identification des composés a été
effectuée.

II.2.3.3- Analyse phytochimique quantitative

II.[Link]- Dosage des flavonoïdes

La teneur en flavonoïdes dans l’extrait de P. soyauxii a été déterminée par la méthode

décrite par Zhishen et al. (1999). Pour l’analyse, l’extrait aqueux du duramen de P. soyauxii a
été bien homogénéisé avec un solvant d’extraction préparé avec le mélange méthanol-eau
distillée-acide acétique (140 : 50 : 10, v/v). Le mélange a été filtré à l’aide du papier filtre
Wattman n°3. A 0,2 mL du filtrat (2 mg/mL), 1 mL du réactif de chlorure d’aluminium
(AlCl3) (formé de 133 mg des cristaux de chlorure d’aluminium et 400 mg de cristaux
d’acétate de sodium dissous dans 100 mL du solvant d’extraction) a été ajouté et l’ensemble a
été bien mélangé à l’aide du vortex et l’absorbance a été lue contre le blanc à 430 nm. Le
blanc a été préparé avec la solution de chlorure d’aluminium et l’eau distillée. La quantité de
flavonoïde a été calculée à l’aide d’une solution standard de quercétine (1 mg/mL) et les
résultats ont été exprimés en mg équivalent de quercétine par gramme de matière sèche, en se
référant à la courbe d’étalonnage de la figure 19.
 1.4

1.2

Densité optique (430 nm)

f(x) = 4.121146953405 x + 0.172430555555556
1
R² = 0.995226780608981

0.8

0.6

0.4

0.2

0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3

Concentration quercétine (mg/ml)

Figure 1: Courbe d’étalonnage de la quercétine.

La concentration de quercétine a été déterminée à partir de l’équation de droite y =
4,1211x. y correspondant à l’absorbance de l’échantillon et x correspondant à concentration
de quercétine en mg/mL à déterminer pour un échantillon.
II.[Link]- Dosage des polyphénols

Les polyphénols totaux ont été évalués suivant la méthode spectrophotométrique

utilisant le réactif de Folin-Ciocalteu décrite par Chun et al. (2003). Environ 0,2 mL d’extrait
aqueux de P. soyauxii (2 mg/mL) a été introduit dans un tube à essai, ensuite 1,2 mL d’eau
distillée et 0,2 mL de réactif de Folin-Ciocalteu (10%) ont été ajoutés. Après 3 min de repos,
0,4 mL de carbonate de sodium (Na2CO3 7,5%) ont ajoutés au mélange. Les tubes ont été bien
agités à l’aide d’un vortex, et incubés pendant 20 minutes dans un bain-marie à 40°C et
l’absorbance a été lue contre le blanc à 760 nm. L’étalonnage a été réalisé à l’aide d’une
solution aqueuse fraîchement préparée d’acide gallique (0,2 mg/mL). La quantité de
polyphénols a été exprimée en mg équivalent acide gallique par gramme de matière sèche, en
se référant à la courbe d’étalonnage ci-dessous (Figure 20).
 0.9
0.8 f(x) = 4.84278136200716 x + 0.252027777777778
R² = 0.995871406533139

Densité optique (760 nm)

0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14

Concentration acide gallique (mg/ml)

Figure 2: Courbe d’étalonnage de l’acide gallique.

La concentration en acide gallique a été déterminée à partir de l’équation de droite y =

4,8428x. y correspondant à l’absorbance de l’échantillon et x correspondant à concentration
d’acide gallique en mg/mL à déterminer pour un échantillon.
II.[Link]- Dosage des tanins

Les tannins ont été déterminés suivant la méthode spectrophotométrique utilisant la

vanilline acidifiée et l’acide tannique comme standard Broadhurst et al. (1978). Un volume de
1 mL d’extrait de P. soyauxii (2 mg/ml) a été introduit dans des tubes à essai recouverts de
papier aluminium pour exclure la lumière suivi de l’ajout de 3 mL d’une solution fraîchement
préparée de vanilline 4% dans l’éthanol (w/v). Après agitation, 1 mL d’acide chlorhydrique
concentré a été ajouté dans chaque tube à essai qui, par la suite a été laissé au repos à
température ambiante pendant 15 min et l’absorbance a été lue à 500 nm contre le blanc.
L’acide tannique (1 mg/mL) a parallèlement été préparé comme l’échantillon pour servir de
référence et pour tracer la courbe d’étalonnage. La teneur en tannin a été exprimée en mg
équivalent acide tannique par gramme de matière sèche utilisant la courbe d’étalonnage de
l’acide tannique (Figure 21).
 0.3

f(x) = 0.240564274293299 x + 0.034756704980843

Densité optique (500 nm)

0.25
R² = 0.997737766370662

0.2

0.15

0.1

0.05

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Concentration acide tannique (mg/ml)

Figure 3: Courbe d’étalonnage de l’acide tannique.

La concentration en acide tannique a été déterminée à partir de l’équation de droite y =

0,2406x. y correspondant à l’absorbance de l’échantillon et x correspondant à concentration
d’acide tannique en mg/mL à déterminer pour un échantillon.
II.2.3.4- Evaluation in vitro de l’activité antioxydante de P. soyauxii

II.[Link]- Détermination de l’activité antiradicalaire de P. soyauxii sur les radicaux

DPPH (1, 1,-diphenyl-2-picrylhydrazyl)

 Principe

Le principe est basé sur la capacité des composés des extraits à fournir des protons aux
radicaux libres 2, 2-Diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Le radical DPPH est instable et
lorsqu'il réagit avec un composé antioxydant, qui peut donner des ions hydrogène, il est réduit
et devient stable. Ce pouvoir réducteur de l'extrait est révélé par un changement de couleur du
violet au jaune. Une diminution de l'absorbance à 517 nm est proportionnelle au potentiel
antioxydant des extraits.

Antioxydant

Extrait de P. soyauxii

Radical DPPH DPPH Réduit

  Préparation des solutions
 Solution mère de l'extrait brut
Les solutions mères de l'extrait brut de P. soyauxii ont été préparées à 2 mg/ml. Pour
cela, 2 mg de l'extrait ont été dissous dans 1 ml de méthanol et homogénéisés.
 Solution de DPPH
Le DPPH a été préparé dans du méthanol à une concentration de 0,02%. Pour cela, 20
mg de DPPH ont été complètement dissous dans 1 L de méthanol à 100%. La solution a été
conservée dans un flacon sombre à l'abri de la lumière et de toute source de chaleur avant
utilisation.
 Mode opératoire
Les activités de piégeage des radicaux libres des extraits de P. soyauxii ont été évaluées
en utilisant l'analyse du DPPH comme décrit par Mensor et al. (2001).
Les activités de piégeage des radicaux de l'extrait brut ont été évaluées par
spectrophotomètre en utilisant le radical libre 1,1-diphényl-2- picrylhydrazyl (DPPH).
Lorsque le DPPH réagit avec un composé antioxydant, qui peut donner de l'hydrogène, il est
réduit. Les changements de couleur ont été mesurés à une longueur d'onde de 517 nm sous un
spectrophotomètre à lumière UV/Visible (Infinite M200, TECAN, Suisse). L'extrait (1000
µg/mL) a été dilué deux fois en série avec du méthanol. Cinquante microlitres de l'extrait
dilué (1000 µg/mL) dans du méthanol ont été mélangés avec 150 µL de solution
méthanolique de 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH) à 0,02%, ce qui a donné une
concentration finale d'extrait allant de 250 à 1,9531 µg/mL (250, 125, 62,5, 31,25, 15,625,
7,8125, 3,9062 et 1,9531µg/mL). Après 30 min d'incubation dans l'obscurité à température
ambiante, la densité optique a été mesurée. L'acide ascorbique (Vitamine C) a été utilisé
comme contrôle positif. Chaque essai a été effectué en trois exemplaires et les résultats ont été
enregistrés sous forme de moyenne ± écart-type (ET). L’activité antioxydante de l’extrait de
plante a été exprimée en pourcentage d’inhibition selon la relation ci-dessous :
(|contrôle|−|échatillon|)
% Inhibition= x 100
|contrôle|
Les pourcentages de piégeage des radicaux ont été tracés en fonction des valeurs
logarithmiques de la concentration des échantillons testés et une courbe de régression linéaire
a été établie afin de calculer la CI 50, qui est la concentration d'échantillon nécessaire pour
réduire de 50 % le radical DPPH libre total.
II.[Link]- Détermination de l’activité antiradicalaire de P. soyauxii sur radicaux acide
2,2’-azino-bis-(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) (ABTS)
Ce test a été réalisé en modifiant légèrement la méthode décrite par Aadil et al, 2014.

 Principe

Le radical ABTS+ est formé par la perte d'un électron de l'atome d'azote de l'ABTS en
présence de permanganate de potassium (KMnO 4) ou de persulfate de potassium (K 2S2O8). Le
principe repose sur la capacité des composés contenus dans les extraits à réduire le radical
bleu-vert 2, 2'-azino bis (acide 3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) (ABTS +) en ABTS
incolore en donnant son H+. Ce dosage permet de mesurer la capacité antioxydante des
composés lipophiles et hydrophiles de l'échantillon (Iqbal et al, 2015). La décoloration du
radical mesurée par spectrophotométrie à 734 nm est proportionnelle à la concentration
antioxydante des extraits.

Antioxydant

Extrait de P. soyauxii

 Préparation des solutions

 Solution d'ABTS
Le radical ABTS+ a été préparé en mélangeant des volumes égaux de 4,9 mM KMnO 4 et
une solution mère de 7 mM ABTS. Le mélange obtenu a été conservé dans un flacon fermé à
l'abri de la lumière et de toute source de chaleur pendant 15 heures avant utilisation. La
solution a été diluée 20 fois avec de l'eau distillée.
 Mode opératoire
La méthode ABTS est connue pour être une méthode rapide pour la détermination de
l'activité antioxydante et pourrait être un outil utile pour cribler des échantillons afin d'obtenir
une teneur élevée en antioxydants naturels (Re et al., 1999). Les activités de piégeage des
radicaux de l'extrait brut ont été évaluées par spectrophotométrie en utilisant le radical libre de
l'acide 2,2'-azino-bis (3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) (ABTS). Lorsque l'ABTS réagit
avec un composé antioxydant, qui peut donner de l'hydrogène, il est réduit. Les changements
de couleur ont été mesurés à 734 nm sous un spectrophotomètre à lumière UV/Visible
(Infinite M200 (TECAN, Suisse)). Du méthanol pur a été utilisé pour calibrer le compteur.
L'extrait (1000 µg/mL) a été dilué deux fois en série avec du méthanol. Vingt-cinq microlitres
de l'extrait dilué ont été mélangés avec soixante-quinze µl de solution méthanolique d'acide
2,2'-azino-bis (3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) (ABTS), pour obtenir une concentration
finale de l'extrait comprise entre 250 et 1,9531 µg/ml (250, 125, 62,5, 31,25, 15,625, 7,8125,
3,9062 et 1,9531 µg/ml). Après 30 min d'incubation dans l'obscurité à température ambiante,
les densités optiques ont été mesurées à 734 nm. L'acide ascorbique (Vitamine C) a été utilisé
comme contrôle. Chaque essai a été effectué en trois exemplaires et les résultats, enregistrés
sous forme de moyenne ± l'écart-type (ET) des trois résultats, ont été présentés sous forme de
tableau. Les résultats ont été exprimés en pourcentage d’inhibition et calculé selon la formule
suivante :

(|contrôle|−|échatillon|)
% Inhibition= x 100
|contrôle|
Les pourcentages de piégeage des radicaux ont été tracés en fonction des valeurs
logarithmiques de la concentration des échantillons testés et une courbe de régression linéaire
a été établie afin de calculer la CI 50, qui est la concentration d'échantillon nécessaire pour
diminuer de 50 % le radical ABTS libre total.
II.[Link]- Détermination de l’activité antiradicalaire de P. soyauxii sur les radicaux
Ferric-Reducing Antioxidant Power (FRAP)
Le test a été réalisé selon la méthode décrite par Benzie et Strain. (1996) avec de légères
modifications.

 Principe

Le principe est basé sur la réduction de Fe 3+ en Fe2+ par les composants de l'extrait, qui
en présence d'ortho-phénanthroline forme un complexe de couleur brune ou rouge-orange. Le
complexe absorbe à 505 nm et l'intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité de
Fe3+ convertie par l'extrait.
  Préparation des solutions
 Solution de Fe3+ :

Elle a été préparée à 1,2 mg/ml. Pour cela, 1,2 mg de FeCl 3 a été dissous dans 1mL
d'eau distillée dans un tube falcon.

 Ortho-Phenantroline :

Un pourcentage de 0,2% d'ortho-phénanthroline a été utilisé pour doser les ions Fe 2+

formés. Pour cela, 200 mg de la poudre ont été pesés et dissous dans 100 µl de méthanol.

 Solution d'hydroxylamine (NH2OH) :

Elle a été préparée à une concentration de 3,3 µg/ml. NH 2OH est un composé qui réduit
Fe3+ en Fe2+. Elle est préparée pour fournir la quantité totale de Fe 2+ qui devrait normalement
être produite par les extraits. La quantité d'hydroxylamine doit être deux fois supérieure à
celle de l'ion Fe3+, pour assurer une réduction complète en Fe2+.

 Mode opératoire

Brièvement, les extraits ont d'abord été dissous comme pour le test DPPH. 25 µL de
chaque dilution ont été introduits dans une nouvelle microplaque et 25 µL de solution de Fe 3+
à 1,2 mg/mL ont été ajoutés. Les plaques ont été pré-incubées pendant 15 minutes à
température ambiante. Après ce temps, 50 µL d'ortho-phénanthroline à 0,2% ont été ajoutés
pour obtenir des concentrations finales d'extrait de 250, 125, 62,5, 31,25, 15,625, 7,8125,
3,90625 et 1,95325 µg/mL. Les mélanges réactionnels ont été incubés pendant 15 minutes à
température ambiante, après quoi l'absorbance a été mesurée à 505 nm sous
spectrophotomètre UV/Visible (Infinite M200 TECAN, Suisse) par rapport au blanc
(composé de 25 µL de méthanol + 25 µL de Fe 3+ + 50 µL d'ortho-phénanthroline). L'acide
ascorbique (Vitamine C) a été utilisé comme contrôle positif. Le test a été réalisé en triplicata.