Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université Virtuelle de Tunis

Génie de la biocatalyse et génie des

procédés

« Traitements des enzymes

industrielles »

Concepteur du cours: Prof. Dr. Mohamed GARGOURI

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Traitements des enzymes industrielles

1. Extraction d’enzymes et traitements possibles

 Le degré de pureté d’une enzyme commercialisée varie des préparations

enzymatiques jusqu’aux enzymes hautement purifiées, et ce selon
l’application envisagée. La matière première pour l’extraction/purification peut
être un organe animal, un matériel végétal ou des microorganismes.

 Le passage d’un procédé d’extraction/purification de l’échelle de laboratoire à

l’échelle industrielle doit tenir compte des contraintes économiques et de
l’aspect technologique.

 Lorsque l’enzyme est extracellulaire, elle est généralement libérée dans le

milieu avec un petit nombre d’autres molécules. Il suffit donc de séparer le
milieu des cellules pour obtenir un extrait enzymatique brut.

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1.1. Extraction des enzymes

 Dans le cas des enzymes animales ou végétales, ou encore les enzymes

intracellulaires des microorganismes, une opération supplémentaire est au
moins nécessaire pour rompre les barrières cellulaires. Le choix de la
procédure d’extraction dépend de la localisation de l’enzyme :
 Méthodes mécaniques :
- Extraction d’enzymes par haute pression suivie de dépression (French-
press),
- Broyage ou écrasement (éventuellement en présence de billes),
- Ultrasons ; à des fréquences déterminées, des trous au niveau de la
membrane laissent sortir des protéines.
 Méthodes non-mécaniques :
- Séchage ou traitement par congélation-décongélation pour la
destruction des barrières,
- Lyse physique des barrières cellulaires par choc osmotique,
- Lyse chimique par l’emploi de détergent,
- Lyse enzymatique (exemple : lysozyme) : méthode de laboratoire.

1.2. Séparation des enzymes d’une part, des cellules et débris cellulaires
d’autre part

 L’étape suivante consiste à éloigner les solides pour obtenir une préparation
enzymatique brute. Cette opération est difficile lorsque la densité des cellules
bactériennes de petite taille est proche de la densité du milieu de
fermentation.

 Les méthodes suivantes sont utilisées :

o Décantation adaptée aux cellules de grande taille comme les
levures,

o Filtration continue, largement utilisée en industrie,

o Des centrifugeuses continues sont de plus en plus utilisées.

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2. concentration et purification d’enzymes

2.1. Opération de concentration

 Puisque les enzymes dans les extraits sont souvent insuffisamment

concentrées, le volume doit être réduit par concentration. Les méthodes de
concentration ne doivent pas altérer l’activité enzymatique.

 Méthodes utilisées :
o Méthodes thermiques, comme la « thin-layer evaporator » :
méthodes douces à cause de la thermolabilité des enzymes.

o Précipitation aux sels, comme le sulfate d’ammonium entre 20 et

80%. Le sel à forte concentration agit sur les molécules entourant la
protéine et change les forces électrostatiques assurant leur
solubilité. Plus le sel est concentré plus il cause la précipitation des
petites protéines. On peut donc procéder à une précipitation
fractionnée. Cette méthode a l’inconvénient d’encourager la
corrosion du matériel et de nécessiter un traitement des eaux avant
leur rejet.

o Précipitation aux solvants organiques comme l’éthanol ou l’acétone.

Les solvants affaiblissent la liaison entre l’eau et la protéine et
encouragent donc les liaisons entre protéines qui agglomèrent et
précipitent. Les solvants présentent cependant une source de
toxicité.

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o Précipitation aux polymères comme les polyéthylenimines et les

polyéthylène glycols entre 15 et 20%.

o Précipitation au point isoélectrique. La solubilité d’une protéine est

minimale au pH où leur charge nette est nulle.

o Ultrafiltration utilisant une membrane semi-perméable laissant

passer des molécules inférieures à une certaine taille. Les
membranes disponibles ont des pores qui laissent passer des
molécules de 1000 à 300 000 Da.

2.2. Purification des enzymes

 Dans certains domaines comme celui médical ou analytique, les enzymes

doivent être hautement purifiées. Dans d’autres domaines industriels les
enzymes peuvent être partiellement purifiées.
 Méthode de cristallisation ; c’est la formation de particules solides de l’enzyme
de forme et taille définies, sous certaines conditions du milieu qui favorisent
les intéractions protéine-protéine. La cristallisation d’enzymes sert plus pour
les analyses par diffraction aux rayons X plutôt qu’un procédé de purification.
On note cependant la commercialisation de certaines enzymes sous forme
cristallisée comme des cellulases ou alcool-oxydase.
 Electrophorèse ; utilisée pour isoler des enzymes pures à l’échelle de
laboratoire. Les méthodes utilisées sont de type électrophorèse zonale,
isotachophorèse ou gradient de porosité. Le Scale-up de l’électrophorèse est
limité par le chauffage généré par le procédé et l’interférence causée par la
convection.
 La chromatographie est d’une importance fondamentale dans la purification
d’enzymes :

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Méthodes chromatographiques

Type de principe Séparation suivant :

chromatographie

adsorption Liaison à la surface Affinité de surface

distribution équilibre de distribution polarité

échange d’ions liaison ionique Charge

Filtration sur gel Diffusion dans les pores Taille et forme moléculaires

Affinité Adsorption spécifique Structure moléculaire

Hydrophobe Interactions hydrophobes Structure moléculaire

Covalente Liaison covalente polarité

Milieux de gel filtration commercialisés (exemples)

Nom commercial Matrice Domaine de

(fabricant) fractionnement (MM)

Biogel (Biorad) Polyacrylamide (P-type) 100-400000

Agarose (A-type) 1000-150 106

Ultrogel (LKB) Agarose 25000-20 106

Sephadex (Pharmacia) Dextran 50-600000

Sepharose (Pharmacia) Agarose 10000-40 106

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(A) (B)

Schémas de procédures de purification d’enzymes par :

(A) : chromatographie d’affinité,

(B) : chromatographie convalente.

3. Formulation et suivi de la pureté

☺
3.1. Forme de commercialisation

 [Link] sont commercialisées sous forme de concentré liquide stabilisé

ou de solide (poudre ou particules). La formule de la préparation enzymatique
comporte différents éléments à objectifs différents :

 Stabilisation : la formulation a comme première tâche de minimiser la perte

d’activité enzymatique durant le transport, le stockage et l’utilisation.

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o Certains producteurs d’enzymes ajoutent à l’enzyme séchée un

sucre, un alcool polyhydrique ou bien des sels pour s’associer avec
l’eau qui hydrate la surface de la protéine et rendre ainsi la protéine
plus rigide donc plus stable.

o Le meilleur moyen de combattre l’inactivation du site actif est

d’ajouter à la formule un cofacteur ou un inhibiteur réversible qui
s’associent au site actif et limitent sa transformation essentiellement
par oxydation.

 Préservation contre la contamination microbienne.

 Eviter la précipitation

 Minimiser la formation de poussière.

 Optimisation de critères esthétiques.

 Une standardisation du produit industriel est nécessaire pour garder la même

qualité d’une même préparation enzymatique.

3.2. Mesure de l’activité enzymatique

 Activité (A) : nombre de moles de substrat transformé (ou de produit apparu)

par unité de temps.
 Unité internationale (UI) : quantité d’enzyme susceptible de transformer 1
micromole de substrat par minute ( mole min-1).
 Activité spécifique (AS) : nombre de micromoles de substrat transformé par
minute, par mg de protéine (UI mg-1).
 La cinétique enzymatique peut être suivie par des méthodes de détection
optiques, électrochimiques ou radio-actives.
 La quantité en protéines est déterminée essentiellement par des méthodes
spectrophotométriques.
 Facteur de purification : ASaprès/ASavant purification
 Rendement de purification : Aaprès/Aavant purification x 100.

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Nous pouvons analyser ce tableau en vérifiant les différents calculs.

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