Expression des transgènes chez les plantes
L'expression d'un transgène dépend de la présence d'un promoteur choisi pour permettre
sa transcription afin de répondre aux tâches voulues comme:
1/ Synthèse plus ou moins accentuée d'une protéine,
2/ Expression exclusive voulue au niveau d'un organe précis de la plante (feuille, racine, graines…)
et Expression lorsque des conditions environnementales précises (présence de parasites,
température, …) sont réunies. Ce sont des régulations spatio-temporelles strictes.
plan
Visualisation de l'expression des transgènes à l'aide des gènes rapporteurs dans la
transgénèse des plantes. Exemples de gènes rapporteurs dans la transgénèse des
plantes
---- Gène LacZ codant pour la béta-galactosidase de la bactérie E coli.
---- Gène codant pour la GFP (green fluorescent protéine)
---- Gène gus (béta-glucuronidase)
- Régulation de l'expression des gènes
- Fusion transcription elle et fusion traductionnelle
- Gènes rapporteurs. Fusion transcriptionnelle et fusion traductionnelle
Visualisation de l'expression des transgènes chez les plantes régénérées à l'aide
des gènes rapporteurs dans la transgénèse des plantes
Comme pour le gène de sélection (gènes marqueurs), le choix du gène rapporteur doit se
faire en fonction de la nature du matériel végétal. En effet, certaines plantes ont des
activités endogènes qui sont capables de masquer l’expression d’un gène rapporteur.
Après transformation et régénération d’une plante, on peut distinguer 3 cas, dont
1/ La plante régénérée n’est pas transformée, mais naturellement résistante à l’agent de
sélection,
2/ L’ADN-T peut avoir été transféré partiellement. Le gène de résistance à l’antibiotique
est présent, mais pas le gène rapporteur (ou en partie)
3/ Les 2 gènes ont été transférés. Certains gènes-rapporteurs peuvent parfois être utilisés
comme gènes marqueurs.
- Gène LacZ codant pour la béta-
galactosidase de la bactérie E coli.
L'activité enzymatique de la béta-
galactosidase (hydrolyse des béta-
galactosides) est mesurée avec un
substrat (X-Gal = 5-bromo-4-chloro-3-
indolyl-béta-D-galactopyranoside) dont
l'hydrolyse donne un produit coloré bleu.
X-Gal + H2O ----- Gal + X
La visualisation de l'activité enzymatique
codée par le gène LacZ requiert la
fixation préalable des tissus et ne peut
donc pas être employé pour marquer des
cellules vivantes. Aussi, l'existence
d'activité béta-galactosidase endogène
chez bon nombre de plantes fait que
cette méthode est peu usitée
Pour pouvoir métaboliser le X-gal, la
cellule doit être exposée à un inducteur,
l'isopropyl béta-D-1-
thiogalactopyranoside (IPTG), proche du
lactose.
- 2/ Gène codant pour la GFP (green fluorescent protein) de la méduse Aequora
victoria.
La GFP est une protéine de 27 kDa avec 2 sous-unités constituées de 1 tonneau (11
feuillet béta) entourant une hélice alpha porteuse d'un chromophore). Actuellement, la
technique de microscopie de fluorescence utilisant des marqueurs GFP fait partie des
méthodes les plus couramment utilisées en imagerie biologique.
La molécule fluorescente a la capacité d'adsorber de l'énergie lumineuse dite lumière
d'excitation et de la restituer rapidement sous forme de lumière fluorescente ou lumière
émise. L'émission de la lumière cesse dès l'arrêt de l'excitation.
Contrairement au gène LacZ, la visualisation de la GFP n'exige pas la fixation du tissu et
ne nécessite pas de substrat chromogène. Il suffit de la soumettre à une radiation bleue ou
UV pour observer une brillance verte. En plus, la GFP ne nécessite pas la destruction de
l'échantillon étudié, ce qui permet notamment de faire une étude des variations de son
expression au sein des mêmes tissus au cours du temps. Ce gène rapporteur, est donc
particulièrement adapté pour suivre l'expression d'un transgène dans des cellules vivantes.
- Gène gus (béta-glucuronidase)
Le gène GUS, isolé d'Escherichia coli, code
pour l'enzyme de la béta-glucuronidase
capable d'hydrolyser certains composés
glucuroniques. Cette enzyme, en présence
du substrat X-Gluc (acide 5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-béta-D-glucuronide) conduit à
l'apparition d'un produit (précipité insoluble)
de couleur bleue
Quand ce gène rapporteur est fusionné avec le promoteur d'un gène d'intérêt, cette
technique permet de visualiser ses territoires d'activité.
Régulation de l'expression des gènes
Fonctionnellement, on peut schématiser un gène comme constitué de 3 éléments : 1/
promoteurs et signaux de contrôle (ou régulation) de la transcription, région
transcrite, signal d'arrêt de la transcription. Le promoteur de transcription est une séquence
de quelques nucléotides permettant à l'ARN polymérase (secondée par divers facteurs de
transcription) de s'accrocher à l'ADN pour démarrer sa transcription, ou synthèse de l'ARN
messager (ARNm).
Il y'a promoteurs et promoteurs!
Le promoteur d'un gène est une séquence courte d'ADN, généralement située en amont du gène, qui en contrôle
l'expression, en régulant sa transcription. Il existe 2 types de promoteurs:
Promoteurs constitutifs
- Peuvent s'exprimer dans toute la plante.
- Expression peu specifique et mal controlée dans le temps et l'espace
Promoteurs inductibles
- Activation d'un promoteur en réponse a la présence d'un composé particulier (= inducteur) ou bien à une condition
externe definie (ex : temperature élevée)
- Le transgene est exprimé a un stade precis de developpement et pendant une durée precise.
- Contrôle du transgene: spatialement (cellule ou tissu -specifique) et quantitativement
- Contrôle par différents produits comme la tetracycline, les steroides, le dexaméthasone, l'oestradiol ou l'éthanol ....)
Il existe deux groupes de promoteurs inductibles:
---- Promoteurs inductibles régulés chimiquement (chemically-regulated): action sur le promoteur de composés
chimiques inhabituels à la plante
---- Promoteurs inductibles régulés physiquement (physically-regulated): les facteurs externes abiotiques (lumière,
température bléssures mécaniques, ...) induisent l'activité du promoteur
Plus ou moins loin des promoteurs, existent des éléments de contrôle, appelés 'enhancers' et
'silencers'. Lorsque des protéines régulatrices s'y attachent, l'effet est respectivement
de faciliter ou d'empêcher l'accès de l'ARN polymérase au promoteur, ce qui conduit à
l'augmentation ou la diminution de la transcription. Ces séquences et la présence ou non dans
chaque cellule des protéines qui les reconnaissent permettent une régulation extrêmement fine
de la transcription des gènes.
Un gène eucaryote naturel ou chimérique peut être cloné, c'est à dire introduit et amplifié dans un
clone bactérien. Mais il n'y sera pas exprimé, c'est à dire ne sera ni transcrit, ni traduit, s'il n'est
pas pourvu des séquences requises pour l'accrochage de l'ARN polymérase bactérienne.
Lorsqu'il est transféré dans une cellule totipotente; s'il s'intègre dans son génome, la cellule sera
dite transformée ou transgénique ou génétiquement modifiée, et le nouveau gène sera qualifié de
transgène. Une plante qui résulte de la multiplication et de la différenciation de cette cellule
possèdera le transgène dans toutes ses cellules, mais ne l'exprimera que dans celles où
le promoteur choisi permet sa transcription pour répondre aux tâches voulues comme: 1/
Synthèse plus ou moins accentuée d'une protéines, 2/ Expression exclusive voulue au niveau
d'un organe précis de la plante(feuille, racine, graines…) et Expression lorsque des conditions
environnementales précises (présence de parasites, température, …) sont réunies. Ce sont
des régulations spatio-temporelles strictes. Pour obtenir une telle expression régulée du
transgène, il faut placer la séquence à transcrire sous contrôle d'un promoteur répondant aux
conditions requises.
Une autre manière de faire taire les gènes
Une autre manière de moduler l'expression de gènes dans des plantes réside dans l'utilisation
d'ARN antisensou ARN interférants. En effet, la synthèse par un transgène d'un ARN
complémentaire à un ARN messager naturellement présent dans la plante, peut conduire à la
dégradation de cet ARNm, d'où l'absence de synthèse de la protéine (voir transgénèse.
transformation antisens).
Universalité ou non de la régulation de l'expression des gènes?
Les promoteurs et terminateurs de transcription, séquences régulatrices, ARN
polymérases, facteurs de transcription, ne sont pas universels. En plus des différences entre
procaryotes et eucaryotes, ils ne sont pas identiques entre animaux et végétaux et même entre
monocotylédones et dicotylédones.
Les signaux de régulation, le promoteur et le terminateur de transcription (dans la construction
d'un gène chimérique comportant la séquence codante) doivent provenir d'un organisme le plus
proche possible du receveur pour assurer la fabrication d'une nouvelle protéine par les cellules
d'un organisme.
Ainsi, les transgènes végétaux doivent être pourvus de signaux de régulation qui permettront à
l'ARN polymérase de les transcrire, selon l'objectif visé, dans le noyau de toutes les cellules de la
plante transgénique (expression constitutive) ou dans uniquement dans le noyau des cellules
appartenant à un tissu ou un organe ciblé et/ou seulement en réponse à stimulus externe précis
(expression régulée). On parle de fusion transcriptionnelle.
Fusion transcriptionnelle et fusion traductionnelle
- Fusion transcriptionnelle : pour être capable de s'exprimer dans une plante, un gène doit être
pourvu des séquences de type végétal régulant sa transcription. Si l'on veut une expression
uniquement dans les feuilles, on choisira un promoteur fonctionnant seulement dans les noyaux
des cellules de feuilles (avec enhancers et silencers ad hoc). Par contre la séquence codante
peut avoir n'importe quelle origine, dès lors qu'elle aura été transcrite en ARN, la séquence
codante de tout gène pourra être traduite en protéine selon le code universel. Les séquences 5'
et 3' NTR peuvent provenir du gène auquel on a emprunté les séquences régulatrices, on parle
dans ce cas de fusion transcriptionnelle, car comme l'ADN, l'ARN fruit de sa transcription, sera
chimérique.
- Fusion traductionnelle : si on souhaite que la nouvelle protéine, dans les cellules où elle sera
synthétisée, soit localisée dans un compartiment cellulaire particulier, il faut lui adjoindre la
séquence permettant l'adressage correct. On opère alors la recombinaison in vitro entre la
séquence codant le peptide d'adressage (et les acides aminés nécessaires à sa séparation
ultérieure de la protéine ayant atteint son adresse) et celle codant la protéine nouvelle à adresser.
Comme non seulement l'ADN et l'ARN, mais également la protéine résultant de la traduction, se
trouveront avoir des origines différentes, on parlera alors de fusion traductionnelle.
La fusion traductionnelle est une fusion de protéines conduisant à la synthèse d'une protéine
hybride, alors que la fusion transcriptionnelle est une fusion de gènes conduisant à la synthèse
de 2 protéines séparées. Chaque stratégie a ses avantages et ses inconvénients. Ainsi dans
une fusion traductionnelle, il arrive parfois que les protéines ne parviennent pas à s'associer
correctement, auquel cas la protéine hybride perd les activités biologiques des 2 protéines
présentes à l'état séparé de départ. Une fusion traductionnelle chez K12 est constituée d'un
ensemble promoteur + RBS + gene1 (sans stop) + gene2 complet fusionné en phase, alors
qu'une fusion transcriptionnelle est constituée d'un ensemble promoteur + RBS1 + gene1
(complet) + RBS2 + gène2 (complet).
La fusion transcriptionnelle rend compte de la capacité de transcription d'une séquence d'ADN
étudiée. Par exemple, on additionne un promoteur de gène à un gène rapporteur comme GUS et
on suit la coloration bleue des territoires où le gène va s'exprimer. Ainsi, dans le cas d'un stress,
les zones où les gènes impliqués dans la lutte contre le stress s'expriment, deviennent visibles. Il
suffit de tremper les plantes dans le substrat de la béta-glucuronidase. Ceci aide à connaître le
rôle des gènes.
La fusion traductionnelle peut rendre compte de la transcription et de la traduction des gènes, en
même temps.
Gènes rapporteurs. Fusion transcriptionnelle et fusion traductionnelle
La fusion transcriptionnelle (transcriptional fusion) consiste en une fusion de gènes intervenant
dans la région transcrite mais non traduite. La fusion traductionnelle est une fusion de gènes
effectuée dans leur partie codante et respectant les cadres de lecture.