UNIVERSITÉ DU QUÉBEC

INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

CENTRE EAU TERRE ENVIRONNEMENT

Développement d’une nouvelle alternative aux antibiotiques

utilisés dans l’élevage de volaille à base d’une combinaison
entre : laccase - protéines de levure - acide citrique

Par
Mona Chaali

Mémoire pour l’obtention du grade de

Maître ès sciences ([Link].) en sciences de l’eau

Jury d’évaluation

Président du jury et Rajeshwar Dayal Tyagi

Examinateur interne INRS ETE

Examinateur externe Rosa Galvez

Université Laval

Examinateur interne Suha Jabaji

Université McGill

Directeur de recherche Satinder Kaur Brar

INRS ETE

© Droits réservés de Mona Chaali, 2017

 REMERCIMENTS

Tout d’abord, je tiens à exprimer ma reconnaissance et mes sincères

remerciements à ma directrice de recherche le Professeure Satinder Kaur
Brar pour m’avoir intégré au sein de son équipe de recherche, pour son
temps et sa patience et surtout pour son encadrement et ces judicieux
conseils qui ont contribué dans le renforcement de ma connaissance.
Je remercie spécialement le Docteur Antonio Avalos Ramirez, chercheur
au Centre National en Électrochimie et Environnement (CNETE) pour
m’avoir accueilli au sein des laboratoires de CNETE et donné la chance de
travailler parmi son équipe d’experts. Je le remercie aussi pour sa
gentillesse, ses conseils et son suivi régulier.
Je remercie aussi les associés de recherche de mon équipe de recherche
le Docteur Tarek Rouissi et le Docteur Joanna Lecka pour leur contribution
au bon déroulement de mon travail de recherche dans les laboratoires de
l’INRS ETE, pour leur disponibilité et leur précieuse aide.
Je tiens aussi à remercier le Directeur général de l’ISHÉDD (Institut
Supérieur des Hautes Études en Développement Durable) Monsieur Kamal
Elhaji, avec qui j’ai commencé la première partie de ma maitrise, pour ses
enseignements qui ont participé en alimentation de ma réflexion, son suivi
et ses conseils.
Grand merci à l’ensemble du personnel de l’ISHÉDD
Je remercie le personnel du laboratoire pour leur professionnalisme et leur
sympathie.
Et finalement, je remercie mes collègues, mes amis et ma famille pour leur
soutien et leurs encouragements continus.

iii
 RÉSUMÉ

Le présent travail de recherche est porté sur le développement d’une nouvelle

combinaison alimentaire qui stimule le métabolisme des volailles pour les
maintenir en bonne santé et ainsi diminuer les doses d’antibiotiques qui leur sont
administrés continuellement. Cette approche sera une initiative pour faire part à la
grande problématique du développement de résistance chez les bactéries
pathogènes. Cette combinaison contiendra l’enzyme laccase, l’acide citrique et
des protéines de levure, produits actuellement au laboratoire par fermentation.
Pour l’enzyme laccase, le marc de pomme est fermenté avec Trametes
versicolore. L’acide citrique est produit par fermentation solide du marc de pomme
utilisant Aspergillus niger. La protéine est produite par fermentation de
Saccharomyces cerevisiae dans les boues de l’ultrafiltration du jus de pomme. Les
taux de production obtenus sont : 38 Unités enzymatiques/g substrat sec, 30-40 g
acide citrique/kg substrat sec et 35-40 g protéine/L substrat. Après l’étape de production,
le test de mélanisation a été réalisé afin de prouver l’efficacité de cette
combinaison et son effet sur le système immunitaire des volailles. La plus
importante réponse a été observée lorsque la laccase est combinée avec l’acide
citrique. Les résultats ont été statistiquement significatifs (P: 0,0005 à 0,005).
Concernant la seconde étape du projet, l’objectif été de passer d’une combinaison
en bouillon de fermentation à un produit finalisé sous forme de poudre utilisable à
grande échelle dans les fermes d’élevage de volailles. La technique utilisée pour
le séchage est la technique de séchage par atomisation. Afin de réaliser une
optimisation de séchage, 8 expériences ont été effectués. Nous avons obtenu les
meilleurs résultats dans la 8ème expérience (72% de récupération l’activité initiale
de la laccase, 99% de la concentration initiale de l’acide citrique et 86% de la
concentration initiale des protéines).

Mots-clés : volaille, antibiotique, fermentation, alternatives, combinaison.

v
 TABLE DES MATIÈRES

CHAPITRE 1 : SYNTHÈSE ........................................................................................................ 1

1. INTRODUCTION .................................................................................................................. 3
2. REVUE DE LITTÉRATURE : ............................................................................................. 5
2.1 Consommation de la viande de volaille à l’échelle mondiale ......................... 5
2.2 Consommation au Canada : .................................................................................... 7
2.3 Utilisation des antibiotiques dans l’élevage de volailles, relation avec la
santé humaine et bio-alternatives existantes : ............................................................... 8
2.4 Les dangers de l’utilisation des antibiotiques promoteurs de croissances
sur la santé humaine : ........................................................................................................... 8
2.5 Bioalternatives aux antibiotiques promoteurs de croissance : ................... 10
2.5.1 Les probiotiques : ............................................................................................ 10
2.5.2 Les prébiotiques :............................................................................................. 10
2.5.3 Les symbiotiques : ........................................................................................... 11
2.5.4 Les acides organiques :.................................................................................. 11
2.5.5 Les enzymes : .................................................................................................... 12
2.5.6 Les extraits de plantes :.................................................................................. 12
2.5.7 Les protéines :................................................................................................... 13
2.6 Les trois composantes de cette bio-alternative et les microorganismes
producteurs............................................................................................................................ 15
2.6.1 La laccase produite par Trametes versicolor : ......................................... 15
2.6.2 Les protéines de levure produites par Saccharomyces cerevisiae :.. 16
2.6.3 L’acide citrique produit par Aspergillus niger :........................................ 16
3. PROBLÉMATIQUE :.......................................................................................................... 19
4. OBJECTIFS DE RECHERCHE : ..................................................................................... 20
5. HYPOTHÈSES : ................................................................................................................. 20
6. MATERIÉL ET MÉTHODES: ........................................................................................... 23
6.1 Production de laccase par Trametes versicolor : ............................................ 23
6.1.1 Culture de Trametes versicolor : .................................................................. 23
6.1.2 La fermentation à l’état solide ....................................................................... 23
6.1.3 Extraction de la laccase et estimation de son activité enzymatique : 25

vii
 6.2 Production de l’acide citrique par Aspergillus niger : .................................... 25
6.2.1 Culture de l’Aspergillus niger : ..................................................................... 25
6.2.2 La fermentation à l’état solide : .................................................................... 26
6.2.3 Extraction de l’acide citrique et estimation de sa concentration : ...... 26
6.3 Production des protéines de levure par Saccharomyces cerevisiae : ....... 26
6.3.1 Culture de Saccharomyces cerevisiae : ..................................................... 26
6.3.2 Fermentation à l’état liquide :........................................................................ 27
6.3.3 Extraction des protéines et estimation de la concentration : ............... 28
6.4 Test de mélanisation................................................................................................ 28
6.4.1 Culture de cellule de Saccharomyces cerevisiae : .................................. 28
6.4.2 Préparation du milieu de fermentation pour la mélanisation : ............. 28
6.4.3 Recomptage des cellules de levure : .......................................................... 29
6.4.4 Extraction et pesée de la mélanine produite par les cellules de
levure :……………………………………………………………………………………………………………………………29
6.5 Développement d’une formulation en poudre par la technique de séchage
par atomisation : ................................................................................................................... 30
6.5.1 Préparation des échantillons : ...................................................................... 30
6.5.2 Le séchage par atomisation : ........................................................................ 30
6.5.3 Analyses des poudres récoltées :................................................................ 30
7. RÉSULTATS ET DISCUSSION:...................................................................................... 33
7.1 Production de la laccase par Trametes versicolor : ....................................... 33
7.2 Production de l’acide citrique par Aspergillus niger : .................................... 34
7.3 Production des protéines de levure par Saccharomyces cerevisiae: ........ 35
7.4 Test de mélanisation : ............................................................................................. 36
7.5 Le séchage par atomisation : ................................................................................ 38
8. CONCLUSIONS : ............................................................................................................... 45
CHAPITRE 2 : ARTICLE DE RECHERCHE ......................................................................... 53
UN SUPPLÉMENT ALIMENTAIRE CONTENANT LA LACCASE ET L’ACIDE
CITRIQUE COMME ALTERNATIVE AUX ANTIBIOTIQUES UTILISÉS DANS
L’ÉLEVAGE DE VOLAILLES – DÉCLENCHEUR IN VITRO DE LA PRODUCTION DE
LA MÉLANINE ............................................................................................................................ 53
SUPPLEMENT COMPRISING LACCASE AND CITRIC ACID AS AN ALTERNATIVE
FOR ANTIBIOTIC IN POULTRY FARMING – IN VITRO TRIGGERS OF MELANIN
PRODUCTION ............................................................................................................................ 55
RÉSUMÉ ...................................................................................................................................... 57

viii
ABSTRACT ................................................................................................................................. 59
1. Introduction .................................................................................................................... 60
2. Material and methods .................................................................................................. 61
2.1 Production of laccase.......................................................................................... 61
2.2 Microorganism ...................................................................................................... 61
2.3 Solid state fermentation (SSF) .......................................................................... 61
2.4 Enzyme extraction and activity test................................................................. 61
2.5 Production of citric acid ..................................................................................... 62
2.6 Microorganism and spore solution.................................................................. 62
2.7 Solid state fermentation (SSF) .......................................................................... 62
2.8 Citric acid extraction and analysis................................................................... 62
2.9 Melanization test ................................................................................................... 63
2.10 Yeast cells culture ................................................................................................ 63
2.11 Test conditions...................................................................................................... 63
3. Yeast cell count............................................................................................................. 63
4. Melanin extraction and quantification..................................................................... 64
5. Results and discussion .............................................................................................. 65
6. Conclusion ..................................................................................................................... 66
7. Conflict of interest ........................................................................................................ 66
8. Acknowledgements...................................................................................................... 66
9. References: .................................................................................................................... 73

ix
 LISTES DES FIGURES

Figure 1 : Graphe représentant les pourcentages d'approvisionnement en viande dans le

monde en 2012. [Link]
janvier 2016. .................................................................................................................................. 5
Figure 2 : Graphe représentant l’évolution de l'élevage mondial. Source : Statistiques
2012, FAO (Organisation des Nations unies pour l'alimentation et l'agriculture.
[Link] janvier 2016 .......... 6
Figure 3 : Schéma explicatif de la transmission de résistance entre les bactéries modifié.
Source : [Link] janvier 2016. .................................... 9
Figure 4 : Schéma représentant des alternatives biologiques aux antibiotiques
promoteurs de croissances chez les volailles, réalisé par Mona Chaali, décembre 2015.
....................................................................................................................................................... 13
Figure 5 : Graphe représentant le profil d’étude de la production de la laccase ............. 33
Figure 6 : Graphe représentant le profil d’étude de la production de l’acide citrique ...... 34
Figure 7 : Graphe représentant le profil d’étude de la production des protéines de levure
....................................................................................................................................................... 35
Figure 8 : graphe représentant le nombre de cellules compté par hémacytomètre après
10 jours de fermentation pour chaque condition. .................................................................. 36
Figure 9 : photo des filtres Wattman après filtration des milieux de cultures pour la
récupération et quantification de la mélanine produite par les cellules de levure dans
chaque condition. A : milieu avec les cellules de levures seulement, B : milieu avec les
cellules de levure et l’acide citrique. C : milieu avec les cellules de levure et la laccase et
D : milieu avec les cellules de levure l’acide citrique et la laccase. .................................... 36
Figure 10 : graphe représentant la quantité de mélanine produite par cellule en g pour
chaque condition......................................................................................................................... 37
Figure 11 : graphe représentant le % récupération de l’activité enzymatique initiale de la
laccase pour chaque expérience de séchage par atomisation. .......................................... 42
Figure 12 : graphe représentant le % récupération de la concentration initiale en protéines
pour chaque expérience de séchage par atomisation. ......................................................... 43
Figure 13 : graphe représentant le % récupération de la concentration initiale en acide
citrique pour chaque expérience de séchage par atomisation. ........................................... 43

xi
 LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Tableau récapitulatif contenant les alternatives biologiques et leurs propriétés

bénéfiques pour les volailles. .................................................................................................... 14
Tableau 2 : tableau représentant la caractéristiques physico-chimiques du marre de
pomme.......................................................................................................................................... 24
Tableau 3 : tableau représentant les caractéristiques physico-chimiques des boues
d'ultrafiltration de fabrication de jus de pomme. .................................................................... 27
Tableau 4 : tableau représente les paramètres variés durant chaque expérience pendant
le séchage par atomisation ...................................................................................................... 31
Tableau 5 : tableau contenant les valeurs de p de l’analyse statistique réalisée sur l’effet
de la laccase et l’acide citrique sur la production de la mélanine. ...................................... 38
Tableau 6: Tableau contenant les paramètres de séchage qui ont été variés ainsi que le
poids et l'humidité de la poudre récupérée après chaque expérience de séchage. ........ 38
Tableau 7 : Tableau contenant l’activité enzymatique avant et après le séchage par
atomisation ainsi que le % de la récupération de l’activité initiale pour les échantillons à
7%(w/v) d’amidon de maïs. ....................................................................................................... 39
Tableau 8 : Tableau contenant l’activité enzymatique de la laccase avant et après le
séchage par atomisation ainsi que le % de la récupération de l’activité initiale pour les
échantillons à 12%(w/v) d’amidon de maïs. ........................................................................... 39
Tableau 9 : tableau contenant la concentration en protéines avant et après le séchage
par atomisation ainsi que le % de la récupération de l’activité initiale pour les échantillons
à 7%(w/v) d’amidon de maïs..................................................................................................... 40
Tableau 10 : tableau contenant la concentration en protéines avant et après le séchage
par atomisation ainsi que le % de la récupération de l’activité initiale pour les échantillons
à 12%(w/v) d’amidon de maïs. ................................................................................................. 40
Tableau 11 : tableau contenant la concentration d’acide citrique avant et après le séchage
par atomisation ainsi que le % de la récupération de l’activité initiale pour les échantillons
à 7%(w/v) d’amidon de maïs..................................................................................................... 41
Tableau 12 : tableau contenant la concentration d’acide citrique avant et après le séchage
par atomisation ainsi que le % de la récupération de l’activité initiale pour les échantillons
à 12%(w/v) d’amidon de maïs. ................................................................................................. 41

xiii
CHAPITRE 1 : SYNTHÈSE

1
 1. INTRODUCTION

La viande de volaille tels que le poulet, le dindon, le canard, la pintade et l’oie est
la deuxième viande la plus consommée au monde après la viande de porc (FAO
(Organisation des Nations Unies pour l'alimentation et l'agriculture), 2012). Elle est
également la viande la plus consommée par les québécois, (Ministère de
l’Agriculture, des Pêcheries et de l’Alimentation du Québec. Février 2011). Afin de
satisfaire la demande d’une population qui ne cesse de croitre, et les exigences
des consommateurs en termes de goût et de qualité de produit, l’utilisation des
antibiotiques comme promoteur de croissance est devenue une pratique très
répandue dans l’élevage des animaux de la ferme, en particulier les volailles. Les
principaux rôles de ces antibiotiques est de contrôler certaines maladies
infectieuses chez l’animal, d’augmenter son poids et d’améliorer ses performances
(Donoghue 2003). Ces dernières années, la surutilisation des antibiotiques a été
fortement observée : actuellement il est confirmé qu'elle est à l'origine du
développement et du transfert de la résistance chez plusieurs bactéries
pathogènes (Toghyani, Tohidi et al. 2013). Par la crainte que cette surutilisation
d'antibiotiques dans l'alimentation des volailles pourrait conduire à de graves
dégâts sur la santé humaine, l'interdiction des antibiotiques comme promoteur de
croissance demeure envisageable et constitue un grand défi pour la production de
viande de volaille. D’où la nécessité de trouver de nouvelles méthodes ou
alternatives afin de remédier à cette problématique (Gaggìa, Mattarelli et al. 2010).
Mon projet de recherche consiste à développer une nouvelle combinaison entre
trois produits à savoir les protéines de levure, l’acide citrique et l’enzyme laccase,
comme une alternative à ces antibiotiques. Lesdits produits auront des rôles bien
précis et bénéfiques avec des actions complémentaires. Les protéines de levure
seront utilisés comme suppléments ou additifs alimentaires et vont agir comme
promoteurs de croissance naturels (Bekatorou, Psarianos et al. 2006). De son côté
l’acide citrique viendra avec son effet antimicrobien et régulateur de pH à l’intérieur
du système digestif (Eswaranandam, Hettiarachchy et al. 2004). Et finalement
l’enzyme laccase permettra par son action oxydo-réductrice la protection des
cellules de l’organisme de volaille, et ce en éliminant les composés phénoliques
qui se forment lors de la digestion (Madhavi and Lele 2009), ainsi ce processus

3
facilitera l’assimilation des aliments. En outre, ces trois composés utilisés dans
cette combinaison seront produits par fermentation des déchets de l’industrie de
jus de pomme, en utilisant les trois souches suivantes : Saccharomyces
cerevisiae, Aspergillus niger et Trametes versicolor, ce qui donne au projet un
aspect de bio-valorisation des déchets et de respect de l’environnement.
L’efficacité de cette combinaison sera démontrée à travers le test de mélanisation
qui sera décrite par la suite dans les chapitres suivants. L’autre objectif de mon
travail sera de développer une formulation en poudre à partir de ces trois produits
par la technique de séchage par atomisation (Gharsallaoui, Roudaut et al. 2007) .

4
2. REVUE DE LITTÉRATURE :

2.1 Consommation de la viande de volaille à l’échelle mondiale

Selon la FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations), la viande
de volaille est la deuxième viande la plus consommée au monde après le porc.
D’après des statistiques en 2012, l’approvisionnement en viande de volaille prend
la deuxième place avec un faible écart après le porc.
La figure 1 ci-dessous représente le pourcentage d’approvisionnement dans le
monde en termes de consommation de viande.

1,7%
22,2%

35,2%

Bovins et buffles
4,6% Ovin et caprin
Suidés
Poulet
Autres

36,3%

Figure 1 : Graphe représentant les pourcentages d'approvisionnement en viande

dans le monde en 2012.
[Link] janvier 2016.

5
Les principaux pays consommateurs de cette viande sont : la chine, sa
consommation moyenne annuelle a été estimée en 2008 à 18,6 millions de tonnes,
en deuxième position vient les États-Unis avec 16,3 millions de tonnes, suivis des
pays européens avec 11,8 millions de tonnes, les pays du Moyen-Orient et du
Maghreb avec 7,3 millions de tonnes et finalement le Brésil avec 7,1 millions de
tonnes.
Concernant la consommation par personne, les plus grands consommateurs de
viande de volaille se trouvent dans les pays développés, avec en tête les États-
Unis et le Canada, où la consommation annuelle par personne atteignait près de
53 kilogrammes en 2009 aux USA. Selon le département de l’USDA (United State
Département of Agriculture), la consommation de volaille continue de suivre une
tendance à la hausse et passera de 45,5 kilogramme par personne en 2010 à 50
kilogramme par personne en 2020.

30000

25000 Bovins Porcins Volailles Ovins

20000
Millions de tête

15000

10000

5000

0
1990 2000 2012
Année

Figure 2 : Graphe représentant l’évolution de l'élevage mondial. Source :

Statistiques 2012, FAO (Organisation des Nations unies pour l'alimentation et
l'agriculture. [Link]
janvier 2016

6
Selon les statistiques de la FAO représentées dans la figure 2, nous constatons
qu’il y a eu une évolution très importante de l’élevage mondial puisque le
pourcentage de variation entre 1990 et 2012 est estimé à 104,2%, ceci est une
conséquence directe de l’augmentation de la demande auprès des
consommateurs de la viande de volaille.

2.2 Consommation au Canada :

D’après le (ministère de l’Agriculture, des Pêcheries et de l’Alimentation du

Québec. février 2011), la viande de poulet est la viande la plus consommée par
les canadiens avec un pourcentage de 33,6 % de la consommation totale de
viande, suivie par la viande du bœuf avec 30,7 %, du porc avec 25,1 %, du dindon
avec 4,9 %, de l’agneau avec 1,3 % et du veau avec 1,1 %.
En 1999, la viande de prédilection des canadiens était plutôt le bœuf (32,5 %),
suivi du porc (30 %), du poulet (27,7 %) et du dindon (4,2 %). Ceci montre
clairement que la viande de volaille a donc gagné des parts de marché en faveur
de la viande du bœuf et du porc.
D’après les chiffres représentés ci-dessus, nous constatons que la volaille occupe
une place importante dans notre consommation quotidienne. Donc, ce que peut
contenir cette viande se transmet à notre organisme et peut affecter d’une manière
directe ou indirecte notre santé, cette thématique sera discutée en détails dans le
chapitre suivant.

7
2.3 Utilisation des antibiotiques dans l’élevage de volailles, relation
avec la santé humaine et bio-alternatives existantes :

Les antibiotiques sont utilisés par l'industrie de volaille et de la volaille

vétérinaire pour augmenter la croissance et l’efficacité alimentaire et également
pour améliorer la santé et la réduction de risque de maladie chez les volailles
(Donoghue 2003). L’objectif est d’assurer une protection à l’animal et renforcer
son immunité et sa résistance aux microorganismes pathogènes d’une part, et lui
permettre d’améliorer ses performances et d’augmenter son poids d’autre part,
ceci en apportant des modifications au niveau de sa flore intestinale. (Schwarz,
Kehrenberg et al. 2001) (Toghyani, Tohidi et al. 2013)
Le microbiote intestinal ou encore appelée la flore intestinale est un assortiment
de microorganismes qui habitent à l’intérieur du tractus gastro-intestinal, vivant en
interaction entre eux et ayant chacun un rôle définit à l’intérieur du système digestif
(Sekirov, Russell et al. 2010). Cette flore intestinale est considérée comme le
responsable majeur de la bonne ou mauvaise santé de l’animal, car elle est
impliquée dans plusieurs fonctions biologiques intestinale telles que la défense
contre les agents pathogènes, l'immunité, le développement des microvillosités
intestinales, la dégradation de polysaccharides non digestibles, etc... (Cani and
Delzenne 2009).

2.4 Les dangers de l’utilisation des antibiotiques promoteurs de

croissances sur la santé humaine :

L'utilisation des antibiotiques a favorisé la production efficace de volaille, ce qui

permet au consommateur l’achat à un coût raisonnable une viande et des œufs
de haute qualité (Donoghue 2003).Sauf que cette pratique a posé une grande
problématique, étant le développement et transmission de gènes de résistance
chez des bactéries nocives, telles que la Salmonelle, Escherichia coli et bien
d’autres (Toghyani, Tohidi et al. 2013)
La figure ci-après schématise le processus de transmission horizontale du gène
de résistance entre deux bactéries, une résistante et l’autre non résistante.

8
Figure 3 : Schéma explicatif de la transmission de résistance entre les bactéries
modifié. Source : [Link] janvier 2016.

Par la crainte que cette surutilisation d'antibiotiques dans l'alimentation des

volailles conduise à un grand problème de résistance, l'interdiction des
antibiotiques comme promoteurs de croissance demeure envisageable et
constitue un grand défi pour la production de viande de volaille, ce qui a engendré
la nécessité de trouver des nouvelles méthodes ou alternatives afin de remédier à
cette problématique. (Gaggìa, Mattarelli et al. 2010)

9
2.5 Bioalternatives aux antibiotiques promoteurs de croissance :

Face à cette inquiétude, plusieurs études ont était menées sur des alternatives
biologiques aux antibiotiques chimiques promoteurs de croissances tels que : les
probiotiques, les prébiotiques, les symbiotiques, les acides organiques, les
enzymes, les sources naturelles et les protéines.

2.5.1 Les probiotiques :

Les probiotiques sont définis comme «des cultures mono ou mixtes de

microorganismes vivants ayant un effet bénéfique sur l’organisme hôte en
améliorant les propriétés de sa flore indigène » (Fuller 1992). Autrement dit, les
probiotiques sont un ou ensemble de microorganismes introduits dans le système
digestif dans le but d’enrichir la flore intestinale, afin de procurer une immunité
contre les agents pathogène en minimisant ou limitant la colonisation de ses
derniers dans le tractus gastro-intestinale, et au final assurer une bonne
croissance de l’animal. (Griggs and Jacob 2005, Hajati and Rezaei 2010)

2.5.2 Les prébiotiques :

Dans le terme prébiotique le préfixe « pro » a été remplacé par « pré » pour
exprimer un « après » ou « pour » (Gibson, Probert et al. 2004). Ils ont défini les
prébiotiques comme « un ingrédient alimentaire non digestible qui
avantageusement affecte l'hôte en stimulant sélectivement la croissance et / ou
l'activité d'une ou d'un nombre limité de bactéries dans le colon ». (Schrezenmeir
and de Vrese 2001). Ce sont une sorte de nourriture en forme d’oligosaccharides
pour les probiotiques et la flore intestinale afin d’assurer une bonne croissance
(Griggs and Jacob 2005).

10
 2.5.3 Les symbiotiques :

Les symbiotiques sont un mélange entre les probiotiques et les prébiotiques.

(Collins and Gibson 1999). Cette combinaison est très intéressante pour la survie
et le bon fonctionnement des organismes probiotiques, car elle met à leur
disposition les éléments nécessaires pour vivre et se développer (Fallah, Kiani et
al. 2013). Les symbiotiques sont responsables de l’immunité chez les volailles
(Zhang, Ma et al. 2006). D’après (Awad, Ghareeb et al. 2009), les symbiotiques
peuvent conduire à une meilleure absorption des aliments par l’organisme
récepteur.
Les symbiotiques ont un réel potentiel d’amélioration des performances chez les
volailles (Mohnl, Acosta Aragon et al. 2007). Liong et Shah ont conclu que
l'utilisation dans symbiotiques régule la concentration des acides organiques et
réduit les taux de cholestérol chez les poulets (Liong and Shah 2006) (Fallah, Kiani
et al. 2013).

2.5.4 Les acides organiques :

Les acides organiques sont des éléments essentiels pour le maintien de la bonne
santé de l’appareil gastro-intestinal chez les poulets, car ils sont responsables de
la régulation du pH à l’intérieur de leurs systèmes digestifs, afin d’améliorer le
processus de la digestion des protéines. Ils ont aussi plusieurs effets bénéfiques
tels que la conservation des aliments, l'amélioration de l'absorption des minéraux
et le contrôle des bactéries pathogènes et non pathogènes (Abdel-Fattah, El-
Sanhoury et al. 2008).

11
 2.5.5 Les enzymes :

Les enzymes ont été définies comme des protéines spéciales capables de
catalyser ou d’accélérer les réactions biochimiques (Ferket 1993). Ces réactions
vont faciliter la digestion des nutriments en les décomposant en éléments plus
petits et rapidement assimilables (Yang, Iji et al. 2009).
Les effets de l’ajout de ses enzymes selon Bedford, est de réduire le nombre de
bactéries en augmentant le taux de digestion et de-là, limiter la quantité des
éléments nutritifs disponibles pour la flore intestinale (Bedford 2000).
Par conséquent, les profils bactériens de l’intestin seront modifiés et les
performances des animaux seront améliorées (Ferket 2004).

2.5.6 Les extraits de plantes :

Les extraits de plantes et les huiles essentielles sont comptés parmi les éléments
à effet antimicrobien (Griggs and Jacob 2005) et sont connues par leur action sur
la stimulation de la digestion (Brenes and Roura 2010). Les plantes ont la capacité
de réagir aux attaques microbiennes à travers un répertoire hautement coordonné
de barrières défensives moléculaires, cellulaires et tissulaires à la colonisation et
l'invasion des pathogènes. Quant aux huiles essentielles, ils composent des
défenses redoutables contre certain composants chimiques (Taylor 2013)
(Botsoglou, Yannakopoulos et al. 1997). Certaines des formes chimiques
antimicrobiennes bioactives, dérivent de plantes grâce aux terpènes qui sont des
composés phénoliques, des glycosides et des alcaloïdes. Le gingembre, le poivre,
la coriandre, le laurier, l’origan, le romarin, la sauge, le thym, les clous de girofle,
la moutarde, la cannelle, l'ail, le citron, l’écorces d'agrumes (citron vert, citron
jaune, orange), et le tabac sont quelques représentants d'une très longue liste de
produits de plantes ayant des propriétés antibactériennes (Hume 2011).

12
 2.5.7 Les protéines :

Les protéines sont des promoteurs de croissance naturels. Elles sont essentielles
à la formation et le développement des muscles. Leurs effets antimicrobiens est
dû aux peptides bioactifs, qui sont des protéines synthétisées sous la forme de
grandes prépropeptides, clivés et modifiés pour donner des produits actifs. Ils
jouent un rôle important dans les fonctions physiologiques et dans la pathogenèse
(Sharma, SIngh et al. 2011).

Probitique

Enzymes Prébiotique

Protection et
croissance de
Peptide
l’animal
Symbiotique
bioactif

Acide Source
organique naturelle

Figure 4 : Schéma représentant des alternatives biologiques aux antibiotiques

promoteurs de croissances chez les volailles, réalisé par Mona Chaali, décembre
2015.

13
Tableau 1 : Tableau récapitulatif contenant les alternatives biologiques et leurs
propriétés bénéfiques pour les volailles.

Références
Alternatives Propriétés bénéfiques pour les volailles

- Utiliser pour briser spécialement les (Yang, Iji et al.

polysaccharides non amylacés 2009)
Enzyme - Faciliter l’assimilation des nutriments par
les microorganismes de la flore intestinale
- Améliore l’assimilation des aliments
(Alloui, Szczurek
- Modifier microflore intestinal
et al. 2013)
- Stimuler le système immunitaire
Probiotique
- Prévenir la colonisation pathogène
- Améliorer les performances des volailles

- Oligosaccharide (Patterson and

- Nourriture pour les probiotiques et la Burkholder 2003,
Prébiotique microflore intestinales Hume 2011)
- Source de vie et stimulant des
microorganismes digestifs

- Combinaison entre les probiotiques et (Fallah, Kiani et

Symbiotique prébiotiques pouvant améliorer la survie de al. 2013)
l'organisme probiotique
- Effets antimicrobiens grâce aux composés (Taylor 2013)
Huiles
phénoliques
essentielles
- Réduire la prolifération des bactéries
- Diminuer la valeur du pH à l’intérieur des (Fallah 2013)
Acide intestins
organique - Agir comme agents conservateurs
- Empêcher contamination microbienne
- Croissance des muscles (Joerger 2003,
- Effet antimicrobiens grâces aux peptides Sharma, SIngh et
Protéines
bioactifs al. 2011)
- Régulateur de l’activité des hormones

14
 2.6 Les trois composantes de cette bio-alternative et les

microorganismes producteurs

Le terme « bio » implique également que ses alternatives sont produites par des
voies biologiques, par le biais de microorganismes (champignons et levures).

2.6.1 La laccase produite par Trametes versicolor :

Laccases est un enzyme contenant du cuivre qui catalysent l'oxydation d'une

grande variété de substrats organiques et inorganiques, y compris les mono-, di- et
les polyphénols, les amino-phénols, les méthoxy-phénols, les amines aromatiques
et d'ascorbate avec la réduction à quatre électrons concomitante de l'oxygène en
eau (Galhaup, Goller et al. 2002)
L’une des espèces les plus productrices de l’enzyme laccase est le champignon
Trametes versicolor. C’est un champignon de la pourriture blanche appartenant à la
famille des Polyporacées. Ils poussent généralement sur les grumes des chênes
abattus ou des feuillus morts (Lorenzo, Moldes et al. 2002).
Il a été rapporté que la laccase produite par Trametes versicolor est particulièrement
intéressante grâce à son haut potentiel d'oxydo-réduction et sa forte activité. En
outre, la capacité de cette laccase à exercer son activité catalytique sur de
nombreux types de composés aromatiques a été démontrée la plus élevée
comparant aux laccases produites par d’autres souches (Kurniawati and Nicell
2008). Les deux principales fonctions attribuées aux laccases fongiques sont la
dégradation de la lignine, conjointement avec d'autres enzymes ligninolytiques
telles que les peroxydases (Brijwani, Rigdon et al. 2010).
La laccase est aussi bien connue pour son rôle dans la virulence fongique comme
agent clé dans la pathogenèse contre des plantes hôtes (Brijwani, Rigdon et al.
2010).

15
 2.6.2 Les protéines de levure produites par Saccharomyces
cerevisiae :

Les protéines sont actuellement utilisées comme aliment pour les animaux dans le
but d’améliorer leur croissance. Afin de répondre aux besoins nutritionnels, la
production de protéines en grande quantité est devenue nécessaire, en particulier
si leurs ressources sont renouvelables (Ravindra 2000). Pour cela, on utilise de plus
en plus les protéines extraites de la biomasse microbienne cultivée comme les
levures (Patelski, Berlowska et al. 2015). Les cellules de levure sont connues par
leur haute teneur en protéines (environ 60-82% de matière sèche) (Choi 2003), elles
contiennent également des graisses, des glucides, des acides nucléiques, des
vitamines et des minéraux, et riche en certains acides aminés essentiels tels que la
lysine et méthionine, les deux qui sont limitées dans la plupart des plantes et la
nourriture des animaux. (Harrison 1993, Asad, Asghar et al. 2000). Une étude a
démontré que les protéinés de cellules peuvent être produites en utilisant une
souche de levure dont la biomasse est utilisée pour la préparation des aliments pour
animaux qui est Saccharomyces cerevisiae (Patelski, Berlowska et al. 2015).
Saccharomyces cerevisiae est la levure la plus populaire et abondante. C’est une
levure unicellulaire, organisme eucaryote appartenant au règne des champignons
et à la famille des saccharomycètes (Moustacchi 1976).

2.6.3 L’acide citrique produit par Aspergillus niger :

L'acide citrique (acide 2-hydroxy-propane-1,2,3-tricarboxylique) est un constituant

des plantes d'agrumes comme le citron, d’où vient son nom l’acide citrique. Il est
aussi connu sous le nom d'un intermédiaire de l'acide tricarboxylique (TCA). Il est
principalement utilisé comme additif et conservateur alimentaire. Il est également
capable de complexer des ions de métaux lourds tels que le fer et le cuivre. De plus,
plusieurs études ont démontrés l’effet antimicrobien de l’acide citrique face à des
bactéries pathogènes comme Escherichia coli et la Salmonelle (Eswaranandam,
Hettiarachchy et al. 2004). Par conséquent, il est aujourd'hui l'un des acides
organiques produits en vrac par la fermentation; généralement produit par le
champignon Aspergillus Niger. C’est un champignon filamenteux ascomycète de

16
l'ordre des Eurotiales, une des espèces les plus communes du genre Aspergillus
qui apparait sous forme d'une moisissure noire (Karaffa and Kubicek 2003). Bien
que de nombreux micro-organismes soient capables de produire l'acide citrique, A.
Niger reste le principal producteur industriel. C’est une souche spécifique qui est
capable de surproduire l'acide citrique. Le rendement de l'acide citrique à partir de
ces souches est souvent supérieur à 70% du rendement théorique sur la source de
carbone (Papagianni 2007).

17
18
 3. PROBLÉMATIQUE :

Ces dernières années, l’utilisation des antibiotiques comme promoteurs de

croissance dans l’élevage de volaille est devenue un sujet d’inquiétude. Il s’avère
que cette pratique est responsable du développement et du transfert de la
résistance aux antibiotiques chez des bactéries. A force d’introduire dans
l’organisme des volailles de faibles doses d’antibiotiques, il y’a eu un
développement de résistance chez certaines bactéries pathogènes telles que la
Salmonella typhimurium ou Eschericha coli à l’intérieur de la microflore intestinale
des volailles. Ces bactéries vont affecter la santé humaine soit par consommation
directe d’une viande mal lavée ou mal cuite, ou d’une manière indirecte puisque le
fumier de volaille est utilisé dans les fermes comme fertilisant qui va contaminer le
sol et ces pathogènes peuvent par la suite se retrouver dans le légume, les fruits ou
de l’eau consommés par l’être humain. De plus, les bactéries résistantes peuvent
transférer d’une façon très facile et rapide les gènes de résistance aux antibiotiques
à des bactéries non résistantes, surtout si elles (les bactéries) se retrouvent dans
un milieu contenant déjà des traces de ces antibiotiques. Aussi, sans oublier la
bioaccumulation de ces gènes de résistances à l’intérieur du système digestif
humain. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles alternatives à l’usage de
ces antibiotiques afin de préserver la santé humaine et l'environnement.

19
4. OBJECTIFS DE RECHERCHE :

L’objectif principal de ce projet est le développement d’une nouvelle alternative

aux antibiotiques utilisés dans l’élevage de volailles à partir d’une combinaison
entre l’enzyme laccase, l’acide citrique et les protéines de levure. Cette
combinaison va stimuler le métabolisme des volailles pour les maintenir en bonne
santé.

Les objectifs spécifiques de ce travail sont :

- La production des protéines de levure, l’enzyme laccase et de l’acide citrique
par fermentation des déchets de l’industrie de jus de pomme en utilisant
respectivement les souches Saccharomyces cerevisiae, Trametes versicolor et
Aspergillus niger.
- Test de la réponse immunitaire à l’aide de test de mélanisation.
- Développement d’une formulation en poudre en utilisant la technique de
séchage par atomisation

5. HYPOTHÈSES :

Les hypothèses de ce travail de recherche sont les suivantes:

- L’utilisation d’une combinaison entre trois alternatives sera plus efficace au lieu
de leur utilisation séparément garce à leurs actions complémentaires.
- Cette combinaison peut avoir un effet bénéfique et augmente le système
immunitaire de l’animal.
- Le test de mélanisation a été choisi pour démontrer l’effet de cette combinaison
sur le système immunitaire des volailles en mesurant la quantité de mélanine
produite qui sera une réponse immunitaire aux ajouts des composés produits.
De plus, c’est un test faisable, facile et réalisable dans un laboratoire de
biotechnologie environnementale, rapide si compare aux tests vétérinaires et
donne des résultats qui peuvent être interpréter statistiquement.

20
- La technique de séchage par atomisation est une technique de séchage moins
couteuse que la lyophilisation (généralement utilisée pour les produits
médicaux) et très efficace si le choix et le dosage des agents protecteurs contre
la chaleur sont bien appliqués, et peut être facilement mise en échelle pour une
production à l’échelle industrielle.

21
6. MATERIÉL ET MÉTHODES:

6.1 Production de laccase par Trametes versicolor :

6.1.1 Culture de Trametes versicolor :

Trametes versicolor a été pré-cultivé dans milieu de culture liquide PDB (Potato
Dextrose Broth) dans un incubateur agitateur sous les conditions suivantes : 30 ±
1 ° C, 150 rpm (rotation per minute) pendant 7 jours. À partir de la culture liquide,
le champignon a été re-cultivé dans des boites de pétri contenant du PDA (Potato
Dextrose Agar) et incubé à 30 ± 1 ° C pendant 10 jours (Lorenzo, Moldes et al.
2002, Gassara, Brar et al. 2010).

6.1.2 La fermentation à l’état solide

Pour la fermentation à l’état solide, le marc de pomme (déchets de l’industrie de

jus de pomme) a été utilisé comme substrat de fermentation pour la production de
laccase par Trametes versicolor. (Gassara, Brar et al. 2010)

23
Tableau 2 : tableau représentant la caractéristiques physico-chimiques du marre
de pomme

pH 4,03
Humidité (%(v/w)) 75 ± 0,7
Protéines 25,66 g/kg substrat sec
Glucose 28,8 g/kg substrat sec
Concentration en métaux
(ppm) :
Ca 345,28
Cu 3,10
Fe 12,58
K 1110,11
Mg 204,42
Na 60,59
Ni 0,11
P 693,69
Zn 2,39
Carbone % 17,9
Hydrogène % 8,1
Azote% 0,3
Sulfure % 0,1

Le milieu de fermentation est préparé dans des fioles de 500mL, en ajoutant 40g
de marc de pomme supplémenté avec du Tween-80 à une concentration de 3 mM
substrat sec, le Tween-80 servira comme inducteur pour la production de laccase.
Le milieu est stérilisé dans un autoclave pendant 20 min à 121°C ±1 °C. Après
stérilisation, le milieu est inoculé par prélèvement directement du mycélium de
Trametes versicolor à partir des boites de pétri (Lorenzo, Moldes et al. 2002).
Les erlenmeyers sont placés ensuite dans un incubateur pendant 15 jours à 30°
C, un échantillon est prélevé toutes les 24h pour dresser la courbe de production
de laccase. L’expérience a été répliquée 10 fois.

24
 6.1.3 Extraction de la laccase et estimation de son activité
enzymatique :

La laccase extracellulaire est extraite du milieu de fermentation par ajout de

10mL/g de substrat sec d’une solution tampon de phosphate de sodium à pH 4,0
concentrée à 50mM. Après macération, le mélange est mis dans un incubateur
rotatif pendant 1h à 150 rpm, 30±1 °C. Ensuite le milieu est centrifugé à 4 ±1 °C
pendant 20 min à 7000xg.
Le surnageant est analysé par spectrophotomètre. Dans une cuvette, 2,48 mL de
solution tampon de citrate-phosphate, 480 µL de réactif ABTS (2,2-azino bis(3-
ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) et 20 µL de surnageant sont mélangés.
L’activité de la laccase extracellulaire est mesurée à 436 nm et à 45°C. Une unité
d'activité de laccase a été définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour
oxyder 1 µmole d'ABTS par minute. (Lorenzo, Moldes et al. 2002, Gassara, Brar
et al. 2010).

6.2 Production de l’acide citrique par Aspergillus niger :

6.2.1 Culture de l’Aspergillus niger :

Aspergillus Niger (NRRL 567 et NRRL 2001) est cultivé premièrement en milieu
liquide (PDB) pendant 6 jours dans un incubateur rotatif à 30±1 °C et à 150 rpm,
puis il est re-cultivé sur PDA en boite de pétri dans un incubateur statique à 30±1
°C pendant 5 jours. Par la suite, les spores produites sont recueillies à partir des
plaques de PDA, en utilisant une solution de Tween-80 solution à 0,1%.
Finalement, les spores sont comptées à l’aide d’un hémocytomètre afin de pouvoir
les utilisées pour l’inoculation (Dhillon, Brar et al. 2011, Dhillon, Brar et al. 2013).

25
 6.2.2 La fermentation à l’état solide :

Pour la production de l’acide citrique, 50g de marc de pomme sont mis dans des
Erlenmeyers de 500 mL et stérilisés dans un autoclave à 121±1 °C pendant 20
min. Après stérilisation, 3% (v/w sec) de méthanol est ajouté comme inducteur
pour la production de l’acide citrique. Ensuite, le substrat est inoculé par 107
spores/g substrat sec et incubé à 30±1 °C pendant 5 jours dans un incubateur
statique. Un échantillon est prélevé toutes les 24h (Dhillon, Brar et al. 2013).
L’expérience a été répliquée 10 fois.

6.2.3 Extraction de l’acide citrique et estimation de sa concentration :

L’extraction de l’acide citrique est faite par ajout d’eau distillée (10 mL pour 1g de
substrat sec). Par la suite, le tout est mélangé au vortex et centrifugé pendant 30
min à 7000xg (Dhillon, Brar et al. 2011, Dhillon, Brar et al. 2013). Le surnageant
est utilisé pour l’estimation de la concentration de l’acide citrique, ceci en ajoutant
à 1 mL de surnageant, 1,3 mL de pyridine et 5,3 mL de l'anhydride acétique. Après
dressage d’une courbe d’étalonnage , la lecture de la concentration se fait à 420
nm au spectrophotomètre (Marier and Boulet 1958).

6.3 Production des protéines de levure par Saccharomyces cerevisiae :

6.3.1 Culture de Saccharomyces cerevisiae :

Pour la production des protéines de levure, Saccharomyces cerevisiae est cultivé

dans un milieu de culture liquide synthétique (PDB) pendant 24h dans un
incubateur rotatif à 30±1 °C et 150 rpm. Ensuite, les cellules de levure contenues
dans le milieu ont été comptées par hémocytomètre pour l’étape de l’inoculation
(Choi and Park 2003).

26
 6.3.2 Fermentation à l’état liquide :

Les boues d’ultrafiltration de production de jus de pomme ont servi comme

substrat de fermentation pour la production de protéines de levure par
Saccharomyces cerevisiae. Le milieu de culture a été inoculé par une pré-culture
de la levure dans un milieu liquide synthétique PDB (Potato Dextrose Broth).

Tableau 3 : tableau représentant les caractéristiques physico-chimiques des

boues d'ultrafiltration de fabrication de jus de pomme.
pH 3,58
Humidité (%(v/w)) 3±1
Volatile solids g/L 6,21
Total solids g/L 54,01
Protéines g/L 24,74
Glucose g/L 28,8
Concentration en métaux
(ppm) : 67,25
Ca
Cu 0,25
Fe 9,34
K 672,56
Mg 45,63
Na 23,15
Ni 0,04
P 235,36
Zn 0,21
Carbone % 44,1
Hydrogène % 6,7
Azote% 1
Sulfure % 0,3

27
Pour la fermentation à l’état liquide, 100 mL de boues d’ultrafiltration de fabrication
de jus de pomme sont stérilisés à l’autoclave à 121 ±1 °C pendant 20 min, ceci
après ajustement de pH à 7 à l’aide de NaOH et ajustement des solides totaux par
dilution en ajoutant de l’eau distillée. Pour l’inoculation, les 100mL sont inoculés
par 106 cellules/mL pré-cultivés dans un milieu liquide PDB (Potato Dextrose
Broth), et la fermentation est maintenu à 30 ±1 °C et 150 rpm pendant 3 jours
dans un incubateur rotatif. Un échantillon est prélevé à 0, 6, 12, 24, 48 et 72
heures pour l’étude de profilage de la production (Madrera, Bedriñana et al. 2013,
Patelski, Berlowska et al. 2015). L’expérience a été répliquée 10 fois.

6.3.3 Extraction des protéines et estimation de la concentration :

Le bouillon de fermentation est centrifugé à 7000xg pendant 20 min. La

concentration en protéines solubles extracellulaires est estimée par analyse au
spectrophotomètre. Dans une cuvette, 100 µl de surnageant est mélangé à 2mL
de solution de Bradford. Après dressage d’une courbe d’étalonnage, la lecture de
la concentration se fait à 595 nm.

6.4 Test de mélanisation

6.4.1 Culture de cellule de Saccharomyces cerevisiae :

Les cellules de Saccharomyces cerevisiae ont été utilisées dans le test de

mélanisation pour la production de la mélanine. Les cellules de la levure ont été
cultivées premièrement sur gélose de YPD (Yeast Peptone Dextrose) en boite de
pétri et ensuite sur un milieu de culture liquide YDB pendant 24h à 25 ±1 °C et 20
rpm. Les cellules ont été comptés après pour l’inoculation.

6.4.2 Préparation du milieu de fermentation pour la mélanisation :

Dans des erlenmeyers de 250 mL, 75 mL d'eau distillée est mélangé à 15 mM de

glucose, 10 mM de MgSO4, 29,4 mM KH2PO4 et 13 mM de glycine. Le milieu est

28
stérilisé dans un autoclave à 121 ° C ± 1 ° C pendant 30 min. Après stérilisation,
3,0 mM de la vitamine B1 et 1,0 mL de catéchol sont additionnés au milieu dans
des conditions aseptiques (Wang, Aisen et al. 1996, Sabiiti, Robertson et al. 2014).
Le test a été effectué sous 4 conditions : A: témoin avec seulement des cellules
de levure (1,0 x 108 cellules de levure), B: les cellules de levure et de l'acide
citrique avec une concentration de 15g/L, C: cellules de levure et la laccase (1400
U); D: cellules de levure avec la laccase et l'acide citrique. Chaque condition a été
réalisée en triplicata. Les milieux ont été incubés dans un incubateur rotatif à 30 ±
1 ° C et 150 rpm, pendant 10 jours (Sabiiti, Robertson et al. 2014). L’expérience a
été répliquée 12 fois.

6.4.3 Recomptage des cellules de levure :

Après 10 jours d’incubation, les milieux ont été centrifugés à 9000xg pendant 20
min, ensuite le culot contenant les cellules de levure a été lavé et remis en solution
dans 5 mL d’une solution de 1,0 M de sorbitol et 0,1 M de citrate de sodium à pH
5,0. Les cellules ont été comptées en utilisant un hémocytomètre (Wang, Aisen et
al. 1996, Sabiiti, Robertson et al. 2014).

6.4.4 Extraction et pesée de la mélanine produite par les cellules de

levure :

Pour extraire la mélanine, les cellules de levure ont été brisées par ultrasonication
pendant 45 secondes. Les débris cellulaires ont été recueillis par centrifugation
(9000xg pendant 20 min) et remis en suspension dans une solution de 4,0 M
d'urée pendant 1 h à température ambiante. Encore une fois les débris cellulaires
ont été recueillis par centrifugation (9000 x g pendant 20 min) et remis en
suspension dans une solution de 6,0 M de HCl et par la suite les solutions ont été
mises dans un bain marie à 100 ° C pendant 1 h. Finalement, les solutions ont été
filtrées sur papier Whatman en utilisant une pompe à vide. Pour le séchage, les
filtres ont été séchés avant le pesage dans un dessiccateur pour quantifier la

29
mélanine produite par les cellules de levure, en adaptant le procédé utilisé par
(Wang, Aisen et al. 1996, Sabiiti, Robertson et al. 2014)

6.5 Développement d’une formulation en poudre par la technique de

séchage par atomisation :

6.5.1 Préparation des échantillons :

Pour le séchage par atomisation plusieurs échantillons ont été préparés pour faire
une optimisation des paramètres de séchage. Les trois bouillons de fermentation :
laccase, acide citrique et protéines ont été mélangés de façon à obtenir les trois
composants en une seule solution (les tableaux 6, 7, 8, 9, 10,11 et 12).

6.5.2 Le séchage par atomisation :

Le modèle utilisé pour le séchage par atomisation est le modèle « Spray dryer
DL410 de Yamato Scientific ». Les paramètres de séchage fixés durant toutes les
expériences de séchage sont : la pression d’atomisation fixée à 0,07 MPa, La
température de séchage fixée à 130° et le débit d’air de séchage fixé à 0,6 m3/min.
En ce qui concerne les paramètres optimisés : le débit de passage de l’échantillon
ainsi que la quantité de l’agent de protection étant l’amidon de maïs, ils ont varié
comme indiquer dans le tableau suivant. Ces valeurs ont été choisies après une
dizaine de tests préliminaires car nous avons eu un problème de blocage des
tuyaux servant au passage de l’échantillon. À des vitesses basses et des quantités
d’gent protecteur grandes, un dépôt sur les tuyaux bloquait le passage des
échantillons. Le volume d’échantillon séché pour chaque expérience est de 500
mL.

6.5.3 Analyses des poudres récoltées :

Pour la mesure de l’activité de la laccase et les concentrations en acide citrique et

en protéines, la poudre récoltée a été dissoute dans de l’eau distillée suivant les
mêmes conditions avant le séchage. Aussi, le poids finale et l’humidité a été

30
mesurée pour la poudre récoltée pour chaque échantillons et après chaque
expérience.

Tableau 4 : tableau représente les paramètres variés durant chaque expérience

pendant le séchage par atomisation

Expérience Débit d’échantillon amidon de mais

mL/min %(w/v)
1 8 12
2 8 7
3 13 12
4 13 7
5 16 12
6 16 7
7 20 12
8 20 7

31
32
7. RÉSULTATS ET DISCUSSION:

7.1 Production de la laccase par Trametes versicolor :

Trametes versicolor a été choisi pour son grand potentiel de production de la

laccase. La production maximale de l’enzyme étant 38 U / g substrat sec a été atteint
après 13 jours 13 jours de fermentation (Figure 5).

Figure 5 : Graphe représentant le profil d’étude de la production de la laccase

33
7.2 Production de l’acide citrique par Aspergillus niger :

Aspergillus niger a été choisi pour sa grande capacité de production de l’acide

citrique. La figure 6 représente une étude du profil de la production d'acide citrique.
Au cours de cette expérience, la production maximale de l’acide citrique a été
observée à 48h de fermentation (35,4 ± 0,7 g/kg substrat sec).

Figure 6 : Graphe représentant le profil d’étude de la production de l’acide

citrique

34
7.3 Production des protéines de levure par Saccharomyces cerevisiae:

Pour la production des protéines de levure, nous avons réalisés une étude du profil
de la production pendant les 72 h de la fermentation (Figure 7), ceci en prélevant
un échantillon à 0h, 6h, 12h, 24h, 36, 48h et 72h. La production maximale est de
37,55 g/L de boues d’ultrafiltration de jus de pomme, elle a été obtenue après 36h
de fermentation.

Figure 7 : Graphe représentant le profil d’étude de la production des protéines

de levure

35
7.4 Test de mélanisation :

Après 10 jours d’incubation, le nombre de cellules de levure a été compté et la

mélanine produite par chaque cellule été extraite et pesée pour la quantification.
Pour le nombre de cellules, il n’y pas eu de changement entre chaque condition la
croissance de levure a été pratiquement la même (le nombre de cellule compté
était aux alentours de 5,5.107cellule) ceci peut s’expliquer par l’action de l’acide
citrique et la laccase qui peuvent stopper la prolifération des microorganismes
(Bhatnagar, Srirangam et al. 1998).

Figure 8 : graphe représentant le nombre de cellules compté par hémacytomètre

après 10 jours de fermentation pour chaque condition.

Figure 9 : photo des filtres Wattman après filtration des milieux de cultures pour
la récupération et quantification de la mélanine produite par les cellules de levure
dans chaque condition. A : milieu avec les cellules de levures seulement, B : milieu
avec les cellules de levure et l’acide citrique. C : milieu avec les cellules de levure
et la laccase et D : milieu avec les cellules de levure l’acide citrique et la laccase.

36
D’après les résultats obtenus, nous avons constaté que la quantité de mélanine
produite diffère d’une condition à une autre.
Dans le milieu où nous avons mis les cellules de levure seulement, nous avons
obtenu la plus faible production de la mélanine (1,07.10-10g/cellule), suivi du milieu
où nous avons mis les cellules avec l’acide citrique (2,88.10-10g/cellule), ensuite le
milieu avec les cellules de levure et la laccase (3.70-10g/cellule) et finalement la
plus grande production a été retrouvé dans la quatrième condition où nous avons
mis ensemble l’acide citrique et la laccase avec les cellules de levure
(10,48 .10-10g/cellule). Une analyse statistique a été réalisée pour la mélanine
produite par les cellules dans chaque condition. Les valeurs sont statistiquement
significatives.

Figure 10 : graphe représentant la quantité de mélanine produite par cellule en g

pour chaque condition.

37
 Tableau 5 : tableau contenant les valeurs de p de l’analyse statistique réalisée
sur l’effet de la laccase et l’acide citrique sur la production de la mélanine.
Le test bilatéral Contrôle Acide citrique Laccase
(logiciel Graph Pad)
P
Laccase + acide citrique 0.0005 0.0048 0.0054

7.5 Le séchage par atomisation :

Pour le séchage par atomisation, 500 mL du mélange de bouillon de fermentation

de la laccase, les protéines de levures et l’acide citrique ont été séchés pour
chaque expérience. Ci-dessous les différents résultats : poids de la poudre
récupéré, sa température à la sortie, le %(v/w) d’humidité ainsi que l’activité
enzymatique de la laccase, la concentration en protéines et en acide citrique avant
et après le séchage et le calcul du % de récupération des concentrations initiales.
Les tableaux ci-après représentent les différents paramètres qui ont été utilisés
durant les expériences du séchage par atomisation, ainsi les différents résultats :
poids de la poudre récupéré, sa température à la sortie, le %(v/w) d’humidité ainsi
que l’activité enzymatique de la laccase, la concentration en protéines et en acide
citrique avant et après le séchage et le calcul du % de récupération des
concentrations initiales.

Tableau 6: Tableau contenant les paramètres de séchage qui ont été variés ainsi
que le poids et l'humidité de la poudre récupérée après chaque expérience de
séchage.

Débit Poids de
Amidon de T à la sortie Humidité
Échantillon d’échantillon poudre
maïs %(w/v) °C % (v/w)
(mL/min) récupérée (g)
1 8 12 46,74 70±1 1,66
2 8 7 28,49 70±1 2,93
3 13 12 46 66±2 3,9
4 13 7 23,61 68±1 3,83
5 16 12 41,87 60±1 3,89
6 16 7 23,17 60±1 3,78
7 20 12 37,66 58±1 5,19
8 20 7 27,7 56±1 4,68

38
 Tableau 7 : Tableau contenant l’activité enzymatique avant et après le séchage
par atomisation ainsi que le % de la récupération de l’activité initiale pour les
échantillons à 7%(w/v) d’amidon de maïs.

Activité Activité
Débit % récupération
enzymatique enzymatique
d’échantillon de l'activité
avant séchage après séchage
(mL/min) initiale
(U/L) (U/L)

8 24 10 41,67
13 24 11 45,83
16 24 14 58,33
20 24 17 70,83

Tableau 8 : Tableau contenant l’activité enzymatique de la laccase avant et après

le séchage par atomisation ainsi que le % de la récupération de l’activité initiale
pour les échantillons à 12%(w/v) d’amidon de maïs.

Activité Activité
Débit % récupération
enzymatique enzymatique
d’échantillon de l'activité
avant séchage après séchage
(mL/min) initiale
(U/L) (U/L)

8 24 11 45,83
13 24 12 50
16 24 12 50
20 24 15 62,5

39
Tableau 9 : tableau contenant la concentration en protéines avant et après le
séchage par atomisation ainsi que le % de la récupération de l’activité initiale pour
les échantillons à 7%(w/v) d’amidon de maïs.

Concentration en Concentration en % récupération

Débit
protéines protéines de la
d’échantillon
avant séchage après séchage concentration
(mL/min)
(mg/L) (mg/L) initiale

8 20,87 9,92 47,53

13 20,87 10,62 50,88

16 20,87 15,75 75,46

20 20,87 17,71 84,85

Tableau 10 : tableau contenant la concentration en protéines avant et après le

séchage par atomisation ainsi que le % de la récupération de l’activité initiale pour
les échantillons à 12%(w/v) d’amidon de maïs.

Concentration en Concentration en % récupération

Débit
protéines protéines de la
d’échantillon
avant séchage après séchage concentration
(mL/min)
(mg/L) (mg/L) initiale

8 20,53 8,06 39,26

13 20,53 9,85 47,98

16 20,53 10,97 53,43

20 20,53 12,2 59,43

40
Tableau 11 : tableau contenant la concentration d’acide citrique avant et après le
séchage par atomisation ainsi que le % de la récupération de l’activité initiale
pour les échantillons à 7%(w/v) d’amidon de maïs.

Concentration Concentration % récupération

Débit
d’acide citrique d’acide citrique de la
d’échantillon
avant séchage après séchage concentration
(mL/min)
(g/L) (g/L) initiale

8 17,32 14,99 86,55

13 17,32 15,77 91,05

16 17,32 16,28 94,00

20 17,32 16,98 98,04

Tableau 12 : tableau contenant la concentration d’acide citrique avant et après le

séchage par atomisation ainsi que le % de la récupération de l’activité initiale pour
les échantillons à 12%(w/v) d’amidon de maïs.

Concentration Concentration % récupération

Débit
d’acide citrique d’acide citrique de la
d’échantillon
avant séchage après séchage concentration
(mL/min)
(g/L) (g/L) initiale

8 17,03 12,41 72,87

13 17,03 14,49 85,09

16 17,03 14,98 87,96

20 17,03 16,14 94,77

D’après les valeurs présentées dans les tableaux (6,7,8,9,10,11 et 12)

nous constatons que pour les expériences réalisées avec un débit de
passage de l’échantillon de 20mL/min et d’une quantité de 7%(w/v)
d’amidon de maïs, nous avons obtenus les plus grandes valeurs en terme
de récupération des concentrations initiales en protéines et en acide citrique
ainsi que l’activité enzymatique initiale de la laccase.

41
Pour l’enzyme laccase, 70,83% de l’activité initiale a été récupérée. Quant
aux protéines provenant de la levure, 84,85% de la concentration initiale a
été récupérée. Et finalement pour l’acide citrique, 98,04% de la
concentration initiale a été récupérée.
Quand la vitesse de passage de l’échantillon augmente le temps de contact
de l’échantillon avec l’air de séchage et le temps de résidence dans la cuve
de la machine diminue. Donc, ceci permet une moindre exposition des
composants de l’échantillon à une très haute température, et delà diminuer
les pertes en terme de concentrations en protéines et activité enzymatique.
Les figures 11, 12 et 13 représentent les % de récupérations de l’activité
enzymatique initiale de la laccase, la concentration initiale en protéines et
la concentration initiale en acide citrique pour chaque expérience de
séchage par atomisation.

20mL/min
16mL/min
8mL/min 13mL/min

Figure 11 : graphe représentant le % récupération de l’activité enzymatique

initiale de la laccase pour chaque expérience de séchage par atomisation.

42
 20mL/min
16mL/min

8mL/min 13mL/min

Figure 12 : graphe représentant le % récupération de la concentration initiale en

protéines pour chaque expérience de séchage par atomisation.

13mL/min 16mL/min 20mL/min

8mL/min

Figure 13 : graphe représentant le % récupération de la concentration initiale en

acide citrique pour chaque expérience de séchage par atomisation.

43
8. CONCLUSIONS :

Au terme de ce travail de recherche, nous avons pu produire les trois composants

de la combinaison étant : la laccase, l’acide citrique et les protéines de levure.
La production de la laccase et de l’acide citrique a été réalisée par fermentation à
l’état solide ayant comme substrat le marc de pomme, et en utilisant les
champignons Trametes versicolor et Aspergillus niger. Pour les protéines, la
fermentation a été réalisée à l’état liquide en utilisant comme substrat les boues
d’ultrafiltration du jus de pomme et comme microorganisme producteur la levure
Saccharomyces cerevisiae. Les deux substrats de fermentation sont des déchets
provenant de l’industrie de jus de pomme. Nous avons obtenus la plus grande
activité de la laccase (38U/g subrat sec) après 13 jours d’incubation à 30ºC de la
souche Trametes versicolor. Pour les protéines de la levure Saccharomyces
cerevisiae, la production maximale (37,55mg/L substrat) a été obtenue après 36h
d’incubation à 150 rpm et 30ºC. Et l’acide citrique a été produit par Aspergillus
niger et la production maximale a été de 35,4 g/kg substrat sec après 3 jours
d’incubation à 30ºC.
Le test de mélanisation a été réalisé pour évaluer l’effet de la combinaison sur la
production de mélanine et par conséquent sur le système immunitaire. Les
résultats démontrent que l'ajout extracellulaire des composants de cette
combinaison peut induire les cellules à produire de la mélanine. Ainsi, en utilisant
cette combinaison comme supplément dans l’alimentation des volailles, nous
pourrions reproduire l’effet des antibiotiques sur l’organisme des volailles.
Le séchage par atomisation s’est avéré une technique de séchage réalisable pour
des composants sensibles à la haute température comme les enzymes et les
protéines (récupération de plus de 70% de l’activité enzymatique de la laccase et
plus de 80% de la concentration en protéines), ceci en optimisant les paramètres
de séchage par l’augmentation du débit de passage de l’échantillon qui va
diminuer le temps de contact entre le liquide et l’air chaud et obtenir une moindre
exposition à la chaleur. De plus, cette technique est moins couteuse que les autres
techniques actuellement utilisées pour le séchage des enzymes et des protéines
comme la lyophilisation et pourrait être envisageable pour un séchage d’une
grande quantité de poudre.

45
9. PERSPECTIVES ET RECOMMANDATIONS :

La prochaine étape de ce projet de recherche sera une production de poudre à

grande échelle, le test de l’effet de cette combinaison sur des bactéries
pathogènes comme Escherichia coli, Clostridium perfringens, Salmonella, etc. Et
par la suite un test direct sur les animaux.
Parmi les principales recommandations que nous pouvons déduire à la fin de ces
travaux de maitrise :
1. Étude de la stabilité de la formulation (jusqu’à 12 mois).
2. Formulation mixte avec d’autres enzymes comme la lipase, la protéase et
l’amylase.
3. Étude en ferme des effets de cette formulation sur les volailles (gain de
poids, indicateur de croissance, système digestif…).

47
10. RÉFÉRENCE :

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[Link]

52
 CHAPITRE 2 : ARTICLE DE RECHERCHE

UN SUPPLÉMENT ALIMENTAIRE CONTENANT LA LACCASE ET

L’ACIDE CITRIQUE COMME ALTERNATIVE AUX
ANTIBIOTIQUES UTILISÉS DANS L’ÉLEVAGE DE VOLAILLES –
DÉCLENCHEUR IN VITRO DE LA PRODUCTION DE LA
MÉLANINE

53
Cet article a dû être retiré de la version électronique en raison de restrictions
liées au droit d’auteur.

SUPPLEMENT COMPRISING LACCASE AND CITRIC ACID AS AN

ALTERNATIVE FOR ANTIBIOTIC IN POULTRY FARMING – IN
VITRO TRIGGERS OF MELANIN PRODUCTION

Mona Chaali1, Joanna Lecka1, Leticia Hernandez-Galan1, Alberto Castaneda Yanez1,

Satinder Kaur Brar1*, Antonio Avalos Ramirez2, and Younes Chorfi3

1
Institut national de la recherche scientifique Centre - Eau Terre Environnement; 490 de
la Couronne; Québec (Qc); G1K 9A9, Canada

2
Centre National en Électrochimie et en Technologie Environnementales; 2263 Avenue
du Collège, Shawinigan, QC G9N 6V8, Canada

3
Université du Québec à Montréal; 405 Rue Sainte-Catherine Est, Montréal,
QC H2L 2C4, Canada

World Journal of Microbiology and Biotechnology

55