HPLC: Chromatographie liquide a haut
performance
L’introduction : chromatographie liquide a haut
performance dérive de la forme la plus ancienne
de la chromatographie en phase liquide sur
colonne
I’Hplc est une nouvelle technique qui sert a
séparer ,identifier, et quantifier les constituants
d’un mélange complexe et homogène en état
liquide
Cette technique analytiques qui caractérise par la
rapidité la sensibilité et la sélectivité est issue du
développement de la chromatographie liquide
classique sur colonne
La différence clé entre l’Hplc et la chromatographie
liquide classique sur colonne
HPLC Chromatographi
e liquide
classique sur
colonne
Le diamètre Diamètre Diamètre
interne des interne petit interne plus
colonnes grand (1-4)cm
Résolution Hplc offre une Une résolution
meilleure moins élevée
résolution et
rapidité grâce a
des colonnes
plus efficaces
application L’hplc est Chromatographi
privilégiée pour e classique est
des analyses souvent utilisée
précises dans pour des
des domaines séparation
comme moins
l’industrie complexes et
pharmaceutique donne des
La résultats moins
biochimie ,..et rapides
donne des
résultats rapide
Phase mobile Hplc utilise une Cpl utilise
phase liquide souvent des
sous haute techniques
pression gravitationnelle
(existence d’un s pour
système de l’utilisation de
pression=une la phase mobile
pompe)
Phase De petits taille De taille plus
stationnaire élevée
Principe de l’Hplc :chromatographie en
phase liquide a haut performance est l’un des
méthodes chromatographique nouvelle qui
caractérise par leur analyses fiable
Cette technique sert a séparer les constituants
d’un mélange complexe en phase liquide a travers
une phase mobile liquide et une phase stationnaire
solide ou liquide
Elle fonctionne en injectant un échantillon dans
une colonne remplie de phase stationnaire, tandis
qu’une phase mobile (solvant)est pompée haute
pression . la séparation fondée sur la différence de
distribution des solutés entre deux phases non
miscibles (phase stationnaire et mobile) .les
résultats sont visualises sous forme de
chromatogramme ou chaque pic correspondant a
un soluté
Appareillage :
1/Les réservoirs de la phase mobile :sont
essentiels pour stocker et distribuer les solvants
utilises dans le processus [Link]
doivent être étanches pour eviter l’evaporation et
la contamination des solvants par les gaz
atmosphériques
2/pompe a haut pression <400bar :la pompe est
essentielles pour transporter la phase mobile en
continu (non pulse) a travers le système .elle
assure un débit constant et précis et une stabilité
de flux
NB : la phase mobile=solvant
3/injecteur :introduit l’échantillon dans le flux de la
phase mobile sans modifier la pression de la
colonne . c’est une vanne a boucle
d’échantillonnage d’une capacité fixe elle a deux
positions, la première permet le remplissage de la
boucle d’injection de volume fixe (load),la seconde
permet la mise en circulation de l’échantillon dans
le système chromatographique (inject)
4/colonne : tube en acier inoxydable résistance aux
fortes pressions contenant la phase
stationnaire .de longueur (10-25cm) et de diamètre
interne (2_8mm)
le remplissage par la phase stationnaire d’une
granulométrie de 3 ,5 ,ou 10 um
Précédée d’une précolonne (0,4 a 1 cm) de même
nature de la phase stationnaire
4/détecteur :la détection se fait par un instrument
place a la sortie de la colonne
Il Sert a mesurer la concentration des composes
sépares souvent a l’aide des méthodes comme uv-
visible ou spectrométrie de masse,..
Pour choisir un meilleur détecteur il y’a des
critères :
Fournir une réponse stable rapide et reproductible
Garantir une bonne sensibilité au débit de la phase
elaunte(mobile) et a la pression dans la cuve de
détection
Linéarité :réponse proportionnelle a la
concentration a chaque instant
Un détecteur a caractère universel ou spécifiques ?
Détecteur Universel :bases sur la mesure d’une
propriété globale de l’effluent chromatographique
ex :refractomètre, spectrométrie de masse,..
Détecteur spécifique ( sélectif) :bases sur les
propriétés physico-chimique particulières des
analytes a doser comme le spectrophotomètre
uv_visible ,spectrofluorimetre et les détecteurs
électrochimiques
5/application :
[Link] en biologie médicale
[Link]ôle du médicament : du la matière
première jusqu’a le produit fini(identification,
essai ,dosage)