THEME 1A – Transmission, variation et expression du patrimoine génétique

TP8 – Les mutations et la variabilité de l’ADN

Certains produits chimiques (molécules cancérigènes) et rayonnements (UV, rayons gammas, rayons X) sont dangereux
pour la santé car ils ont un pouvoir mutagène. Ces agents désorganisent le fonctionnement de la cellule en produisant
des mutations. Les mutations sont des changements de séquence de l’ADN qui peuvent avoir des conséquences sur la protéine produite et
sur les caractères (phénotype) de l’être vivant étudié. Nous allons étudier une mutation qui modifie la couleur des levures (Saccharomyces
cerevisiae). En effet, elles possèdent un gène Ade2 qui est responsable de la production d’un pigment rouge.

Problématique : Comment les UV peuvent-ils modifier l’ADN et le phénotype d’un être vivant ?

Matériel : Manuel Belin p34-41

- Suspension de levures Ade2 (normales : rouge, mutées : blanches) - Boites de Pétri stériles contenant le milieu YPD permettant la culture des levures
- Pipette, étaleur, gants, lunettes, charlotte (facultatif), masque, lampe UV permettant d’irradier l’ADN
- Ordinateur muni du logiciel MESURIM2 et du logiciel GenieGen2 et leurs banques de données

Activités et déroulement des activités Capacités et critères de réussite

 ETAPE 1 : Proposez une stratégie expérimentale Concevoir une stratégie
- Proposez une stratégie qui permette de déterminer que les UV induisent des Quoi, Comment, Attendu ?
Envisager des témoins, Envisager comment mesurer l’effet des UV.
mutations dans l’ADN, ce qui a des conséquences sur le phénotype.
 Appelez le professeur pour vérification Réaliser une manipulation en suivant un protocole expérimental
Travailler proprement et TRES CALMEMENT
 ETAPE 2 : Mettez en œuvre le(s) protocole(s) proposé(s) NB : La croissance des levures nécessite 4 à 7 jours. Vous utiliserez donc
 Réalisez la manipulation de mutagenèse des levures en suivant le protocole les photographies des boites de pétri à 7 jours pour réaliser la suite du TP.
proposé.
 Appelez le professeur pour vérification Utiliser un logiciel de traitement de données (MESURIM2)
Utiliser l’outil comptage, trouver les photos dans la banque ; annoter les
 Utilisez le logiciel MESURIM2 pour dénombrer les colonies rouges et blanches catégories. Si les colonies sont trop nombreuses, restreindre le comptage à
aux différents temps d’exposition grâce aux les photographies fournies. la moitié ou le quart de la boite (attention aux calculs nécessaires).
 Appelez le professeur pour vérification Utiliser un logiciel de traitement de données (GenieGen2)
Comparer des séquences de même nature, identifier la mutation sur l’ADN,
 Utilisez le logiciel GenieGen2 pour comparer les séquences Ade2 des levures identifier la conséquence sur la séquence protéique, paramétrer
rouges et blanches et identifier l’impact sur la protéine produite. correctement l’échelle de numérotation (ADN ou Protéines).
 Appelez le professeur pour vérification
Communiquer à l’écrit
Choisir le mode de représentation des résultats et leur interprétation
 ETAPE 3 : Présentez vos résultats selon une forme judicieuse
Rédiger un texte scientifique
 ETAPE 4 : Rédigez une conclusion qui réponde au problème posé On a vu que … (avec des valeurs, des éléments précis : nature et position
de la mutation) Or on sait que … (précision du vocabulaire) Donc …
En fin de séance, rangez le matériel utilisé et nettoyer la paillasse.
Gérer et organiser le poste de travail

e SVT - M POURCHER (MAJ : 24/04/2022)

 Protocole de mutagenèse chez les levures (Ade2)
en conditions « quasi » stérile
Matériel :
• Plan de travail : STERILE si actif : la chaleur soulève l’air et évite les contaminations.
• Tube de suspension de Levures (souche rose Ade2– mutante) STERILE  Déjà sur la table stérile
• Boîtes de Pétri avec milieu de culture gélosé STERILE  Déjà sur la table stérile
• Ensemenceur (bleu) – Stérilisé par un bain de Javel  A placer sur la table stérile allumée
• Pipette Pasteur – Stérilisé par un bain de Javel  A placer sur la table stérile allumée
• Hotte à U.V. (à faire fonctionner 1 ou 2 minutes pour la stériliser et assurer une efficacité maximale)
• Eau de Javel
• Gel hydroalcoolique
• Pince en bois
• Feutre

1- Avant la manipulation :
ATTENTION : Faire pousser des Levures n'est pas un acte dangereux mais le milieu de culture
utilisé convient très bien à d'autres microbes dont certains peuvent être pathogènes. Pour
cette raison, la manipulation doit se faire dans des conditions les plus stériles possibles en
suivant ces règles simples :
- On travaillera à moins de 20 cm de la « table stérile »
- N’ouvrir les tubes ou la boîte qu’au dernier moment
- Se déplacer au minimum, ne pas faire de courant d’air, pas d’excitation ou d’agitation
- Ne pas tousser, rire, parler et souffler près du plan de travail
- Utiliser un masque pour éviter de contaminer par les mouvements respiratoires
- La blouse est propre et fermée
- Les cheveux sont attachés et emballés dans une charlotte (si disponible : facultatif)
- Le plan de travail et le matériel ont été stérilisés à la javel
- Les mains devront être désinfectées au gel hydroalcoolique (et on ne touche plus à ses cheveux, mains …)
- Anticiper chaque geste pour éviter de se retrouver dans une situation contaminante.

Astuce :
On annote
généralement les
boites sur le « fond »,
qui contiendra
ensuite la gélose car
le couvercle pourrait
être « échangé ».

Photographie d’une table stérile

2- Réalisation de la boite de culture :
• Se laver les mains et les désinfecter au gel hydroalcoolique (si possible)
• Se munir de la pince en bois
• Aller chercher un tube de milieu gélosé fondu à la paillasse professeur
• Ramener ce tube à votre paillasse et le placer sur le porte tube de la table stérile
Attention : les portes tubes des becs électriques sont haut et les tubes risquent de tomber !
• Sans ouvrir la boite, indiquer au feutre vos noms, votre classe, votre groupe, ainsi que le temps d’exposition
• Placer la boite (non ouverte) sur la table stérile
• Dévisser le tube de milieu gélosé
• Ouvrir délicatement la boite (en laissant le couvercle à moins de 20 cm de la source de chaleur)
• Vider l’intégralité du tube dans la boite
• Refermer la boite rapidement puis la placer sur la paillasse (refroidissement plus rapide)
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3- Mise en culture des levures :
• Vérifier que la boite a bien figé (10 à 15 minutes), on doit pouvoir la retourner
• Agiter la suspension de Levures (celles-ci se déposent au fond du tube)
• Ouvrir le tube de levure sans faire entrer d’air et sans toucher le bord du tube (à 20 cm !)
• Prélever un peu de la suspension avec la pipette Pasteur (à 20 cm !)
• Déposer une goutte au centre de la boîte de pétri maintenue entrouverte
• Etalez la goutte avec l’ensemenceur de façon uniforme en faisant des stries TRES DOUCEMENT (gélose fragile)

Photographie de l’ensemenceur

Schéma du principe de l’ensemencement par stries

4- Exposition aux UV :
ATTENTION : Les UV utilisés dans cette expérience sont très efficaces pour muter l’ADN (longueur d’onde
spécifique : 254 nm) et ils sont très concentrés (forte intensité) !!
• La lampe s’éteint automatiquement quand on ouvre
• Enlever le couvercle de la boîte de Pétri et le placer à l'envers à côté de la boîte
• Si les couvercles sont nombreux, les empiler « face à face »
• Régler le minuteur sur 30 secondes
• Appuyer sur le bouton rouge
• Dès que la lampe s’éteint (OUT s’éteint), vous pouvez recommencer (si votre temps
est 60 ou 90 s)
• Sortir la boîte de Pétri de l’enceinte à U.V.
• Refermer rapidement (mais calmement) le couvercle puis déposer votre boite sur la paillasse professeur
• Ranger votre paillasse
Astuce :
Le plastique arrête
les UV (le risque est
donc très faible
tant que la boite à
UV est fermée).
DONC
Ne pas oublier
d’ouvrir les boites
de Pétri sinon, les
levures ne seront
pas irradiées.

Photographie de la mutabox (enceinte à UV)

Ici le bouton d’allumage est bleu

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Document 1 : L’action des UV sur l’ADN
Les UV sont des agents mutagènes qui augmentent fortement le taux de mutations de l’ADN. Généralement, les UV
agissent sur les Thymines (T) qui vont se lier entre elles : on parle de formation de dimère de thymine. Ceci déforme
l’ADN et contribue à des erreurs de réplication ou d’appariement de l’ADN, ce qui cause la mutation.

Document 2 : Mesurer l’effet des agents mutagènes sur les levures Ade2 (doc 1 p36 BELIN)

Les levures sont des unicellulaires

eucaryotes (avec noyau), entourées par une
paroi.

Ces cellules sont normalement isolées mais

lorsqu’on les cultive sur une boite de Pétri,
chaque cellule se multiplie et forme un petit
dôme (tas) qu’on appelle une colonie.

Les colonies présentent la couleur

correspondant à celle des levures qui la
composent.

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Document 3 : Identifier et présenter des mutations
Les levures Ade2 blanches sont mutées. Pour rechercher la mutation, on utilise Anagène, après avoir séquence l’ADN de
cette levure.

Capture d’écran Anagène montrant la comparaison des séquences des levures rouges et blanches

AIDE ETAPE 3
Pour présenter les résultats, il faut :
- Lister quelques codons (triplets de nucléotides) pour les 2 séquences : 4 à 5
- Vous pouvez utiliser les tirets pour montrer que les séquences sont identiques
- Encadrer la mutation
- Annoter sa position (n°)
- Faire de même pour les séquences de protéines

Document 4 : L’effet des UV et les cabines à UV (doc 3 p 37 BELIN)

Document 5 : L’effet de mutagènes plus puissants : la radioactivité

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 FICHE TECHNIQUE : COMPTAGE OU MESURE AVEC MESURIM
Mesurer des angles Mesurer une surface
 «Choix/Outil de mesure/Angle»
et choisir sa couleur et son épaisseur
 Tracer à la souris deux segments en partant du sommet de
«Image/Délimiter des zones»
l’angle à mesurer, des flèches apparaissent à l’opposé du
- Colorer grossièrement un élément, puis un autre avec une autre couleur et
sommet.
ainsi de suite, faire de même avec le fond
 la valeur de l’angle s’affiche en bas de l’écran - Cocher «étendre la classification à tous les pixels» : le résultat s’affiche pour chaque élément en %
ATTENTION : la valeur affichée est celle de l’angle compris entre de la surface totale de l’image ou en unité de surface si l’échelle a été définie
le premier et le deuxième segment dans le sens trigonométrique
Compter des objets et présenter graphiquement les résultats
 Compter des objets
- Cliquer «Outils/Comptage»
- choisir dans la fenêtre flottante le nombre de séries à compter ; des couleurs par défaut sont attribuées à chaque série. Remplacer si nécessaire les numéros
par des noms plus évocateurs
- cocher la ligne 1 et repérer dans l’image un objet appartenant à la classe 1
- cliquer sur l’objet, un point de la couleur de la classe s’affiche sur l’objet en même temps qu’il est comptabilisé dans le tableau.
- faire de même avec les autres objets de la série
- utiliser la même méthode pour les autres lignes.
Pour effacer un point cliquer dessus puis cliquer «oui» dans la fenêtre «Avertissement».
Construire un graphique
- Cliquer «Outils/Tableau» et cocher la première ligne.
- Reporter les valeurs du compteur dans le tableau (en X le n° des séries et en Y le nombre d’objets comptabilisés)
- Double-cliquer sur le graphique pour modifier sa présentation.
REMARQUE : Il est possible d’enregistrer le tableau en fichier texte pour le traiter dans un tableur (Excel ou OpenOffice) et construire un histogramme.

Mesurer les dimensions d’un objet connaissant l’échelle Créer une échelle
- Sélectionner l’image.«Image/Créer/Modifier l'Échelle» - «Image/Créer/Modifier l'Échelle» et cocher «Échelle à définir»
- cocher «Échelle déjà mémorisée» et choisir le nom de l’échelle - Tracer une ligne avec le curseur de la souris sur une partie de l’image de calibrage dont la
à utiliser dimension est connue.
- tracer une ligne à la souris sur la partie de l’objet à mesurer : la - Reporter en bas dans les cases correspondantes, son unité et sa valeur.
mesure s’affiche en bas à droite. - «transférer l’échelle» et cocher «Ajout temporaire». Choisir un Nom pertinent.
Réaliser une lecture optique d’une bande d’électrophorèse
- Ouvrir une image scannée de la bande d’électrophorèse
- tracer un trait à la souris sur la totalité de la bande
- «Choix/Outil de mesure/Lumière sur une bande»
- dans le menu flottant «Mesure d’intensité de couleur sur une ligne», choisir une largeur de bande d’une dizaine de pixels
- cocher «Tout», «Mesure en absorption» et «Mesure linéaire»
- mesurer pour afficher le graphique.
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 FICHE TECHNIQUE : COMPARAISON - CONVERSION AVEC ANAGENE
Les icônes de la barre d’outils Numérotation des éléments d’une séquence
Echelle de repérage des
nucléotides

Echelle de repérage des

acides aminés
Attention au décalage
des numéros
Cliquer sur l’échelle pour passer de l’échelle des
nucléotides à celle des acides aminés.
Utiliser le curseur
Surligner pour sélectionner la partie de la séquence
choisie. Cliquer sur l’icône « grand curseur ».
Bulles d’aide
Une bulle d’aide s’affiche sur l’objet pointé par le curseur
de la souris
Editer une séquence Sélectionner une séquence
Sélectionner cette séquence dans l’un des répertoires d’Anagène : Cliquer sur le bouton de sélection. La séquence sélectionnée
 Banque de séquences s’inscrit sur fond blanc. On peut sélectionner plusieurs séquences.
 Thèmes d’étude La flèche rouge indique la ligne pointée, sur laquelle il est possible
 Programmes et documents d’obtenir des informations et que l’on peut déplacer à l’aide des
ou par «Fichier / Ouvrir / sauve» flèches grises, haut - bas.
Convertir une séquence Comparer des séquences
Menu «traiter / convertir ces séquences». Pour traiter une ATTENTION : pour comparer, la séquence de référence est toujours celle qui est
séquence, elle doit être au préalable sélectionnée. placée en premier.
Informations sur la ou les séquence(s) sélectionnée(s) Menu «traiter / comparer les séquences» ou «convertir ces séquences».
Menu «informations / sur la ligne pointée» pour obtenir des Pour traiter une séquence, elle doit être au préalable sélectionnée.
informations sur la sélection : soit d’une ligne, soit de toutes les La comparaison des séquences ne peut se faire que sur des séquences de même nature.
lignes en cliquant d’abord devant « traitement ». Les flèches grises haut-bas permettent de placer la séquence de référence.
Attention : les pourcentages obtenus portent soit sur des Deux comparaisons possibles :
différences soit sur des ressemblances.  La comparaison par alignement permet de comparer avec discontinuité, en
éliminant les décalages résultant de délétion(s) ou d’insertion(s), les valeurs
Créer des séquences
affichées sont des ressemblances (identités),
Menu «Fichier / créer». Choisir le type de séquence et le nommer.
 La comparaison simple permet de comparer point par point des séquences sans
Taper ou choisir dans la fenêtre d'«édition de séquences», votre
aucun alignement, les valeurs affichées sont des différences.
séquence.

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