République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université des frères Mentouri- CONSTANTINE
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département de Biochimie et de Biologie Cellulaire et Moléculaire

N° d’ordre : 13/DS/2015
N° de série : 01/BIOC/2015

Thèse de doctorat en sciences

Spécialité : biochimie et microbiologie appliquées

Préparée par

Hayet boukhalfa-lezzar

Thème

Etude de la production de la protéase par

aspergillus oryzae sur milieu solide en fermenteur
fujiwara. Utilisation des déchets de tomate comme
substrat de fermentation.

Soutenue le : 23/02 /2015

Devant le jury :

Mr A. Benguedouar Prof. Université Mentouri, Constantine Président

Mme A. Mechakra-Maza Prof. Université Mentouri, Constantine Encadreur
Mr F. Duchiron Prof. Université de Reims Co-Encadreur
Mr A. Touzi Prof. DGRSDT, MESRS, Alger Examinateur
Mr S. Benallaoua Prof. Université Abderahmane Mira, Béjaia Examinateur
Mme F. Fazouane-Naimi Prof. Université M’Hamed Bouguera, Examinatrice
Boumerdès

Année universitaire 2014-2015

 Avant propos

« L’esprit s’il est en bonne santé, ne prend plaisir que dans la science »

Emir Abd el-Kader (1808-1883)

« … tard, très tard, j’ai découvert la véritable nature de la science, de sa

démarche, des hommes qui la produisent.

J’ai trouvé là un monde de jeu et d’imagination, de manies et d’idées fixes. A

ma surprise, ceux qui atteignaient l’inattendu et inventaient le possible, ce
n’étaient pas simplement des hommes de savoir et de méthode. C’était surtout
des esprits insolites, des amateurs de difficultés, des êtres à vision
saugrenue… »

François Jacob, Prix Nobel 1965 (1920-2013)

i
 A la mémoire de ma très chère mère

Kheira bent M’Hammed BOUDARENE

Symbole de la gentillesse, la patience et le sacrifice

Que DIEU l’accueille dans son vaste paradis

ii
 A mon cher père

Abdallah ben Messaoud Boukhalfa

Tu as su m’apprendre la persévérance, l’amour du travail bien fait,

Et que l’effort est toujours payant…

Que ce travail soit une modeste récompense pour tous ce que tu m’as donnés.

A ma belle mère

Khedidja bent Ahmed Lezzar

Avec toute mon affection

iii
 À mon époux

A mes enfants

Vous avez été très patients pendant mon absence et même après…

Je vous ai privé de beaucoup de choses pour réaliser ce travail mais vous m’avez assuré

le soutien au quotidien.

Je vous demande pardon pour tous ces manquements.

A mes chères sœurs

Vos sacrifices et votre dévouement m’ont permis d’embrasser cette carrière

Je ne pourrai assez bien exprimer ma gratitude, ma reconnaissance et ma grande affection

Merci pour tous ce que vous avez fait pour moi

Que ce travail soit une réalisation de vos vœux.

A mes frères

Vous m’avez appris à aimer la science

Vous m’avez toujours encouragée et soutenue

Merci pour tous ce que vous m’avez donné de puis ma jeune enfance.

A mes belles sœurs

A mes beaux frères

A mes nièces et mes neveux

A toutes les familles BOUKHALFA et LEZZAR

A tous ceux que j’aime, je dédie ce travail .

iv
 Remerciements
Ce travail a été réalisé, dans le cadre du Programme Franco-Algérien de Formation
Supérieure (PROFAS), conjointement entre le laboratoire de Biologie et Environnement
(LBE) de l’Université des frères Mentouri, Constantine (UFMC) et le Laboratoire de
Microbiologie Industrielle (LMI) INRA, de l’Université de Reims, Champagne-Ardenne
(URCA).
Il a été encadré, du côté algérien par le Professeur Aicha Mechakra-Maza, du côté français
par le Professeur Francis Duchiron.
J’exprime mes remerciements et ma profonde reconnaissance à mon encadreur, Mme Aicha
MECHAKRA-MAZA, Professeur à la Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie,
UFMC. Merci pour la confiance, la liberté et le soutien permanant que vous m’avez
témoignés malgré toutes vos responsabilités et les problèmes de santé. Merci pour les
précieux conseils et aides qui ont fait aboutir cette thèse. Vous trouverez ici l’expression de
ma profonde gratitude et toute ma considération.
J’exprime toute ma reconnaissance et toute ma gratitude au Professeur Francis
DUCHIRON, directeur du LMI, pour m’avoir accueillie au sein de son laboratoire, pour la
grande confiance qu’il m’a accordée. Malgré toutes vos responsabilités, vous avez été
disponible et à l’écoute de mes préoccupations. Je ne saurais vous remercier pour tous les
précieux conseils, les bonnes orientations, la bonne humeur au quotidien et surtout pour les
nuits passées au laboratoire pour le suivi du fermenteur. Vous trouverez ici le témoignage
de ma profonde admiration.
Je remercie Mr Ammar BENGUEDOUAR, Professeur au département de Microbiologie,
UFMC, qui me fait l’honneur de présider le jury de thèse. Merci pour l’intérêt que vous
avez porté à mes travaux
De même, je remercie très sincèrement Mr Abdelkader TOUZI, Directeur des études au
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique, pour avoir accepté
de juger ce travail. Je suis très honorée par votre participation dans l’évaluation de cette
thèse.
Je suis également très honorée par la présence dans ce jury de Mr Said BENALLAOUA,
Professeur à L’université de Béjaia et de Mme Fathia FAZOUANE-NAIMI, Professeur à
l’université de Boumerdès. Je vous remercie très sincèrement pour l’intérêt et le regard très
lucide que vous avez porté à ce modeste travail.
A Reims, je tiens à remercier tout particulièrement Mme Estelle COPINET, Maître de
conférences et Melle Véronique GAILLET, Assistante ingénieur au LMI. Je les remercie
pour leurs aides et collaboration au cours de la réalisation de ce travail. Merci d’avoir prêté

v
main forte au cours des manipulations sans laquelle ce travail ne serait pas achevé
aujourd’hui.
Une place particulière à Martine qui m’a accueillie chez elle et m’a aidée avec beaucoup de
sympathie, de modestie et de simplicité. Vous avez été très gentille et très aimable. Je vous
remercie pour tout.
Je remercie Mme Hanane ZAIDI, la constantinoise de Reims, doctorante au bâtiment 6,
qui m’a beaucoup aidée à m’installer. Et aussi Mme Hind LEGHLIMI, pour les
inoubliables moments passés au laboratoire et à Reims, ta présence à mes côtés m’a souvent
réconfortée.
Je n’oublie pas de citer tous les membres du LMI, à savoir Mmes Harivony
RAKOTOARIVONINA, Angélique GAINVORS-CLAISSE, Parissa ALIMARDANI-
THEUIL et le Gentleman Mr Vincent PREVOT, Maîtres de conférences. Je vous remercie
pour les agréables moments que j’ai passés avec vous, pour la sympathie et l’amitié que
vous m’avez témoignées et dont j’avais besoin tout au long de mon détachement.
Mes pensées vont également aux stagiaires qui m’ont accompagné dans ce travail : Melles
Ibtissam MOUSTATIR, Aouatef TAOU et Mrs Valentin PETIT et Johann PRUDENCE.
Je remercie tout le personnel de l’Europol’Agro, qui ont toujours été accueillants et
serviables.
Enfin, j’exprime toute ma reconnaissance au Laboratoire « INZO » à Château-Thierry,
France, pour leur aide dans l’analyse des composants des déchets de tomate.
A Constantine, je remercie très sincèrement tout le personnel du LBE en particulier Mme le
Professeur Oualida RACHED et aussi le Professeur Yacine Benhizia, qui n’ont pas
manqué de m’encourager.
Je présente mes plus vifs remerciements à Mme Zoubida GHERIBI-OULMI et Melle
Kounouz RACHEDI pour leur aide dans l’analyse statistique des résultats ; à Mme le
Docteur Karima BOUBEKRI et Mme le Professeur Sakina ZERIZER pour leur aide et
soutien.
Je voudrais aussi remercier mes amies de la promotion en particulier, Mmes Hayet Goudjil,
Malika BENKAHOUL, Leila BENNAMOUN, Scheherazed DAKHMOUCHE, Nassira
RIAH et aussi Naïma BOUTHAGHANE pour leurs soutiens et encouragements.
Je tiens à remercier Mrs Islem Boucheloukh et Ilyes Taleb Hacine pour la réussite de la visio.
Enfin, un grand MERCI à tous les Professeurs et collègues à la Faculté SNV, et tout le
personnel du Biopôle qui n’ont pas cessés de m’encourager.
Hayet BOUKHALFA-LEZZAR

Le 20/04/2014

vi
 Liste des figures

Figure 1 : Schéma des différentes couches mycéliennes au cours de la croissance fongique en

FMS.

Figure 2 : Constitution et développement fonctionnel des différents compartiments de

l’hyphe.

Figure 3 : Les spores fongiques et bactériennes : (a) Aspergillus (b) Penicillium, (c)
Acremonium, (d) Beauveria bassiana (e) Bacillus thuringiensis.

Figure 4 : Exemples de champignons supérieurs cultivés par FMS (de gauche à droite:
Agaricus, Pleurotus ostreatus, Agaricus augustus).

Figure 5: Réacteur colonnes de laboratoire.

Figure 6: Schéma d’un réacteur de laboratoire pour FMS en condition stérile.

Figure 7: Schéma d'un réacteur à plateaux statique avec aération passive.

Figure 8 : Réacteur statique avec aération forcée, photographie de Zymotis.

Figure 9 : Photographie et schéma d’un réacteur rotatif à agitation alternée, sans aération
forcée.

Figure 10 : Fermenteur à tambour perforé rotatif.

Figure 11: Réacteur pilote en cuve profonde INRA Dijon

Figure 12 : Photographie et schéma du réacteur de type Koji.

Figure 13: Distribution des différentes classes d’enzymes industrielles.

Figure 14: Distribution des organismes sources d’enzymes industrielles.

Figure 15 : Répartition du marché mondial des enzymes.

Figure 16: Les couleurs des biotechnologies.

Figure 17: Principales caractéristiques d’une bioraffinerie basée sur le traitement biologique
des déchets agro-alimentaires.
Figure 18: Production mondiale de la tomate en 2010.
Figure 19: Principales régions productrice de tomate industrielle en Algérie.
Figure 20: Composition des sous produits de la tomate transformée.

vii
Figure 21: Le fermenteur Fujiwara : (A) armoire de contrôle, (B) fermenteur Koji avec sa
cuve de culture à l’intérieur.

Figure 22: La partie arrière du fermenteur Fujiwara : de l’unité de refroidissement (A), le

réservoir d’eau (B).

Figure 23: Le système d'aération du fermenteur Fujiwara : (A) humidificateur, (B) arrivée
d’air humidifié, (C) conduite d’échappement d’air ayant traversé la cuve.

Figure 24: L’intérieur du fermenteur Fujiwara : la cuve du fermenteur (A) la sonde de

température, (B) les vis sans fin.

Figure 25: Evolution cinétique de la production de la protéase par les cinq souches fongiques
en FMS (cultures réalisées à 30°C, durant 144h avec un taux d’humidité initiale de 50%).

Figure 26: Effet du pH initial sur la synthèse de la protéase neutre à 50% d’humidité initiale,
FMS de 5 jours pour A. oryzae 5777 et 3 jours pour A. oryzae 2220.

Figure 27: Effet de la taille de l’inoculum sur la production de la protéase neutre (50%
d’humidité initiale et à pH 6).
Figure 28: Effet de l’âge des spores sur la production de la protéase neutre (50% d’humidité
initiale, pH 6 et 106 spores/g de substrat).
Figure 29 : Effet de la taille des particules des déchets de tomate sur la production de la
protéase neutre.

Figure 30 : Effet de l’addition de la caséine sur la production de la protéase neutre.

Figure 31 : Effet de l’addition de la farine de soja sur la production de la protéase neutre.

Figure 32 : L’aspect du substrat au cours de la culture: Erlenmeyers inoculum, cuve du

fermenteur Fujiwara avec les déchets de tomates inoculés, substrat fermenté après 13 heures
de culture, substrat après 20 heures de culture, substrat à la fin de la fermentation.

Figure 33 : Evolution de l’activité protéasique et du pH au cours du temps. FMS réalisée par

A. oryzae 2220 sur déchets de tomate enrichie en farine de soja (humidité 50%, et température
30°C).

Figure 34 : Evolution de l’activité protéasique et du pH au cours du temps. FMS réalisée par

A. oryzae 2220 sur déchets de tomate sans enrichissement (humidité 50%, et température
30°C).

viii
Figure 35 : Evolution de l’activité protéasique au cours du temps pour les deux types de
culture avec et sans enrichissement.

Figure 36 : L’activité de la protéase neutre produite par A. oryzae 2220, après extraction par
les différentes solutions et centrifugation à 10 000g durant 5 min (résultats exprimés en
valeurs moyennes ± les écarts-types).

Figure 37 : L’activité de la protéase neutre produite par A. oryzae 2220, après extraction par
les différentes solutions et centrifugation pendant 10 min à 4°C (résultats exprimés en valeurs
moyennes ± les écarts-types).

Figure 38 : Cinétique de l’extraction de la protéase neutre par l’eau osmosée, à partir de

déchets de tomate fermenté par A. oryzae 2220 (résultats exprimés en valeurs moyennes ± les
écarts-types).

Figure 39 : Cinétique de l’extraction de la protéase neutre par la solution de NaCl à 3% à

partir de déchets de tomate fermenté par A. oryzae 2220 (résultats exprimés en valeurs
moyennes ± les écarts-types).

Figure 40 : Effet du pH sur l’activité de la protéase neutre produite en fermenteur par A.

oryzae 2220 en FMS sur déchets de tomate (résultats exprimés en valeurs moyennes ± les
écarts-types).

Figure 41 : Effet de la température sur l'activité de la protéase neutre produite en fermenteur

par A. oryzae 2220 en FMS sur déchets de tomate (résultats exprimés en valeurs moyennes ±
les écarts-types).

Figure 42 : La stabilité thermique de la protéase neutre d'Aspergillus oryzae 2220 produite

par FMS sur déchets de tomate.

Figure 43 : Effets du zinc, du cuivre et de l'EDTA sur la protéase neutre d'A. oryzae 2220
produite par FMS sur déchets de tomate.

ix
 Liste des tableaux

Tableau 1: Historique et développement des fermentations solides.

Tableau 2: Exemples de cocultures fongiques pour la production d’enzymes par fermentation
en milieu solide.
Tableau 3: Comparaison de la production d’enzymes issues d’une culture d’Aspergillus niger
par fermentation en milieu liquide et en milieu solide.
Tableau 4: Principaux aliments d’origine africaine ou asiatique, produits par FMS.
Tableau 5: Les enzymes produites par fermentation solide.

Tableau 6 : Production des acides organiques par fermentation solide à partir de divers
substrats.

Tableau 7 : Les spores des microorganismes produites par fermentation solide.

Tableau 8 : Les applications de spores produites par FMS. (A) Dans le contrôle biologique.
(B) Dans la biocatalyse.

Tableau 9: Champignons et substrats utilisés pour leur production.

Tableau 10: Les métabolites secondaires produits par fermentation solide.

Tableau 11: Les différentes souches fongiques productrices de colorants par FMS.

Tableau 12: Liste des classes d’enzymes selon le profil catalytique et les enzymes
industrielles correspondantes.

Tableau 13: Les exopeptidases et leur mode d'action.

Tableau 14: Liste des protéases fongiques.

Tableau 15 : Exemples des protéases des détergents disponibles dans le commerce.

Tableau 16: Les protéases produites par FMS avec les substrats et microorganismes utilisés.

Tableau 17: Résultats de la composition des déchets de tomate.

Tableau 18: Composition comparée des déchets de tomate et du son de blé traditionnel (en %
de la matière sèche).

x
Tableau 19: Activité protéolytique produite par les cinq souches d’Aspergillus au cours de la
FMS des déchets de tomate en (U/gms).

Tableau 20: Evolution du pH au cours de la FMS par rapport aux différentes souches
étudiées.

Tableau 21 : Effet de l’humidité initiale sur la production de la protéase par les deux souches
d’Aspergillus oryzae par FMS sur déchets de tomate. L’activité en (U/gms).

Tableau 22 : Evolution du pH à la fin de la FMS sur déchets de tomate (humidité initiale de

50%).

Tableau 23 : Bilan de la précipitation au sulfate d’ammonium.

xi
 Liste des abréviations
AMFEP: Association of Manufacturers and Formulators of Enzyme Products
AOAC: Association of Official Analytical Chemistry
AVC : Accident vasculaire cérébral
Aw : Activity of Water
CA : Chiffre d’affaire
CEE : Communauté Economique Européenne
EC: Enzyme commission
EDTA : Acide ethylène diamine tétra acétique
ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
FDA: Food and Drug Administration
FML: Fermentation en milieu liquide
FMS: Fermentation en milieu solide
GA3: Acide gibberellique
gds: gram of dry substrate
gms: gramme de matière sèche
GRAS: Generally Recognized as Safe
HPLC: Chromatographie en phase liquide à haute performance
LBE : Laboratoire de Biologie et Environnement
LMI : Laboratoire de Microbiologie Industrielle
NF : Norme Française
OGM : Organisme Génétiquement Modifié
PDA: Potato Dextrose Agar
pI : point isoelectrique
ppCO2 : Pression partielle de CO2
SSF: Solid-State Fermentation
TCA: Acide trichloroacétique
URCA : Université de Reims en Champagne Ardenne
UV : Ultra violet

xii
 Sommaire
Avant propos i
Dédicaces ii
Remerciements v
Liste des figures vii
Liste des tableaux x
Liste des abréviations xii
Introduction générale 1

4
Partie I. Synthèse bibliographique
4
1. La fermentation en milieu solide 4
1.1. Définition des procédés en FMS 4
1.2. Historique des FMS 5
1.3. Microorganismes utilisés en FMS 6
1.4. Avantages et inconvénients des procédés en FMS 7
1.5. FMS versus FML 7
2. Applications des fermentations en milieu solide 7
2.1. Préparation d’aliments 7
2.1.1. Pain 8
2.1.2. Fromage 8
2.1.3. Aliments fermentés 8
2.2. Production d’enzymes 9
2.3. Production des acides organiques 9
2.4. Production des spores 10
2.5. Production des champignons supérieurs 11
2.6. Production de métabolites secondaires 12
2.6.1. L’acide gibbérellique 12
2.6.2. Les pigments 13
2.6.3. Les composés aromatiques 13
2.6.4. Le xanthane 13
2.7. L’ensilage 14
2.8. Le compostage 14
3. Facteurs affectant les cultures en FMS 14
3.1. Substrat et rapport C/N 15
3.2. Taille des particules de substrat 15
3.3. Humidité et activité de l’eau 16
3.4. Le pH 16
3.5. Température et accumulation de la chaleur métabolique 17
3.6. Aération et agitation 18
3.7. Oxygène et dioxyde de carbone 19
3.8. Type de l’inoculum 19
3.9. Stérilité 20
3.10. La biomasse 20
4. Les bioréacteurs de la FMS et les répercussions de ces procédés 21
4.1. Classification des fermenteurs en FMS 21
4.1.1. Réacteurs de laboratoire 21
4.1.2. Fermenteurs pré-pilotes et pilotes 22
 4.2. Répercussions des FMS 23

5. Les protéases 24
5.1.Généralités sur les enzymes 24
5.2. Définition et rôles des protéases 25
5.3. Classification et mécanisme d’action des protéases 25
5.4. Rôles physiologiques des protéases 27
5.5. Sources potentielles des protéases 27
5.5.1. Protéases végétales 27
5.5.2. Protéases animales 28
5.5.3. Protéases microbiennes 28
[Link] applications industrielles des protéases 29
5.6.1. Industrie des détergents 29
5.6.2. Industrie du cuir 30
5.6.3. Industrie alimentaire 30
5.6.4. Industrie pharmaceutique 31
5.6.5. Industrie cosmétique 31
5.6.6. Synthèse d’hydrolysats de protéines 31
5.7. Les protéases produites par FMS 32

6. Les déchets de tomates comme ressource végétale 34

6.1. Définition des agroressources 34
6.2. Valorisation de la biomasse végétale par FMS 34
6.3. Production mondiale de la tomate 35
6.4. Tomate industrielle en Algérie 35
6.5. Les sous-produits de la tomate transformée 36
6.6. Fermentation des déchets de tomate 37

Partie II. Matériel et méthodes 38

1. Les souches fongiques 38

1.1. Production et conservation des spores 38
1.2. Dénombrement des spores à la cellule de Thoma 39
1.3. Viabilité des spores 39
2. Substrat de fermentation 39
3. Conduite des FMS en Erlenmeyers 40
4. Extraction de l’enzyme 40
5. Détermination de l’activité enzymatique 40
6. Dosage des protéines 42
7. Détermination de la teneur en eau 43
8. Optimisation des différents facteurs 43
8.1. Le taux d’humidité 43
8.2. Le pH initial 43
8.3. Le taux d’inoculum 43
8.4. L’âge de l’inoculum 43
8.5. La taille des particules 44
8.6. Les sources azotées 44
9. Culture en fermenteur Koji (Fujiwara) 44
9.1. Présentation du fermenteur 44
9.2. Conditions de culture dans le fermenteur 47
48
 10. Optimisation de l’extraction 48
10.1. Solutions d’extraction 48
10.2. Cinétique de l’extraction 48
11. Caractérisation de l’enzyme 48
11.1. Effet du pH sur l’activité de la protéase neutre 49
11.2. Effet de la température sur l’activité enzymatique 49
11.3. Stabilité thermique de l’enzyme 49
11.4. Effet de l’EDTA, du zinc et du cuivre 49
12. Précipitation par le sulfate d’ammonium 50
13. Analyse statistique
51
Partie III. Résultats et discussions
51
1. Etude biochimique du substrat de fermentation 53
2. Profil de production de la protéase neutre par différentes souches
d’Aspergillus 57
3. Etude des conditions de la fermentation solide sur déchets de tomate 57
3.1. Effet de l’humidité 59
3.2. Effet du pH 62
3.3. Effet de l’inoculum 62
3.3.1. Effet de la taille de l’inoculum 63
3.3.2. Effet de l’âge de l’inoculum 64
3.4. Effet de la taille des particules de substrat 66
3.5. Effet de l’addition des protéines sur la production de la protéase 66
3.5.1. Effet de la caséine 68
3.5.2. Effet de la farine de soja 70
3.6. Conclusion partielle 71
4. Production de la protéase neutre en réacteur Fujiwara 71
4.1. Culture avec le substrat enrichi par la farine de soja 71
4.2. Culture avec déchets de tomate sans enrichissement 75
5. Optimisation de l’extraction de l’enzyme 75
5.1. Effet de la solution utilisée pour l’extraction 78
5.1. Effet de la durée de solubilisation du substrat fermenté 78
5.1.1. Avec de l’eau 78
5.1.2. Avec la solution de NaCl à 3% 80
5.2. Conclusion partielle 81
6. Caractérisation de la protéase neutre d’Aspergillus oryzae 2220 81
6.1. Effet du pH 83
6.2. Effet de la température 84
6.3. Stabilité thermique 85
6.4. Effet de l’EDTA, du zinc et du cuivre 86
7. Précipitation par le sulfate d’ammonium

Conclusion générale et perspectives 87

91
Résumés
94
Références bibliographiques
Annexes
Introduction
 Introduction

Les ressources végétales présentent l’avantage d’être renouvelables et très largement

présentes sur l’ensemble des terres à l’échelle planétaire. Cela génère des quantités
importantes de déchets qui constituent une nuisance certaine pour l’environnement. Ces
déchets, riches en matières organiques, peuvent être recyclés et transformés par les procédés
biotechnologiques. Ces derniers constituent une solution de choix pour remédier aux
problèmes de pollution et permettent la production d’une nouvelle génération de molécules à
haute valeur ajoutée, souvent importées. Parmi ces molécules, les enzymes sont les
catalyseurs les plus efficaces et les plus recherchées dans des domaines extrêmement variés
tels que l’agro-alimentaire, le chimique, le pharmaceutique, etc.

Au moment où le marché de la biocatalyse est en pleine expansion, l’industrie des

enzymes est totalement absente en Algérie. En effet, leur chiffre d’affaires (CA) passe de 600
millions de Dollars en 1995 (Cuvellier et al., 1999) à 4,9 milliards de Dollars pour l’année
2013 (BCC Research, 2013). Parmi ces enzymes, les protéases occupent une position
centrale ; elles représentent environ 60 % du marché global des enzymes (Mahajan et
Badgujar, 2010) et offrent de nombreuses possibilités d’utilisation en thérapie (plusieurs
études cliniques rapportent leur application en oncologie), en industries alimentaires
(panification, brasserie, fromagerie, tendérisation de la viande, …), en tannerie, en
cosmétique, dans les détergents, etc (Vishwanatha et al., 2010).

Les premières enzymes préparées industriellement provenaient de fermentations en

milieux solides (FMS) (brevet Jokichi Takamine, 1894), celles-ci sont des cultures dans
lesquelles les substrats sont seulement humidifiés. La faible teneur en eau favorise la
croissance de champignons filamenteux. Ces fermentations sont très avantageuses car elles
sont simples, peu coûteuses, moins polluantes et très rentables. Ces systèmes dotés d’une
longue tradition, sont économes d’énergie, très répandus en industrie alimentaire et de
production d’enzymes. La production des enzymes ramenée au volume des réacteurs est près
de cent fois plus importante en culture solide comparée à celle des cultures submergées
(Duchiron et Copinet, 2011). Actuellement, les procédés en phase solide connaissent un
regain d’intérêt à travers le monde, particulièrement avec la valorisation des coproduits
agricoles pour la production de divers produits et substances.

1
 D’après Van Dyk et al. (2013), les sous-produits de la tomate transformée peuvent
atteindre plus de 10 millions de tonnes à l’échelle mondiale. En Algérie, il n’y a pas de
statistique officielle sur le volume de ces déchets, mais d’après nos estimations, ils peuvent
dépasser 160 000 tonnes par an. Une partie est utilisée dans l’alimentation animale et le reste
est mis à la décharge malgré leur richesse en nutriments comme les protéines, les sucres, les
fibres insolubles, les huiles, les caroténoïdes, etc. Ces nutriments rendent ces déchets très
appropriés pour leur exploitation en tant que matière première dans la production de
substances à intérêt industriel par fermentation. Ainsi nous nous sommes intéressés à la
valorisation des déchets de tomates industrielles par FMS car ce produit est particulièrement
abondant dans la région Nord-Est de l’Algérie.

Ce travail fait suite à une étude antérieure où la protéase neutre a été produite sur
milieu à base de déchets de tomate par des fermentations en milieux liquides (FML) en
Erlenmeyrs par Aspergillus oryzae (Ahlburg) Cohen 1042.72. Les résultats nous ont permis
de découvrir un substrat convenable pour la croissance de la souche fongique et aussi pour la
production d’enzymes protéolytiques.

Cependant ce type de culture ne permet pas d’utiliser les composants insolubles de ce

substrat. Ainsi, l’objectif de cette thèse est la valorisation des déchets de tomate par FMS afin
d’exploiter toute la matière organique, soluble et insoluble, et qui doit servir à la fois de
support et de nutriments pour le champignon producteur de la protéase. Sa richesse en
protéines peut aussi répondre en besoin d’inducteurs pour la production de protéase. En effet,
dans la biosynthèse des enzymes, on doit souvent exploiter certains mécanismes de
régulation. Ainsi, on peut multiplier par 1000 la production d’une enzyme en ajoutant un
composé inducteur particulier dans la cuve de fermentation. Cet inducteur peut être le substrat
ou son analogue. On peut aussi éviter la répression catabolique en remplaçant les sources de
carbone et d’azote rapidement métabolisables comme le glucose et l’ammoniaque, par des
substances nutritives consommées plus lentement telles que les déchets de tomate.

Dans le cadre du présent travail, l’étude de la composition biochimique du substrat a

été réalisée en première étape. Des cultures en Erlenmeyers ont été effectuées pour la mise au
point du milieu de culture. La sélection des souches les plus productrices de la protéase neutre
en FMS sur déchets de tomate, parmi cinq souches de collection d’Aspergillus a été effectuée.
Plusieurs facteurs importants dans les procédés en FMS ont été testés pour mesurer leur effet
sur la production de la protéase. Ces facteurs sont : la teneur en eau, le pH, le taux de

2
l’inoculum, l’âge des spores, la taille des particules du substrat et la source d’azote. Des
cultures en fermenteur Koji sont réalisées par la suite, en conditions contrôlées d’aération et
d’humidité. Une optimisation de l’extraction de l’enzyme par différentes solutions
d’extraction a été effectuée. Une étude de quelques caractéristiques de la protéase neutre ainsi
que sa purification partielle ont été réalisées en dernière étape.

3
Synthèse bibliographique
 Synthèse bibliographique

Partie I. Synthèse bibliographique

1. La fermentation en milieu solide

1.1. Définition des procédés en FMS

La fermentation en milieu solide (FMS), est définie comme une technique de culture de
microorganismes, essentiellement des champignons filamenteux, sur et/ou à l’intérieur de
particules solides.

Dans les milieux naturels, les fermentations solides se produisent partout, dans les sols
cultivés ou non, dans le compost ou l’ensilage, etc. Le contenu en eau, liée à ces particules,
doit se situer à une activité de l’eau (Aw) permettant l’expression du métabolisme des
microorganismes mais ne doit pas excéder la capacité maximale de rétention en eau de ces
particules solides (Lonsane et al., 1985 ; Krishna, 2005)
Les fermentations sont associées aux biotechnologies et sont essentiellement des
procédés en milieu liquide. Actuellement, les procédés en phase solide connaissent un regain
d’intérêt en occident, avec la valorisation des coproduits agricoles pour la production
d’enzymes, de nourriture animale et pour la production de produits organiques (Singhania et
al., 2009 ; Thomas et al., 2013). Ce procédé est très convenable pour les pays dont l’économie
est basée sur l’agriculture. En effet, les résidus agricoles peuvent être hautement valorisés par
ce type de transformation (Singh et al., 2008).

1.2. Historique des FMS

Les fermentations solides sont utilisées depuis des millénaires avant JC. La fabrication
du pain et des fromages remonte à 4000 ans (Demain et Solomon, 1981 ; Rose, 1981), celle
du Shoyu date probablement à trois milles ans en Chine et à plus de mille ans avant JC au
Japon. Elles se sont ensuite développées dans le secteur alimentaire partout dans le monde
selon le procédé «Koji » ; celui-ci est réalisé avec du riz cuit inoculé avec la moisissure
Aspergillus oryzae puis adapté à d’autres végétaux pour la production d’autres préparations
fermentées.
Le procédé a été transféré en occident par le japonais Takamine, à la fin du 19e siècle,
pour la production d’enzymes. A la fin de la seconde guerre mondiale, les procédés
traditionnels en FMS ont été remplacés par les fermentations en profondeur pour la
production des antibiotiques. En parallèle, les FMS ont été développées et automatisées en

4
 Synthèse bibliographique

Tableau 1: Historique et développement des fermentations solides (Demain et Solomon,

1981; Couto et Sanromán, 2005 ; Pandey et al., 2008).
Période Développement
4000 avant JC. Fabrication du pain par les Egyptiens

En Asie 1000 avant JC. Fabrication de fromage par Penicillium roquefortii

(1000 BP)

2500 BP (Before Present) Fermentation de poisson/conservation avec le sucre, amidon, sel, etc.,
procédé Koji

Vème siècle
Transfert du procédé Koji de la Chine au Japon

XVIIIème siècle
Utilisation de l’acide gallique en tannerie, imprimerie ; fabrication du
vinaigre
1860-1900

1900-1920 Traitement des eaux d’égouts

Production d’enzymes fongique et d’acide kojique

1920-1940

Production d’enzymes fongique, acide gluconique, acide citrique,

développement de « drum-type » fermenteur
1940-1950
Développement de l’industrie fermentaire, production de pénicillines

1950-1960 Transformation des stéroïdes

1960-1980 Production des mycotoxines, aliments enrichies en protéine

Production de métabolites primaire et secondaire, développement des

1980-1990 fermenteurs en colonne, travaux sur la cinétique et « modelling aspects » des
SSF

1990-présent Développement des aspects fondamentaux des SSF,

bioprocédés/développement des produits :

Bioprocédés « Bioremediation » et biodégradation des composés dangereux,

détoxification biologique des résidus agro-industriels, biotransformations,
« biopulping », etc

Produits Substances bioactives : aflatoxine, ochratoxine, acide gibbérellique, ergot

alcaloïdes, divers antibiotiques, antifongiques volatiles, acide clavulanique,
acide mycophenolique

Enzymes : cellulases, protéases, lipases, glucosidases, amylases, etc

Acides organiques : acide citrique, acide fumarique, acide lactique, etc

Autres produits : acide L-glutamique, pigments, vitamines, éthanol, acide

gamma-linolenique, biosurfactants, biopesticides/bioherbicides

4
 Synthèse bibliographique

Hyph
yphes aériennes
Interface air liquide
H
Hyphes aérobiques de
la couche humide

H
Hyphes anaérobiques
de la couche humide
Substrat

Hy
Hyphes pénétrantes

Figure 1 : Schéma des différent

rentes couches mycéliennes au cours de la croissa
oissance fongique en
FMS (Barrios-González, 2012).

développement fonctionnel des différents compar

Figure 2 : Constitution et déve partiments de l’hyphe
(Duchiron et Copinet, 2011).

4
 Synthèse bibliographique

Extrême-Orient (Singh et al., 2008). Ces dernières années, elles se sont étendues à
l’échelle industrielle dans plusieurs pays tels que le Brésil, l’Inde, les USA et la France. Le
succès des compagnies de Biotechnologie est dû à l’utilisation de ces procédés qui permettent
la production des enzymes, de substances pharmaceutiques et de divers métabolites
secondaires (Duchiron et Copinet, 2011). Le tableau 1 résume l’évolution historique de ces
systèmes.

1.3. Microorganismes utilisés en FMS

Les microorganismes utilisés en fermentation solide sont essentiellement les

moisissures et certaines bactéries. Les champignons filamenteux sont les plus importants et
les mieux adaptés pour les cultures en FMS.
Les champignons filamenteux sont caractérisés par la croissance végétative et apicale
des hyphes, la tolérance à des faibles activités de l’eau et des conditions de haute pression
osmotique. En effet, ce type de culture reproduit en quelque sorte les phénomènes naturels,
c'est-à-dire le développement de moisissures à la surface de nombreux produits solides
(Durand, 1998 ; Krishna, 2005 ; Duchiron et Copinet, 2011). Il faut noter que la croissance
fongique ne se déroule pas seulement en surface du milieu de culture, mais également en
profondeur et en hauteur. La pénétration des hyphes dans le substrat facilite l’accès aux
éléments nutritifs, tandis que la production de filaments aériens permet l’accès à de nouveaux
substrats non immédiatement en contact avec le milieu de culture déjà colonisé (Boiron,
1996).
La colonisation du substrat par un champignon filamenteux se fait par extension et
ramification de filaments appelés « hyphes » qui forment le mycélium. Grâce à une solide
structure des parois cellulaires aux extrémités et aux points de ramification, ces filaments
pénètrent la plupart des substrats solides à la recherche des nutriments. L’accroissement des
hyphes s’effectue par les extrémités « apex » où s’effectuent l’essentiel des réactions de
synthèses et de dégradation nécessaires à la construction de la cellule fongique (figure 1 et
2) (Duchiron et Copinet, 2011 ; Barrios-González, 2012).
Par ailleurs, les bactéries sont utilisées pour des fermentations naturelles comme c’est le
cas du compostage, de l’ensilage et des procédés alimentaires. Plusieurs bactéries ont été
testées avec succès pour la production de quelques enzymes comme Staphylococcus sp. et
Brevibacterium sp. (Krishna, 2005). Singhania et al. (2009) rapportent l’utilisation de
plusieurs bactéries en FMS pour la production de l’alpha amylase par Bacillus

5
 Synthèse bibliographique

Tableau 2: Exemples de cocultures fongiques pour la production d’enzymes par

fermentation en milieu solide (Duchiron et Copinet, 2011).

Micro-organismes Produit Substrat

Aspergillus ellipticus et A. Cellulases Bagasse
fumigatus

Trichoderma reesei et A. Xylanases

phoenicus

Trichoderma reesei LM- UC4 Cellulases Bagasse

et A. niger

Thermoascus aurantiacus et A. β-glucosidases, laccases, Paille d’avoine

niger pectinases et amylases

[Link] et Fusarium laccases, pectinases et

monoliforme amylases
Trametes versicolor et [Link]

Trichoderma reesei et cellulases et xylanases Coque de graine de soya et son

[Link] de blé

Penicillium oxalicum SAUE- xylanases et laccases Bagasse et autre coproduit

3.510 et Pleurotus ostreatus végétal
MTCC 1804

6
 Synthèse bibliographique

amyloliquefaciens ATCC 23842, de l’iturine A (un antifongique) par B. subtillus, de la

poudre de B. thuringenesis, de l’acide lactique par Lactobacillus delbrueckii, de la tannase de
Lactobacillus sp., et de l’hydrogène biologique par Clostridium tyrobutyricum JM1. D’autre
part, Mahanta et al. (2008) ont réalisé la production de protéase et de lipase par Pseudomonas
aeruginosa PseA, alors que Dutt et al. (2009) ont produit une protéase à activité présure par
B. subtillus avec le son de riz et la farine de soja comme substrat. Lazim et al. (2009) et
Anisha et al. (2010) ont effectué des FMS par les bactéries filamenteuses Streptomyces sp.
CN902 et S. griseoloalbus pour la production de la protéase alcaline et l’alpha- galactosidase
respectivement.
Les levures sont aussi utilisées en FMS pour la production d’éthanol et l’alimentation
humaine et animale. Des procédés de fermentation en milieu solide utilisant des cocultures de
champignons sont décrits dans le tableau 2.

1.3. Avantages et inconvénients des procédés en FMS

Les procédés en FMS présentent plusieurs avantages mais aussi quelques inconvénients.
Parmi les avantages du système en phase solide, on peut citer : une productivité volumétrique
élevée, une simplicité de la technique, un volume limité et les investissements réduits, une
faible exigence en énergie, une inoculation directe possible, un apport d’eau limité, des
conditions proches de celles observées dans la nature pour la croissance des champignons,
une absence de formation de mousse et une utilisation directe du produit.

Le système FMS présente des désavantages tels que : un contrôle difficile de la

fermentation, un échauffement éventuel, une énergie importante exigée pour les systèmes
avec mélangeur, un inoculum sporogène important, des difficultés de passer à des volumes
très grands et un risque de contamination bactérienne (Larpent-Gourgaud et Sanglier, 1992).

6
 Synthèse bibliographique

Tableau 3: Comparaison de la production d’enzymes issues d’une culture

d’Aspergillus niger par fermentation en milieu liquide et en milieu solide
(Duchiron et Copinet, 2011).

Activité FMS FML

enzymatique (UI/Litre) (UI/Litre)

Endocellulase 7900 108

Exocellulase 1560 16
Cellulase(s) 970 6
Xylanase 27 900 330
Pectinase 56 000 472
Amylase 3 000 21

7
 Synthèse bibliographique

1.3. FMS versus FML

La production des différents métabolites est beaucoup plus importantes dans les
procédés en FMS comparée à celle des cultures submergées (Thomas et al., 2013). Celle des
enzymes ramenée au volume des réacteurs est près de cent fois plus importante en culture
solide (Duchiron et Copinet, 2011). Les premières applications non alimentaires des FMS ont
porté sur la production d’enzymes, en particulier les hydrolases qui agissent sur les polymères
végétaux. En effet, ces enzymes ne sont produites que par un système inductible par un
polymère naturel. Ces polymères sont très peu solubles en phase aqueuse. En phase solide, le
substrat de base est lui-même l’inducteur et se trouve à une concentration bien élevée. Le
tableau 3 indique les différences entre les deux procédés au cours de la production de
quelques enzymes.

2. Applications des fermentations en milieu solide

Les FMS sont traditionnellement utilisées en Asie pour la fabrication d’aliments comme
le Miso, le Tempeh, le Sufu et le Saké, avant qu’il ne soit mis en œuvre pour la fabrication
d’enzymes, d’acides organiques et d’autres métabolites ainsi que des spores et des
champignons supérieurs (Krishna, 2005 ; Pandey et al., 2008 ; Duchiron et Copinet, 2011).

2.1. Préparation d’aliments

Selon Durand (1998), de nombreux aliments traditionnels sont obtenus par FMS dans
les pays orientaux et en Afrique.

2.1. 1. Pain
Le pain est l’aliment de base de nombreuses sociétés. Il est le résultat d’une
fermentation alcoolique provoquée par diverses levures, essentiellement Saccharomyces
cerevisiae qui est utilisée comme levain. Les espèces suivantes sont également présentes :
Candida holmii, Pichia saitoi et Candida krusei. Une fermentation lactique est également
impliquée avec certains lactobacilles (Lb. plantarum, Lb. brevis var lindneri, Lb. fermentum,
Lb. fructivorans) et leuconostoc mesenteroïdes (Larpent-Gourgaud et Sanglier, 1992).

7
 Synthèse bibliographique
Tableau 4: Principaux aliments d’origine africaine ou asiatique, produits par FMS (Rose, 1981 ; Larpent-
Gourgaud et Sanglier, 1992 ; Panda et al., 2010).

Aliment fermenté Substrat(s) Microorganisme(s)

Ang-kak Riz, maïs Monascus purpureus

Banku Maïs, manioc Bactéries lactiques, levures

Bonkrek Coco Rhizopus oligosporus

Burukutu Sorgho, manioc Candida, [Link],

bactéries lactiques

Gari Manioc Geotrichum candidum,

Corynebacterium manihotis
Bactéries lactiques

Hamanatto Soja, riz, blé Aspergillus oryzae, Streptococcus,

Pediococcus

Ingera Maïs, blé, sorgho Candida guilliermondii

Lao-chao Riz Rhizopus oryzae, Rh. Chinesis,

Chlamydomucor oryzae,
Saccharomycopsis

Miso Riz, soja et orge Aspergillus sojae

Aspergillus oryzae

Ogi Maïs Aspergillus, Fusarium

Cephalosporium,
Penicillium, bactéries lactiques,
Candida vini

Shoyu Soja, blé Aspergillus oryzae, Mucor,

Rhizopus

Thumba Millet Endomycopsis fibuliger

8
 Synthèse bibliographique

2.1.2. Fromage
Le fromage est préparé depuis l’antiquité pour conserver les constituants du lait.
L’affinage des fromages avec des moisissures représente une part importante des
fermentations solides dans le domaine des aliments fermentés traditionnels. Les fromages
persillés comme le roquefort ou les fromages présentant un développement mycélien de
surface tel que le camembert sont parmi les plus connus. Le roquefort est connu depuis un
millénaire dans le Causse Aveyronnais (entre Montpellier et Albi). Les levains sont des
streptocoques mésophiles, des lactobacilles et une suspension des moisissures (Penicillium
camemberti et P. roquefortii (Larpent-Gourgaud et Sanglier, 1992 ; Labeille, 1997).

2.1.3. Aliments fermentés

Diverses préparations alimentaires asiatiques ou africaines sont obtenues par
fermentations à partir des végétaux tels que le riz, le blé, le soja, le maïs, le sorgho, l’orge, le
millet, le manioc, le coco et autres. Dans ce type de fermentation, interviennent souvent des
moisissures pour l’hydrolyse de l’amidon et des protéines. Par la suite, les bactéries lactiques
et les levures agissent par une double fermentation lactique et alcoolique.
Plusieurs de ces produits tels que le Miso, le Shoyu, le Koji et la choucroute sont bien
connues et d’autres sont moins réputés, tels que le Ang-kak, le Banku, le Burukutu, le
Hamanatto et le Lao-chao (voir tableau 4) (Panda et al., 2010). Les graines de café, les fèves
de cacao et les feuilles de thé sont fermentées après récolte sur lesquelles les bactéries et les
levures développent les aromes caractéristiques et influencent ainsi la qualité et le goût du
produit fini (Rose, 1981 ; Larpent-Gourgaud et Sanglier, 1992).

2.2. Production d’enzymes

À l’origine, les premières enzymes préparées industriellement provenaient de

fermentations en milieux solides. C’est le cas du procédé Koji qui est une tradition plus que
millénaire dans les pays d’Orient. Celui-ci a été introduit en Occident par le japonais
Takamine qui a développé aux Etats-Unies, la production de la « Takadiastase », un mélange
d’amylase et de protéase d’Aspergillus oryzae, par fermentation solide de son de blé (Joyeaux,
1982). Cette préparation enzymatique a été destinée pour remplacer le malt dans les
distilleries (Labeille, 1997).
Plusieurs travaux ont été réalisés en FMS pour la production d’enzymes à importance
industrielle telles que les protéases, les cellulases, les ligninases, les xylanases, les pectinases,
les amylases, la glucoamylase, polygalacturonase, etc (Ellaiah et al., 2002 ; Abidi et al.,

8
 Synthèse bibliographique

Tableau 5: Les enzymes produites par fermentation solide (Singh et al., 2008).
Enzyme Organisme Substrat(s)
α-amylase Aspergillus sp. Son de blé

[Link] COC+amidon+peptone
Son de blé+GOC

Bacillus subtilis Son de blé

Bacillus sp. PS-7 Son de blé+glycérol+farine

de soja

Cellulase Aspergillus niger KK2 paille de riz+son de blé

Penicillium decumbens paille et son de blé

Chitinase Aspergillus sp. S1-13 coquilles de crabe

Trichoderma harzianum son de blé+chitine+extrait de levure

Penicillium aculeatum NRRL 2129 son de blé

Glucoamylase Aspergillus sp.

HA-2 son de blé+saccharose

Lipase Aspergillus niger

son de blé+huile d’olive
Penicillium simplicissimum
tourteaux de soja
Rhizopus oligosporus
farine d’amande
Aspergillus awamori
déchets de raisin
Pectinase Penicillium viridicatum
RFC3 Son de blé+bagasse d’orange (1 :1)

Bacillus sp. Son de blé+

Acide polygalacturonique

Aspergillus niger
Son de blé+farine de soja
Phytase Mucor racemosus
NRRL 1994 Son de blé+tourteaux de sésame

[Link]. son de blé+ protéine de soja

écorce verte
Protéase alcaline Bacillus sp.
son de blé
Bacillus sp. P-2
tourteaux de noix de coco+son de
A. oryzae blé (1 :3)
NRRL 2217
son de blé
Protéase neutre A. oryzae
NRRL 1808
poudre de Larrea tridentata Cov.
Aspergillus niger
Aa-20 Epis de maïs

Tannase Aspergillus foetidus

Son de blé
Xylanase [Link]
Farine de sorgho
Trichoderma harzianum
Son de riz
Bacillus sp.
JB-99

9
 Synthèse bibliographique

2008 ; Mamma et al., 2008 ; Shankar et Mulimani, 2007 ; Sukumaran et al., 2009 ;
Ustok et al., 2007). Des études de procédés FMS pour la production d’autres
enzymes (inulinases, phytases, tannase, acide phénolique estérase, présure microbienne, aryl-
alcool oxidase, oligosaccharide oxidase, tannin acyl hydrolase, a-L arabinofuranosidase) sont
en réalisation (Xiong et al., 2007). D’après Singh et al. (2008), la production d’enzymes par
fermentation solide aura un rôle important dans l’avenir de la biotechnologie ; le tableau 5
présente la liste de ces enzymes.

[Link] des acides organiques

De nombreux acides organiques, résultant du métabolisme des oses, peuvent
s’accumuler dans le milieu de culture. Ce sont des produits terminaux de la glycolyse (acide
lactique et propionique), ou résultant de l’oxydation incomplète des oses (acide citrique,
itaconique, gluconique). On peut citer aussi l’acide acétique qui provient de la
déhydrogénation de l’alcool en présence d’oxygène (Rivière, 1975).
Selon Soccol et al. (2008a), les acides organiques sont des ingrédients les plus utilisés
dans la préparation des aliments et boissons. Parmi ces acides organiques, les acides (citrique,
acétique, lactique, tartarique, malique, gluconique, propionique et fumarique) sont utilisés
dans divers secteurs industriels. Les acides organiques issus du cycle de Krebs peuvent être
produits par fermentation.
La production par FMS permet d’obtenir des rendements de production élevés,
comparée aux fermentations liquides. L’utilisation des résidus agro-industriels réduit les coûts
de production et s’avère écologique. L’acide citrique est obtenu par la levure Yarrowia
lipolytica NCIM 3589 (Imandi et al., 2008), et par Aspergillus niger (Roukas, 2005). L’acide
kojique est produit par Aspergillus oryzae en FMS, l’acide itaconique est obtenu par
l’[Link] ou [Link] (Larpent-Gourgaud et Sanglier, 1992). Les autres acides
organiques, dont l’acide citrique et l’acide acétique représentent les trois-quarts des acidulants
alimentaires, sont présentés dans le tableau 6.

[Link] des spores

La spore est une forme de vie la plus résistante à la chaleur, aux UV, à la dessiccation et
aux produits chimiques. Certaines bactéries telles que les Bacillus et les Clostridium
(bactéries à Gram positif) et les champignons ont la capacité de former des spores lorsque les
conditions de croissance sont défavorables. Ces spores retournent à l’état fonctionnel par la
germination si elles retrouvent des conditions convenables à la croissance (figure 3).
9
 Synthèse bibliographique

Tableau 6: Production des acides organiques par fermentation solide à partir de divers
substrats (Soccol et al., 2008).

Acide organique Microorganisme Substrat Rendement

(g/kg)
Acide citrique [Link] LPB 21 Bagasse de manioc 269
[Link] DS 1 Bagasse de canne à sucre 198
[Link] NRRL 328 Pulpe de pomme 816
[Link] NRRL 567 771
[Link] ATCC 9142 Caroube 264
[Link] NRRL 328 Bagasse de canne à sucre 523
[Link]
Déchets d’ananas 300
Acide lactique Lactobacillus
delbrueckii Bagasse de canne à sucre 249

Acide oxalique [Link] SL1 Patate douce 26.4

Acide gluconique [Link] ATCC10577 Figue 490

aa b c

d e

Figure 3 : Les spores fongiques et bactériennes : (a) Aspergillus ([Link]), (b)

Penicillium ([Link]), (c) Acremonium ([Link]), (d) Beauveria bassiana
([Link]), (e) Bacillus thuringiensis ([Link]).

10
 Tableau 7: Les spores des microorganismes produites par fermentation solide
(Ramachandran et al., 2008b ; Bhanu Prakash et al., 2008).

Spores Substrat de production

Metarhizium anisopliae Mélange de son et d’enveloppe de riz

Mélange de riz, orge et sorgho

Coiothyrium minitans Avoine, blé et son de blé

Verticillium lecanii Riz, son et enveloppe de riz

Beauveria bassiana Bagasse de canne à sucre, son de blé, pomme de terre

déclassée

Mucor bacilliformis Mousse de polyuréthane

Penicillium roquefortii Graines de sarrasin

Penicillium nalgoviensis Pain

Trichoderma harzianum Bagasse

Aspergillus niger Graines de sarrasin

Clonostachys rosea Riz

Bacillus thuringiensis Son de blé, riz, soja moulu, poudre de citron, enveloppe
de riz

B. sphaericus Graine de coton, graine de lin, son de blé, graine de

sésame
 Tableau 8: Les applications des spores produites par FMS
(Ramachandran et al., 2008b).

(A) Dans le contrôle biologique

Spores Organisme cible Culture protégée

Beauveria bassiana Diatraea saccharalis Maïs

Le perce-canne à sucre

Ostrinia nubilalis Maïs

La pyrale du maïs

Bacillus thuringiensis Larve de castor semilooper Graine de ricin

Verticillium lecanii Aleurodes (mouches Diverses cultures

blanches)

Coniothyrium minitans Sclerotinia sclerotiorum Laitue

Colletotrichum truncatum Sesbania exaltana Soja

Clonostachys rosea Botrytis cinerea Fraises

(B) Dans la biocatalyse

Spores Réaction de bioconversion

Penicillium roquefortii Acide octanoique 2-heptanone

Aspergillus niger Glucose acide gluconique

Penicillium digitatum Géraniol, nerol, citral et l’acide

géranique methylheptenone
 Synthèse bibliographique

La production des spores par FMS ne peut être remplacé ni rivalisé par FML. En effet,
le premier procédé permet d’obtenir des spores en quantité et qualité répondant à la demande
du marché mondiale (Ramachandran et al., 2008b). Divers résidus agroindustriels ont été
utilisés pour la production des spores mais aussi des supports inertes tels que les particules de
pouzzolane (tableau 7) (Larroche et al., 1986).
Les procédés de FMS permettent de produire des quantités considérables de spores
ayant de meilleure qualité, par exemple la résistance aux UV ou à une dessiccation. Elles sont
viables et maintiennent les activités enzymatiques même après une longue période de
conservation, comme c’est le cas pour la glucose oxidase de l’[Link] (Ramachandran et al.,
2007 ; Ramachandran et al., 2008 a et b).
Les applications des spores sont bien nombreuses et intéréssantes (voir tableau 8 A et
B). Selon Boiron (1996), Beauveria bassiana agit comme insecticide (entomopathogène)
contre le doryphore et le nématode Globodira pallida et les larves de Galleria mellonella,
Metarhizium anisopliae inhibe Naharnava pesticata (parasite de canne à sucre) ainsi que de
nombreux insectes parasites des feuilles de céréales et des plantes horticoles. Le champignon
Verticillium lecanii est un parasite d’un grand nombre d’insectes, de coléoptères et d’acariens.
Les spores de ces champignons insecticides se développent et envahissent le corps de l’insecte
en libérant des toxines.
Certaines espèces fongiques sont capables d’inhiber d’autres champignons
phytopathogènes. C’est le cas de Verticillium lecanii qui inhibe le développement
d’Uromyces dianthii et certaines rouilles telles que Pucciana horiana. D’autres sont des
mycoherbicides, tel que Colletotrichum qui agit sur les espèces végétales Aeschynomena
virginica et Jussiaea decurrens pour le traitement des champs de soja et de riz (Botton et al.,
1990).
Selon Larpent-Gourgaud et Sanglier (1992), le principal insecticide biologique
commercialisé à grande échelle est Bacillus thuringiensis. Cette bactérie au moment de la
sporulation produit une protéine soluble dans la cavité digestive des insectes. Des protéases
transforment cette protoxine en molécule toxique active.

[Link] des champignons supérieurs

La culture de champignons comestibles comme Agaricus bisporus, le champignon de

Paris (figure 4) est aussi un procédé de FMS. En effet, avant qu’apparaisse, par fructification,
la partie aérienne qui sera consommée (le carpophore), le champignon se développe d’abord
sous forme mycélienne à l’intérieur du compost, le substrat solide (Durand, 1998).
10
 Synthèse bibliographique

Tableau 9 : Champignons et substrats utilisés pour leur production (Fan et al., 2008).

Espèces Substrat de production

Agaricus, Pleurotus, Volvariella. Paille de riz
Pleurotus, Agaricus, Stropharia, Volvarielle Paille de blé
Pleurotus, Lentinula Pulpe de café
Lentinus, Pleurotus, Hericium, Auricularis, Sciure
Ganoderma, Grifola, Flammulina
Pleurotus, Volvariella Déchets de coton issue de l’industrie du
textile
Pleurotus, Lentinus Ecorce des graines de coton
Pholiota, Lentinula, Tremella Buches
Pholiota, Auricularis, Coprinus, Sciure, son de riz
Flammulina, Lentinula
Pleurotus, Hericium, Lentinula Maïs

Pleurotus, Stropharia Papier

Agaricus Fumier du cheval (frais ou composté)

Pleurotus Déchets de sucrerie (bagasse et molasse),

paille d’haricot, paille de coton, coques de
cacao
Volvariella Feuilles de bananier

Figure 4 : Exemples de champignons supérieurs cultivés par FMS

(De gauche à droite : Agaricus, Pleurotus ostreatus, Agaricus augustus)
[Link]

11
 Synthèse bibliographique

La production mondiale des macrochampignons se mesure en centaines de milliers de

tonnes. Diverses espèces sont ainsi cultivées, Volvariella volvacea, Agaricus bisporus,
Pholiota nameko, Auricularia auricularia, A. polytricha, Lentinus edodes, Pleurotus
ostreatus, Coprinus fimetarius, etc. Les substrats utilisés sont également très diversifiés
fumiers de chevaux, paille, effluents liquides, lactoserum, ensilages, liqueurs sulfitiques,
marcs, etc (Boiron, 1996) et les déchets de tomate pour la culture de Pleurotus ostreatus
(Assi et King, 2007).
La production est réalisée à travers le monde, en particulier aux Etats-Unis, en Chine,
aux Pays-Bas, en France, au Japon, à Taiwan, en Corée, etc. La compétence des champignons
à transformer divers substrats en protéines est plus efficace que celle des plantes et des
animaux. La consommation de ces champignons est bénéfique. En effet, le carpophore est peu
calorique, à teneur faible en lipides et cholestérol mais riche en protéines, carbohydrates,
fibres, vitamines et minéraux (Fan et al., 2008) (voir tableau 9).

[Link] de métabolites secondaires

Au cours de ces dernières années, de nombreux métabolites secondaires ont été

découvert. Ce sont des molécules ayant des activités nouvelles dans divers champs
d’applications : pharmacie, cosmétique, alimentation et agriculture. Ils sont utilisés en tant
qu’anti-inflammatoires, hypotenseurs, anti tumoraux, anticholestérolémique, insecticides,
régulateurs de la croissance végétale ainsi en tant qu’herbicide et pesticide écologiques. Ils
comprennent les acides, les alcaloïdes, les antibiotiques, les immunodépresseurs, les
immunistimulants, les arômes et les enzymes (Boiron, 1996). Le tableau 10 regroupe les
différents métabolites secondaires produits par FMS.
Les métabolites secondaires se caractérisent par le fait que leur production n’est pas
indispensable à la croissance du micro-organisme, qu’ils sont de structure et d’activité
biologique des plus diverses, qu’ils possèdent des voies de synthèse qui leurs sont propres à
partir de produits du métabolisme primaire et qu’ils sont généralement produits en faible
quantité (Larpent-Gourgaud et Sanglier, 1992).
Les métabolites secondaires sont généralement produits par fermentation par un nombre
limité d’organismes principalement par les actinomycètes et les champignons, à la fin de leurs
cycles de croissance, souvent pendant la phase stationnaire (Barrios-González et Mejía,
2008).

11
 Synthèse bibliographique

Tableau 10 : Les métabolites secondaires produits par fermentation solide (Botton et al.,
1990 ; Larpent-Gourgaud et Sanglier, 1992 ; Krishna, 2005 ; Barrios-González et Mejía,
2008).
Métabolite secondaire Microorganismes Activité biologique Substrat de culture
Lovastatine ou Aspergillus terreus Hypocholestérolemique Support inerte
Monacoline K A. flavipes Anti tumorale Son de blé
Monascus sp Riz

Cyclosporine A Tolypocladium inflatum Immunodépresseur Son de blé

(administré après
transplantation d’organe),
anti-inflammatoire,
antifongique et antiparasite

Acide mycophenolique Penicillium brevi- Immunodépresseur Son de blé

compactum
P. sp

Nigerloxine Aspergillus niger Antioxydant par inhibition Son de blé

de lipoxygénases, anti-
inflammatoire, anti
allergique, anticancéreux

Penicilline G Penicillium chrysogenum Antibiotique Bagasse de canne à sucre

Blé grossièrement moulu

Cephalosporine C Acremonium chrysogenum Antibiotique (BGM)

Griséofulvine [Link] Antibiotique Son de riz

Rifamycine SV Amycolatopsis mediterranei Antibiotique Son de blé

Neomycine Streptomyces mainensis Antibiotique Blé grossièrement moulu

Cephamycine [Link] Antibiotique BGM/tourteaux des

graines de coton

Tetracycline Streptomyces sp. Antibiotique Cosse de cacahuètes,

Streptomyces viridefaciens résidus de patate douce
ATCC 11989

Iturine Bacillus subtilis Antifongique Son de blé

(champignons
phytopathogènes)

Surfactine Bacillus subtilis Biosurfactant, inhibiteur Résidus de soja (Okara)

de coagulation de la fibrine
et agent de lyse des :
érythrocytes, spheroplastes
et de protoplastes de
quelques bactéries

11
 Synthèse bibliographique

2.6.1. l’acide gibbérellique

Les gibberellines sont des hormones régulatrices de la croissance des plantes
supérieures. Parmi ces molécules l’acide gibbérellique ou (GA3), est le plus important. Il peut
être obtenu par synthèse chimique ou par fermentation (Botton et al., 1990 ; Machado et
Soccol, 2008).
Les gibberellines sont produits par certaines souches fongiques et bactériennes.
L’organisme producteur par fermentation industrielle, est Fusarium moniliforme forme
imparfaite de Gibberalla fujikuroi qui produit 25 gibberellines (Barrios-González et Mejía,
2008). Des investigations de FMS ont été réalisées pour augmenter le taux de production et
réduire les coûts de production et de l’extraction. Pour cela plusieurs substrats naturels et
synthétiques ont été étudiés (Machado et Soccol, 2008).

2.6.2. Les pigments

Les colorants étaient connus et utilisés depuis la plus haute Antiquité, notamment
comme teintures et produits cosmétiques. Les pigments naturels sont préférables par rapport
aux colorants synthétiques. Ils peuvent être métabolisés et représentent des propriétés anti-
oxidantes. Ceci a augmenté la demande pour les colorants naturels, notamment ceux obtenus
par fermentation (Carvalho et al., 2008).
Selon Larpent-Gourgaud et Sanglier (1992) et Carvalho et al. (2008), les principaux
pigments d’origine microbienne commercialisés sont:
• la riboflavine (vitamine B2), pigment jaune produit par Eremothecium ashbyii et
Ashbya gossypi,
• le pigment rouge produit par Monascus purpureus et M. ruber et obtenu par
fermentation solide du riz,
• la caroténoïde, pigment jaune précurseur de la vitamine A tel que la β-carotène,
produite par la moisissure Blakeslea trispora (Botton et al., 1990) et par les micro-
algues halotolérantes Dunalielle salina et D. bardawil.

Les souches fongiques potentielles pour la production des colorants en FMS sont
regroupées dans le tableau 11.

2.6.3. Les composés aromatiques

Feron et al. (1996), estiment qu’environ 100 composés aromatiques peuvent être
produits par des microorganismes. Ainsi, divers arômes et senteurs tels que l’anis, le miel,

12
 Synthèse bibliographique

Tableau 11: Les différentes souches fongiques productrices de colorants par FMS
(Carvalho et al., 2008)

Souches fongiques Pigments

Blakeslea trispora DSM 2387,DSM 2388, β-carotène

ATCC 14271

Sphingomonas echinoids DSM 1805 autres caroténoïdes

Acremonium diospyri DSM 2939, ATCC
9066
Dacrymices deliquescens ATCC 13293,
ATCC 13295, ATCC 13292
Mucor azygosporus ATCC 15087
Neurospora crassa ATCC 10816, ATCC
26187

Monascus sp. DSM 1604, ATCC 16360, Pigments rouge

ATCC 16362, ATCC 16365, ATCC 16427

Acremonium diospyri DSM 2939, Riboflavine (vitamine B2)

ATCC9066
Candida sp. DSM 70109, ATCC 10539,
ATCC 9058
Eremothecium ashbyii ATCC 26614, ATCC
36179
Pichia guilliermondii DSM 70051

12
 Synthèse bibliographique

l’amande, le fruité, la banane, la rose, la lavande, le jasmin et l’herbe, peuvent être

obtenus par fermentation.
Les champignons producteurs d’arômes appartiennent à tous les groupes systématiques
à l’exception possible des myxomycètes. Plusieurs Aspergillus (A. niger, A. oryzae), des
Penicillium, Alternaria, Cephalosporium et Fusarium libèrent sur milieu solide, des
composés volatils dont les six principaux sont les suivants : 3-methyl-butanol, 3-octanone, 3-
octanol, 1-octène-3-ol, 1-octanol et 2-octène-1-ol (Larpent-Gourgaud et Sanglier, 1992).
Bramorski et al. (1998 a et b) ont étudié la production de substances aromatiques chez les
moisissures Ceratocystis fimbriata et de Rhizopus oryzae cultivées en milieu solide sur divers
résidus agro-industriels.
Certaines bactéries synthétisent également des composés aromatiques. C’est le cas de
Lactococcus lactis var diacetylactis produit du diacétyle (Larpent-Gourgaud et Sanglier,
1992 ; Couto et Sanromán, 2006).
La levure Klyveromyces marxianus produit également en FMS des composés
aromatiques tels que les alcools, les esters et les aldehydes (Soccol et al., 2008b).

2.6.4. Le xanthane

Le xanthane est un polymère de β -1,4 D-glucoside avec des chaînes latérales de 3 unités
d’acétyl D-mannose en β-1,2, d’acide D-glucuronique et de D-mannose-4,6-pyruvate.

Les polysaccharides microbiens possèdent de nombreuses applications industrielles.

Par sa viscosité, le xanthane permet de solidifier les boues de forage, même en milieu marin
(Rivière, 1975). Cet hétéro-polysaccharide a été produit par la bactérie Xanthomonas
campestris en FMS à partir de plusieurs sous-produits agro-alimentaires (Stredansky et al.,
1999 ; Soccol et Vandenberghe, 2003 ; Couto et Sanromán, 2006).

2.6. L’ensilage
L’ensilage est une méthode de conservation du fourrage sous forme humide, avec le
minimum de perte de matières sèches et de valeur nutritive. Il est réalisé à partir de différentes
espèces végétales récoltées à des stades variables de leur croissance. L’ensilage suppose une
anaérobiose pour arrêter la respiration du végétal et empêcher le développement de la flore
aérobie putréfiante (moisissures). Les streptocoques se développent après les coliformes, puis
cèdent la place aux lactobacilles, principalement Lactobacillus plantarum. Divers additifs

13
 Synthèse bibliographique

peuvent être ajoutés pour contrôler la fermentation, tels que l’héxamethylène-tétramine,

l’acide formique ou propionique et les glucides. L’acidification de l’ensilage bloque les
enzymes végétales et inhibe le développement de Clostridium butyricum (Larpent-Gourgaud
et Sanglier, 1992 ; Weinberg, 2008).

2.7. Le compostage
C’est une bioconversion de la matière organique par des microorganismes hétérotrophes
(bactéries, champignons, actinomycètes et protozoaire) en compost. Pour cela, plusieurs
bactéries et moisissures interviennent dans le processus, exemple Bacillus sp., Pseudomonas
sp., Serratia sp., Streptococcus sp. Altermaria sp., Aspergillus sp., Fusarium sp., Monilia sp.,
Mucor sp., Rhizopus sp., Phanerochaete chrysosporium et Trichoderma sp (Couto et
Sanromán, 2006).
Le processus se déroule naturellement lorsque les conditions physico-
chimiques (humidité, oxygène, température, matière biodégradable) sont réunies. Il débute par
une dégradation aérobie intense des sucres et amidon. Cette décomposition provoque une
augmentation de la température qui peut atteindre 70 °C. Par la suite, les composés humiques
sont formés suite à l’action des champignons. Les déchets solides sont ainsi convertis en
fertilisants (Garg et al., 2008).

3. Facteurs affectant les cultures en FMS

Les facteurs majeurs qui affectent la croissance et l’activité microbienne au cours d’une
fermentation solide se résument comme suivant : la nature du substrat et de son prétraitement,
la taille des particules de substrat, l’humidité et l’activité d’eau du substrat, le type et la taille
de l’inoculum, la température, le temps de culture et l’aération (Pandey et al., 2008).

3.1. Substrat et rapport C/N

Les substrats peuvent être classés en trois grandes catégories. La première correspond
aux matériaux organiques naturels, polymères lignocellulosiques ou amylacés insolubles dans
l’eau, jouant en même temps le rôle de support de culture et de substrat. C’est le cas de tous
les substrats solides issus de l’industrie agricole, composés essentiellement d’amidon, de
cellulose, de lignocellulose, de pectine et d’autres polymères.

14
 Synthèse bibliographique

Les cultures réalisées en FMS sur substrats naturels sont mentionnées comme
« cultivation on natural substrate » (Krishna, 2005). La deuxième comprend les matériaux
minéraux tels que les granulés d’argile, la perlite, la pouzzolane, etc. Enfin, les matériaux
synthétiques de type mousses de polyuréthane constituent la troisième catégorie de matrice
solide utilisable par la FMS. Dans ces cas, les matériaux doivent être imprégnés de solutions
nutritives pour assurer la croissance des microorganismes (Durand, 1998, Thomas et al.,
2013).
Au cours de la formulation d’un milieu de culture, il est important de tenir compte de la
composition de la biomasse. En effet, cette dernière se compose de 40-50 % de carbone, 30-
50 % d’oxygène, 6-8 % d’hydrogène et 3-12 % d’azote, en plus du phosphore, soufre et
métaux qui sont aussi importants mais en petite quantité. Le carbone est l’élément le plus
important, suivi par l’azote. Les deux autres éléments sont fournis par la source de carbone
organique (Rodriguez-Leon et al., 2008).
Le rapport C/N est crucial pour la production des métabolites non associés et
partiellement associés à la croissance. Lors de la réalisation des cultures fongiques, il est
important de connaitre le rapport C/N qui pourrait inciter ou retarder la sporulation. Un
rapport de 16 s’est avéré convenable pour les fermentations. La nature et le type de la source
carbonée et azotée représentent les plus importants facteurs des procédés des fermentations
(Rodriguez-Leon et al., 2008). La sélection d’un substrat de fermentation solide dépend de
plusieurs facteurs, principalement, en relation avec le coût et la disponibilité (Krishna, 2005).

3.2. Taille des particules de substrat

La taille des particules est importante pour la croissance des microorganismes car elle
détermine la surface d’échange et le volume d’air interparticulaire qui correspond à l’oxygène
nécessaire à la respiration microbienne. Ce facteur caractérise le substrat et sa capacité
d’échange avec la croissance du microorganisme ainsi que le transfert de chaleur et de masse
au cours de la fermentation. Il s’agit de la fraction du substrat qui sera accessible à la souche
microbienne (Krishna, 2005).
Généralement, les particules de substrat de taille petite présentent une large surface
d’attaque microbienne. Ceci est également avantageux pour le transfert de chaleur et les
échanges gazeux (O2/CO2) entre l’air et la surface solide du substrat. Cependant, une taille
très petite provoque une agglomération du substrat et donc une mauvaise aération. Ceci
affecte la respiration et se traduit par une faible croissance. Au même temps, les particules

15
 Synthèse bibliographique

larges permettent une meilleure aération et par conséquent une bonne respiration, mais moins
de surface d’attaques pour le microorganisme (Rodriguez-Leon et al., 2008).

3.3. Humidité et activité de l’eau

L’eau joue un rôle essentiel dans le déroulement d’une FMS car elle est nécessaire à la
constitution du mycélium, au métabolisme de la croissance, à la mobilité des enzymes et des
nutriments ainsi qu’à la solubilisation de l’oxygène. Dans ces conditions, le développement
des microorganismes dépend de la teneur en eau du milieu de culture ainsi qu’à sa
disponibilité mesurée par l’activité de l’eau (Aw). Aw d’un produit rend compte de sa
disponibilité de l’eau libre par rapport à l’eau liée aux molécules. L’échelle de mesure de
l’Aw est comprise entre 0 et 1 et l’eau pure a une Aw de 1 (Durand, 1998).
L’influence de ce paramètre est caractérisée par une Aw optimale et une Aw limite
propres à chaque microorganisme (Labeille, 1997). Au cours d’une FMS, l’activité de l’eau
peut diminuer suite à une déshydratation du substrat et à l’accumulation des solutés. De
même, le taux d’humidité doit être optimisé et contrôlé. En effet, un taux faible de l’humidité
réduit la diffusion des nutriments, la croissance, la stabilité des enzymes et le gonflement du
substrat. Par contre, un taux élevé de l’humidité provoque une agglomération des particules,
une limitation de transfert des gaz et favorise les contaminations bactériennes (Duchiron et
Copinet, 2011).
Vue l’importance de ce paramètre, il est nécessaire de connaitre sa valeur optimale
avant de lancer une FMS. Selon Krishna (2005), le taux d’humidité dans les procédés en FMS
est en général compris entre 30 et 85 %. Pour les cultures de moisissures, il peut varier de 20
à 70 % ; pour les levures de 60 à 72 %, alors que pour les bactéries il doit être supérieur à 70
%. Une cellule vivante est caractérisée par un taux d’humidité de 70 – 80 %. Lorsque le taux
d’humidité utilisé est faible, ceci présente une barrière naturelle vis-à-vis des contaminations
(Rodriguez-Leon et al., 2008).

3.4. Le pH

Le pH est un autre facteur important dans une fermentation ; il change en réponse à

l’activité métabolique du microorganisme utilisé. La sécrétion des acides organiques conduit à
sa baisse, alors que l’assimilation de ces acides ainsi que l’hydrolyse de l’urée provoquent son
augmentation. Cependant, à chaque microorganisme correspond une valeur optimale de pH
convenable à sa croissance. Les champignons filamenteux peuvent se développer dans un
domaine de pH de 2 à 9 avec un optimum compris entre 3 et 6 (Duchiron et Copinet, 2011).
16
 Synthèse bibliographique

Les levures peuvent pousser dans l’intervalle de pH de 2,5-8,5 mais l’optimum de croissance
est obtenu à 4-5 (Krishna, 2005). Pour la majorité des bactéries, c’est un peu plus au
voisinage de la neutralité (6,5-7,5) (Rodriguez-Leon et al., 2008).

La polyvalence des champignons permet de lutter contre les contaminations

bactériennes, particulièrement par l’utilisation des milieux de cultures à pH faible. Cependant,
à l’inverse des FML, le contrôle du pH au cours d’une FMS fongique est pratiquement
impossible. Ceci est dû à l’hétérogénéité du procédé et au manque d’électrodes adaptées à des
mesures de pH sur des matériaux solides (Krishna, 2005).
Les variations de pH dépendent de la nature de la source azotée et des caractéristiques
de la croissance. Le problème du changement du pH, peut être résolu par l’utilisation de
substrats capables de tamponner le milieu ou par l’utilisation de tampon n’ayant pas d’effet
sur l’activité biologique de la souche utilisée (Krishna, 2005). le milieu de culture peut être
tamponé également par l’addition des sels de calcium ou d’une solution alcaline (Bellon-
Maurel et al., 2003).

3.5. Température et accumulation de la chaleur métabolique

La température est un paramètre important pour le contrôle de la croissance et de la

production des différents métabolites en FMS, dont les enzymes. La chaleur s’accumule
facilement dans ces cultures, car les échanges thermiques sont difficiles dans un milieu peu
hydraté. Ceci peut avoir des effets importants tels que la dénaturation des protéines,
l’inhibition des enzymes, l’augmentation ou l’inhibition de la production des métabolites et la
mort des cellules (Krishna, 2005).
Chaque microorganisme exige une température déterminée pour sa croissance optimale,
proche de la température limite. Ceci a permis de classer les microorganismes selon la
température de croissance en différents groupes : extrêmo-thermophiles ; thermophiles ;
mésophiles et psychrophiles (Rodriguez-Leon et al., 2008).
Connaitre la souche utilisée permet de savoir son adéquation au procédé. La régulation
de la température reste un des problèmes majeurs à surmonter en FMS. En effet, au cours de
sa croissance, un microorganisme produit notamment de la chaleur métabolique qu’il faut
éliminer. Si, en FML, il est trivial de réguler la température du fait que l’eau conduit bien les
calories, il n’en est pas de même en FMS, ces calories ne peuvent être éliminées que par
ventilation de la couche du substrat en fermentation (Durand, 1998 ; Krishna, 2005 ;
Rodriguez-Leon et al., 2008).

17
 Synthèse bibliographique

Les systèmes utilisés habituellement pour évacuer la chaleur par conduction ou

convection se révèlent généralement insuffisants pour réguler correctement la température en
FMS. Dans un réacteur aéré, l’évaporation permet de refroidir efficacement le milieu. Au
cours d’une fermentation fongique de son de blé dans un réacteur-colonne équipé d’un
système d’aération, 64,7 % de la chaleur est éliminée par évaporation, 26,5 % par convection
et 8,65 % par conduction. Le taux d’évaporation peut être contrôlé par une régulation du débit
et du taux d’humidité de l’air qui circule à travers le milieu de fermentation (Labeille, 1997).
Dans le rapport de Krishna (2005), l’évaporation peut éliminer jusqu’à 80 % de la chaleur.

3.6. Aération et agitation

Ces deux paramètres influencent de façon significative une FMS. L’aération fournie
l’oxygène nécessaire aux procédés aérobies ; selon Rodriguez-Leon et al. (2008), la demande
d’O2 peut être satisfaite par une faible aération ce qui n’est pas le cas en FML qui nécessite
des mécanismes pour la dissolution de l’O2 dans le milieu liquide. En FMS, elle permet
d’éliminer la chaleur, le CO2 et les métabolites volatiles produits au cours de la fermentation.
Le taux d’aération dépend des exigences de la souche microbienne, de son
métabolisme et de l’évolution de la chaleur. Le transfert de l’oxygène dépend des paramètres
opératoires et des caractéristiques du substrat utilisé. Parmi ces paramètres : la pression et la
quantité de l’air, la porosité du substrat humide ainsi que son épaisseur, le niveau de
perforation des cuves utilisées, le taux d’humidité et la géométrie du réacteur. Le flux d’air et
sa qualité peut améliorer le contrôle de la température (Krishna, 2005). En pratique,
l’utilisation de l’air saturé en humidité permet d’éviter le séchage du substrat, de maintenir le
taux d’humidité adéquat et le contrôle de la température (Rodriguez-Leon et al., 2008).
L’agitation permet d’assurer l’homogénéité du procédé, d’améliorer le transfert de
masse et de chaleur, de bien répartir l’eau additionnée pour compenser la perte provoquée par
son évaporation (Durand, 2003). Par conséquent, les substrats solides ayant une faible
capacité d’absorption, peuvent être utilisés dans les réacteurs avec agitation. Les substrats de
culture formant des agrégats rendent l’aération et l’agitation difficiles. Le support solide doit
conserver sa structure et supporter les forces d’agitation. Tout ceci doit être pris en compte
lors du choix du substrat. Le microorganisme mis en culture doit également tolérer l’agitation.
L’activité microbienne peut être affectée lors du mixage pour certains substrats et pas pour
d’autres (Couto et Sanromán, 2006).
L’agitation augmente la production de certains métabolites mais peut aussi réduire la
croissance, particulièrement lorsqu’il s’agit de culture fongique. Les mycéliums peuvent être
18
 Synthèse bibliographique

endommagés ainsi que l’adhérence des cellules aux particules de substrat par les effets des
cisaillements. Ceci peut être remédié par l’application d’une agitation intermittente.
Cependant, plusieurs procédés FMS se déroulent en condition statique, c’est le cas des
fermenteurs à plateaux (Krishna, 2005).

3.7. Oxygène et dioxyde de carbone

L’environnement gazeux affecte d’une façon significative la croissance et la production
des enzymes. La FMS permet un accès libre de l’O2 jusqu’au substrat, aucune limitation en
cet élément n’a été observée. En effet, la surface de contact est importante entre la phase
gazeuse, les particules de substrat et le mycélium aérien lors d’une culture sur milieu solide
(Raghavaro et al., 2003).
Le contrôle de la phase gazeuse et du flux de l’air est une approche simple et pratique
qui permet de réguler le transfert des gaz. Le quotient respiratoire théorique des
microorganismes aérobies est égal à 1 ; au dessous de cette valeur il y’a un transfert
insuffisant de l’O2, ce qui se traduit par une faible croissance. Au cours d’une FMS, le
rapport entre l’oxygène consommé et le dioxyde de carbone produit est utilisé pour
l’évaluation de la croissance car ceci est étroitement lié au métabolisme du microorganisme
(Krishna, 2005).
Narahara et al. (1982) rapportent qu’une pression de 5 % de CO2 stimule la production
de protéases par A. oryzae pendant la phase de latence tandis qu’une pression partielle ppCO2
de 10 % la limite. Par ailleurs, Labeille (1997) a trouvé que l’utilisation de réacteur en
colonne aéré stimule la production de glucoamylase d’A. niger.

3.8. Type de l’inoculum

Les spores représentent un moyen d’inoculation plus avantageux que les cellules
végétatives. En effet, elles facilitent la préparation de l’inoculum. Elles sont stables après une
longue conservation ou lors d’une mauvaise manipulation. Cependant, elles présentent
quelques inconvénients : phase de latence plus longue, conditions de germination différentes
de celles nécessaires à la croissance et exigence de quantité importante de l’inoculum.
Les spores sont métaboliquement dormantes, la synthèse des systèmes enzymatiques
appropriés débute après l’induction de l’activité métabolique. Elles permettent alors aux
champignons d’utiliser le substrat pour se développer.
Par ailleurs, certains microorganismes nécessitent un inoculum végétatif riche en
enzymes. Ce type d’inoculum permet de produire plus de protéines lors de la fermentation du

19
 Synthèse bibliographique

son de blé par Chaetomium cellulolyticum (Abdullah et al., 1985). Il a été démontré que lors
de l’utilisation de cellules végétatives de l’Aspergillus niger, comme inoculum, le rendement
de la production de la phytase et la formation de la biomasse sont fortement corrélés à l’âge
de l’inoculum sans oublier l’importance de la densité de l’inoculum dans une fermentation
(Krishna et Nokes, 2001).

[Link]érilité
La mise en place d’un procédé de fermentation nécessite la stérilisation du milieu de
culture avant l’apport du microorganisme choisi. Néanmoins, il existe de nombreux cas en
FMS où l’élimination de la flore autochtone n’est pas nécessaire comme c’est le cas des
levains de boulangerie, de l’ensilage et le compostage. Pour les autres procédés, lorsque le
champignon filamenteux a suffisamment colonisé le substrat, il n’est plus nécessaire de
travailler en condition stérile (Duchiron et Copinet, 2011).

3.10. La biomasse
La mesure de la biomasse est un paramètre fondamental lors du suivi d’une culture
microbienne. En FML, elle peut être estimée par des méthodes directes, alors qu’en FMS, sa
mesure est peu accessible et ce, à cause des problèmes de séparation entre le microorganisme
et le substrat d’une part, et de l’hétérogénéité du procédé d’autre part. Pour cela, des
méthodes indirectes sont donc utilisées (Auria et al., 1993), notamment par le dosage de
certains produits de la fermentation.
Les déterminations qui peuvent être utilisées en FMS concernent la glucosamine,
l’ergostérol, l’ADN, les protéines et l’oxygène/dioxyde de carbone (Cahagnier et Richard-
Molard, 1998 ; Rodriguez-Leon et al., 2008). Ce dernier paramètre semble le plus prometteur
pour l’estimation de la biomasse au cours d’une FMS aérobie (Krishna, 2005). Cependant,
d’après Bellon-Maurel et al. (2003), la mesure des protéines et des acides nucléiques peut
interférer avec les substrats riches en ces composés, quand à la mesure de la chitine et de
l’ergostérol, elle ne convient que pour les cultures fongiques.
L’étude de la croissance de l’A. niger en FMS par Favela-Torres et al. (1998) a été
réalisée par les mesures de protéines, alors que celle de l’Aspergillus oryzae a été évaluée par
Hoogschagen et al. (2001) en mesurant la respiration et celle de la levure [Link] a été
suivie par Neves et al. (2006) par des mesures de l’ATP.

20
 Synthèse bibliographique

Figure 5: Réa
éacteur colonnes de laboratoire (Duchiron et Copine
opinet, 2011).

Eau
stérile Eau
froide

Air
stérile Eau
froide

Figure 6: Schéma d’un réacteurr de laboratoire pour FMS en condition stérile. (1)
1) ccouvercle, (2) sonde
de température, (3) tamis enn ac
acier inoxydable, (4) sonde de température de l’air
air entrant, (5) sonde
d’humidité relative, (6) résistan
tance de chauffage, (7) sonde de température de l’ea
’eau, (8) compteur du
débit d’air, (9) sonde
onde dde niveau d’eau, (10) enveloppe isolante (Durand,
and, 20
2003).

21
 Synthèse bibliographique

4. Les bioréacteurs de la FMS et les répercussions de ces procédés

Le bioréacteur assure quatre rôles essentiels : le stockage, la stérilisation, l’aération et

l’agitation. Il doit permettre également le contrôle des paramètres physiques et chimiques de
la fermentation (Larpent-Gourgaud et Sanglier, 1992).
La conception d’un fermenteur pour cultures solides tient compte des paramètres
suivants : le milieu de culture, la stérilisation des équipements et la prévention des
contaminations, la technique d’inoculation, le contrôle de l’aération, l’intérêt et la nature du
système d’agitation, le contrôle et la mesure des divers paramètres, la possibilité de
développer les équipements à l’échelle industrielle et les coûts d’investissement et d’entretien
(Raghavarao et al., 2003). L’installation d’un bioréacteur en FMS est plus respectueuse de
l’environnement qu’une installation en FML (Krishna, 2005).

4.1. Classification des fermenteurs en FMS

Différents types de bioréacteurs en FMS sont utilisés en fonction des applications

recherchées, à l’échelle du laboratoire ou à l’échelle industrielle. Plusieurs auteurs ont décrit
ces modèles (Durand, 2003 ; Couto et Sanromán, 2006 ; Giovannozzi-Sermanni et Tiso,
2008 ; Duchiron et Copinet, 2011).

4.1.1. Réacteurs de laboratoire

Les études préliminaires de la FMS en laboratoire sont réalisées avec différents
équipements à température constante, sans aération, ni agitation. Ces cultures sont réalisées
dans des boites de Pétri, des jars, des Erlenmeyers, des fioles ou des réacteurs à lit fixe. Le
réacteur à lit fixe se compose d’une ou de plusieurs colonnes. Ces dernières contiennent le
substrat inoculé. Chaque colonne est traversée par un courant d’air humide de bas en haut.
Le réacteur à colonnes comprend un bain–marie thermostaté pour le contrôle de la
température et un dispositif de chromatographie en phase gazeuse pour l’analyse de la
respiration microbienne. Le suivi de la culture s’effectue par sacrifice d’une colonne. Ce type
de fermenteur permet de travailler en conditions stériles (figure 5).
Ce dispositif est idéal pour l’étude au laboratoire ; il a permis l’étude de la croissance
de A. niger dans un réacteur contenant la résine d’amberlite (Favela-Torres et al., 1998), la
production de la xylanase par A. niger avec des tourteaux de noyau de palmier (Abdeshahian
et al., 2009) et la production de α-galactosidase par Streptomyces griseoloalbus avec la farine
de soja (Anisha et al., 2010).
21
 Synthèse bibliographique

Sortie de l’air

Plateaux
Substrat solide

Entr
ntrée d’air

Figure 7: Schéma d'un réacteur

ur à plateaux statique avec aération passive (Couto
to eet Sanromán, 2006).

Figure 8 : Réacteur statique

que avec aération forcée, photographie de Zymotiss : P Plaques pour la
circulation de l’eau thermost
ostatée (à gauche), au cours de la culture (à droite)
e) ((Durand, 2003).

21
 Synthèse bibliographique

Une nouvelle génération de fermenteurs à une colonne a été développée par l’équipe de
l’Inra-Dijon avec un volume de travail de 1 l (figure 6). Ces nouveaux réacteurs sont équipés
d’accessoires supplémentaires par rapport au premier modèle ; à savoir une sonde de
l’humidité relative, une jaquette de refroidissement et un couvercle de chauffage pour la
colonne. Les prélèvements peuvent être effectués au cours de la culture (Durand, 2003).
4.1.2. Fermenteurs pré-pilotes et pilotes
L’échelle pilote est une étape importante dans le développement d’un procédé ; elle
permet de valider les travaux réalisés en laboratoire en vue d’une application industrielle.
Les bioréacteurs peuvent être classés en plusieurs catégories selon le mode d’aération et
d’agitation adopté (Labeille, 1997). On distingue au moins 6 types.
 Réacteur statique sans aération (réacteurs à plateaux) : c’est le plus simple et le
plus anciens des fermenteurs. Il permet la production de tempeh, fromages et d’enzymes
(Smits et al., 1998). Voir figure 7.
 Réacteur statique avec aération forcée : il est aéré par de l’air conditionné passant
à travers le tamis portant le substrat. La régulation de la température a lieu durant la culture
microbienne. Ce type de réacteur est utilisé pour la production de substances cytotoxiques
telles que l’acide mycophenolique et la lovastatine (Raghavarao et al., 2003 ; Durand, 2003).
Voir figure 8.
 Réacteur à agitation alternée sans aération forcée : il s’agit d’une cuve
cylindrique avec un mode d’agitation intermittente. Ceci évite l’agglomération du milieu de
culture et provoque moins de cisaillements pour le mycélium que l’agitation continue. Tout
l’équipement peut être géré manuellement et automatiquement (Krishna, 2005 ; Giovannozzi-
Sermanni et Tiso, 2008). Voir figure 9.
 Réacteur à agitation continue sans aération forcée : le fermenteur rotatif est
essentiellement sous forme de cuves tournantes autour d’un axe horizontale. La performance
de ce genre de réacteur est améliorée par l’étude de la vitesse de rotation et des paramètres
d’agitation. L’étude cinétique de Rhizopus cultivé sur son de blé est un exemple de
fermentation réalisée sur ce matériel (Durand, 2003 ; Giovannozzi-Sermanni et Tiso, 2008).
Voir figure 10.
 Réacteur à agitation continue avec aération forcée : ce type se caractérise par
l’agitation en continue, une addition d’eau par pulvérisation ou par égouttement qui permet un
bon rafraichissement du substrat. Ce système est convenable pour les fermentations à grande

22
 Synthèse bibliographique

Figure 9 : Photographie et sché

schéma d’un réacteur rotatif à agitation alternée, sans aération forcée
(Durand, 2003).

Entrée de remplissage et
d’échantillonnage
Cuve
perforée Sortie d’air

Porte
coulissante
nte

Entrée Axe de la
d’air cuve

Enveloppe d’eau

Figuree 110: Fermenteur à tambour perforé rotatif (Durand

nd, 2003).

22
 Synthèse bibliographique

Figure 11 : Ré
Réacteur pilote en cuve profonde INRA Dijon (Duc
uchiron et Copinet,
2011).

Figure 12 : Photog
hotographie et schéma du réacteur de type Koji: (1) 1) cchambre de Koji, (2)
table perforée ro rotative, (3) dispositif de mélange rotatif, (4,11) vis et dispositif de
déchargement, (5) 5) air conditionné, (6) ventilateur, (7) sortie d’air,, (8
(8) amortisseur, (9)
filtre à air, (10)) ddispositif de remplissage, (12) tableau de contrôle le (Durand, 2003).

22
 Synthèse bibliographique

échelle (Krishna, 2005; Couto et Sanromán, 2006; Giovannozzi-Sermanni et Tiso, 2008).

Voir figure 11.
 Réacteur à agitation alternée avec aération forcée : l’application d’une agitation
de manière discontinue avec le passage d’un flux d’air forcé permettent d’assurer
l’homogénéité et le contrôle des paramètres de culture (taux d’humidité, la température),
ainsi que l’élimination des composés volatiles et du dioxyde de carbone au cours de la
fermentation. Ce système est similaire au Packed-bed. Il contient des vis sans fin pour
mélanger le substrat durant la culture. Sur cette base plusieurs bioréacteurs ont été développés
jusqu’au stade industriel (capacité de plusieurs tonnes), pour des cultures non stérile (Durand,
2003 ; Giovannozzi-Sermanni et Tiso, 2008). Ce modèle est commercialisé par la marque
japonaise Fujiwara qui permet de réaliser des cultures par le procédé traditionnel koji, comme
c’est le cas du fermenteur utilisé dans ce travail (Voir figure 12).

4.2.Répercussions des FMS

Les FMS permettent la production d’aliments riches en protéines, d’enzymes, d’acides

organiques, de spores, … tout en valorisant des sous-produits agricoles. De nombreux
secteurs tels que l’agriculture et l’environnement pourraient exploiter utilement ce procédé.
Le premier pour la production des biopesticides destinés à la lutte biologique ou des
hormones végétales et le deuxième pour la dépollution par bioremediation ou biodégradation
(Roy et al., 2006).
Pour les pays industrialisés, l’utilisation de la FMS a des répercussions essentiellement
économiques et environnementales. Elle peut générer des molécules à haute valeur ajoutée
tout en étant plus économe en énergie que les procédés en phase liquide, et en recyclant
certains sous-produits solides polluants.
Pour les pays du Sud, l’enjeu de la FMS est encore plus important. Ses répercussions
sont cette fois socio-économiques comme l’indique le rapport de Durand (1998). En effet, la
FMS pourrait faciliter la valorisation de tonnages importants de résidus agricoles et agro-
industriels. Ces derniers peuvent être une source nouvelle de produits de première nécessité,
tels que les aliments riches en protéines destinés à l’alimentation animale ou humaine.

23
 Synthèse bibliographique

Tableau 12: Liste des classes d’enzymes selon le profil catalytique et les enzymes
industrielles correspondantes (Østergaard et Olsen, 2010).

Classes Profil catalytique Enzymes industrielles

EC 1 : Oxydoréductases Réactions de transfert d’électrons Catalase, glucose oxidase, laccase, peroxidase

EC 2 : Transférases Transfert de groupements Fructosyltransferase, glucosyltransferase,

transglutaminase

EC 3 : Hydrolases Réactions d’hydrolyse Amylase, cellulase, β-glucanase, lactase, lipase,

mannanase, pectin methyl esterase, pectinase,
phospholipase, phytase, protéase, pullulanase,
xylanase

EC 4 : Lyases Elimination ou addition de Pectate lyase, α-acétolactatedécarboxy-lase

groupements sur double liaison

EC 5 : Isomérases Réactions d’isomérisation Glucose isomérase

EC 6 : Ligases Formation de liaison entre deux Pas encore utilisée

groupements avec dégradation
simultanée d’ATP

23
 Synthèse bibliographique

Lyases 4% isomerases 1% Oxydoreductases

8%
Transferases 2%

Hydrolases 85%

Figure 13: Distribution des différentes classes d’enzymes industrielles (Østergaard

et Olsen, 2010 ; AMFEP, 2013).

Autres levures 3% Algue/plante

champignons 4%
Animal 6%
14%

Humicola 2%
Rhizopus 5%

Bactérie 27%
Penicillium
6%

Trichoderma
6%
Aspergillus
27%

Figure 14 : Distribution des organismes sources d’enzymes industrielles

(Østergaard et Olsen, 2010).

23
 Synthèse bibliographique

[Link] protéases

5.1 Généralités sur les enzymes

Les enzymes sont les catalyseurs biologiques ; elles assurent le déroulement de toutes
les réactions métaboliques de l'être vivant. Leur nombre élevé a conduit à leur classification
en six grandes classes. Chaque classe se caractérise par un profil catalytique et chaque
enzyme porte un numéro qui lui est spécifique (Pelmont, 1995).
Les enzymes industrielles appartiennet à toutes les classes sauf celle des ligases, mais
en majorité à la 3e, celle des hydrolases (figure 13) (tableau 12). En effet, celles-ci
représentent 85 % des enzymes (Østergaard et Olsen, 2010).
Les enzymes industrielles peuvent être extraites de tissus végétaux ou animaux, ou
produites par fermentation par certains microorganismes. Elles sont appréciées pour leur
grande efficacité et spécificité ainsi que pour une contribution à la mise en œuvre de procédés
plus respectueux de l’environnement. Les enzymes microbiennes sont dominantes car elles
offrent plusieurs avantages, en particulier une facilité d’obtention, une possibilité d’améliorer
le rendement et l’éventualité de l’utilisation de matières premières bon marché comme milieu
de culture (Bouix et Leveau, 1999).
Les enzymes fongiques sont largement majoritaires (figure 14); elles représentent 60 %
des enzymes commercialisées (Østergaard et Olsen, 2010).
Aujourd’hui le marché des enzymes industrielles a beaucoup évolué, il est passé de 600
millions de $ de CA en 1995 (Cuvellier et al., 1999) à 4,9 milliards de $ en 2013, marché
supérieur à celui des antibiotiques qui est estimé à environ 2,3 milliards de $ (BCC Research,
2013). On estime que ce marché pourrait doubler d'ici 2020, selon le PDG de Danisco (www.
[Link]/actualité/environnement-thematique_191/).
Les enzymes occupent une place grandissante dans de nombreux secteurs. Cela
s’explique par les nombreuses applications (Sicard, 1982), en particulier en industries
alimentaires qui utilisent 57 %, contre 27 % pour les industries chimiques (Østergaard et
Olsen, 2010). Plusieurs études rapportent également leurs applications dans le domaine
médical (en oncologie et dans de nombreuses autres pathologies) (Mahajan et Badgujar, 2010)
et dans le secteur des biotechnologiques (Vishwanatha et al., 2009). Actuellement de
nouveaux débouchés prennent de l’ampleur, la chimie fine, la nutrition animale et
l’environnement. L’exemple le plus frappant est la production des biocarburants lancée par
plusieurs industriels des enzymes, tel que Novozymes qui s’est lancé dans la production de
bioéthanol en 2012.
24
 Synthèse bibliographique

Enzymes
pharmaceutiques
; 10%
Lipases; 3% Renine; Trypsine; 3%
10%

Carbohydrases;
10%

Protéases
alcalines; 25%
Amylases; 18%

Autres protéases;
21%

Figure 15: Répartition du marché mondial des enzymes, protéases en rouge (Mahajan et
Badgujar, 2010).

Tableau 13: Les exopeptidases et leur mode d'action (Mahajan et Badgujar, 2010).

Protéase Mode d’action Code E.C.

Aminopeptidases •-o-o-o-o-o-o 3.4.11

Dipeptidyl peptidase •-•-o-o-o-o-o 3.4.14

Tripeptidyl peptidase •-•-•-o-o-o-o 3.4.14

Carboxypeptidase o-o-o-o-o-o-• 3.4.16-3.4.18

Peptidyl dipeptidase o-o-o-o-o-•-• 3.4.15

Dipeptidases •-• 3.4.13

24
 Synthèse bibliographique

[Link]
thematique_191/novozymes-roi-des-enzymes-futur-major-des-biocarburants-article_6503/

Parmi les enzymes industrielles, les protéases occupent une position centrale. Elles
représentent environ 60 % du marché global des enzymes (figure 15) (Mahajan et Badgujar,
2010).

5.2 Définition et rôle des protéases

Les protéases appelées aussi protéinases ou enzymes protéolytiques, représentent un
important groupe de la classe des hydrolases, sous classe des peptidases (EC. 3.4.). Elles
catalysent le clivage des liaisons peptidiques des protéines. Ce sont les enzymes responsables
de la digestion des protéines présentes dans nos aliments et interviennent dans de nombreux
processus physiologiques comme la digestion des nutriments, la maturation des protéines
cellulaires, l’activation des formes zymogènes des enzymes digestives, l’inactivation
d’hormones, le transport transmembranaire, la régulation du métabolisme, etc.
Elles sont également très utilisées tant au niveau industriel, qu’au niveau
pharmacologique, médical et analytique.

5.3 Classification et mécanisme d’action des protéases

Les protéases peuvent être classées selon trois types de classifications, soit en fonction
du pH, soit selon le mode d’action ou selon la nature des résidus impliqués dans le site actif.
Dans le premier type on distingue : (i) les protéases acides, actives à partir du pH 2 ; (ii) les
protéases neutres à pH 6,5 et 7,5 et (iii) les protéases alcalines qui agissent à des valeurs de
pH supérieures à 7,5 jusqu’à 11 (Larpent-Gourgaud et Sanglier, 1992 ; Mahajan et Badgujar,
2010).
En fonction du mode d’action, les protéases sont classées en deux groupes, les
exopeptidases et les endopeptidases. Les premières agissent au niveau des extrémités N
terminales pour les aminopeptidases ou C terminales pour les carboxypeptidases (voir tableau
13). Les secondes agissent à l’intérieur de la chaine peptidique.
Le troisième type classe les protéases sur la base de la nature des résidus impliqués dans
le site actif. Ainsi, on distingue quatre groupes : (i) séryl-protéases, (ii) cystéyl-protéases, (iii)
aspartyl-protéases et (iiii) métallo-protéases.

25
 Synthèse bibliographique

Les séryl-protéases (E.C.3.4.21) possèdent au niveau du site actif une triade de résidus,
sérine, aspartate et histidine. Les enzymes digestives appartiennent à ce groupe (Larpent-
Gourgaud et Sanglier, 1992 ; Garrett et Grisham, 2000).
Les cystéyl-protéases (E.C.3.4.22) sont les protéases à thiol, leur site actif contient la
cystéine, l’histidine et l’aspartate. L’ordre des deux premiers résidus varie selon le type de
famille de protéase (cys-his ou his-cys). La papaïne est la plus connue de cette classe où l’on
retrouve également l’actidine et les cathepsines B et L (Larpent-Gourgaud et Sanglier, 1992 ;
Mahajan et Badgujar, 2010).
Les aspartyl-protéases (E.C.3.4.23) sont les protéases acides, anciennement appelées
carboxyl-protéases. Elles contiennent l’acide aspartique dans leur site actif. Ce groupe
comprend la pepsine, la renine, la cathepsine D et beaucoup de protéases fongiques (Mahajan
et Badgujar, 2010). Il comprend également la protéase de VIH qui est une imitation des
aspartate-protéases de mammifères (Garrett et Grisham, 2000).
Les métallo-protéases (E.C.3.4.24) se caractérisent quant à elles par la présence d’un
cation métallique divalent au niveau du site actif. Le plus souvent, il s’agit de l’ion de zinc.
Les métallo-protéases bactérienne exigent du calcium pour leur stabilité (Larpent-Gourgaud et
Sanglier, 1992). Elles sont inhibées par les agents chélatants tels que l’acide ethylène diamine
tetra acetique (EDTA). Parmi ce groupe on retrouve la thermolysine, la collagenase, la
kératinase, la gelatinase et des protéases fongiques et bactériennes (Mahajan et Badgujar,
2010).
Le mécanisme d’action des hydrolases le plus répandu est le suivant :
H2O
R1-R2 + Enz-H R1H + Enz-R2 R1H + R2OH +Enz-H
Réactants Etat de transition Produits

Il ne fait intervenir l’eau qu’après une série d’échanges d’électrons et de protons entre
certains résidus de l’enzyme et le substrat (Mouranche, 1985 ; Cuvellier, 1999). Dans ce cas
un agent nucléophile de l’enzyme transfère un doublet d’électrons à un atome de la liaison à
hydrolyser dont la charge positive est stabilisée par un autre groupement de l’enzyme. Il
forme alors un intermédiaire réactionnel (Enzyme-R2) par rupture de la liaison à hydrolyser,
le fragment de substrat R1étant simultanément déplacé et libéré, en captant un proton cédé par
un résidu de l’enzyme. L’intermédiaire formé avec l’enzyme, est ensuite hydrolysé par une
molécule d’eau qui régénère les résidus du site actif de l’enzyme dans leur forme initiale et
libère le produit de la réaction (Mouranche, 1985).

26
 Synthèse bibliographique

5.4 Rôles physiologiques des protéases

Les protéases agissent dans le métabolisme et la régulation de chaque cellule vivante.

Les protéases extracellulaires hydrolysent les protéines en petites molécules qui peuvent être
absorbées par les cellules alors que les protéases intracellulaires jouent un rôle dans la
régulation du métabolisme. Elles jouent des rôles physiologiques et pathologiques parmi
lesquels le catabolisme des protéines, la coagulation du sang, la croissance et la migration
cellulaire, l’activation des zymogènes, l’inflammation, la croissance tumorale et métastase et
le transport des protéines secrétées à travers les membranes (Mahajan et Badgujar, 2010).
Une autre fonction importante des protéases est la régulation de l’expression des gènes
où le répresseur peut subir une protéolyse par une protéase à ATP. En effet, les modifications
des protéines ribosomales par l’action des protéases sont responsables de la régulation de la
traduction (Mahajan et Badgujar, 2010),
Récemment, de nouvelles fonctions physiologiques ont été attribuées aux protéases
dépendantes de l’ATP chez les bactéries et les eucaryotes. Elles servent comme
intermédiaires dans les réactions de protéolyse, d’insertion des protéines dans les membranes
et aussi d’oligomérisation ou de désassemblage des complexes protéiniques.
Les protéases jouent également un rôle dans la formation des spores bactériennes, des
ascospores des levures, des fructifications ainsi que la libération des conidies fongiques. C’est
le cas par exemple de la sérine protéase du champignon Conidiobolus coronatus, nécessaire à
la libération des conidies (Mahajan et Badgujar, 2010).

5.5 Sources potentielles des protéases

Les protéases comme le reste des enzymes, proviennent de diverses sources : végétales,
animales et microbiennes.

5.5.1 Protéases végétales

Ces protéases végétales exigent la présence du groupe –SH- libre dans leur site actif
(cystéyl-protéase). Les plus connues pour leur intérêt technologique sont la papaïne, la
broméline, la ficine. La première, extraite du papayer (Carica papaya) est une enzyme
thermostable active de pH 5 à 9. La broméline est obtenue à partir des tiges et jus d’ananas
(Ananas comosus) ; elle remplace parfois la papaïne dans l’industrie de la viande. La ficine
pour sa part est extraite du latex du figuier (Ficus carica) (Cuvellier et al., 1999 ; Mahajan et
Badgujar, 2010).

27
 Synthèse bibliographique

De nombreuses autres protéases végétales sont actuellement utilisées dans divers

secteurs telles que la brofasine extraite des fruits de Bromelia fastuosa, utilisée comme
substitut de la protéinase K lors de l’extraction de l’ADN ou la cystéyl-protéase, obtenue à
partir des germes de blé tendre (Triticum aestivum) et la protéase extraite du kiwi (Actinida
chinensis) qui ont des activités coagulantes du lait (Mahajan et Badgujar, 2010 ; AMFEP,
2013).
5.5.2 Protéases animales
Les protéases animales les plus connues sont la trypsine, la chymotrypsine, la pepsine et
la rénine. Ce sont des enzymes digestives, produites sous forme de précurseurs. La
conversion du pepsinogène en pepsine résulte principalement d’une protéolyse
intramoléculaire par rupture d’une liaison Leu-Ile (Gripon, 1985).
Les pepsines bovines et porcines (E.C.[Link],2,3) présentent un intérêt industriel pour
la préparation des fromages, dans les soft drinks et en brasserie (Cuvellier et al., 1999), alors
que la chymotrypsine (E.C.[Link]) est utilisée pour des applications analytiques et de
diagnostic (Mahajan et Badgujar, 2010).
La chymosine (E.C.[Link]) est une aspartyl-protéase constituant la « présure » avec la
pepsine en proportions variables. Elle est l’enzyme idéale, déclenchant la coagulation du lait
par une seule action protéolytique.
Actuellement, une alternative intéressante à l'utilisation de protéases d'origine animale
est leur production par les microorganismes génétiquement modifiés tels que Kluyveromyces
lactis, Aspergillus niger et Escherichia coli k 12. La source d’ADN varie selon l’enzyme
produite (Goursaud et Cuvellier, 1999 ; Volontè et al., 2011 ; AMFEP, 2013).

5.5.3 Protéases microbiennes

Les protéases microbiennes ont dominé le marché mondial des enzymes où elles
représentent une part de 40 % (Mahajan et Badgujar, 2010) car elles possèdent toutes les
caractéristiques recherchées dans les applications biotechnologiques, tout en répondant à la
demande toujours croissante des protéases qui ne peut être assurée par la source végétale ni la
source animale.

Parmi les bactéries, Bacillus subtilis est la souche productrice de la protéase la plus
utilisé industriellement; cette enzyme sert d’additif dans les détergents (Ellouz et al., 2001).
Des protéases appartenant à d’autres genres bactériens sont également disponibles sur le
marché de la biocatalyse, tels que Pseudomonas, Streptomyces, Enterococcus, Listeria,

28
 Synthèse bibliographique

Tableau 14: Liste des protéases fongiques (AMFEP, 2013).

Protéase Souche fongique Domaine(s) d’application
Aminopeptidase ([Link]) Aspergillus niger Alimentaire, technique
[Link]

Rhizopus oryzae Alimentaire

Trichoderma reisei Alimentation humaine et

(Aspergillus organisme animale, technique
donneur)

Carboxypeptidase (3.4.16.x) [Link] Alimentaire

Protéase (dont les coagulantes du [Link] Alimentaire

lait) ([Link]) [Link] (ADN de l’estomac de
veau et de chameau)

[Link] (sans et avec ADN de Alimentation humaine et

Rhizomucor sp.) animale et technique

[Link] Alimentation humaine et

animale et technique

Endothia parasitica (sans et Alimentaire

avec ADN de Cryphonectria
sp.)

Fusarium venematum Alimentaire et technique

Kluyveromyces lactis (avec Alimentaire
ADN de l’estomac de veau)

Rhizomucor miehei Alimentaire et technique

Rhizopus niveus Alimentaire

Trichoderma reesei Alimentaire et technique

28
 Synthèse bibliographique

Thermus, Oenococcus, Chrysobacterium, Microbacterium (Adesh et al., 2002 ; Anisha

et al., 2008 ; Mahajan et Badgujar, 2010 ; AMFEP, 2013).
Les champignons représentent des sources plus variées. Comparés aux bactéries, ils
élaborent une plus large variété d’enzymes. Les enzymes fongiques peuvent être produites par
FMS. La production de la présure microbienne et autres protéases, est réalisée par de
nombreuses espèces : Mucor pussilus, M. miehei, Aspergillus parasiticus, A. niger, A. oryzae,
A. awamori, Rhizopus microsporus, Trichoderma koningii, Pleurotus ostreatus (Chakraborty
et al., 1995 ; Fazouane-Naimi et al., 2010). Elles peuvent aussi être produites en FML par
Penicillium citrinum, [Link], Candida albicans, [Link], Sarocladium oryzae
(Mahajan et Badgujar, 2010). La liste des enzymes actuellement commercialisées est
représentée dans le tableau 14. (AMFEP, 2013).

5.6. Les applications industrielles des protéases

Toutes les protéases possèdent des propriétés caractéristiques par rapport à la

température, le pH, la présence des ions, la spécificité, l’activité et la stabilité. Ces paramètres
biochimiques déterminent l’application industrielle correspondante, en plus du coût de la
production et de son développement à l’échelle industriel et sa demande sur le marché.
Les protéases, comme d’autres enzymes, sont introduites dans plusieurs produits et
procédés industriels grâce à l’éfficacité de leurs propriétés catalytiques favorisées par
l’introduction de nouveaux développements de la biotechnologie. En effet, l'ingénierie des
protéines et l'évolution dirigée par exemple, ont permis un développement efficace de
nouvelles enzymes ayant des propriétés améliorées et la production de nouvelles sur mesure
pour des domaines d'application non encore exploités (Kirk et al., 2002).
Les applications industrielles des protéases englobent plusieurs domaines, elles
évoluent aussi rapidement que les récents progrès technologiques, ce qui permet la production
d’enzymes ayant de nouvelles propriétés et des spécificités de substrat. Une description de
l'application générale des protéases est décrite par Li et al. (2013) dans les détergents à
lessive, la transformation des aliments et l'industrie du cuir. Les auteurs examinent également
le développement croissant des protéases comme une classe d'agents thérapeutiques et les
progrès récents dans le domaine de l'ingénierie de la protéase. Seuls quelques exemples des
applications industrielles des protéases sont décrits ci-dessous.

29
 Synthèse bibliographique

5.6.1. Industrie des détergents

L’utilisation des protéases dans l’industrie des détergents correspond à 25 % du marché
mondial des enzymes (Larpent-Gourgaud et Sanglier, 1992). La protéase de lessive idéale doit
être stable à pH et température élevés et compatible avec les agents chélatants et oxydants. Ce
qui est le cas des protéases ayant un pI proche du pH du détergent en solution. Les protéases
actives à basses températures sont actuellement recherchées en raison de la crise d’énergie et
la prise de conscience pour sa conservation. La majorité des protéases commerciales sont
produites par des bactéries du genre Bacillus (Aehle, 2007) (voir tableau 15). Les protéases
alcalines fongiques sont avantageuses puisque ce sont des enzymes extracellulaires (Mahajan
et Badgujar, 2010).

5.6.2. Industrie du cuir

Cette industrie est l’une des principales causes de la pollution causée par ses effluents
très polluants (sulfure de sodium, sel, solvants et chaux). L’utilisation des enzymes comme
alternative aux produits chimiques a permis l’amélioration de la qualité du cuir et la réduction
de la pollution environnementale (Aehle, 2007).
Les principaux éléments constitutifs de la matière première sont de nature protéique.
Les protéases servent pour l’hydrolyse sélective des constituants noncollagéneux des peaux et
pour l’élimination des protéines non fibrillaires telles que l’albumine et les globulines, dans le
prétannage du cuir. Elles sont utilisées dans toutes les étapes de traitement du cuir (des
protéases alcalines microbiennes pendant le trempage et l’épilage, la trypsine pancréatique
combinée avec autres protéases de Bacillus et Aspergillus pour le confitage (Mahajan et
Badgujar, 2010 ; Østergaard et Olsen, 2010).

5.6.3. Industrie alimentaire

L’utilisation des protéases dans les préparations alimentaires remonte à l’antiquité, à des
fins diverses : la production du fromage, du pain, des hydrolysats de soja et l’attendrissement
de la viande. Actuellement, le nombre de secteurs utilisateurs englobe diverses industries, les
plus importants concernent l’industrie laitière et la brasserie.
En industrie laitière, leur application majeure concerne la production du fromage aux
deux principales étapes à savoir la coagulation du lait et l’affinage. Les enzymes coagulantes
appartiennent à quatre catégories : (i) présure animale (un mélange de pepsine et de
chymosine) ; (ii) coagulant d’origine microbienne (ceux de Rhizomucor miehei, R. pussilus et
Cryphonecteria parasitica sont les plus utilisées) ; (iii) présure végétale (de chardons et de
30
 Synthèse bibliographique

Solanum dobium) ; (iiii) chymosine recombinante (Larpent-Gourgaud et Sanglier, 1992 ;

Aehle, 2007 ; Mahajan et Badgujar, 2010).
La brasserie est également le secteur majeur d’utilisation des protéases. L’hydrolyse
des protéines de l’orge donne des peptides et des acides aminés qui vont assurer l’apport en
azote pour les levures responsables de la fermentation des sucres en alcool et gaz carbonique.
C’est le cas de la protéase de Bacillus subtilis. En post fermentation, ces enzymes éliminent
les précipités et agrégats qui peuvent se former au cours du stockage (Mahajan et Badgujar,
2010).

5.6.4. Industrie pharmaceutique

Les protéases sont des agents thérapeutiques efficaces. Il s’agit des protéases
pancréatique, gastrique, plasmatique, facteurs de coagulation, activateurs de plasminogène, du
venin de serpents et aussi de protéases végétales et microbiennes. Ces enzymes sont utilisées
comme aide digestive, anti-inflammatoire, antalgique, colle chirurgicale. Elles servent pour le
débridement et la cicatrisation des plaies, et le traitement des ulcères cutanés et gastriques.
Elles améliorent la rhéologie du sang. Ainsi, elles sont administrées dans les cas
d’hémophilie, des maladies coronariennes, les cas d’infarctus du myocarde, d’obstruction des
artères, d’AVC ischémique et d’embolie pulmonaire pour leur action fibrinolytique (Aehle,
2007 ; Li et al., 2013)
En combinaison avec d’autres thérapies, les protéases permettent d’éliminer les
substances indésirables dans le sang et les tissus de l’organisme. Elles sont utilisées dans les
cas de bronchite chronique, pneumonie aigu, sinusite, leucémie lymphoblastique et
lymphosarcome (Aehle, 2007).

5.6.5. Industrie cosmétique

Les occidentaux introduisent les protéases végétales (papaïne et broméline) dans les
produits de soins de la peau, en s’inspirant du traditionnel bain d’enzymes japonais. La
protéase bactérienne, la subtilisine, est utilisée pour avoir le même effet que les acides de
fruits. Les protéases rentrent dans la composition des crèmes de gommage, de certains
dentifrices et bains de bouche (Aehle, 2007).

31
 Synthèse bibliographique

5.6.6. Synthèse d’hydrolysats de protéines

Les protéases sont utilisées pour la production d’hydrolysats de protéines susceptibles
de contenir des peptides bioactifs. Un large spectre d’activités biologiques est attribué aux
peptides (de 2 à 12 acides aminés): activités anti-hypertensives, hypocholestérolémiantes,
immunomodulantes, antimicrobiennes, anti-oxydantes et antistress. Les peptides bioactifs
résisteraient à l’action des enzymes digestives et franchiraient la barrière intestinale pour être
véhiculés par le sang. L’hydrolyse de thon par la thermolysine donne un oligopeptide
antihypertenseur, commercialisé aux Japon, aux USA et au Canada. Un peptide de cabillaud,
Nutripeptin, réduit le glucose sanguin, est disponible sur le marché américain (Guérard,
2009). Ils ont aussi des applications en biotechnologie, en effet, ce sont une source d’azote
nécessaire pour les cultures cellulaires (Pasupuleti et Braun, 2010).

5.7. Protéases produites par FMS

Selon Krishna (2005), les protéases sont les enzymes fongiques majeures produites par
FMS avec les amylases. Différentes protéases ont été produites par ces procédés sont
reportées dans les revues bibliographiques de Pandey et al. (1998), Rodriguez Couto (2008),
Thomas et al. (2013) et d’autres articles (voir tableau 16).
Parmi plusieurs substrats utilisés pour la production des protéases en FMS, le son de
blé s’est avéré le plus convenable, pour cela il est le substrat le plus utilisé. Ses propriétés
physico-chimiques sont particulièrement bien adaptées aux FMS. Sa structure très poreuse
facilite les transferts de masse et de chaleur dans le milieu de fermentation humidifié
(Labeille, 1997).
D’autres substrats ont fait l’objet d’études récentes, c’est le cas des tourteaux de
Jatropha délipidés, une plante tropicale utilisée pour la production des agrocarburants
notamment en Inde, la farine de poisson, les noyaux de dattes, la bouse de vache et les plumes
de poules.
D’après Krishna (2005), la synthèse des protéases est inhibée par la source de carbone.
Ceci indique l’effet de la répression catabolique dans la biosynthèse.

32
 Synthèse bibliographique

Tableau 16: Les protéases produites par FMS avec les substrats et microorganismes utilisés.

Protéase Micro-organisme Substrat Références

Protéase acide Aspergillus niger Son de blé, résidus de patate douce Pandey et al.
Rhizopus oligosporus Son de riz (1998b)
Penicillium bois
chrysosporium

Protéase neutre + Bacillus licheniformis son de blé

α-amylase

Protéase alcaline B. amyloliquefaciens farine de soja

Pseudomonas sp. son de blé
[Link] mousse de polyurethane
Trichoderma koningii son de blé et de riz
[Link] son de blé

protéase [Link] farine de soja, de tournesol, écorce de

café
[Link] son de blé, de soja, riz et son de riz
[Link] son de blé, de riz, de maïs
Actinomycetes sp. son de blé
Streptomyces sp. déchets de cheveux

Protéase compatible avec Penicillium sp. Tourteaux de soja délipidés Rodriguez

détergents Couto (2008)
commercialisés

Alcaline serine protéase Aspergillus parasiticus Son de blé

stable dans détergents,
garde 85 % de son
activité

Protéase alcaline Bacillus sp. Son de blé et cosse de lentille

Protéase neutre Aspergillus oryzae Son de blé

Protéase alcaline Bacillus sp. Ecorce verte

Protéase Pseudomonas Tourteaux de Jatropha délipidés

aeruginosa
Pse A

Protéase [Link] Farine de poisson García-GÓmez

et al. (2009)

Protéase alcaline Streptomyces sp. Son de blé et noyau de datte Lazim et al.
thermostable CN902 (2009)

Protéase alcaline [Link] NCIM 2724 Son de blé et son de riz Naga et al.
thermostable (2010)

Protéase alcaline Myceliophthora sp. Son de blé et caséine Zanphorlin et

al. (2010)

33
 Synthèse bibliographique

Protéase [Link] Résidus de Jatropha curcas Thanapimmetha

et al. (2012)

Protéase alcaline Halomonas sp. PV1 Bouse de vache Vijayaraghavan

halotolérante et al. (2012)

Protéase [Link] AT Bouse de vache Vijayaraghavan

et al. (2013)

Protéase acide [Link] MTCC 5341 Son de blé Thomas et al.

(2013)

Kératinase Streptomyces sp. NRC Plumes de poules

13S

Protéase alcaline Pseudomonas Son de blé Meena et al.

aeruginosa (2013)

6. Les déchets de tomate comme ressource végétale

6.1 Définition des agroressources

Les ressources végétales sont toutes les matières premières issues de l'agriculture. Elles
présentent l’avantage d’être renouvelables et très largement présentes sur l’ensemble des
terres à l’échelle planétaire, à la différence des ressources fossiles et minérales. Actuellement,
de nombreux pôles de compétitivité et organismes de recherche se consacrent au
développement de nouvelles technologies pour la production et l'innovation en matière de
valorisation des agroressources. Ces dernières, sont constituées de molécules aux structures
complexes (protéines, polysaccharides, lipides, etc).
Le terme « agroressource » est souvent utilisé pour évoquer les produits non
alimentaires issus des systèmes agricoles. Parmi celles-ci, les cultures lignocellulosiques
(luzerne, phalaris, miscanthus, etc.) destinées à l'élaboration de biocarburants et bioproduits,
les cultures d'agroressources comestibles (colza, tournesol ou jatropha) peuvent également
être transformées en produits non alimentaires (biocarburants de première génération), et les
produits agricoles destinés à l'alimentation humaine et animale (Blanc et Goma, 2006).
L’apport de la biomasse produite à la surface du globe terrestre est considérable :
12.10 tonnes /an. Mais, seulement 6.109 tonnes sont utilisés par l’homme (Guillou, 2006).
11

L’agriculture mondiale produit 3.109 tonnes pour l’alimentaire et 2.109 tonnes pour le non

34
 Synthèse bibliographique

Figure 16: Les couleurs des biotechnologies (Monsan,

n, 2012
2012).

Figure 17: Principales caracté

ctéristiques d’une bioraffinerie basée sur le trai
raitement biologique
dess déche
déchets agro-alimentaires (Fava et al., 2013).

35
 Synthèse bibliographique

alimentaire. L’industrie agroalimentaire utilise la partie comestible et s’intéresse moins à la

partie non digestible (Blanc et Goma, 2006).

6.2 Valorisation de la biomasse végétale par FMS

Les biotechnologies microbiennes et enzymatiques représentent une des voies

prometteuses dans la valorisation non alimentaire des agroressources, c’est la biotechnologie
industrielle dénommé « white biotechnology ». Les biotechnologies blanches ont pour objet
la fabrication de produits chimiques de matériaux et de bioénergie à l’échelle industrielle par
l’utilisation de la biomasse comme matière première renouvelable. Les biotechnologies
regroupent plusieurs domaines, que l’on a distingués par des couleurs, ainsi les
biotechnologies médicales sont dites biotechnologies rouges, celles concernant le végétal (par
exemple les recherches sur les OGM) sont dites biotechnologies vertes, en bleu correspond le
milieu de la mer, et en jaune l’environnement (voir figure 16) (Monsan, 2012).
Au concept de biotechnologie, s’ajoute celui de bioraffinerie très utilisé ces dernières
années. Celui-ci suppose la concentration sur le même site de différentes unités de
transformation des agroressources. Il doit s’insérer dans le cadre d’une exploitation d’un
système d’agroproductions et d’agrotransformations ayant une entrée d’agroressources mais
aussi plusieurs sorties multisectorielles tels que les aliments, les produits pharmaceutiques et
autres intermédiaires à applications multiples. Tous cela est basé sur le principe de
l’utilisation confinée de microorganismes et/ ou d’enzymes (voir figure 17) (Monsan, 2012 ;
Fava et al., 2013).

6.3 Production mondiale de la tomate

La tomate (Solanum lycopersicum L.) est originaire de la région Andéenne, en
éme
Amérique latine, a été importée en Europe au 16 siècle. Puis s’est répondue à travers tous
les continents. Elle représente l’une des importantes cultures de légumes à l’échelle mondiale
donnant le légume-fruit le plus consommé après la pomme de terre. Ses fruits sont destinés à
la consommation en frais ou à la transformation en différents produits. C’est une source de
lycopène, β-carotène et vitamine C, qui sont importants pour la santé humaine et protègent du
cancer et des maladies cardiovasculaires. Sa production et sa consommation augmente avec la
croissance démographique. La plus importante consommation est entre 40 et 100
kg/habitant/an dans le bassin méditerranéen et dans les pays arabes. La production mondiale
de la tomate a atteint la quantité de 160 millions de tonnes en 2011 sur une surface de 4,5

35
 Synthèse bibliographique

Afrique; Océanie;
11,70% 0,40%

Europe;
14,30%
Asie ;
Amérique 57,40%
; 16,20%

Figure 18: Production mondiale de la tomate en 2010 (Bergougnoux, 2013).

Figure 19: Principales régions productrice de tomate industrielle en Algérie (Tomatonews,

2013).

35
 Synthèse bibliographique

millions d’hectares. La région asiatique produit plus de 57 % de la production mondiale en

particulier la Chine, le plus grand producteur avec environ 49 millions de tonnes, suivie de
l’Inde. Puis, viennent les USA, la Turquie, l’Egypte, l’Iran, l’Italie, le Brésil et l’Espagne
(voir figure 18) (Bergougnoux, 2013).

6.4 Tomate industrielle en Algérie

Les tomates d’industrie sont principalement cultivées au Nord-Est du pays Les

wilayates d’El Tarf, d’Annaba, de Guelma, de Skikda et de Jijel où elles représentent 85 %
de la superficie totale consacrée à cette culture. Le reste est réparti entre la région du Centre
avec 7% et l’Ouest 3% (Voir figure 19).
Une augmentation de la production est constatée au cours de ces dernières années. Selon
les statistiques du ministère algérien de l’agriculture la production a atteint 900 000 tonnes en
2012, soit plus que le double de ce qui était produit en 2009 (380 000 tonnes). Ce qui permet
de répondre à 50 % des besoins nationaux, avec 40 220 tonnes de double concentré de tomate
obtenu après transformation depuis 2010 (Djama, 2013). Selon le président du groupe
Benamor, pleinement investi dans ce secteur, l’Algérie pourra arriver à l’autosuffisance et
même envisager l’exportation en 2018. Ce qui indique que la production progressera
d’avantage dans les prochaines années.

6.5 Les sous-produits de la tomate transformée

La filière de la tomate industrielle, génère un volume important de déchets, évalué entre

10 et 30 % selon Benakmoun et al. (2008) et entre 3 et 7% de la matière première selon Van
Dyk et al. (2013). D’après ces derniers, les déchets de tomate peuvent atteindre plus de
10 millions de tonnes à l’échelle mondiale. En Algérie, il n’y a pas de statistique officielle sur
le volume de ces déchets, mais d’après nos estimations, ils peuvent dépasser la quantité de
160 000 tonnes par an. Ils sont mis en décharge et ne sont pas exploité sauf en alimentation
animale. Ils sont une excellente source de caroténoïdes. La majorité des travaux réalisés avec
ce sous-produit, sont focalisés sur ces pro-vitamines (lycopene et β-carotène) et sur les
composés phénoliques (Kaur et al., 2008). Ces substances sont susceptibles de réduire le
risque d’apparition de certains cancers ainsi que des maladies cardiovasculaires et autres
maladies chroniques dont celles liées au vieillissement (Chiu et al., 2007 ; Vági et al., 2007 ;
Choudhari et Ananthanarayan, 2007 ; Kaur et al., 2008 ; Zuorro et al., 2013).

36
 Synthèse bibliographique

Déchets de tomate

Pellicules et
Graines pulpes
Huile
ile adhérentes
Cellulose
protéines Fibres
Furostanol Caroténoïdes insolubles
Stérols
saponine

Figure 20 : Composition
on de
des sous produits de la tomate transformée (So
(Sogi et al., 2002 ;
Boukha
oukhalfa-lezzar, 2010 ; Mirabella et al., 2013).

36
 Synthèse bibliographique

Les déchets de tomate sont composés principalement de graines, 33 % selon Kaur et al.
(2008) et 60 % selon Shao et al. (2013), de peaux et de pulpe adhérente (voir figure 20). Les
graines constituent une excellente source de substances riches en nutriments, les
caroténoïdes, les protéines, les sucres, les fibres et les huiles. La pelure est principalement
composée de carbohydrates (80 %), sous la forme de fibres insolubles (Mirabella et al., 2014).
L’huile de pépins de tomate est très intéressante du fait qu’elle soit riche en acides gras
insaturés, en particulier linoléique, oléique. Elle représente 20 à 37,9 % de la composition
des graines. La farine délipidée des graines renferme entre 22 et 33,9 % de protéines. La
composition en acides aminés de la farine des graines de tomate est comparable à celle de la
farine de soja et même de la viande. Elle est particulièrement riche en lysine (Sogi et al.,
2002 ; Sogi et al., 2005 ; Shao et al., 2013). La peau avec la pulpe adhérente contient aussi les
protéines avec une bonne proportion en lysine, valine et leucine (Al-Wandawi et al., 1985).
Toutes les matières premières contenant plus de 15 % de protéines sont considérées comme
matières riches en protéines (Sebillotte, 2002). Ce qui rend ces déchets très approprié pour
une exploitation en tant que matière première dans la production de substances à intérêt
industriel par fermentation.

6.6. Fermentation des déchets de tomate

Peu de travaux ont été publiés sur l’utilisation de cette matière première en
fermentation. Carvalheiro et al. (1994) ont réalisé la bioconversion des déchets de tomate par
des cultures mixtes de Trichoderma reesei et Sporotrichum sp. en FMS. Avelino et al. (1997)
ont effectué une saccharification de ce substrat par des cellulases commerciales pour la
production de la biomasse de la levure Geotrichum candidum en FMS. Rawashdeh et al.
(2005) ont réalisé la production de xylanase par Streptomyces sp. Do Rosário Freixo et al.
(2008 a et b) ont produit la polygalacturonase, la laccase et la xylanase sur milieu à base de
déchets de tomate (20 g/l) par des cultures du champignon Coriolus versicolor. Fakas et al.
(2008) ont effectué la synthèse de l’acide γ-linolénique sur l’hydrolysat de déchets de tomate
en culture submergée par la moisissure Cunninghamella echinulata. Iandolo et al. (2011) ont
étudié la production des enzymes : laccase, xylanase et protéase sur les mêmes déchets par les
champignons Pleurotus ostreatus et Trametes versicolor en FMS.

37
Matériel et méthodes
 Matériel et méthodes

Partie II. Matériel et méthodes

1. Les souches fongiques

Les souches d’Aspergillus oryzae utilisées dans ce travail pour la production de la

protéase sont :

• [Link] (Ahlburg) Cohn [Link] : provient de l’American Type Culture

Collection (ATCC, Rockville, Etats-Unis) 22788. Elle est employée dans la réalisation
du koji de riz ; elle produit des alpha-amylases et des protéases.
• [Link] [Link] Murakami : répértoriée sous le code 42149 par l’ATCC, cette
souche a servi pour le clonage et le séquençage de la takaamylase A. (Labeille, 1997).
• A. oryzae NRRL A_5777= 35890
• [Link] NRRL 2220 var. oryzae: provient de l’ATCC, sous le code IMI 52145. Elle
est isolée de la sauce de soja (Chine). Elle produit les protéases.
• [Link] NRRL 1988, répertoriée sous le code ATCC 9362. Elle est utilisée pour la
préparation de la sauce de soja. Elle est productrice de protéases et de tannase.
Les deux premières souches sont disponibles au LMI, les trois dernières souches ont été
fournies par National Center for Agricultural Utilization Research, Illinois, USA.

1.1. Production et conservation des spores

Pour l’obtention des spores fongiques, nous avons utilisé un milieu gélosé : le PDA
(Potato Dextrose Agar), fourni par Biokar Diagnostics. Le milieu de sporulation est composé
en g/l de : extrait de pomme de terre : 4, glucose : 20, agar agar bactériologique : 15. Il est
préparé avec 39 g de la poudre de PDA par litre d’eau distillée. Le milieu est autoclavé
pendant 20 min à 121 °C. Il est ensuite réparti dans des boites de Pétri à raison de 20 ml par
boite. Après refroidissement, les milieux gélosés sont inoculés avec 0,2 ml de la suspension
de spores. Ils sont ensuite incubés dans une étuve à 30 °C pendant une semaine.

L’eau osmosée, mélangée au Tween 80 (0,1%), stérile sert à récupérer les spores (eau
tweenée). Un volume de 10 ml est additionnée dans la boite de Pétri. La surface de la culture
est grattée et les spores sont récupérées dans des tubes. La suspension va servir d’inoculum
pour les cultures en Erlenmeyers. La conservation des souches est réalisée par addition de

38
 Matériel et méthodes

20% de glycérol comme agent cryoprotecteur à l’eau tweenée stérile qui sert à la
récupération des spores. Cette dernière solution est congelée par aliquotes de 2 ml.

1.2. Dénombrement des spores à la cellule de Thoma

Les dénombrements sont effectués par comptage direct sur cellule de Thoma au
grossissement X400 à l’aide d’un microscope optique E600 (Nikon). Les dilutions, quand
elles ont été nécessaires, sont réalisées avec de l’eau tweenée stérile.

1.3. Viabilité des spores

La viabilité des spores fongiques dans l’inoculum est évaluée par des dilutions de la
suspension de spores (100 à 1000 fois) qui permettent d’obtenir 30 spores/ml. Celles-ci
serviront à inoculer des boites de Petri. Après incubation à 30 °C pendant 48 heures, un
comptage sur cellule de Thoma est réalisé. En rapportant cette valeur au nombre de spores
total, le pourcentage de spores viables d’un inoculum donné est alors calculé.

2. Substrat de fermentation

Les fermentations sont réalisées avec les déchets de tomates industriels. Ils sont obtenus
de la conserverie « La Maison Latina » de Chelghoum Laid (wilaya de Mila), compagnes été
2007 et 2008. Le substrat récupéré humide est essoré puis séché à l’air libre. Il est composé
de graines et de peaux auxquelles est resté fixée un peu de pulpe.

Les principaux composants des déchets de tomates ont été déterminés par le laboratoire
« Inzo » de Château-Thierry, France. Le dosage des protéines par la méthode Kjeldhal selon la
norme iso 5983 et CEE 93/28. L’amidon Ewers par polarimétrie selon la norme CEE 72/199.
L’humidité par dessiccation selon la norme NF V18-109. La matière grasse par extraction
directe selon la norme NF V18-117. Les fibres sont déterminées selon la norme AOAC 1997.

39
 Matériel et méthodes

3. Conduite des FMS en Erlenmeyers

Au cours de l’étape de l’optimisation de la production de la protéase, les cultures sont

réalisées en Erlenmeyers. Une capacité de 500 ml de ces récipients, permet d’avoir un volume
gazeux satisfaisant. Le milieu de fermentation est préparé avec 20 g de déchet de tomate et
un volume d’eau distillée ou de tampon selon le taux d’humidité désiré. Les Erlenmeyers
sont ensuite bouchés avec du coton cardé, recouverts de papier aluminium et autoclavés 20
min à 121 °C. Les flacons sont inoculés stérilement avec la solution de spores préparée
précédemment, puis placés dans une étuve à 30 °C. L’essai initial est réalisé avec 106 spores/g
de substrat et un taux d’humidité de 50%. Chaque Erlenmeyer correspond à un prélèvement et
à une durée de culture de 24 à 144 heures ; il permet de déterminer le meilleur temps de
culture qui donne la plus grande activité de la protéase.

4. Extraction de l’enzyme

A la fin de la période d’incubation, le produit fermenté est mixé avec 100 ml d’eau
distillée au Waring-blender pendant 40 secondes. La suspension obtenue, est filtré sur un
Büchner actionné par une pompe à vide électrique. La solution est par la suite centrifugée
(centrifugeuse Jouan MR 1812) à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C, pour éliminer les spores
et les particules du substrat. Le surnageant correspond à l’extrait enzymatique brut sur lequel
le pH est mesuré. Il est congelé à -20 °C pour les dosages ultérieurs.

5. Détermination de l’activité enzymatique

L’activité de la protéase neutre est déterminée par le dosage colorimétrique des

groupements tyrosine à l’aide du réactif de Folin-Ciocalteu (MERCK), selon la méthode
d’Anson (1938). Ces groupements donnent une couleur bleue mesurée au spectrophotomètre
(Uvikon 931-Kontron Instruments) à 750 nm. Le protocole adapté par Mechakra et al. (1999)
avec la caséine (ALFA AESAR) comme substrat est réalisé comme suivant :

40
 Matériel et méthodes

• Extrait enzymatique décongelé juste avant le dosage et convenablement dilué : 1 ml,

• Tampon citrate/phosphate (0,1 M/0,2 M), pH 6,8 : 1,5 ml,
• Solution de caséine 2,5%(w/v) dans le citrate de sodium 0.02M à pH 7 : 2,5 ml.

La réaction se déroule au bain-marie à 40 °C. Après 60 min, elle est stoppée par addition de 5
ml d’acide trichloroacétique (TCA) à 4% (w/v). Le mélange est centrifugé à 10 000 x g
pendant 5 min (centrifugeuse EPPENDORF-Centrifuge 5417C), pour faire précipiter les
particules du substrat coagulées par l’acide.

Le dosage de la tyrosine est effectué sur le surnageant par le mélange suivant :

• Surnageant : 1 ml,
• Solution de carbonate de sodium à 15% : 2 ml,
• Réactif de Folin-Ciocalteu (dilué au 1/3) : 0,5 ml.

Une deuxième incubation à température ambiante et à l’obscurité pendant 5 heures, est

nécessaire pour le développement de la coloration. L’absorbance est mesurée à 750 nm.
L’activité protéolytique est exprimée en µmol de tyrosine libéré par minute, est rapportée à la
quantité de matière sèche initiale (MSI), par référence à une courbe étalon de tyrosine à des
concentrations de 0 à 100 µg/ml (voir figure (a) en annexe).

41
 Matériel et méthodes

6. Dosage des protéines

Les protéines sont mesurées par la méthode de Lowry et al. (1951). Les solutions
nécessaires sont :

• Solution A : carbonate de sodium à 2% dans le NaOH 0,1N,

• Solution B : tartrate double de sodium et de potassium à 2% (w/v) dans l’eau distillée,
• Solution C : sulfate de cuivre, 5 H2O à 1% (w/v) dans l’eau distillée,
• Solution D : 0,5 ml de C + 0,5 ml de B + 50 ml de A. Ce mélange doit être préparé
juste avant utilisation.
• Solution E : réactif de Folin-Ciocalteu dilué au 1/3.

Le milieu réactionnel est préparé comme suit:

• Solution de l’échantillon convenablement dilué : 1 ml,

• Solution D : 5 ml.

Après une agitation et un repos de 10 minutes sur la paillasse, 0,5 ml de la solution E

sont rajoutés. Après une deuxième agitation, le développement de la coloration est obtenu
après une incubation de 30 min à température ambiante et à l’abri de la lumière. La lecture de
l’absorbance est réalisée à 650 nm. La quantité de protéines est déterminée par comparaison
avec une gamme de Bovin Serum Albumin (BSA) à des concentrations de 0 à 500 µg/ml (voir
figure (b) en annexe).

42
 Matériel et méthodes

7. Détermination de la teneur en eau

La teneur en eau du milieu de fermentation est obtenue par la balance à halogène

(OHAUS MB45). Une quantité équivalente de 1 g du substrat est placée dans la balance qui,
après séchage de l’échantillon par la lampe infrarouge, donne le taux de l’humidité exprimé
en pourcentage par rapport à la masse de produit. Ceci permet de déterminer également la
matière sèche.

8. Optimisation des différents facteurs

Plusieurs facteurs ont été testés pour mesurer leur effet sur la production de la protéase
par les deux souches d’Aspergillus oryzae. Le meilleur résultat obtenu est appliqué dans
l’expérience qui suit. Ces facteurs sont : la teneur en eau, le pH, le taux de l’inoculum, l’âge
des spores, la taille des particules du substrat et la source d’azote.

8.1. Le taux d’humidité du substrat est le premier facteur étudié. Des variations de
la teneur en eau des déchets de tomate de 40, 45, 50, 55, 60, 65 et 70%, ont été
réalisées. Des volumes croissants d’eau distillée, nécessaires pour chaque valeur
d’humidité, sont rajoutés au substrat avant stérilisation.

8.2. Le pH initial est le paramètre étudié en second. Les différents pH testés sont 3,
4, 5, 6 par le tampon citrate-phosphate (0,2 M) ; pH 7 et 8 par le tampon
phosphate (0,2 M). Le volume des différents tampons correspond au meilleur
taux d’humidité, résultat du test précédent. Il sert à humidifier le substrat avant
autoclavage.

8.3. Le taux d’inoculum est étudié après l’effet du pH. Différents volumes
d’inoculum sont testés : 0,05 ; 0,1 ; 0,25 ; 0,5 ; 1 et 2 ml de la suspension de
spores contenant 2 x 107 spores/ml.

8.4. L’âge de l’inoculum est réalisé sur plusieurs jours. Nous avons préparé
l’inoculum de 3, 4, 5 et 6 jours.

43
 Matériel et méthodes

8.5. La taille des particules du substrat correspond au traitement mécanique qui peut
permettre à la moisissure d’attaquer plus facilement le substrat au cours de la
fermentation. Les déchets de tomate sont moulus au Waring-blender puis passés
aux tamis de différentes tailles, ce qui a permis d’obtenir les granulométries
suivantes : 450, 500, 630 et 800 µm.

8.6. Les sources azotées additionnelles ont été les derniers facteurs testés. Pour cela,
nous avons choisi d’étudier l’effet de la caséine et de la farine de soja aux
concentrations suivantes : 5, 15, 25 et 35 mg/g de substrat de base.

9. Culture en fermenteur Koji (Fujiwara)

9.1. Présentation du fermenteur

Le fermenteur utilisé dans ce travail est semi-pilote à plateau de type Koji, disponible
dans le LMI, conçu par la société japonaise Fujiwara. Il a servi pour le développement d’un
complexe enzymatique solide en partenariat avec la société Soufflet (Duchiron et Copinet,
2011). Il peut contenir de 5 à 20 kg de matière. Le lit du substrat peut atteindre une hauteur
de 20 cm. Ce bioréacteur est composé d’un système de régulation de la chaleur grâce à un
dispositif de conditionnement d’air, et d’un système de circulation d’eau froide qui permet de
créer une atmosphère humide au cours de la FMS. La culture peut être mélangée par des vis
sans fin au cours de la fermentation (Voir figures 21, 22, 23, 24).

44
 Matériel et méthodes

Figure 21: Le fermenteur Fujiwara : (A) armoire de contrôle, (B) fermenteur Koji avec sa
cuve de culture à l’intérieur.

Figure 22: La partie arrière du fermenteur Fujiwara :

l’unité de refroidissement(A), le réservoir d’eau (B).

45
 Matériel et méthodes

Figure 23: Le système d'aération du fermenteur Fujiwara : (A) humidificateur, (B) arrivée
d’air humidifié, (C) conduite d’échappement d’air ayant traversé la cuve.

Figure 24 : L’intérieur du fermenteur Fujiwara : la cuve avec (A) la sonde de température,

(B) les vis sans fin.

46
 Matériel et méthodes

9.2. Conditions de culture dans le fermenteur

Après l’optimisation de l’effet des différents facteurs étudiés lors des cultures en
Erlenmeyers. Nous avons choisi la souche Aspergillus oryzae NRRL 2220 pour les cultures
en fermenteur. En effet, cette souche a donné le maximum de l’activité protéolytique en trois
jours de culture ; à l’inverse de la souche A. oryzae NRRL A-5777 qui a nécessité une durée
de cinq jours. Nous avons testées deux conditions : absence et présence de la farine de soja
comme source azotée additionnelle à raison de 0 et 15 mg/g de substrat. L’inoculum est
préparé en Erlenmeyers, à raison d’un flacon par kilogramme de substrat. Pour cela, 20 g de
déchet de tomate sont humidifiés par 30 ml d’eau distillée.
Après stérilisation, ils sont inoculés par 2 x 107 spores/fiole (106 spores/g de substrat) et
incubés à 30 °C pendant 5 jours. Le substrat de fermentation est préparé dans des sacs en
plastique autoclavables pouvant contenir deux kilogrammes par sac. Le substrat est mélangé
avec 80% de l’eau totale puis autoclavé 20 min à 120 °C. Après refroidissement, il est
mélangé avec l’inoculum contenant les 20% d’eau restants, puis placé dans la cuve du
fermenteur préalablement flambée par l’éthanol à 90°. Cette inoculation correspond au début
de la fermentation qui va se dérouler pendant 44 heures. Cette culture doit se faire à 30 °C,
mais en pratique il se produit des variations de température qui peuvent être rectifiées par le
réglage de la température de l’air pulsé et par un brassage du milieu de culture sans abus pour
ne pas fractionner le champignon.
Après 12 heures, la culture est suivie par des prélèvements toutes les deux heures. Les
mesures du pourcentage de l’humidité sont nécessaires, celui-ci doit être maintenu à 50%
par addition d’eau distillée stérile. L’aération est assurée par un ventilateur dont la puissance
est de 15 hertz muni de vannes permettant un réglage de 0 à 100% selon le besoin et l’état de
la culture.
Le prélèvement, effectué sur plusieurs endroits dans la cuve pour avoir un échantillon
représentatif, sert à préparer l’extrait enzymatique selon le protocole décrit précédemment.
Après mesure du pH, il est conservé au congélateur pour le dosage de l’activité protéasique.
A la fin de la période de la fermentation, la moitié du substrat est conservée à -20 °C
dans des sacs en plastique ; ceci correspond au « substrat humide ». L’autre moitié est
séchée dans le fermenteur puis est également conditionnée dans des sacs en plastique et
gardée à température ambiante, c’est le « substrat sec ».

47
 Matériel et méthodes

10. Optimisation de l’extraction

10.1. Solutions d’extraction

Plusieurs solutions ont été testées pour la préparation de l’extrait enzymatique pour voir
celle qui permet d’avoir la plus grande activité protéasique. Ces solutions sont : Tween 80
(0,1%), tampon citrate/phosphate à pH 6 et 6,8, Tween 80 (0,1%) dans le tampon à pH 6,8,
NaCl à 1% dans le tampon à pH 6,8 ainsi qu’à différents pourcentages de NaCl (0,5, 0,9, 1, 2,
3, 4, 5).
Chaque solution est mélangée au produit fermenté (humide et sec), à raison de (1 : 5 w :
v) le mélange est mixé au Waring-blender pendant 40 secondes. La suspension obtenue, est
par la suite centrifugée à 10 000 x g dans deux conditions différentes: à 4 °C (centrifugeuse
Jouan MR 1812) pendant 10 min et par la centrifugeuse non réfrigérée pendant 5 min
(centrifugeuse Eppendorf-Centrifuge 5417C) pour éliminer spores et particules du substrat.
Les dosages de l’activité enzymatique sont réalisés sur le surnageant.

10.2. Cinétique de l’extraction

L’étude de l’effet du temps de contact avec l’eau et la solution de NaCl à 3% a été

réalisée pour les deux formes de substrat, humide et sec. Après le mixage du substrat avec les
deux solutions, un volume de 5 ml est centrifugé à 4 °C et 10 000 x g pendant 10 min, ce qui
correspond à l’extrait au temps zéro. Le reste des mélanges mixés est gardé dans un bain de
glace sous agitation. Des prélèvements sont effectués chaque heure de 1 à 7 heures.

11. Caractérisation de l’enzyme

11.1. Effet du pH sur l’activité de la protéase neutre

Le mélange réactionnel est tamponné à divers pH (4 ; 4,6 ; 5 ; 5,6 ; 6 ; 6,8 ; 7 ; 7,6 ; 8 ;

8,6 ; 9) à l’aide de deux tampons : citrate/phosphate (0,1 M/0,2 M) du pH 4 à 7 et Tris/HCl
(0,2 M/0,2 M) du pH 7,6 à 9.

48
 Matériel et méthodes

11.2. Effet de la température sur l’activité enzymatique

L’effet de la température d’incubation du mélange réactionnel a été étudié de 30 à

90°C, avec des intervalles de 5°C, à pH optimal durant une heure.

11.3. Stabilité thermique de l’enzyme

L’étude de la stabilité thermique de la protéase est déterminée par incubation du

mélange réactionnel à des températures élevées allant de 60 à 90°C avec différents temps
de réaction de 15 à 60 min, avec des intervalles de 15 min. l’activité enzymatique
résiduelle est calculée.

11.4. Effet de l’EDTA, du zinc et du cuivre

L’activité protéasique est mesurée en présence de l’Ethylène Diamine Tetra Acetate

(EDTA) à la concentration 1 mM. Elle est aussi évaluée avec les ions divalents du zinc et
du cuivre à différentes concentrations 5, 10 et 20 mM.

12. Précipitation par le sulfate d’ammonium

Le fractionnement des protéines est souvent réalisé par le sulfate d’ammonium (SA), en
première étape de séparation. En effet, ce sel présente plusieurs avantages un pouvoir
précipitant élevé, un faible effet dénaturant vis-à-vis des protéines, une grande solubilité en
plus de son faible coût (Laurent, 1982).
Ce sel à forte concentration entre en compétition pour l’eau avec les protéines en
mélange, ce qui entraîne leur précipitation « salting out ». La concentration en sel précipitante
dépend de la nature de la protéine et de ses propriétés moléculaire.
L’échantillon enzymatique est soumis à une précipitation fractionnée par le SA à des
saturations croissantes de 20 à 80 %. Cette étape est réalisée sous agitation pendant 1 heure,
sur bain de glace. Ensuite, une centrifugation à 10 000 x g pendant 30 minutes à 4 °C, est
effectuée (Centrifugeuse Jouan KR 22i).
Chaque précipité est récupéré dans le tampon phosphate citrate à 50 mM à pH 6,8.
Chaque surnageant est reconcentré en SA.

49
 Matériel et méthodes

[Link] statistique

Les données résultantes des différents essais sont soumises à une analyse de la variance
afin d’évaluer les effets des différents facteurs étudiés.

Tous les tests de l’ANOVA ont été effectués avec le logiciel STATISTICA version 5.
Le niveau de confiance accepté est de 95%, comme c’est le cas dans les travaux de Hajji et al.
(2008) et Vishwanatha et al. (2010).

50
Résultats et discussions
 Résultats et discussions

Partie III. Résultats et discussions

1. Etude biochimique du substrat de fermentation

La production d’enzymes par FMS est affectée par la composition du substrat (Castro et
Sato, 2013). Les principaux composants des déchets de tomate sont résumés dans le tableau
17. L’ensemble de la matière organique est de 86,51 %, avec une proportion de plus de 52%
de fibres totales insolubles constituées principalement de lignine (24 %) et de cellulose (19,5
%). Cette composition est liée à la nature de ces déchets, composés essentiellement de
constituants rigides que sont la peau et les graines. Celle-ci donne au substrat une structure
qui se maintient même après la stérilisation dans l’autoclave. De ce fait, ce substrat peut être
bien adapté à la réalisation de culture microbienne à l’état solide (Rodríguez Couto, 2008) ; il
correspond donc à la fois comme support et comme source de nutriments pour les cellules des
microorganismes.
Dans les déchets de tomate, les protéines représentent un taux de plus de 20%. Ceci est
en accord avec ce qui est rapporté dans la littérature (24,5 % dans les graines selon
Tsatsaronis et Boskou, 1975 ; 20- 22 % d’après Kramer et Kwee, 1977a ; plus de 21 % selon
Elliott et al., 1981 ; et 22,9 % d’après Assi et King, 2007). De ce fait, ces déchets sont
considérés comme une matière riche en protéines, ce qui favorise la synthèse d’enzymes. En
effet, la présence d’une source de protéines dans le substrat induit la production des protéases
(Castro et Sato, 2013).
Comparativement au son de blé, substrat de choix pour les procédés en FMS, et en
particulier pour la production des protéases (Sandhya et al., 2005 ; Vishwanatha et al., 2009 ;
Castro et Sato, 2013), les déchets de tomate sont plus riches en protéines. En effet, le son de
blé ne contient que 14,2% selon Labeille (1997) et 14,74% selon Castro et Sato (2013), soit
une différence de plus de 5%. Voir la composition comparée dans le tableau 18.
Les cendres, avec un taux de 6,52% sont aussi importantes dans les déchets de tomate
que celui reporté pour le son de blé. Dans leur étude sur la composition des déchets de tomate,
Tsatsaronis et Boskou (1975) ont trouvé un taux de 5,4% dans les graines et 2,7% dans la
peau. Ils citent une prédominance des minéraux suivants : K, P, Mg, Ca, Na et Cl. Cela
correspond aux oligo-éléments nécessaires à toute culture microbienne.
L’analyse de la composition chimique de ce substrat, montre qu’il est très convenable
pour une utilisation comme milieu de culture, en particulier en FMS. Les matières premières

51
 Résultats et discussions

comptent pour 60 à 80 % du prix de revient dans une production d’enzymes par fermentation
(Cuvellier et al., 1999)

Tableau 17 : Résultats de la composition des déchets de tomate.

Déterminations Substrat brut Substrat sec

(g/100g) (g/100g)
Humidité 6,97
Cendres 12,73 6,52
Protéines (N x 6,25) 18,70 20,10
Matière grasse 10,70 11,51
Amidon Ewers 2,3 2,5
Fibres totales 48,6 52,4
insolubles
Cellulose 18 19,5
Hemicellulose 8,3 8,9
Lignine 22,3 24

Tableau 18 : Composition comparée des déchets de tomate et du son de blé

traditionnel (en % de la matière sèche)

Composants Déchets de tomate secs Son de blé traditionnel*

Cendres 6,52 4,3

Protéines 20,10 14,2

Matière grasse 11,51 5,9

Amidon 2,5 29,4

Cellulose 19,5 7,2

Lignine 24 3,0
*
Valeurs rapportées par Labeille (1997).

52
 Résultats et discussions

2. Profil de production de la protéase neutre par différentes souches

d’Aspergillus

Dans l’objectif de sélectionner les souches fongiques qui seront utilisées pour la
production de la protéase neutre par FMS avec les déchets de tomate, les premiers essais ont
été réalisés avec les cinq souches d’Aspergillus A. oryzae 22788, A. oryzae 42149, A. oryzae
5777, A. oryzae 2220 et A. sojae 1988. L’observation de leur développement et de la
production de la protéase neutre au cours du temps montre une bonne multiplication des
souches dès le premier jour de la fermentation.
La croissance des moisissures apparait avec l’envahissement du substrat par un
mycélium blanchâtre. Ceci permet leur dissémination et leur pénétration dans le substrat
solide. En effet, la croissance fongique ne se déroule pas uniquement en surface, mais aussi en
profondeur et en hauteur. La pénétration des hyphes dans le substrat facilite l’accès aux
éléments nutritifs (Boiron, 1996). Au deuxième jour de culture, les premières spores sont
visibles. L’apparition de structure de couleur vert-jaunâtre indique l’étape de la formation des
spores qui apparaissent après 48 heures.
Le suivi de la cinétique de synthèse de la protéase neutre par les différentes souches en
culture solide sur déchets de tomate est représenté dans la figure 25. La production de
l’enzyme est détectable à partir de 24 heures de culture pour les cinq souches fongiques
étudiées à des valeurs très faible (de 0,52 à 1,032 U/gms) comme cela a été décrit par
Chancharoonpong et al. (2012). Par la suite, on constate des variations dans la production de
l’enzyme selon la souche utilisée. Les plus importantes activités protéasiques sont obtenues
par A. oryzae 5777 avec 6,75 U/gms ; A. sojae 1988 avec 6,02 U/gms après 120 heures de
fermentation ; A. oryzae 2220 avec 6,21 U/gms, après un temps plus court, 72 heures. Les
deux autres souches [Link] 42149 et 22788, montrent des activités protéasiques plus
faibles avec 5,52 U/gms et 4,94 U/gms obtenues respectivement après 144 et 96 heures de
culture (voir tableau 19). En effet, elles sont connues pour la production d’amylase (Labeille,
1997).
Ces variations dans la durée de la culture dépendent de la souche ainsi que la
composition et la nature du substrat de culture, comme le montre la littérature. En effet,
Sandhya et al. (2005) ont obtenu le maximum de protéase neutre par A. oryzae 1808, cultivé
sur le son de blé, après 72 heures. Sumantha et al. (2005) ont réalisé une FMS par A. oryzae
2217, par une combinaison de tourteaux de noix de coco et le son de blé. Ils ont obtenu le pic
de l’activité enzymatique en 48 heures de fermentation. Plus tard, en 2009, García-Gómez et

53
 Résultats et discussions

al. ont également étudié la production de la même enzyme en FMS, sur farine de poisson par
la souche A. oryzae 2095. L’activité maximale est produite après 44 heures. Une durée de
culture plus longue, de 120 heures, a été nécessaire pour la production de la protéase acide de
l’A. oryzae 5341, cultivé en FMS d’un mélange de son de blé avec 4 % de farine de soja
délipidée ; et ce dans les travaux de Vishwanatha et al. (2010). Récemment,
Chancharoonpong et al. (2012), ont obtenu le maximum d’activité de la protéase neutre après
48 heures de FMS, réalisée avec A. oryzae S. cultivée sur un mélange de soja et de son de blé
à 30°C. De même, Castro et Sato (2013), ont observé le maximum d’activité protéasique
après 48 et 72 heures, lorsqu’ils ont réalisé des FMS de son de blé, farine de soja et farine des
graines de coton, par l’[Link] LBA 01.
Le suivi du pH au cours de la culture (tableau 20) indique une similitude pour les deux
souches A. oryzae 22788 et 42149. Les variations ne sont pas très importantes ; le pH atteint
en fin de culture des valeurs proches de la neutralité (6,55 et 6,86 pour les deux champignons
respectivement). En ce qui concerne les trois autres souches A. oryzae 5777 et 2220, et A.
sojae 1988, on a relevé des augmentations des valeurs de pH en fin de culture (8,25 ; 7,4 et
8,14 respectivement). Ceci indique que le métabolisme des protéines est plus important,
résultat confirmé par le taux de production de protéase neutre des trois souches fongiques
avec des valeurs de l’activité enzymatique qui dépasse les 6 U/gms. Cependant, le
métabolisme des deux autres souches, n’a pas modifié le pH du milieu, ce qui peut être
expliqué par une production équivalente en acides organiques et en ammoniac.
La production des protéases est importante pour les champignons. Ces enzymes
dégradent les composants protéiques du milieu de culture et fournissent les acides aminés et
l’azote. La croissance des hyphes nécessite la synthèse de composants pariétaux, dont la
chitine. Ce dernier est formé par l’enzyme chitine synthétase, dont la forme active est obtenue
grâce à l’action d’une enzyme protéolytique (Boiron, 1996).
D’après ces résultats nous avons choisi de continuer le reste des essais avec les deux
souches A. oryzae 5777 et A. oryzae 2220, pour mesurer l’effet des différents paramètres
pouvant affecter la production de l’enzyme.

54
 Résultats et discussions

Tableau 19 : Activité protéolytique produite par les cinq souches d'Aspergillus au cours de la
FMS des déchets de tomate en (U/gms).
Temps(h) [Link] Ecart- [Link] Ecart- [Link] Ectart- [Link] Ectart- [Link] Ecart-
type type type type type
22788 42149 5777 2220 1988
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

24 1,032 0,02 0,52 0,01 0,65 0,02 0,8 0,01 0,7 0,03

48 2,31 0,014 2,01 0,07 4,53 0,02 3,86 0,14 3,11 0,15

72 4,66 0,07 3,82 0,02 5,53 0,05 6,21 0,1 4,76 0,05

96 4,94 0,06 4,87 0,65 6,03 0,65 5,57 0,06 5,5 0,08

120 2,7 0,18 3,11 0,15 6,75 0,81 3,18 0,15 6,02 0,2

144 2,87 0,65 5,52 0,2 6,13 0,7 3,45 0,2 5,98 0,3

7
Activité protéasique (U/gms)

6 [Link] 22788

5 [Link] 42149

4 [Link] 5777

3 [Link] 2220

2 [Link] 1988

0
Temps (heures)
0 50 100 150 200

Figure 25: Evolution cinétique de la production de la protéase par les

cinq souches fongiques en FMS (cultures réalisées à 30 °C, durant 144 h
avec un taux d'humidité initiale de 50 %).

55
 Résultats et discussions

Tableau 20 : Evolution du pH au cours de la FMS par rapport aux différentes

souches étudiées.

Temps(h) [Link] [Link] [Link] [Link] [Link]

22788 42149 5777 2220 1988
0 5,17 5,17 5,17 5,17 5,17

24 6,01 5,79 5,8 5,84 5,94

48 6,27 6,48 6,28 6,37 7,1

72 5,95 6,2 6,88 6,67 7,45

96 5,43 5,94 7,38 6,61 7,76

120 6,18 6,07 7,8 7,08 7,94

144 6,55 6,86 8,25 7,4 8,14

56
 Résultats et discussions

3. Etude des conditions de la fermentation solide sur déchets de tomate

3.1. Effet de l’humidité

La teneur en eau initiale du substrat de fermentation, a été étudiée dans l’intervalle de

40 à 70 % avec des variations de 5 %. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 21.

La souche A. oryzae 5777 a donné plus d’activité protéasique à des taux d’humidité de
40 à 50 % ; avec un maximum de 6,5 U/gms. Une augmentation de la teneur en eau jusqu’à
70 %, conduit à une diminution de 25 % de l’activité enzymatique étudiée avec un effet très
significatif (p<0,04). Cette diminution pourrait s’expliquer par une modification de la
structure du milieu. En effet, un taux élevé de l’humidité provoque une agglomération des
particules, une limitation de transfert des gaz et favorise les contaminations bactériennes
(Duchiron et Copinet, 2011). Ces résultats sont similaires à ceux de Sandhya et al. (2005) qui
ont obtenu un maximum d’activité de la protéase neutre à 43,6 % d’humidité de son de blé ;
de Sumantha et al. (2005) avec 60 % du même substrat et de Chutmanop et al. (2008) qui ont
trouvé une teneur d’eau optimale de 50 % pour la production de protéase sur un mélange de
son de blé et son de riz.

Cependant, pour la souche A. oryzae 2220, on a observé une similitude des résultats de
l’activité de la protéase par rapport au taux d’humidité; avec une activité minimale de 6,5
U/gms et maximale de 6,8 U/gms, soit une variation de 0,3. Les changements de l’humidité
n’affectent pas la production de la protéase neutre, du moins dans l’intervalle étudié. Par
ailleurs, Belmessikh (2011) signale un niveau optimal de la teneur d’eau entre 50 et 60%,
avec l’utilisation des déchets de tomate moulus en particules de 1 mm de diamètre. On peut
conclure que le niveau de l’humidité optimal pour la production d’une enzyme dépend non
seulement de la souche mais aussi de la taille des particules du substrat.

L’analyse de la variance permet de confirmer les effets significatifs du facteur souche (F

= 46,30 et p = 0) ainsi que du facteur humidité (F = 2,27 et p = 0,03) sur la production de la
protéase.

57
 Résultats et discussions

Tableau 21 : Effet de l’humidité initiale sur la production de la protéase par les deux souches
d’Aspergillus oryzae par FMS sur déchets de tomate. L’activité en (U/gms).

Taux [Link] Ecart- [Link] Ecart-

d’humidité 5777* type 2220** type
(%)
40 6,3 0,1 6,7 0,2

45 6,5 0,4 6,6 0,3

50 6,4 0,2 6,7 0,2

55 5,3 0,1 6,6 0,1

60 5,2 0,3 6,8 0,2

65 5,1 0,1 6,8 0,1

70 4,9 0,2 6,5 0,3

* : FMS de 5 jours ; ** : FMS de 3jours.

Plusieurs auteurs ont étudié ce paramètre : Labeille (1997) rapporte un taux d’humidité
de 55 % du son de blé pour la production de glucoamylase par Aspergillus niger ATCC
76061 ; Agrawal et al. (2005) ont trouvé un taux d’humidité initial de 120 % pour la
production de la protéase alcaline par Beauveria felina mais de seulement 60 % pour A.
oryzae NCIM 649 lorsqu’ils sont cultivé sur son de blé ; Mahanta et al. (2008) ont trouvé un
taux de 50 % pour la production de protéase et de lipase par Pseudomonas aeruginosa cultivé
sur les tourteaux de la plante Jatropha curcas ; Prakasham et al. (2006) ont trouvé un taux
de 140 % pour la production de protéase alcaline par Bacillus sp. cultivé sur écorce verte;
Bhanu Prakash et al. (2008) ont obtenu lors de la production des spores de Metarhizium
anisopliae en FMS, un taux d’humidité qui varie selon le nature du substrat utilisé : 75,68 %
pour sorgho, 73,21 % pour l’orge et 22,34 % pour le riz ; Mukherjee et al. (2008) ont obtenu
un taux de 100 % pour la production de protéase alcaline de Bacillus subtilis cultivé sur les
deux substrats qu’ils ont étudiés : peaux de pomme de terre et la plante herbacée Imperata
cylindrica ; Lazim et al. (2009) ont trouvé un taux de 60 % pour la production de la protéase
alcaline par Streptomyces sp. CN902 cultivé sur un mélange de son de blé et de noyaux de
dattes coupés aux proportions 5 :5. Le taux d’humidité est optimal lorsque le substrat est
saturé en eau. D’une manière générale, ce taux varie selon la nature du substrat entre 30 – 85
% (Bellon-Maurel et al., 2003), pour les cultures bactériennes il peut atteindre 140 %
(Prakasham et al., 2006.)

58
 Résultats et discussions

Par conséquent, nous avons décidé de continuer les essais avec un taux d’humidité
initiale de 50 % qui est favorable pour les deux souches.

3.2. Effet du pH

Le pH influence la croissance des champignons par action directe sur la membrane

cellulaire, ou indirecte sur la disponibilité des éléments nutritifs tels que le fer qui reste sous
forme d’ions ferreux assimilables à pH acide (Boiron, 1996).
Les résultats de l’effet du pH initial sur la production de la protéase neutre sont
regroupés dans la figure 26. Pour la souche A. oryzae 5777, on constate une activité
protéasique diminuée lorsque le milieu est acidifié (pH 3 à 5). Le maximum de l’activité est
atteint à pH 6 avec 6,11 U/gms et reste pratiquement stable jusqu’à pH 8. En ce qui concerne
la souche A. oryzae 2220, c’est l’inverse. En effet, une activité protéasique de plus de 95 %
est obtenue à pH 3. Le maximum de l’activité enzymatique (7,35 U/gms) est produit,
également à pH 6. Au-delà de cette valeur, on constate une diminution de la protéase neutre.
Par ailleurs, on remarque que le taux de production de l’enzyme est plus important pour cette
dernière souche. Ceci est en accord avec la revue de Duchiron et Copinet (2011), où ils
indiquent que la gamme optimale de pH pour les champignons filamenteux se situe entre 3 et
6. Par ailleurs, Agrawal et al. (2005) ont trouvé un pH initial optimal de 7 pour la production
de la protéase alcaline de Beauveria felina et de A. oryzae NCIM 649, Sandhya et al. (2005)
et Chutmanop et al. (2008) ont obtenu le maximum d’activité à pH 7,5. Mukherjee et al.
(2008) indiquent que la production de la protéase alcaline est maximale après humidification
du substrat de culture par l’eau distillée à pH 8, Mahanta et al. (2008) ont obtenu le plus de
protéase et de lipase à pH 6 et 7 respectivement par Pseudomonas aeruginosa PseA, alors
que Vishwanatha et al. (2010) ont obtenu le maximum de la protéase acide à pH 5. Il est
clair, que chaque type de protéase nécessite un pH correspondant du milieu de fermentation.
Celle de la protéase neutre doit être neutre ou proche de la neutralité.
Par ailleurs, le pH initial varie aussi selon le substrat de culture utilisé. Bhanu Prakash
et al. (2008) ont trouvé pour la production des spores de Metarhizium anisopliae en FMS les
valeurs de pH 7,01 pour le riz, 7,06 pour le sorgho et 6,76 pour l’orge.
L’analyse de la variance indique l’effet significatif du facteur souche avec F = 117,18 et
p = 0 ; et aussi pour le pH qui exerce un effet significatif sur la production de la protéase
neutre (F = 6,13 ; p = 0,0008).
Les activités métaboliques des deux souches d’Aspergillus oryzae cultivées en FMS sur
déchets de tomate, ont induit des modifications du pH (tableau 22). En fin de culture, les
59
 Résultats et discussions

valeurs de pH ont augmenté pour les milieux à pH initial 3 à 6. Cela s’explique par le
métabolisme des protéines qui produit de l’ammoniac (Sparringa et Owens, 1999 ; Garcia-
Gómez et al., 2009). Pour les milieux à pH initial 7 et 8, ils sont amenés à 7,66 et 7,43 pour A.
oryzae 5777 ; et à 6,57 et 6,47 pour A. oryzae 2220. La production en acides est équivalente à
celle de l’ammoniac. De ce fait, le pH proche à la neutralité est favorable à la croissance et à
la production de la protéase neutre.

La suite du travail, a été réalisée par le substrat humidifié avec le tampon phosphate-
citrate (0,2 M/ 0,1 M) à pH 6.

60
 Résultats et discussions

Tableau 22 : Evolut
volution du pH à la fin de la FMS sur déchetss de tomate
(Humidité initiale de 50 %).
pH initial pH de fin de culture

A .oryzae 5777* 2220**

[Link] 222

3 8,01±0,2 6,51±0,1

4 7,80±0,1 6,40±00

5 7,63±00 6,44±0,1

6 7,54±0,1 6,38±00

7 7,59±0,1 6,47±0,1

8 7,44±0,1 6,49±00

Valeur moyenne ± ll’écart-type, * : FMS de 5 jours, ** : FMS de 3 jours.

9
8
Activité proteasique (U/gms)

7
6
5 [Link]
.oryzae 5777
4
[Link]
.oryzae 2220
3
2
1
0
3 4 5 6 7 8 pH initial
Figuree 26. Effet du pH initial sur la synthèse de la
protease neut
neutre à 50% d'humidité initiale, FMS de 5 jours
ours
pour [Link]
.oryzae 5777 et de 3 jours pour [Link] 2220.

61
 Résultats et discussions

3.3. Effet de l’inoculum

lum

3.3.1. Effet de la tai

taille de l’inoculum

Les résultats de la produc bre de spores pour les

oduction de la protéase en fonction du nombre
vité enzymatique est
deux souches sont présentéss sur la figure 27. Le maximum de l’activit
obtenu par la souche A. oryzae ulture est ensemencé
zae 2220 (7,7 U/gms) lorsque le milieu de cult
par un inoculum sporal de 106 spores/g de substrat. En ce qui concerne
ne la souche A. oryzae
ions dans la réponse en production de l’enzyme
5777, on constate des variations me ciblée par rapport
aux différents taux de spores ouvé le maximum de
res étudiés. Sandhya et al. (2005) ont trouvé
l’activité protéasique avec un iinoculum de 8 x 107 spores/g de substrat, alor
alors que Agrawal et
al. (2005) n’ont pas pu déterm oduction de la protéase
rminer ce taux dans leur travaux sur la produc
lle 105 - 1010 spores/g
M 649, cultivé sur son de blé, dans l’intervalle
alcaline par A. oryzae NCIM
de substrat. Aussi les travaux
ux de Bhatnagar et al. (2010) ont montré un ef
effet non significatif
production de la protéase acide par A. niger
du taux de l’inoculum sur la pr ger en FMS, pour les
deux taux de spores étudiéss (2 x 105 et 4 x 106 spores/g de substrat). Ainsi
nsi, nos résultats sont
l’analyse de la variance indique que ce facte
conformes à ces travaux ; l’a cteur n’a pas d’effet
significatif sur la production 179) dans l’intervalle
on de la protéase neutre (F = 1,7484, p = 0, 179
choisi.

Le taux de 106 spores/gg dde déchets de tomate a été retenu pour la suite du travail.

9
Activité protéasique (U/gms)

8 [Link]
5777
7
6 [Link]
5 2220
4
3
2
1
0
0,1 0,25 0,5 1 2
Nombre de spores * 106 /g de substrat

Figure
re 27. Effet de la taille de l'inoculum sur la
production
ion de la protéase neutre (FMS réalisées à 50%
d'humidité initiale et pH 6).

62
 Résultats et discussions

3.3.2. Effet de l’âge

’âge de l’inoculum

L’étude de ce facteur no és dans la figure 28.

nous a permis d’obtenir les résultats résumés
que eest obtenu avec un
Pour la souche d’A. oryzae 5777, le maximum de l’activité protéasique
inoculum de 3 jours (8,48 U/g activité enzymatique
/gms) ; des spores plus âgées, donnent une ac
de plus en plus faible. Enn cce qui concerne la souche A. oryzae 2220, l’âge optimal de
l’inoculum est de 5 jours ; ill pe on d’
permet d’obtenir 6,57 (U/gms) ; l’utilisation d’un inoculum plus
âgé d’un jour, conduit à une pe
perte de 19 % de l’activité protéasique. Enn eff
effet, des spores trop
jeunes sont immatures, et ceux germer et de produire
eux qui sont trop âgées sont incapables de germ
les différents métabolitess dont lles enzymes.
Différents auteurs ont m spores sur la production
mis en évidence l’influence de l’âge des spore
acharyya (2000) ont trouvé meilleur l’inoculum
des enzymes. Aikat et Bhattacha um de 7 jours pour la
Rhizopus oryzae cultivé en FMS sur son de blé. Irfan et al. (2011)
production de protéase par Rhi
se aacide. Ils indiquent
ont également étudié l’effet de ce facteur sur la production de la protéase
que l’âge de 7 et 8 jours pour R nt, sont les meilleurs.
R. oligosporus et R. arrhuzus respectivement,
enu la meilleure production de lovastatine par un inoculum de 9
Porcel et al. (2006) ont obtenu
jours d’A. terreus.
nce indique l’effet significatif de ce facteur sur la production de la
L’analyse de la variance
protéase neutre (F = 23,404 ; p = 0,00004).
Les essais qui suivent jours pour A. oryzae
nt sont donc réalisés avec des inocula de 3 jour
5777 et de 5 jours pour A. oryzae 2220.
Activité proteasique (U/gms)

10
[Link]
.oryzae 5777
8
6 [Link]
.oryzae 2220
4
2
0
3 4 5 6
Age de l'inoculum (jours)
Figure 28. E
Effet de l'âge des spores sur la production
on de lla
protéase
ase neutre (FMS réalisées à 50% d'humidité
nitiale, pH 6 et 106 spores/g de substrat).
initi

63
 Résultats et discussions

3.4. Effet de la taille des particules de substrat

L’évaluation de la production de la protéase en fonction de quatre différentes tailles des

déchets de tomate a permis d’obtenir les résultats présentés dans la figure 29. Ces résultats
sont comparés à ceux obtenus dans le test précédent avec le substrat en taille originale
(contrôle). Pour la souche A. oryzae 5777, la production de la protéase de 8,48 U/gms, la plus
élevée, est atteinte avec le substrat non broyé (taille des particules originale) ; soit une
différence de plus de 30% par rapport au substrat broyé. Pour A. oryzae 2220, une faible
augmentation de l’activité enzymatique est observée lorsque le substrat a une taille des
particules de 500 µm. L’analyse de la variance a donné une probabilité supérieure à 0,05 (F =
1,488 ; p = 0,243), ce qui indique l’effet non significatif de ce paramètre sur la production de
l’enzyme.
Parmi les auteurs ayant étudié ce paramètre, plusieurs ont observé une meilleure
production de la protéase avec une grande taille des particules de substrat. C’est ainsi que
Elibol et Moreira (2005) ont trouvé que la meilleure production de la protéase alcaline par la
bactérie Teredinobacter turnirae est obtenue avec des particules de soja de 2 mm. Les
travaux de Prakasham et al. (2006) sur la production de la protéase alcaline par Bacillus sp.,
ont montré que les particules de taille 1,4-1 mm permettent d’obtenir le maximum d’activité
enzymatique. Castro et Sato (2013) ont trouvé la meilleure production de protéase d’A. oryzae
LBA 01, cultivé sur son de blé de taille 0,258 à 1,68 mm et sur farine de soja et farine de
graines de coton de taille 1,68 mm. A l’inverse, Chellappan et al. (2006) ont trouvé que
l’utilisation de particules de son de blé de petite taille (425 µm) par la moisissure marine
Engyodontium album a permis d’obtenir une bonne production de protéase alcaline.
Tous ces travaux indiquent l’importance d’utiliser un substrat de taille adapté pour une
meilleure production des protéases. De ce fait, la granulométrie du milieu de culture est d’un
grand intérêt. En effet, dans les procédés en FMS, les surfaces des substrats disponibles ont un
effet vital pour les microorganismes. Le transfert et la disponibilité des nutriments affectent
directement la croissance microbienne et ainsi la production des enzymes et autres
métabolites. Ainsi, il est préférable d’utiliser des substrats avec des tailles des particules
différentes comme cela a été montré par Pandey (1991) avec le son de blé. C’est le cas des
déchets de tomate utilisés dans cette étude. Ce substrat est composé de graines en petite taille
présentant une large surface d’attaque microbienne ainsi que de pellicules de tailles variables
permettant une meilleure aération et par conséquent une bonne respiration. Pour cela, et pour

64
 Résultats et discussions

des raisons économiques, il est inutile de broyer les déchets de tomate ava
avant leur utilisation
comme substrat de la FMS.

10
9
Activité proteasique (U/gms)

8
7
6
[Link]
ryzae 5777
5
4 [Link]
ryzae 2220
3
2
1
0
Taille des particules (µm)
450 500 630 800 contrôle

Figure 29. E
Effet de la taille des particules des déchets de
tomate
ate sur la production de la protéase neutre.

65
 Résultats et discussions

3.5. Effet de l’addition des protéines sur la production de la protéase

Les protéines sont les inducteurs de la synthèse des protéases par les microorganismes.
Pour cela nous avons effectué des essais avec des milieux enrichis en caséine et en farine de
soja.

3.5.1. Effet de la caséine

Les résultats de l’effet de l’addition de la caséine au milieu, comparés à ceux obtenus en

son absence, sont présentés dans la figure 30. Bien que les déchets de tomate soient assez
riches en protéines, l’addition de la caséine dans le substrat de culture a donné de meilleurs
résultats pour les deux souches testées.
Pour A. oryzae 5777, on note une augmentation de 28 % de l’activité de la protéase
neutre lorsque 1 g de substrat est supplémenté de 5 mg de caséine. L’activité atteint la valeur
de 10,88 U/gms. En ce qui concerne la souche A. oryzae 2220, l’effet inducteur se révèle de
façon plus importante avec une augmentation de plus de 76 % de l’activité protéasique. Ce
maximum (11,6 U/gms), est obtenu par l’addition de 15 mg de caséine par gramme de
substrat. Les valeurs de l’activité sont importantes avec toutes les concentrations de caséine
testées. Ce facteur exerce un effet très significatif sur la production de l’enzyme recherchée,
ceci est confirmé par l’ANOVA (F = 82,82 ; p = 0). Cet effet positif sur la production de la
protéase a été démontré dans le travail de Belmessikh et al. (2013) sur les déchets de tomate
et celui de Merheb et al. (2007) sur le son de blé.
Par contre, un effet négatif a été observé par Chellappan et al. (2006) et Sumantha et al.
(2005). En effet, ces auteurs ont trouvé que l’addition de la caséine au milieu de culture ne
conduit pas à une augmentation de la production de la protéase. L’effet de l’addition de cette
protéine sur la production de l’enzyme dépend de la composition du substrat de culture et de
la souche utilisée.

66
 Résultats et discussions

14
Activité protéasique (U/gms)

12 A.
[Link]
10 57
5777
8
A.
[Link]
6 22
2220
4
2
0
contrôle 5 15 25 35
caséine (mg/g de substrat)

Figure 30. Effet de l'addition de la caséine sur la

pr
production de la protéase neutre.

67
 Résultats et discussions

3.5.2. Effet de la farine de soja

Les résultats de l’effet de cette deuxième source de protéine sont présentés dans la
figure 31. On constate des augmentations de l’activité protéasique par rapport aux deux
souches pour toutes les concentrations de farine de soja ajoutées au milieu.
Pour A. oryzae 5777, le maximum de l’activité est obtenu par l’addition de 15 mg/g de
substrat soit une production de 38 % d’activité supplémentaire. Cet effet est plus important
avec la souche A. oryzae 2220, avec 66,5 % d’augmentation pour la même concentration de
farine de soja. Nous avons constaté que les quantités supérieures à 15 mg/g de substrat,
conduisent à des diminutions de l’activité enzymatique étudiée. L’analyse de la variance des
résultats indique l’effet significatif de ce facteur (F = 57,47 ; p = 0). En effet, les protéines
sont de bons inducteurs de la production des protéases.
Plusieurs auteurs ont mis en évidence cet effet : Agrawal et al. (2005) ont obtenu une
augmentation de 12 fois de la protéase alcaline de l’A. oryzae NCIM 649 cultivé sur le son de
blé enrichi par les protéines de soja ; Vishwanatha et al. (2010) ont observé une stimulation
de la synthèse de la protéase acide en présence de farine de soja et de caséine à 4 % par A.
oryzae MTCC 5341, cultivé en FMS sur son de blé.
Ainsi, ces deux protéines se révèlent comme des sources azotées capables de stimuler la
production des protéases par les deux souches d’A. oryzae étudiées. Mais cette stimulation
varie en fonction de la souche : la caséine induit la production de la protéase neutre beaucoup
plus pour A. oryzae 2220, alors que la farine de soja le fait pour A. oryzae 5777. Il est donc
clair que chaque souche a des besoins nutritionnels et d’inducteurs spécifiques pour produire
l’enzyme recherchée. Par ailleurs, d’autres sources d’azote sont également inductrices de la
production de l’enzyme comme c’est le cas de l’extrait de levure ou la peptone pour la
protéase alcaline étudiée par Prakasham et al. (2006) en FMS.

68
 Résultats et discussions

14
Activité protéasique (U/gms)

12
10 [Link]
5777
8
6 [Link]
2220
4
2
0
contrôle 5 15 25 35
Farine de soja (mg/g de substrat)
Figure 31. Effe
ffet de l'addition de la farine de soja sur la
produc
oduction de la protéase neutre.

69
 Résultats et discussions

3.6. Conclusion partielle

D’après cette étude, nous pouvons conclure qu’il est possible de produire des protéases
fongiques avec des milieux de culture à base des déchets de tomate. Par sa composition en
différentes matières organiques et minérales, ce substrat se trouve parfaitement adapté à la
croissance des souches d’Aspergillus, particulièrement par la présence de protéines qui sont
des inducteurs des protéases.
L’étude des différents facteurs sur la production de la protéase neutre en FMS avec les
déchets de tomate comme substrat a permis de définir ceux qui ont des effets significatifs ;
parmi ces paramètres, le taux de l’humidité, le pH initial, l’âge de l’inoculum et la teneur en
protéines.
Ces résultats permettent de définir les conditions qui seront adoptées dans la deuxième
partie du travail, à savoir, la production de la protéase neutre en fermenteur par la souche A.
oryzae 2220. Cette dernière est la plus rapide, en effet, le facteur temps est très important pour
une production à l’échelle industrielle. Cette souche arrive à produire le maximum de la
protéase en 72 h (3 jours), alors que la souche A. oryzae 5777 le fait en 120 h (5 jours) pour le
même niveau de la production de l’enzyme. Par ailleurs, le taux d’humidité du substrat adopté
est de 50 % et l’enrichissement par la farine de soja est de 15 mg/ g de substrat, cela afin de
rendre la production plus économique comparativement à la caséine qui ne permet pas
d’augmenter la production de l’enzyme d’une façon très importante. En ce qui concerne le pH
du substrat, nous avons opté pour une humidification du substrat de culture avec de l’eau
osmosée sans utilisation de la solution tampon à pH 6 ; ce qui permet d’obtenir un pH de 5,49
convenable à la production de la protéase neutre par la souche fongique sélectionnée.
Pour la température, nous continuerons à travailler à 30°C comme en Erlenmeyers car
c’est la température optimale de production des protéases par Aspergillus oryzae, rapportée
par plusieurs auteurs (Botton et al., 1990 ; Sandhya et al., 2005 ; Sumantha et al., 2005 ;
Chutmanop et al., 2008 ; Vishwanatha et al., 2010 ; Chancharoonpong et al., 2012).
Par ailleurs, les essais sont poursuivis par des cultures en fermenteur pilote de type Koji,
équipé d’un système d’aération avec des quantités importantes de substrat pour le « scaling-
up » du procédé.

70
 Résultats et discussions

4. Production de la protéase neutre en réacteur Fujiwara

L’utilisation du bioréacteur Koji a permis de créer des conditions de fermentations les

plus favorables au développement de la souche fongique et à la production de la protéase.

4.1. Culture avec le substrat enrichie par la farine de soja

Une culture préliminaire a été réalisée avec 20 kg de substrat enrichi avec la farine de
soja, durant 3 jours. Cet essai a permis d’évaluer la productivité de l’enzyme et de déduire le
temps de fermentation. En effet, nous avons constaté que la production de l’enzyme est
détectable dès les premières heures de culture. Le maximum est obtenu après 41 heures (11,66
U/gms), avec dégagement d’une forte odeur d’ammoniac traduite par une augmentation du
pH à 7,82 est une activité protéolytique importante. Au delà, la production de la protéase
ralentit progressivement pour atteindre 3,85 (U/gms) en 71 heures. Ce déclin peut s’expliquer
par le fait que le milieu n’est plus convenable à la croissance et à la production de
l’enzyme après la consommation des nutriments et la modification du pH. Au cours de la
fermentation, la moisissure se développe, envahit et solidifie le substrat. A la fin de la culture,
l’apparition des spores rend le milieu entièrement vert (voir figure 32).

Dans le deuxième essai en fermenteur, la culture est réalisée avec une masse de substrat
égale à 9,2 kg. Les résultats présentés dans la figure 33 montrent une production plus rapide
et plus importante comparée aux résultats obtenus en Erlenmeyers. La synthèse de l’enzyme
débute après 12 heures de culture (1,41 U/gms), le maximum de l’activité (plus de 12 U/gms)
est atteint après 42 heures. Le pH aussi augmente pour atteindre la valeur de 6,8 à la fin de la
fermentation. Cette amélioration de la production s’explique par le fait qu’en réacteur la
culture est aérée, contrairement à la fermentation en Erlenmeyers.

4.2. Culture avec déchets de tomate sans enrichissement

La culture en fermenteur Koji mais sur déchets de tomate sans addition de source de
protéine additionnelle a permis d’obtenir 3,03 U/gms dès la 12ème heure de culture, soit une
augmentation de 115% comparée à l’essai réalisé avec enrichissement. Après 34 heures de
FMS, l’activité est de 12,7 U/gms. Le maximum est produit à la 42ème heure de fermentation
(13,55 U/gms) (voir figure 34). Parallèlement, le pH augmente rapidement pour se stabiliser à
partir de la 30ème heure entre 7,34 et 7,57. Cette augmentation est due au métabolisme des

71
 Résultats et discussions

protéines se trouvant dans le substrat de culture. A la fin de la période de la fermentation, la

stabilité du pH dans la zone neutre est convenable à l’activité de la protéase produite.
La production de la protéase neutre par la moisissure A. oryzae 2220 est plus importante
et plus rapide dans le milieu formulé avec les déchets de tomate sans aucune addition (figure
35). Cela s’explique par la composition de ce substrat associée à des conditions d’aération
correctes. Plusieurs auteurs ont montré l’efficacité de l’aération dans la production d’enzymes
par les cultures en milieux solides : Labeille 1997 dans ses travaux sur la production de
glucoamylases d’A. niger en FMS sur son de blé; Tunga et al. (1999) dans leurs travaux sur la
production de protéase ; Anisha et al. (2010) dans les essais réalisés pour la production de l’α-
galactosidase par Streptomyces griseoloalbus ; et récemment Chen et al. (2014) dans les
essais de production de cellulase par Trichoderma viride L3. Ce système d’aération apporte
l’oxygène nécessaire à la croissance et accélère l’élimination du dioxyde de carbone produit
par le métabolisme et devenu défavorable pour la moisissure. Cela permet également de
réguler la température en évitant une accumulation de la chaleur métabolique. L’effet se
traduit par une amélioration de la croissance et une meilleure production de l’enzyme.

a b

c d e

Figure 32. L’aspect du substrat au cours de la culture : (a) Erlenmeyers inoculum, (b) cuve du
fermenteur Fujiwara avec les déchets de tomate inoculés, (c) substrat fermenté après 13 heures de
culture, (d) substrat après 20 heures de culture, (e) substrat à la fin de la fermentation.

72
 Résultats et discussions

14
Activité protéasique (U/gms) et pH

pH
12

10

0
Temps en heures
0 10 20 30 40 50
Figure 33. Evolution de l'activité protéasique et du pH au cours du
temps. FMS réalisée par [Link] 2220 sur déchets de tomate
enrichie en farine de soja (humidité 50%, et température 30°C).

16
14
Activité protéasique (U/gms) et du pH

12
10
8
6
pH
4
2
0 Temps en heures
0 10 20 30 40 50
Figure 34. Evolution de l'activité protéasique et du pH au cours du
temps. FMS réalisée par [Link] 2220 sur déchets de tomate sans
enrichissement (humidité 50% et température 30 °C).

73
 Résultats et discussions

Activité protéasique (U/gms)

16
déchets de tomate +
14
farine de soja
12
10 déchets de tomate
8
6
4
2
0
0 20 40 60 Temps en heures

Figure 35. Evolution de l'activité protéasique au cours du

temps pour les deux types de culture avec et sans
enrichissement.

74
 Résultats et discussions

5. Optimisation de l’extraction de l’enzyme

Après la fermentation, l’enzyme reste liée au substrat sous deux formes, l’une séchée
après une déshydratation dans le fermenteur (pourcentage de l’humidité entre 4 et 6 %) ;
l’autre conservée directement à -20°C. Ce qui nécessite une extraction permettant d’obtenir
l’enzyme avec la meilleure activité. Pour cela, il faut choisir les conditions adéquates (type de
solvant utilisé, durée de la centrifugation et temps de contact avec le solvant).

5.1. Effet de la solution utilisée pour l’extraction

Au cours de cet essai, différentes solutions d’extraction ont été testées pour mesurer
l’effet de chacune d’elles sur l’activité de l’enzyme. Les deux types de substrat
fermenté utilisés sont le substrat séché et le substrat congelé humide. Les résultats sont
regroupés dans les figures 36 et 37. Le substrat humide permet d’obtenir plus d’activité de la
protéase neutre produite par A. oryzae 2220. L’analyse de la variance confirme l’effet
significatif du facteur substrat avec F = 114,36 et p = 0, lorsque la centrifugation est réalisée
durant 5 minutes et F = 610,57 et p = 0, après 10 minutes de centrifugation.
La solution de NaCl à 3 % (w/v) donne le maximum de l’activité pour les deux types de
substrat. Comparativement à l’eau osmosée, ce solvant permet d’obtenir entre 14,5 et 21,5 %
d’activité supplémentaire selon la durée de la centrifugation; l’activité diminue à des
concentrations supérieures en sel.
L’extraction à partir du substrat sec avec une solution à 5 % de NaCl a donné une
augmentation d’environ 8 % après une centrifugation de 5 minutes. Cela s’explique par la
durée de centrifugation qui n’a pas été suffisante pour une concentration en sel plus faible.
L’analyse de la variance des résultats indique un effet significatif de la nature du solvant
utilisé (F = 10,33 et p =0) dans les cas de 5 minutes de centrifugation ; (F = 33,26 et p = 0)
dans le deuxième cas. Díaz et al. (2007), ont étudié l’effet de la solution d’extraction de
certaines hydrolases. Ils ont trouvé que le tween 80 à 0,1 %, est le meilleur solvant pour
l’extraction de la xylanase ; alors que la solution de NaCl (0,1M) est la meilleure pour l’exo-
polygalacturonase de l’Aspergillus awamori. Mukherjee et al. (2008), ont trouvé la meilleure
solution pour l’extraction de la protéase alcaline de Bacillus subtilis, l’eau distillée contenant
0,1 % de Triton X-100 à pH 8,0. L’analyse de la variance du facteur durée de centrifugation
indique l’effet significatif de ce paramètre, pour le substrat séché (F = 93,88 et p = 0) et aussi
pour le substrat congelé humide (F = 11,98 et p = 0,001).

75
 Résultats et discussions

Un bon solvant d’extraction doit être recherché pour que l’enzyme soit soluble et donne
le maximum de son activité. Les solvants polaires tels que l’eau et de nombreux sels
inorganiques, interagissent fortement avec les enzymes et les rendent solubles. Pour des
concentrations plus fortes en sels, il se produit une nouvelle diminution de la solubilité
(Laurent, 1982). L’utilisation de l’eau osmosée, le plus économique des solvants, permet
d’obtenir de bonnes valeurs d’activité protéasique. Ceci est en accord avec les conclusions de
Díaz et al. (2007).

76
 Résultats et discussions

10
9 ssubstrat sec
8
Activité protéasique (U/gms)

7 ssubstrat humide
6
5
4
3
2
1
0

Figu
igure 36. L'activité de la protéase neutre produit
oduite par A. oryzae
2220, après extraction par les différentes solutions
ons et centrifugation
eurs moyennes ± les
à 10 000g durant 5 min (résultats exprimés en valeur
écarts-types).

10 sub
substrat sec
9
Activité protéasique (U/gms)

8 sub
substrat
hu
humide
7
6
5
4
3
2
1
0

Figure 37. LL'activité de la protéase neutre produite par A. or

oryzae
2220, après ex
extraction par les différentes solutions et centri
ntrifugation
à 10 000g pendant 10min à 4°C
ts eexprimés en valeurs moyennes ± les écarts-ty
(résultats -types).

77
 Résultats et discussions

5.2. Effet de la durée de la solubilisation du substrat fermenté

5.2.1. Avec l’eau

Les résultats de l’étude de l’effet de la durée de contact du substrat fermenté avec l’eau
sont regroupés dans la figure 38. Il apparait que plus le substrat fermenté, reste en contact
avec le solvant plus longtemps, cela permet d’augmenter l’activité protéasique. Cette
augmentation est de (15,62 %) pour le substrat humide, alors qu’elle est beaucoup plus
importante (40,33 %) dans le cas du substrat séché. On constate que pour le dernier, l’activité
maximale est obtenue après 7 heures d’agitation. Cela est évident, puisque le substrat
contenant l’enzyme a été complètement déshydraté. Pour le substrat humide, cela correspond
à une durée plus courte. En effet, le maximum de l’activité est obtenu après 4 heures de
solubilisation. L’analyse des résultats indique l’effet significatif du facteur temps sur la
solubilisation et par conséquent sur l’extraction de l’enzyme (F = 46,14 et p = 0). Cela
correspond aux résultats d’Arantes et al. (2011) qui ont trouvé une durée optimale de 4 à 5
heures pour l’extraction de la manganèse-peroxydase produite par le champignon Lentinula
edodes en FMS.

5.2.2. Avec la solution de NaCl à 3 %

L’effet de la durée de contact du substrat contenant l’enzyme avec la solution de NaCl à

3 %, ayant donné la meilleure activité parmi les différentes solutions d’extraction testées a été
non significatif (F = 0,48 et p = 0,48), comme cela apparait dans la figure 39. Dans
l’intervalle de temps étudié, les valeurs de l’activité protéasique restent rapprochées. Cela
correspond aux résultats de Díaz et al. (2007), dans leur étude de l’effet temps de contact dans
l’intervalle 15 à 60 minutes. Ces auteurs n’ont pas trouvé d’effet significatif sur l’extraction
de leurs enzymes.

78
 Résultats et discussions

10
Activité protéasique (U/gms)

9
8 subs
ubstrat sec
7
6 subs
ubstrat humide
5
4
3
2
1
0
0 1 2 3 4 5 6 7 Temps en heures

Figure 38. Cinétique

nétique de l'extraction de la protéase neutre parr l'l'eau
osmosée, à partir
rtir des déchets de tomate fermentés par [Link]
yzae
exprimés en valeurs moyennes ± les écarts-type
2220 (résultats ex ypes).

8
7 substrat sec+
c+NaCl 3%
Activité protéasique (U/gms)

6
substrat hum
umide + NaCl
5
3%
4
3
2
1
0 Temps en heures
es
0 1 2 3

Figure 39. Ciné

Cinétique de l'extraction de la protéase neutree pa
par la
solution de Na
NaCl à 3%, à partir des déchets de tomate ferm rmentés
par A. oryzae
zae 2220 (résultats exprimés en valeurs moyenn nnes ±
les écarts-types).

79
 Résultats et discussions

5.3. Conclusion partielle

L’analyse des différents résultats obtenus dans cette partie, indique que parmi les
différentes solutions, l’eau est la plus convenable des solvants qui puissent être utilisés pour
l’extraction de la protéase. Une durée de contact de 4 heures permet d’obtenir 8,36 U/gms à
partir du substrat humide. Ce taux d’activité est relativement proche de ce qui est obtenu après
extraction par la solution de NaCl (8,79 à 8,93 U/gms). En outre, la présence du sel pourrait
poser des problèmes lors de la purification de l’enzyme et aussi à l’échelle d’une production
industrielle. En ce qui concerne le mode de conservation du substrat fermenté, soit par le
mode de séchage ou le mode de congélation directe après fermentation, il est convenable de
faire une évaluation du coût pour chacun des deux traitements dans la perspective du
développement du procédé.

80
 Résultats et discussions

6. Caractérisation de la protéase neutre produite par A. oryzae 2220

6.1. Effet du pH

Les résultats de l’action du pH sur l’enzyme indiquent une augmentation de l’activité

protéasique dans l’intervalle étudié (figure 40). Le maximum catalytique est atteint entre les
pH 7,6 et 8. Après une baisse de l’activité, une autre augmentation est constatée à pH 9.
L’enzyme garde pratiquement le même niveau d’activité à partir du pH 6,8 jusqu’à pH 9.
L’analyse de la variance montre un effet significatif de ce paramètre (F = 116,6 et p =0).
Ces résultats correspondent à ceux obtenus par Sumantha et al. (2005) pour la protéase
neutre d’[Link] 2217, Boulhalfa-Lezzar (2010) pour la protéase neutre d’A. oryzae
(Ahlburg) Cohen 1042.72 et Belmessikh (2011) pour la protéase neutre de la souche utilisée
dans ce travail.
Tous ces travaux indiquent la présence de protéases neutre et alcaline. En effet, Les
souches fongiques et notamment [Link], sont connues pour leur production de protéase
acide, neutre et alcalines en même temps dans les milieux de cultures (Botton et al., 1990).
Ainsi, il est nécessaire de définir le pH optimal de la protéase produite, car des
variations de ce paramètre affectent l’intégrité physique de la protéine enzymatique et peut
conduire à sa dénaturation. Le pH peut aussi avoir un effet sur l’affinité de l’enzyme pour le
substrat et son état d’ionisation dans le cas où des charges ioniques sont mises en jeu pour le
déroulement de la réaction. Le pH optimal dépend de la nature des résidus d’acides aminés
constituant le site actif (Pelmont, 1995).

81
 Résultats et discussions

6
Activité protéasique (U/gms)

0
pH
3 4 5 6 7 8 9 10

Figure 40. Effet du pH sur l'activité de la protéase neutre produite en

fermenteur par [Link] 2220 en FMS sur déchets de tomate (resultats
exprimés en valeurs moyennes ± les écarts-types).

82
 Résultats et discussions

[Link] de la température

Les résultats de l’effet de la température sur l’activité protéasique sont présentés dans la
figure 41. Le maximum est obtenu à 45 °C. L’enzyme reste active jusqu’à la température 55
°C. Au-delà, une diminution de l’activité est observée suite à l’instabilité et la dénaturation de
la protéine enzymatique. Ces résultats correspondent à ceux de Sumantha et al. (2005), de
Boukhalfa-Lezzar (2010) et de Belmessikh (2011). La température est un facteur important
dans la catalyse des transformations chimiques. En effet, elle augmente l’agitation des
molécules et accroît la possibilité de contact entre les molécules. Dans le cas de réaction
enzymatique, la température accélère la fréquence de collision entre le substrat et l’enzyme.
Au-delà d’une certaine température, la protéine enzymatique va subir des modifications de sa
structure tridimensionnelle, ce qui entraine progressivement la perte de son activité (Cuvellier,
1999).
Activité protéolytique (U/gms)

7
6
5
4
3
2
1
0
0 20 40 60 80 100
Température (°C)
Figure 41. Effet de la température sur l'activité de la
protéase neutre produite en fermenteur par A. oryzae 2220
en FMS sur déchets de tomate (résultats exprimés en
valeurs moyennes ± les écarts-types).

83
 Résultats et discussions

3.2. Stabilité thermique

Les résultats de l’étude de la stabilité thermique sont regroupés dans la figure 42. Cette
protéase présente une stabilité thermique reflétée par son activité résiduelle de 34 %, soit le
1/3 de l’activité totale, à 60°C après 60 minutes et de 25 %, le quart de l’activité totale, à 65°C
après 45 minutes. Ces résultats sont proches de ceux obtenus par Hajji et al. (2007) et García-
Gómez et al. (2009), sur les protéases alcalines d’Aspergillus clavatus ES1 et d’A. oryzae
2095 respectivement. Cependant, à 70 °C l’activité résiduelle passe de 16 % après 15 minutes
à 12 % après 45 minutes. L’enzyme se dénature presque totalement à température plus
élevées. La vitesse à laquelle une enzyme se dénature à une certaine température est un
moyen très pratique pour juger de sa stabilité. La dénaturation d’une protéine est mesurée par
la perte de ses propriétés biologiques (Pelmont, 1995).

40
60°C
Activité résiduelle (%)

35
65°C
30 70°C
25 75°C
20 80°C
15 85°C
10 90°C

5
0
15 30 45 60 Temps (minutes)

Figure 42. La stabilité thermique de la protéase neutre

d'Aspergillus oryzae 2220 produite par FMS sur déchets de tomate.

84
 Résultats et discussions

3.3. Effet de l’EDTA,, du zinc et du cuivre

D’après la figure 43,, l’ED

l’EDTA à la concentration 1mM provoque une perte de 70 % de
l’activité de la protéase neutre.
re. C ques divalents et inhibe
Cet agent chélateur fixe les ions métalliques
atique. Ce résultat confirme la présence d’un métal dans le site
de ce fait la molécule enzymat
se. Ces résultats sont déjà observés dans dess ttravaux précédents
catalytique de cette protéase.
Sumantha et al. (2005), Boukha 2012).
oukhalfa-Lezzar (2010) et Benkahoul et al. (2012

vité de l’enzyme. Des

Les cations du zinc et du cuivre exercent un effet positif sur l’activité
ions de ZnSO 4 aux
augmentations de 12 % et de 15 % sont obtenues par les solutions
concentrations 10 et 20 mM
M respectivement. L’effet de l’activation
on est beaucoup plus
important par la solution de CuCl2 en particulier à la concentration
on 20 mM avec 50 %
d’activité protéasique supplém urs auteurs Rao et al.
émentaire. Cet effet est mentionné par plusieurs
(1998), Agrawal et al. (2005)
5), Sumantha et al. (2005), Hajji et al. 2007, Boukhalfa-Lezzar
(2010) et Benkahoul et al. (2012 nt l’
(2012). L’ensemble de ces résultats indiquent l’état d’une protéase
à métal.

160
Activité résiduelle (%)

140
120
100
80
60
40
20
0
contrôle EDTA Zn Zn Zn Cu Cu Cu
(1 mM) (5 mM) (10 mM) (20 mM) (5 mM) (10 mM) (20 mM)

Figure 43. Effet

fets du zinc, du cuivre et de l'EDTA sur la
protéase neutre
re d'A. oryzae 2220 produite par FMS sur
déchets de tomate.

85
 Résultats et discussions

4. Précipitation par le sulfate d’ammonium

Les résultats de la précipitation fractionnée de l’extrait enzymatique par le SA, sont

regroupés dans le tableau 23. L’extrait brut contient plus de 1505 mg de protéines et 1120 U
d’activité de la protéase neutre produite par A. oryzae 2220 par FMS sur déchets de tomate.
L’enzyme est purifiée 4 fois, dans la fraction 40-80 % de saturation en SA. Le
rendement obtenu est de 30 %. Ce résultat est comparable à ceux rapportés dans la
littérature : Sumantha et al. (2005) ont obtenu une purification de 3 fois la protéase neutre
d’A. oryzae 2217, après une précipitation par le SA (sans indication de sa concentration).
Chellappan et al. (2006) ont purifié de 10 fois la protéase alcaline d’Engyodontium album
dans la fraction (40-90 %) de SA. Kumar et al. (2008) ont obtenu un taux de purification de
2,2 de la protéase produite par Synergistes sp. à 80 % de saturation par le SA. D’autres
auteurs ont réalisé un fractionnement de l’extrait enzymatique par l’acétone. Les taux de
purification obtenus sont de 1,6 et 2,6 pour les protéases alcalines d’A. parasiticus et A.
clavatus ES1 respectivement (Tunga et al., 2003 et Hajji et al., 2007). Cependant, les
solvants organiques sont dénaturants pour les protéines pour cela leur application est limitée.

Tableau 23 : Bilan de la précipitation au sulfate d’ammonium.

Protéines Activité Activité Taux de Rendement

totales (mg) totale (U) spécifique purification (%)
(U/mg)

Extrait brut 1505 1120 0.74 1 100

Précipitation
au SA 120 337 3 4 30
fraction
(40-80 %)

86
Conclusion générale et
perspectives
 Conclusion générale et perspectives

Le principal objectif de ce travail est la valorisation des sous-produits de la filière

tomate transformée par FMS afin de produire une enzyme protéolytique d’origine fongique.
Ce procédé permet d’exploiter toute la matière organique de ces déchets agro-industriels
disponibles en grande quantité et jamais utilisés pour cet effet.

Dans la première étape, les déchets de tomate ont été analysés. Ils sont composés à plus
de 52 % de fibres insolubles qui servent dans les cultures microbiennes par FMS à la fois de
support et de nutriments pour les microorganismes. Cette composition donne au substrat une
structure qui se maintient même après la stérilisation. Ces déchets sont également riches en
protéines avec un taux de plus de 20%. De ce fait, ils sont considérés comme une matière
riche en source azotée, ce qui favorise la synthèse d’enzymes. Ils répondent donc au besoin
d’inducteurs, en particulier pour la production des protéases. En effet, l’inducteur peut être le
substrat ou son analogue. Ainsi, son addition dans la cuve de fermentation peut multiplier
par 1000 la production de l’enzyme. Les déchets de tomate contiennent un taux de 6,52% de
cendres, ce qui représente aussi une quantité importante qui peut assurer l’apport en oligo-
éléments nécessaires à toute culture microbienne. Par ailleurs, ces déchets, produits en été,
peuvent être séchés à l’air libre sans aucune consommation d’énergie. Ils présentent un
substrat riche en matière organique complexe et minérale très économique.

La deuxième partie a été consacrée aux choix des micro-organismes et à la mise au

point du milieu de fermentation. Parmi les cinq souches d’Aspergillus cultivées en FMS sur
déchets de tomate, en Erlenmeyers, deux souches A. oryzae 5777 et A. oryzae 2220 ont été
sélectionnées pour la suite du travail. Ces deux champignons ont donné les activités
protéasiques les plus importantes. L’augmentation du pH en fin de culture a confirmé le
métabolisme des protéines. Les essais suivants ont été réalisés pour mesurer l’effet de
différents paramètres pouvant affecter la production de l’enzyme. Parmi ces paramètres, le
taux de l’humidité, le pH initial, l’âge de l’inoculum et la teneur en protéines ont eu des effets
significatifs sur la production de la protéase neutre. Alors que les deux facteurs, le taux de
spores et la taille des particules de substrat se sont révélés sans effet significatif sur la
synthèse de l’enzyme. Ce dernier résultat parait très intéressent, en effet les déchets de tomate
sont composés de graines en petite taille présentant une large surface d’attaque microbienne
ainsi que de pellicules de tailles variables permettant une meilleure aération et par conséquent

87
une bonne respiration pour le micro-organisme cultivé. Ce substrat se trouve encore
économique puisque il est inutile de le broyer avant son utilisation dans les procédés en FMS.

Dans la troisième partie, la production de l’enzyme a été réalisée en bioréacteur

« Fujiwara » équipé d’un dispositif d’aération, avec des quantités importantes de substrat.
L’utilisation de ce bioréacteur a permis de créer des conditions de fermentations plus
favorables au développement de la souche fongique utilisée et aussi à la production de la
protéase.

Parmi les souches testées, A. oryzae 2220 est la plus rapide ; elle arrive à produire le
maximum de la protéase en 72 h (3 jours), alors que A. oryzae 5777 le fait en 120 h (5 jours).
Sachant que le facteur temps est très important pour une production à l’échelle industrielle, la
première moisissure a été choisie pour la production de la protéase neutre.

Une nette amélioration de la production de la protéase est observée en réacteur. Cette

production est non seulement plus rapide, mais aussi plus importante comparée aux résultats
obtenus en Erlenmeyers. Pour la culture réalisée avec le substrat enrichi par la farine de soja,
la synthèse de l’enzyme débute après 12 heures de culture pour atteindre un maximum de
l’activité après 42 heures (plus de 12 U/gms). Le pH augmente aussi pour atteindre la valeur
de 6,8 à la fin de la fermentation.

Une production remarquable a été obtenue après la fermentation des déchets de tomate
sans apport d’une source de protéine additionnelle avec 13,55 U/gms, soit 12 % d’activité de
plus par rapport à la fermentation avec supplémentation. Le pH augmente puis se stabilise
entre 7,34 et 7,57 à partir de la 30ème heure. Il ressort de cette étude que ce sous-produit est
très adapté à la production d’enzymes protéolytiques en fermenteur par FMS, puisque il ne
nécessite aucun enrichissement. La composition de ce substrat associée à une aération
correcte stimule la production de la protéase neutre par la moisissure. Le système d’aération
apporte l’oxygène nécessaire à la croissance et accélère l’élimination du dioxyde de carbone,
produit du métabolisme défavorable à la moisissure. Il permet également de réguler la
température en évitant une accumulation de la chaleur métabolique. Ceci améliore la
croissance et conduit à une meilleure production d’enzymes. Le fermenteur utilisé permet
également le séchage du substrat fermenté en fin de culture. L’enzyme peut donc être
conservée sous cette forme à température ambiante pour les diverses utilisations ultérieures.

88
 Dans la suite de ce travail, l’extraction de l’enzyme a été réalisée à partir de deux types
de substrat fermenté, le substrat séché et le substrat humide congelé. Parmi les solvants
d’extraction étudiés, le maximum de l’activité est obtenu avec une solution de NaCl à la
concentration de 3 % (w/v). L’eau osmosée, la plus économique des solvants, donne
également de bonnes valeurs d’activité. Les résultats ont montré que le substrat humide
permettait d’obtenir plus d’unités de la protéase neutre produite par A. oryzae 2220 que le
substrat sec.

L’effet de la durée de contact du substrat fermenté avec l’eau a montré que plus le
substrat fermenté reste en contact avec le solvant, plus il permet d’augmenter l’activité
protéasique récupérée. Pour le substrat humide, la durée est de 4 heures ; elle est plus courte
que celle nécessaire à la solubilisation du substrat sec. Pour ce dernier, l’activité maximale
est obtenue après 7 heures d’agitation. Cela est évident puisque le substrat contenant l’enzyme
a été complètement déshydraté.

En dernière partie, l’étude des propriétés de l’enzyme vis-à-vis du pH, de la température

et aussi de quelques ions a été réalisée. Une augmentation de l’activité protéasique avec le pH
a été constatée, le maximum atteint se situe entre les valeurs de pH 7,6 et 8. L’enzyme a
gardé pratiquement le même niveau d’activité à partir du pH 6,8 jusqu’à pH 9. D’autre part, la
température optimale d’activité a été mesurée à 45°C ; celle-ci garde environ le même niveau
catalytique jusqu’à la température de 55°C. La protéase a présenté une stabilité thermique de
25 % d’activité résiduelle à 65°C après 45 minutes, soit le quart de l’activité totale, et de 34 %
à 60°C après 60 minutes, soit le tiers de l’activité totale. D’après l’étude de l’effet de l’EDTA
sur l’activité enzymatique, une inhibition de 70 % a été observée, alors que les cations
divalents du zinc et du cuivre activent l’enzyme. Cela met en évidence une structure
métalloprotéasique de l’enzyme. L’enzyme a été purifiée 4 fois par le SA et ce dans la
fraction 40-80 %. Le rendement de cette séparation est de 30 %, comparable à de nombreux
résultats de la précipitation fractionnée de certaines protéases.

Cette thèse présente la mise au point d’un procédé en FMS pour la production à
l’échelle pilote d’une enzyme ayant un intérêt technologique. Ces résultats mettent en relief
l’intérêt de recycler les déchets de tomate industrielle par ce type de fermentation pour la
production d’une protéase neutre fongique à un niveau élevé et à moindre coût.

89
 En perspectives, il serait souhaitable de :

 Poursuivre l’optimisation du milieu et d’étudier les paramètres ayant des effets sur le
système qui améliorent la production.
 Poursuivre la séparation de l’enzyme en fonction de l’utilisation envisagée.
 Réaliser des tests d’application de l’enzyme (tannerie, détergents, etc)
comparativement à des protéases commerciales.
 Recherche d’autres activités enzymatiques dans le même extrait telles que les
cellulases, les xylanases, les pectinases et les lipases, ainsi que d’autres métabolites.

90
Résumés
 Abstract

Agro-industrial residues are rich in organic matter. This makes such wastes very appropriate
for transformation by biotechnological processes. Among these, the solid-state fermentation
(SSF) have renewed interest worldwide because they provide significant production of
various substances compared to submerged cultures. Thus, the objective of this thesis is the
use of tomato waste in SSF for production of fungal protease. This substrate is composed of
more than 52 % of insoluble fiber, more than 20 % of proteins, 6.52 % ash, and other organic
materials. This composition is used in this type of fermentation as support and nutrients for
the microorganism and covers the requirements for inducing production of proteases. Among
five strains of Aspergillus grown on tomato pomace SSF in Erlenmeyer flasks, two strains
were selected for the development of culture conditions, A. oryzae 5777 and A. oryzae 2220.
The study of various parameters on neutral protease production gave a significant effect of
moisture, initial pH, age of inoculum and protein content. Two factors (spores rate and
particle size) were found no significant effect on enzyme synthesis. The fermentations
performed on a pilot scale by A. oryzae strain 2220, at 50 % initial moisture of substrate and
the enrichment of soy flour in an amount of 15 mg / g of substrate, more than 12 U / gds is
achieved after 42 hours. Culture with tomato pomace without adding additional protein source
allows higher production with 12 % more activity, of 13.55 U / gds. Among the solutions
studied for protease extraction, the 3% NaCl (w / v) gives the maximum activity. The results
also showed that the wet fermented substrate provides more neutral protease relative to the
dry substrate. The effect of the contact time of the fermented substrate with water gave a
maximum activity after stirring for 4 hours with the wet substrate and after 7 hours for the dry
one. On the other hand, the pH between 7.6 and 8 and a temperature of 45 ° C allow to obtain
maximum catalyst activity. The enzyme retains this activity until a temperature of 55 ° C. The
produced protease has a residual activity of 25 % at 65 ° C after 45 minutes and 34 % at 60 °
C after 60 minutes; it is inhibited at 70% by EDTA and activated by divalent cations of zinc
and copper. This indicates that it is a metallo-protease. The enzyme was purified 4-fold by SA
precipitation in the 40-80% fraction. The efficiency of this separation is 30%. These results
show the potential of tomato pomace as a culture substrate for protease production by SSF.
This would make it very economical synthesis and could meet the demand of growing market
for this group of hydrolases with very diverse technological interests

Key-words: Agro-industrial residues, tomato pomace, solid-state fermentation (SSF),

proteases, Aspergillus oryzae, optimization.

91
 ‫‪þ þ þÿ‬‬

‫‪ÿ'7 ÿÿþ ÿ‬ﻧﻔﺎﯾﺎت اﻟزراﻋﯾﺔ  ﻏﻧﯾﺔ ‪ /'N ÿ ÿþÿ‬اﻟﻌﺿوﯾﺔ‪ ،‬ﯾﻣﻛن 'ﺳﺗرﺟﺎﻋﮭﺎ ‪ N‬ﻣﻌﺎﻟﺟﺗﮭﺎ ‪ þ 7 ÿ 'N ÿ‬اﻟﻌﻣﻠﯾﺎت اﻟﺑﯾوﺗﻛﻧوﻟوﺟﯾﺔ ‪.‬ﻣﻦ ﺑﯿﻨﮭﺎ‬

‫طﺮﯾﻘﺔ '‪ (SSF) . þÿ ÿ' 7 ÿ ÿ ÿÿ‬ﺣﯿﺚ ‪ //ÿ ÿ‬اﻻھﺗﻣﺎم ﺑﮭﺎ ‪ þ ÿ‬ﺟﻣﯾﻊ '‪ Gÿþþ ÿ' ' þÿ ÿ‬ﻷﻧﮭﺎ ‪ . þÿÿ' 7 ÿN ÿ‬ﻛﺑﯾر ‪þ ÿ þ ÿ7 þþÿ þ þþÿÿ ÿ ÿ' /'N ÿ ÿ' F ÿ‬‬

‫'‪ F þÿ  þ ÿþÿÿþÿN . 7 N ÿ þ ÿ ÿ' 7 ÿ ÿ ÿÿ‬اﻟﮭدف ‪ F ÿ‬ھذه '‪ þÿþÿ 7 ÿ‬ھو ' ‪ . þþþÿ ÿ G'/ÿ ÿÿ‬اﻟﻄﻤﺎطﻢ ﻋﻦ طﺮﯾﻖ ‪SSF‬ﻹ‪ . þÿÿ‬أﻧزﯾم اﻟﺑروﺗﯾ‪6 þ‬‬

‫'‪.N 7 7 þÿ‬‬

‫‪ÿ ÿÿ‬ون ھده اﻟﻧﻔﺎﯾﺎت ﺑﺄ ‪ ٪ 52 F ÿ 7 ÿÿ‬أﻟﯾﺎف ﻏﯾر ‪ ٪ 20 F ÿ 7 ÿÿ ' N F þÿN 6þÿ þþÿþÿ‬ﺑروﺗﯾن  ‪ /'N ÿ N  /þÿ 7 ٪ 6.52 N‬ﻋﺿوﯾﺔ‬
‫' ‪ .O 7 ÿ‬ﯾﺗم ' ‪ G'/ÿ ÿÿ‬ھذه اﻟﺗرﻛﯾﺑﺔ ‪ þ ÿ‬ھذا '‪ 7 ÿ ÿ ÿÿ' F ÿ ? N ÿÿ‬اﻟﻣﯾﻛرو‪ / 'N ÿ ÿ' 7 /ÿ ÿ ÿ N þ ÿ þÿ /ÿ þ ÿ‬اﻟﻣﻐذﯾﺔ ‪ . þÿÿþÿ þÿ‬اﻟﺣﯾﺔ اﻟدﻗﯾﻘﺔ ﻣﻊ‬
‫ﺗﻐﻄﯿﺔ ‪þÿ ÿÿ . þÿþ7 ÿÿ‬ﯾ ‪ . þÿÿ' 6‬اﻟﺑروﺗﯾﺎ ‪ F ÿ .6‬ﺑﯾن ‪ SSFþ þÿ . ÿ ÿ Aspergillus.F ÿ . ÿ þ ÿ 7 ÿ ÿ‬ﻧﻔﺎﯾﺎت '‪þ ÿ G7 þÿ 7 ÿ‬‬
‫ﺣﻮﺟﻼت ‪7 N 7 ÿ ÿ‬ﯾﺔ  ‪ Gÿ‬اﺧﺗﯾﺎر '‪ÿÿÿ‬ﯾن ‪ . [Link] 2220 N [Link] 5777 þÿ '7 /ÿ' þ þÿ 'N ÿ ÿ‬إن ‪G þÿÿ ÿ þÿ '7 /‬‬

‫'‪ÿ‬ﻣﻌﺎﯾﯾر '‪ þ þÿ /7 ÿ& ÿ ÿ‬وﺳﻂ اﻟﺘﺨﻤﺮ ﺳﻤﺤﺖ ﺑﺎﻟﺘﻌﺮف ﻋﻠﻲ '‪ÿN ÿ ' þÿ N ÿ ÿ ÿ' þÿ 7 /  þ ÿN 7 7 ÿ‬ﯾ ‪O N ÿÿ ÿ N > 'N ÿÿ ' F ÿ  7 ÿ N þÿ þ‬‬
‫اﻟﺑروﺗﯾن ‪ÿ' . þÿÿ' þ þÿ /7 ÿ& ÿ /ÿ F ÿ 'N þ ÿ‬ﺑروﺗﯾ‪ .þ ÿ/þþ ÿÿ ÿ' 6 þ‬ﺑﯾﻧﻣﺎ ﺗﺑﯾن أن اﺛﻧﯾن ‪ ) þ ÿ N 7 /ÿ ÿ' F ÿ 'N þ ÿ' F ÿ‬ﻋﺪد اﻟﺠﺮاﺛﯾم ‪Gÿ ÿ N‬‬

‫ﺟﺳﯾﻣﺎت ‪ (7 ÿ ÿ ÿÿ' 7 ÿ N // þÿ‬ﻻ ﺗﺄﺛﯾر ﻟﮭﺎ ‪ þ þÿ‬ﺗﺧﻠﯾق اﻹﻧزﯾم ‪ .‬ﻋﻣﻠﯾﺔ ﺗﺧﻣﯾر ‪ F þ7 ÿ þ þÿ‬ﺗﺟرﯾﺑﻲ ' ‪7 7 ÿ þ 7 ÿ 'N ÿ 7 ÿÿ‬‬

‫‪  A . oryzae 2220‬ﻓﻲ وﺳﻂ دو ‪ þ ÿN 7 7‬أوﻟﯾ ‪ þ ÿþÿ ' N ٪ 50 þ‬دﻗﯾق اﻟﺻوﯾﺎ ﺑﻤﻘﺪار ‪,7 ÿ ÿ ÿÿ' //þÿ F ÿ G'7 ÿ / þ þÿ 15‬‬

‫ﯾﺗﺣﻘ ‪ F‬اﻟﻣزﯾد ‪ . þÿÿ' F ÿ‬إﻧزﯾم ‪ . þÿ þÿ 42 /þ ÿ 12 U /gds‬ﻋﻣﻠﯾﺔ ﺗﺧﻣﯾر ﻧﻔﺎﯾﺎت '‪ F N / G7 þÿ 7 ÿ‬ﺑروﺗﯾن ' ‪ þ ÿ ÿ ÿ þ ÿþÿ‬ﺑﺎﻟﺤﺼﻮل‬

‫ﻋﻠﻲ '‪ F ÿ . 13.55U/ gds N ' 7 þÿ ÿÿ' F ÿ ٪ 12. þ þÿ ' . þÿÿ‬ﺑﯾن '‪ÿþÿ ÿ ÿ‬ﯾ ‪ F‬اﻟﻢ ‪ 7 þ ÿ ÿÿ ÿ þ ÿ N 7 /‬اﻟﺑروﺗﯾ‪ þ ÿ ÿÿÿ ÿ' 6 þ‬ﻓﺎن‬
‫ﻛﻠورﯾد اﻟﺻودﯾوم ‪ (w/v) ٪ 3‬أ ‪. 7 þÿ ÿÿ' þ ÿ ÿ' þ 7 ÿ‬وأظﮭرت '‪ þ ÿþÿÿÿ‬أﯾﺿﺎ ' ‪ 7 ÿÿ ' 7 ÿN ÿ þ ÿ7 7 ÿ' /7 ÿ ÿ ÿ ÿ' //þÿ ÿ' F‬ﻗﯾﻣﺔ ﻣن‬

‫اﻟﺑروﺗﯾ‪ 6 þ‬اﻟﻤﺘﻌﺎدﻟﺔ ﻣﻘﺎرﻧﺔ ﻣﻊ '‪ þÿþÿ ÿ' þ ÿþÿ ÿ‬ﻟﻠﻤﺎدة اﻟﻤﺨﻤﺮة‪ .‬ﺗﺄﺛﯾر ﻣﺪة ' ‪þ ÿ7 7 ÿ' /7 ÿ ÿ ÿ ÿ' G7 þÿ 7 ÿ' . þþþÿ ÿ N ' þÿ ÿþÿ F þÿ ÿÿ‬‬
‫' ‪ F ÿ .þ þþÿ ÿ ÿ' . þþþÿ ÿ þÿ þ ÿÿ ÿÿþÿ . þÿ þÿ 7 /þ ÿ N . þÿ þÿ 4 //ÿ /þ ÿ 7 þÿ ÿ þ ÿ ÿ' þ 7 ÿ‬ﻧﺎﺣﯾﺔ ' ‪ þ ÿ N ÿ ÿ ÿ' þ ÿ 7 / . ÿþÿ O 7 ÿ‬ﺑﯾن‬
‫‪ þÿ 7 / 45 /7 '7 ÿ þÿ 7 / N 8 N 7.6‬ﻣﺋوﯾﺔ أدت إﻟﻰ '‪ 7 þÿ ÿÿ' þ ÿ ÿ' þ þÿ F N ÿ ÿ ÿ‬أﻧزﯾﻣﻲ ‪ .‬ﯾﺣﺗﻔظ ھذا ' ‪ÿ‬ﻧزﯾم ﺑﻨﺸﺎ ‪7‬ﮫ ‪þÿ 7 / þ ÿÿ‬‬

‫‪ þ ÿ 7 / 55 /7 '7 ÿ‬ﻣﺋوﯾﺔ‪ .‬ﻧﺴﺒﺔ '‪þÿ þ þÿÿÿ ÿ' 7 þÿ ÿÿ‬ﺑروﺗﯾ‪ þ ÿÿÿ ÿ'6 þ‬ھﻲ ‪ þ ÿ 7 / 65 /ÿÿ ٪ 25‬ﻣﺋوﯾﺔ ‪ 45 /þ ÿ‬دﻗﯾﻘﺔ ‪60 /ÿÿ ٪ 34 N‬‬

‫‪ þÿ 7 /‬ﻣﺋوﯾﺔ ﺑﻌﺪ ‪ 60‬دﻗﯾﻘﺔ  ﯾﺛﺑط ﻧﺷﺎط اﻷﻧزﯾم ‪ ٪ 70 þ ÿÿ ÿÿ‬ﺑﻮاﺳﻄﺔ ‪ N EDTA‬ﯾﺤﻔﺰ ﺑﺎ‪ÿ‬ﻛﺎﺗﯾوﻧﺎت اﻟﺚ‪ÿ‬ﺎﺋﯾ ‪G ÿ6 þÿ & ÿþÿ ÿÿ' þ‬‬
‫‪ .7 þÿ ÿÿ'N‬ھذا ﯾدل ‪ F ' þ þÿ‬اﻷﻧزﯾم ھو ﺑروﺗﯾ‪ Gÿ .þ ÿ/ þ ÿ 6 þ‬ﺗﻧﻘﯾﺔ ھدا ' ‪ÿ‬ﻧزﯾم ' ‪n 40-80 þ ÿÿ ÿ /ÿÿ SA þ 7 ÿ 'N ÿ . '7 ÿ þ ÿ7‬‬

‫‪ /' þþÿ ÿ‬ھذا اﻟﻔﺻل ھ ‪ þ ÿþÿÿÿ' F ' .n 30 þ‬اﻟﻣﺗﺣﺻل ﻋﻠﯾﮭﺎ ﺗدل ﻋﻠﻰ ' ‪ ? þÿ 7 ÿÿ ' F þÿ ÿ‬ﻧﻔﺎﯾﺎت '‪ÿþÿ þ ÿÿ þÿ G7 þÿ 7 ÿ‬ﮭﺎ ﻛﻮﺳﻂ ﻧﻤﻮ‬
‫ﻓﻲ ﺑﯿﺌﺔ ﺻﻠﺒﺔ ‪ . þÿÿÿ‬اﻟﺑروﺗﯾ‪ . 6 þ‬ھذا ‪ F ÿ‬ﺷﺄﻧﮫ ' ‪ F‬ﯾﺟﻌل ‪ÿþÿÿ' F ÿ‬ﯾ ‪ þ‬اﻗﺗﺻﺎدﯾﺔ ﻟﻠﻐﺎﯾﺔ ‪ N‬ﯾﻣﻛن ﺗﻠﺑﯾﺔ '‪ . þ7 ÿ‬اﻟﻣﺗزاﯾد ‪ þ ÿ‬ا‪ F N ÿ ÿ‬ﻟﮫ ‪G6‬‬

‫'‪ F ÿ þ ÿ N ÿ ÿ ÿ ÿ‬اﻟﮭﯾدروﻻز اﻟﻤﻌﺮوﻓﺔ ﺑﺎﻟﻔﻮاﺋﺪ اﻟﺗﻛﻧوﻟوﺟﯾﺔ اﻟﻤﺘﻨﻮﻋﺔ ‪.'/ÿ‬‬

‫اﻟﻜﻠﻤﺎت اﻟﻤﻔﺘﺎﺣﯿﺔ ‪ÿ' :‬ﻧﻔﺎﯾﺎت اﻟزراﻋﯾﺔ  ‪ (SSF) . þÿ ÿ' 7 ÿ ÿ ÿÿ'  G7 þÿ 7 ÿ' . þþþÿ ÿ‬؛ أﻧزﯾم اﻟﺑروﺗﯾ‪Aspergillus  6 þ‬‬

‫‪ oryzae‬ﺗﺣﺳﯾن '‪.7 ÿ ÿ ÿÿ‬‬

‫‪92‬‬
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106
Annexes
 2,5
Absorbance 750 nm

1,5

y = 0,019x
1
R² = 1

0,5

0
0 20 40 60 80 100 120
Tyrosine (µg/ml)

Figure a. Courbe étalon pour le dosage de la tyrosine.

 1,2
Absorbance à 650 nm

0,8

0,6

0,4 y = 1,993x
R² = 0,941
0,2

0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Concentration de BSA (mg/ml)

Figure b. Courbe étalon des protéines.

 Hayet BOUKHALFA-LEZZAR

Laboratoire de Biologie et Environnement- Université des frères Mentouri- Constantine

Laboratoire de Microbiologie Industrielle- Université de Reims

Thème

Etude de la production de la protéase par Aspergillus oryzae sur

milieu solide en fermenteur Fujiwara. Utilisation des déchets de
tomate comme substrat de fermentation.

Résumé

Les déchets agro-industriels, riches en matières organiques, peuvent être recyclés et transformés par
les procédés biotechnologiques. Parmi ces derniers, les fermentations en milieu solide (FMS)
connaissent un regain d’intérêt à travers le monde, puisque elles permettent une production importante
de diverses substances comparée à celle des cultures submergées. Ainsi, l’objectif de cette thèse est la
valorisation des déchets de tomate par FMS pour la production d’une protéase fongique. Ce substrat
est composé à plus de 52 % de fibres insolubles, de plus de 20% de protéines, de 6,52% de cendres et
autres matières organiques. Cette composition sert dans ce type de culture microbienne à la fois de
support et de nutriments pour le microorganisme et couvre les besoins d’inducteurs pour la production
des protéases. Parmi cinq souches d’Aspergillus cultivées en FMS sur déchets de tomate en
Erlenmeyers, deux ont été sélectionnées pour la mise au point des conditions de culture, A. oryzae
5777 et A. oryzae 2220. L’étude de différents paramètres sur la production de la protéase neutre a
donné un effet significatif par le taux d’humidité, le pH initial, l’âge de l’inoculum et la teneur en
protéines. Deux facteurs (taux de spores et taille des particules de substrat) se sont révélés sans effet
significatif sur la synthèse de l’enzyme. Les fermentations réalisées à l’échelle pilote par la souche A.
oryzae 2220, à 50 % d’humidité initiale du substrat et avec un enrichissement par la farine de soja à
raison de 15 mg/g de substrat, a permis d’atteindre plus de 12 U/gms après 42 heures. La culture avec
les déchets de tomate sans apport de la source de protéine additionnelle permet une production plus
importante avec 12% d’activité supplémentaire, soit 13,55 U/gms. Parmi les solutions étudiées pour
l’extraction de la protéase produite, le NaCl à 3 % (w/v) donne le maximum d’activité. Les résultats
ont également montré que le substrat fermenté humide permet d’obtenir plus de protéase neutre par
rapport au substrat sec. L’effet de la durée de contact du substrat fermenté avec l’eau a donné une
activité maximale après 4 heures d’agitation pour le substrat humide et après 7 heures pour le substrat
sec. D’autre part, le pH entre 7,6 et 8 et la température de 45°C permettent d’obtenir le maximum de
l’activité catalytique. L’enzyme conserve cette activité jusqu’à la température de 55°C. La protéase
produite présente une activité résiduelle de 25 % à 65°C après 45 minutes et 34 % à 60°C après 60
minutes ; elle est inhibée à 70 % par l’EDTA et activée par les cations divalents du zinc et du cuivre.
Cela indique qu’il s’agit d’une protéase à métal. L’enzyme a été purifiée 4 fois par le SA dans la
fraction 40-80 %. Le rendement de cette séparation est de 30 %. L’ensemble du travail réalisé montre
les potentialités des déchets de tomate comme substrat de culture en phase solide pour la production de
protéases. Cela rendrait cette synthèse très économique et pourrait satisfaire la demande du marché
toujours croissante pour ce groupe d’hydrolases à intérêts technologiques très variés.

Mots-clés : fermentation en milieu solides (FMS), résidus agro-industriels, déchets de tomate,

protéases, Aspergillus oryzae, optimisation.