2.
Extraction d’ADN génomique par PCI :
a. Principe :
L’extraction au phénol chloroforme iso amylique est une méthode liquide-liquide employée en
biologie moléculaire pour isoler les acides nucléiques. La solution PCI engendre la formation de 2
phase liquide distinctes : une phase aqueuse contenant l’ADN et une phase ph2nolique contenant les
protéines.
b. Avantage et inconvénient :
Avantage Inconvénient
• Composition des réactifs est connue • Produits chimiques toxiques
• Rendement élevé. • Prend beaucoup de temps
• L’extraction au phénol-chloroforme
comporte plusieurs étapes qui peuvent
introduire des contaminants dans
l’échantillon d’ADN
c. Matériel et appareils
Verre à pied
Micropipette
Colonne spin
Minuterie
Tube Eppendorf
Cônes
Spectrophotomètre
Bain marin
Etuve
Centrifugeuse
d. R
Réactif Role é
a
c
Solution de lyse SDS : Sodium Dedocyl Sulfate est un t
i
détergent qui attaque les lipides f
membranaires. s
EDTA : chélateur des ions bivalents.
Tris : garde la stabilité du pH.
Na Cl : permet de neutraliser les charges
négatives de l’ADN
Protéine k Permet de digérer les protéines et
dégrader les histones
Phénol Responsable de la déprotéinisassions
Chloroforme Elimine les trace de phénol
Ethanol Utiliser pour la précipitation et la
déshydratation
NaCl Maintenir le pH
TE Lyse des GR
et leurs rôles
e. Echantillonnage
A partir d’une souche d’E. Coli on prend à l’aide d’un cône une ligne de colonie pour le premier
binôme pour le deuxième binôme on prend 2 lignes
f. Protocole :
Etape 1 : La lyse
- Prélever à l’aide d’une cône une ligne de la bactérie
- Mettre l le cône dans un tube Eppendorf
- Ajouter 500µl de solution de lyse
- Mélanger par le cône
- Ajouter 20µl de Pk
- Mélanger
- Centrifuger
- Mettre le tube dans un bain marin pendant 3h
- Vérifier le culot on doit trouver une dégradation complète
Etape 2 : extraction par PCI
- Ajouter 500µl de phénol
- On obtient 2 phases
- centrifuger pendant 5 min, 3500trm
- On pépite la phase aqueuse
- Ajouter 500µl du chloroforme pour éliminer le phénol
- On observe que le mélange à une couleur blanchâtre
- centrifuger pendant 5min, 3500trm
- pépite la phase aqueuse
Etape 3 : précipitation d’ADN
- Purification par 1ml de l’éthanol froid
- Ajouter 50µl de NaCl
- On observe l’apparition des petits filaments fines
- Centrifuger pendant 10min
- Eliminer le surnageant
- Ajouter 1ml de l’éthanol froid
- Centrifuger pendant 10min
- Eliminer le surnageant
- Sécher dans l’étuve pour évaporer la solution et ne laisse que la Médus
Etape 4 : Ressuspension de l’ADN
- Ajouter 50ul de TE ( 10.1 )
- Mettre le tube dans un bain marin à 65°C pendant 10min
Etape 5 : préparation des délutions
On prépare des dilutions de
g. Analyse quantitative d’ADN
La concentration d’ADN extrait à été estimée par spectrophotométre à 260nm sachant que une unité
de DO 260nm = 50ug/ml d’ADN donc :
[ ADN ](ug/ml) = facteur de dilution DO 260nm 50ug/ml
h. Analyse qualitative d’ADN
La pureté des acides nucléiques est évaluée en calculant un "ratio"
Qualité d’ADN = DO260 / DO280
Résultats
Méthode Phénol-Chloroforme
Binome
Groupes Echa Qt s DO260 DO280 DO230 DO260/DO280 DO260/DO230 [ADN]
Bacterie 1 passage B1 0,00557 0,00336 0,00123 1,66 4,54 55,7
G5 -
Bacterie 2 passage B2 0,01016 0,00552 0,00244 1,84 -4,16 101,6
Sang 100 B1 0,02213 0,01236 0,00740 1,79 2,99 221,3
G6 -
Sang 200 B2 0,04105 0,02195 0,00987 1,87 -4,16 410,5
-
Ecouv B B1 0,00543 0,00305 0,00035 1,78 -15,44 54,3
G7
-
Ecouv B B2 0,00307 0,00186 0,00018 1,65 -16,77 30,7
GB 100 B1 0,03890 0,02058 0,01292 1,89 3,01 389
G8
GB 200 B2 0,08601 0,04551 0,03660 1,89 2,35 860,1