Partie 1: Techniques spectroscopiques

▪ Introduction à la spectroscopie
▪ Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

▪ Spectrométrie infrarouge (IR)

▪ Spectrométrie de fluorescence (Fluorimétrie ou spectrofluorimétrie)

▪ Spectrométrie de fluorescence des rayons X (FX)

▪ Diffraction des rayons X (DRX)

▪ Spectrométrie d'Absorption Atomique (AA)

▪ Spectrométrie d’émission atomique à plasma à couplage inductif (ICP)

 1- Principes de Base et Théorie
 Le domaine spectral UV-VIS

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 1- Principes de Base et Théorie
 L’origine des absorptions
L’énergie absorbée dans la région UV-Visible produit des variations dans l’énergie électronique de la
molécule résultant de transitions d’électrons de valence dans celle-ci.

Ces transitions consistent en l’excitation d’un électron d’une orbitale moléculaire occupée (habituellement
une orbitale n non liante ou π liante) vers l’orbitale d’énergie supérieure (une orbitale anti-liante, π* ou *).

*
niveaux antiliants vacants
Transitions *
  * E = h
*
n* n niveau non liant occupé
n  *

niveaux liants occupés


Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 1- Principes de Base et Théorie
 Transitions électroniques des composés organiques
La longueur d'onde d'absorption dépend de la nature des orbitales mises en jeu :

Transition   *
La grande stabilité des liaisons σ des composés organiques fait que la transition d'un
électron d'une OM liante σ vers une OM antiliante σ* demande beaucoup d'énergie. La *
bande d’absorption correspondante est intense (transition permise) et située dans l’UV-
lointain, vers 130 nm.
*
Les hydrocarbures saturés sont transparents dans la région de l’UV proche  solvants E = h
Hexane max = 135 nm =10000 n

Transition   * 

La transition électronique dans les composés possédant une double liaison isolée 
conduit à une forte bande d'absorption (transition permise) vers 165-200 nm.

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 1- Principes de Base et Théorie
 Transitions électroniques des composés organiques
Les électrons n (des atomes O, N, S, Cl..) ne forment pas de liaison, ils ne leur correspond pas d’orbitale
antiliante, ils peuvent subir deux types de transitions.
*
Transition n  * *
Le transfert d'un électron du doublet n d’un hétéroatome (O, N, S, Cl..) à un niveau σ* est
E = h
observé pour les alcools, les éthers, les amines ainsi que pour les dérivés halogénés.
Cette transition donne une bande d'intensité moyenne (transition interdite) qui se situe à
l'extrême limite du proche-UV. n


Transition n  *

Cette transition résulte du passage d'un électron d'une OM non-liante n à une OM
antiliante *. Ce type de transition a lieu dans le cas des molécules comportant un
hétéroatome porteur de doublets électroniques libres appartenant à un système insaturé.
La plus connue est celle qui correspond à la bande carbonyle située entre 270 et 280
nm. Le coefficient d'absorption molaire est faible (transition interdite).

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 1- Principes de Base et Théorie
 Transitions électroniques des composés organiques
Quelques exemples :

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 1- Principes de Base et Théorie
 Transitions électroniques des composés organiques

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 1- Principes de Base et Théorie
 Terminologie
Chromophore: groupement insaturé covalent responsable de l'absorption (C=C, C=O,...)

Auxochrome : substituant saturé (NH2, OH, Cl ...) quand il est relié à un chromophore, modifie la longueur d’onde max
(effet bathochrome ou effet hypsochrome) et l'intensité du maximum d'absorption (effet hyperchrome ou effet hypochrome) .

Effet hyperchrome

Effet hypsochrome Effet bathochrome
(blue shift) (red shift)
(se déplace vers le (se déplace vers le rouge ou l’IR)
bleu ou l’UV)
UV IR
Effet
hypochrome

λ(nm)
λmax

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 1- Principes de Base et Théorie
 Effet de la substitution
La position de la bande d’absorption dépend de la présence ou non de substituants (Auxochrome) sur le groupement
chromophore. Par exemple, plus le groupe éthylénique est substitué par un substituant à effet inductif donneur +I,
plus la bande d’absorption due à la transition  → * est déplacée vers le visible : effet bathochrome, couplé à un effet
hyperchrome ( augmente)

Pour les substituants (Auxochrome) à effet mésomère donneur +M (-OH, -OR, -X, -NH2, ...) portés par un
chromophore C=C ou C=O, les paires d’électrons peuvent participer à la résonance, augmentant la conjugaison d’une
molécule, d’où des effets bathochrome et hyperchrome.

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 1- Principes de Base et Théorie
 Effet de la conjugaison
L’enchaînement d’insaturations entraîne la délocalisation des électrons . Cette délocalisation qui traduit la facilité des
électrons à se mouvoir le long de la molécule est accompagnée d’un rapprochement des niveaux d’énergies.

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 1- Principes de Base et Théorie
 Effet de la conjugaison

1 2

3 4

- Effet hyperchrome : Pour des liaisons non conjuguées, la valeur ε est simplement proportionnel au nombre de
liaisons doubles 1 , pour des liaisons conjuguées, on observe une augmentation importante d’ε 2 .

- Effet bathochrome : Pour des liaisons non conjuguées, la molécule absorbe à la même longueur d’onde que le
chromophore éthylénique isolé 3 .
La conjugaison des liaisons déplace le maximum d’absorbance vers des longueurs d’onde plus élevées 4 .
Plus la délocalisation sera importante, plus ε et λmax seront importants.

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 1- Principes de Base et Théorie
 Effet de la conjugaison
Effet de plusieurs doubles liaisons conjuguées sur la position du maximum d’absorption de la transition   * pour quelques
polyènes conjugués.

Exemple: la couleur orangée du ß-carotène, provient de la

présence de onze doubles liaisons conjuguées (λmax = 448 nm).

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 1- Principes de Base et Théorie
 Effet de solvant
La position, l’intensité et la forme des bandes d’absorption des composés en solution dépendent du solvant. Ces
changements traduisent les interactions physiques soluté-solvant qui modifient la différence d’énergie entre état
fondamental et état excité.

Transition n  * :

Avant l’absorption, la liaison δ+C=Oδ- est

stabilisée par un solvant polaire. Il faut
plus d’énergie pour provoquer la
transition   diminue par augmentation
de la polarité du solvant : effet
hypsochrome.

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 1- Principes de Base et Théorie
 Effet de solvant
Transition   * :
Si l’état excité est plus polaire que l’état fondamental, c’est la forme excitée qui est stabilisée par un solvant polaire.
ΔE diminue   augmente par augmentation de la polarité du solvant : effet bathochrome.

Remarque : une structure fine peut être

observée dans la solvants apolaires

400 nm 588 nm

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 1- Principes de Base et Théorie
 Effet de solvant
Exemple: La benzophénone

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 1- Principes de Base et Théorie
 Effet du pH
Le pH du milieu dans lequel est dissous l’analyte peut avoir un effet important sur le spectre. Parmi les composés qui
manifestent cet effet de manière spectaculaire, on trouve les indicateurs colorés dont le changement de couleur est mis à
profit au cours de dosages acidobasiques. C’est ainsi que les points d’équivalence sont repérés.
Incolore Rose
Exemple: phénolphtaléine (absorption à 500 nm)

Spectre en 3D

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 1- Principes de Base et Théorie
 Absorption et couleur
On voit les couleurs qui ne sont pas absorbées → La couleur d’une substance, est le complément de la couleur absorbée.

naphtalène anthracène tétracène

Le tétracène absorbe
essentiellement dans le
bleu (460nm-490nm) ,
il est donc orange. Le naphtalène et l’anthracène
absorbent dans l’UV (200nm-
800
400nm) et reflète toutes les
radiations du visible. Ils sont
donc incolore.

Spectres UV-Visible de différentes substances chimiques

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 1- Principes de Base et Théorie
 Transformation chimique
Quand un composé n’absorbe pas la lumière, il peut néanmoins faire l’objet d’un dosage photométrique si on peut le
transformer en un dérivé qui, lui, comporte un chromophore exploitable.

À cette fin, la mesure d’absorbance est précédée d’une transformation

chimique qui doit être à la fois spécifique, totale, rapide,
reproductible et conduire à un dérivé stable en solution.

Composé à analyser + Réactif spécifique Dérivé

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 1- Principes de Base et Théorie
 Transformation chimique
Par cet artifice, il devient possible de doser toutes sortes d’espèces chimiques dont l’absorption est initialement soit très
faible, soit dans une partie du spectre où coexistent d’autres absorptions qui interférent.

chromophore chromophore
correspondant composé
masqué correspondant
au dérivé au dérivé
spécifique dans un
mélange spécifique
très faible
absorption
du composé

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 2- Instrumentation
 Spectromètres simple faisceau

une source : composé de 2 lampes, une au tungstène pour le domaine

visible (400-800 nm), l’autre au deutérium pour le domaine UV (200-400
nm).

un monochromateur qui a pour rôle de disperser le rayonnement

polychromatique provenant de la source et d’obtenir des radiations
monochromatiques.
Les monochromateurs les plus utilisés sont composés en général d'une
fente d'entrée, d'un dispositif de dispersion comme un prisme ou un
réseau à réflexion et d'une fente de sortie.

un compartiment à échantillon

un détecteur à photodiode ou photomultiplicateur qui convertit la lumière

reçue en courant. Le détecteur est relié à un enregistreur qui permet de
tracer un spectre d’absorption de l’échantillon analysé.

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 2- Instrumentation
 Spectromètres double faisceau

Dans le montage à double faisceau, la source

passe par le monochromateur puis est
partagée en 2 faisceaux : l’un dirigé vers le
« blanc ou la référence » c'est-à-dire le
compartiment contenant le solvant, l’autre dirigé
vers le compartiment de l’échantillon. L’intensité
lumineuse est mesurée par 2 photodiodes.

Le diviseur de faisceau sert à séparer en deux

faisceaux la lumière monochromatique qui
émerge du monochromateur afin qu'ils
traversent les compartiments de l’échantillon et
de la référence.

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 2- Instrumentation
Deux approches différentes permettent d’aboutir au spectre. Dans la première le spectre est obtenu de manière
séquentielle en fonction du temps (une seule longueur d’onde à la fois). Dans la seconde, le détecteur mesure les
intensités lumineuses à toutes les longueurs d’onde (type simultané) pratiquement au même instant en alignant un grand
nombre de détecteurs quasi ponctuels pour former une barrette de diodes.

Détecteur: photodiode Détecteur à barrette de diodes

Spectromètre de type Spectromètre de type

séquentiel à optique normale simultané à optique inverse

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 2- Instrumentation
Les spectromètres de type simultané à optique inverse sont largement utilisés, comme détecteurs, en
chromatographie liquide.

Le faisceau lumineux
issu de la source

Cuve à échantillon ou cellule à

circulation
Cellule à circulation de la phase
mobile qui transporte les analytes
de la colonne au détecteur Chromatogramme en 3D

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 2- Instrumentation
Dans les spectromètres on utilise des cellules (ou cuves) qui ont un chemin optique qui varie de 1 à 10 cm pour la
détermination des spectres en solution. On utilise couramment des tubes parallélépipédiques de 1x1 cm de côté qui
nécessitent environ 3 mL de solution. Elles sont en quartz pour le domaine UV-visible. Le verre est réservé aux mesures
dans le domaine visible uniquement.

zone d’absorption du quartz et

du verre

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 3- Applications
 Analyse qualitative
Les spectres UV fournissent généralement peu de renseignements sur la structure moléculaire des
composés comparés aux spectres IR.

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 3- Applications
 Analyse quantitative
L’analyse quantitative par la spectrométrie UV-visible est très employée grâce à l’utilisation de la loi de
Beer-Lambert.

- Dosages de substances qui absorbe dans le domaine UV-visible

- Suivis de cinétique de réactions (surveiller le changement de concentration des réactifs ou des
produits au fil du temps.)
- Contrôle qualité, etc

Spectrométrie d’absorption de l’ultraviolet et du visible (UV-Visible)

 3- Applications
 Analyse quantitative
La méthode de la gamme d'étalonnage
Cette méthode consiste à préparer des solutions dont la concentration encadre la solution de concentration inconnue.
L'absorbance mesurée pour chacune de ces solutions permet d'établir un graphe où l'on trace A = f(C). Il ne reste plus
qu'à placer l'absorbance de la solution inconnue et l'on obtient la concentration inconnue.

y=ax

Concentration du composé à analyser

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