RÉPUBLIQUE ALGÉRIENNE DÉMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTÈRE DE L’ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

Université des Frères Mentouri Constantine

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département : Microbiologie :

Mémoire présenté en vue de l’obtention du Diplôme de Master

Domaine : Sciences de la Nature et de la Vie
Filière : Sciences Biologiques
Spécialité : Microbiologie Générale et Biologie Moléculaire des Microorganismes

Intitulé :

Isolement et Etude de quelques Entérobactéries pathogènes

dans les eaux usées d’Oued Boumerzoug à Constantine

Présenté et soutenu par : SAVADOGO Mahamadi Le : 28/06/2016

BOUBKEIR Youssouf

Jury d’évaluation :

Présidente du jury : Mme BOUBEKRI K. (MCA - UFM Constantine)

Rapporteur : Mme BOUZERAIB L. (MAA - UFM Constantine)

Examinatrice : Melle MEZIANI M. (MAA - UFM Constantine)

Année universitaire
2015 - 2016
 Remerciements
Nous remercions tout d’abord Allah Le Tout Puissant pour nous avoir accordé la santé,
l’énergie et l’opiniâtreté nécessaire à la réalisation de ce modeste travail.

Nous remercions très singulièrement notre encadreur Mme BOUZERAIB L. pour avoir
accepté diriger ce travail, pour ses conseils , son aide, ses suggestions sur la rédaction
de ce mémoire ainsi que la confiance qu'elle nous a témoigné tout au long de cette
étude. Tout au long de la réalisation de ce mémoire, nous avons pu apprécier son
enthousiasme, son savoir-faire, sa pédagogie, son sens de communication. Vous avez été
la quand nos milieux de culture faisaient défauts et nous avons pu apprécier ensemble la
bonne odeur de certaines bactéries. Merci pour tous ces bons moments.

Nous adressons également nos remerciements à :

- Mme BOUBEKRI K. Maître de conférences à l’UFM-Constantine pour l’honneur

qu’elle nous fait de présider ce jury.
- Melle MEZIANI M. Maître assistante à l’UFM-Constantine d’avoir accepté
d’apporter son jugement à ce travail.

Nous remercions aussi nos pays, qui ont bien voulu nous accorder cette bourse d’étude. Nos
plus sincères gratitudes vont vers ce beau pays, l’ALGERIE, qui nous a accueillis et suivi
tout au long de notre parcours.

Nous saisissons cette occasion pour exprimer nos profonds respects et notre reconnaissance à
l’ensemble du corps enseignant de la faculté des Sciences de la Nature et de la Vie plus
particulièrement celui de la spécialité Microbiologie, pour avoir participé à notre
formation graduée.

Merci à Mme ZOGHMAR S. responsable du laboratoire de microbiologie N°11 de la Faculté

et son équipe, à Mme BOUZIDI N. et Mr SLOUGHI S. du laboratoire de biologie
moléculaire qui nous ont beaucoup aidés tout au long de notre travail.

Enfin, nous adressons nos plus sincères remerciements à nos parents, nos amis, nos
camarades ainsi que tous ceux qui nous ont toujours soutenus et encouragés au cours de la
réalisation de ce mémoire.
 Dédicace
Je ne peux adresser les prémices de cette dédicace qu’à mes parents,

premiers piliers de mon éducation, vous m’avez soutenu depuis mes débuts

jusqu’à maintenant par vos bénédictions.

A ma chère mère

Aucun mot, aussi expressif qu’il soit, ne saurait remercier sa juste valeur .Puisse

Allah vous garder longtemps auprès de nous et vous bénir infiniment.

A la mémoire de mon père, paix à son âme.

A mon oncle, El Hadj Harouna OUEDRAOGO appelé aussi « Papa » pour tous les

efforts qu’il a effectué et qu’il continue d’effectuer pour la bonne marche de mes

études. Merci Papa.

A mes frères et sœurs Abdoul Salam, Idrissa, Balkissa et Mariam pour leur

encouragement, leur sacrifice qui m’ont permis d’aller de l’avant.

A toute la communauté Burkinabè à (Salo H., Tamboura A., Ouédraogo F.,

Ouédraogo I., Bambara I., Zallé R...)

A mes professeurs de la faculté de SNV (Dr. Arabet D…)

A toute la communauté des étudiants étrangers à Constantine (en particulier

Malienne)

A tous mes amis algériens Akram, Yahia, Meriem, Asma, Sara qui ont

fait de mon séjour en Algérie un paradis sur terre. Merci à vous.

Enfin à tous ceux ou celles que j’ai eu l’immense plaisir de côtoyer.

Merci à vous tous

Mahamadi SAVADOGO
 Dédicace
Je dédie ce travail :

A mes très chers parents, que Dieu me les gardent et protègent.

A mes frères et sœurs.

A toute ma famille.

A tous mes amis sans citer les noms.

Youssouf BOUBKEIR
 Résumé

Les eaux usées sont susceptibles de renfermer et de véhiculer une grande variété d’agents
pathogènes pour l’homme. Les organismes pathogènes présents dans les eaux usées d’une
collectivité, en reflètent l’état sanitaire.

Les entérobactéries représentent une des principales familles de bacilles à Gram négatif
se retrouvant partout y compris les eaux usées. Ce sont les plus impliquées en pathologie
infectieuse humaine surtout en milieu hospitalier.

Notre travail s’inscrit dans le cadre de la recherche et l’étude de quelques entérobactéries

pathogènes dans les eaux usées d’oued Boumerzoug. Ainsi une évaluation préalable de la
FTAM a été effectuée sur nos échantillons avant de procéder à des isolements sur milieux
spécifiques ainsi qu’une identification par des méthodes microbiologiques standardisées puis
une réalisation de profils électrophorétiques de l’ADN total des souches identifiées.

Sur trois échantillons étudiés, les résultats de la FTAM varient entre 1.14 106 et 13.8 106
UFC/ml qui témoignent d’une charge microbienne importante des eaux usées. Quant à
l’isolement, sur un total de quatre germes recherchés, nous avons pu isoler et identifier 3
souches d’E. coli et une absence de Salmonella spp. , Shigella spp. et Yersinia enterocolitica a
été observée. Par contre d’autres germes ont été isolés comme Proteus mirabilis, Proteus
morganii, Enterobacter agglomerans et Pseudomonas sp. . Les profils électrophorétiques de
l’ADN total des souches identifiées ont été aussi obtenus.

La presente étude nous a permis de récolter des données locales relatives à la présence de
pathogènes et des indicateurs de contamination fécale tels qu’E. coli. et une contribution à
l’extraction de l’ADN total des souches isolées.

Mots clés : Entérobactéries, eaux usées, Oued Boumerzoug, FTAM, isolement

 Abstract

The wastewater is likely containing and conveying a wide variety of pathogens for humans.
Pathogenic organisms in wastewater of a community, reflected in the health status.
Enterobacteria represent one of the main families of negative Gram of bacilli being found
everywhere including wastewater. These are the most involved in human infectious diseases
especially in hospitals.
The purpose of our work is researching and studying of some pathogenic Enterobacteria in
wastewater of oued Boumerzoug. A preliminary evaluation of the TMAF was performed on
our samples before making isolations on specific media, and identification by standard
microbiological procedures and a realization of the electrophoretic patterns of total DNA of
the identified strains were done.
For the three samples studied, the results of the TMAF vary between 1.14 106 and 13.8 106
CFU/ml which reflect a significant microbial load of waste water. As for the isolation of a
total of four germs sought we could isolate and identify 3 strains of E. coli and an absence of
Salmonella spp., Shigella spp. and Yersinia enterocolitica was observed. Also other germs
were isolated like Proteus mirabilis, Proteus morganii, Enterobacter agglomerans and
Pseudomonas sp. The electrophoretic patterns of total DNA identified strains were also
obtained.
The present study allowed us to collect local data on the presence of pathogens and indicators
of fecal contamination such as E. coli. and a contribution to the extraction of total DNA
isolated strains.

Key words: Enterobacteria, wastewater, Oued Boumerzoug, TMAF, isolation

 .

/ 13.8 106 1.14 106

.
.Yersinia enterocolitica Shigella spp. Salmonella spp. E. coli
Enterobacter Proteus morganii Proteus mirabilis
. Pseudomonas sp. agglomerans

.E. coli
.

FTAM
 Tables des Matières

Liste des abréviations…………………………………..................................................... iv

Liste des figures………………………………………………………………………… vi
Liste des tableaux……………………………………………………………………….. vii
Liste des organigrammes………………………………………………………………... viii

Introduction……………………………………………………………………………… 1

Bibliographie
Chapitre I : Généralités sur les entérobactéries……………………………………………. 3
1. Définition et caractéristiques généraux………………………………………………... 3
2. Position taxonomique………………………………………………………………….. 6
3. Etudes de quelques genres particuliers………………………………………………… 8
[Link] coli………………………………………………………………………... 8
3.1.1. Habitat……………………………………………………………………………... 8
3.1.2. Mode de transmission……………………………………………………………… 8
3.1.3. Pouvoir pathogène………………………………………………………………… 9
[Link]………………………………………………………………………………… 10
3.2.1. Habitat…………………………………………………………………………….. 10
3.2.2. Mode de transmission……………………………………………………………… 10
3.2.3. Pouvoir pathogène…………………………………………………………………. 11
[Link]……………………………………………………………………………... 11
3.3.1. Habitat……………………………………………………………………………... 11
3.3.2. Mode de transmission……………………………………………………………… 12
3.3.3. Pouvoir pathogène………………………………………………………………… 12
[Link] enterocolitica…………………………………………………………………. 12
3.4.1. Habitat…………………………………………………………………………….. 12
3.4.2. Mode de transmission……………………………………………………………… 13
3.4.3. Pouvoir pathogène…………………………………………………………………. 13
4. Bases moléculaires de l’antibiorésistance chez les entérobactéries…………………… 13
[Link]…………………………………………………………………………... 13
4.1.1. Définition………………………………………………………………………….. 13

i
4.1.2. Mécanisme d’action des antibiotiques……………………………………………... 14
4.2.Résistance aux antibiotiques…………………………………………………………… 15
4.2.1. Résistance naturelle………………………………………………………………... 15
4.2.2. Résistance acquise…………………………………………………………………. 16
Chapitre II : Généralités sur les eaux usées……………………………………………….. 17
1. Définition des eaux usées……………………………………………………………… 17
2. Origines des eaux usées………………………………………………………………... 17
3. Bactéries pathogènes des eaux usées…………………………………………………... 18
Chapitre III : Analyse de l’ADN bactérien………………………………………………… 22
1. Extraction et purification………………………………………………………………. 22
[Link] de l’ADN………………………………………………………………….. 22
1.2.Méthodes de purification………………………………………………………………. 22
2. Electrophorèse : Analyse des fragments d’acides nucléiques…………………………. 23

Matériel et Methodes
1. Cadre d’etude…………………………………………………………………………... 25
2. Matériel………………………………………………………………………………… 25
[Link]ériel de prélèvements……………………………………………………………… 25
[Link]ériel de laboratoire………………………………………………………………… 25
3. Méthodes………………………………………………………………………………. 27
[Link]élèvement……………………………………………………………………………. 27
3.1.1. Lieu de prélèvement……………………………………………………………….. 27
3.1.2. Période de prélèvement……………………………………………………………. 27
3.1.3. Technique de prélèvement…………………………………………………………. 28
3.1.4. Transport des échantillons…………………………………………………………. 28
[Link] des germes…………………………………………………………………. 28
3.2.1. Dénombrement de la flore totale aérobie mésophile (FTAM)…………………….. 28
3.2.2. Pré-enrichissement, enrichissement, isolement et identification…………………... 29
3.2.3. Profil électrophorétique de l’ADN total…………………………………………… 35

Résultats et discussion
Résultats…………………………………………………………………………………… 36
1. Dénombrement de la FTAM…………………………………………………………... 36

ii
2. Aspects culturaux……………………………………………………………………… 36
[Link] macroscopique……………………………………………………………….. 36
[Link] microscopique………………………………………………………………... 38
3. Test de l’oxydase………………………………………………………………………. 38
4. Test de catalase………………………………………………………………………… 38
5. Test de nitrate réductase……………………………………………………………….. 38
6. Recherche de l’utilisation du glucose, du lactose, de la production de gaz et H2S sur
milieu KIA et TSI……………………………………………………………………… 38
7. Recherche de l’utilisation du citrate…………………………………………………… 39
8. Test du mannitol mobilité……………………………………………………………… 40
9. Recherche de l’indole et mise en évidence de l’uréase et de la TDA………………… 40
10. Le test de RM et du VP………………………………………………………………... 41
11. Recherche de la -galactosidase : test ONPG…………………………………………. 42
12. Galerie API 20 E………………………………………………………………………. 42
13. Profils électrophorétiques de l’ADN…………………………………………………... 47
Discussion………………………………………………………………………………….. 48

Conclusion…………………………………………………………………………………. 51
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

iii
 LISTE DES ABREVIATIONS

Liste des abréviations

ADH : Arginine Dihydrolase
ADN: Acide désoxyribonucléique
AMY : Amygdaline
AND: Acide désoxyribonucléique
API : Appareillage et Procédé d’Identification
ARA : Arabinose
ARNr : Acide ribonucléique ribosomique
BET : bromure d’éthidium
CIT : Citrate de Simmons
DCL : Milieu Désoxycholate citrate lactosée
ECAD: Escherichia coli à adhésion
ECEA : Escherichia coli entéroaggrégatifs
ECEP : Escherichia coli Entéropathogènes
ECET : Escherichia coli Entérotoxinogène
EDTA : Acide Ethylène Diamine Tétra acétique
EHEC : Escherichia coli Entérohémorragiques
EIEC : Escherichia coli Entéro-invasifs
EPEI : Eau peptonée exempte d’indole
ERU : Eau Résiduaire Urbaine
FTAM : Flore Totale Aérobie Mésophile
GEL : Gélatinase
GLU : Glucose
GN : Gélose nutritive
H2S : Sulfure dihydrogène
HCl: Chlorure d’hydrogène
IND : Indole
kb: kilobase
KIA : Kligler-Hajna
KOH: Hydroxyde de potassium
LDC : Lysine Décarboxylase
LPS : lipopolysaccharide

iv
 LISTE DES ABREVIATIONS

MAN : Mannose
MEL : Mélibiose
Ng : nanogramme
ODC : Ornithine décarboxylase
ONP : Orthonitrophényl
ONPG : Orthonitrophényl- -D-galactopyrannoside
pb: Paire de base
PCA : Plate Count Agar
PDA: Phenylalanine désaminase
pH : Potentiel hydrogène
PLP : Protéines de liaison aux pénicillines
RHA : Rhamnose
RM : Rouge Méthyle
rpm: Rotation par minute
S: Svedberg
SAC : Saccharose
SFB : Sélénite F Broth
SHU : syndrome hémolytique et urémique
SOR : Sorbitol
SS : Salmonella-Shigella
STEC : Shiga Toxin Escherichia Coli
TBE : Tris Borate EDTA
TDA : Tryptophane désaminase
TSI : Triple Sugar Iron Agar
UFC : Unité Formant Colonie
VBNC: Viable But Non Culturable
VP : Voges-Proskauer

v
 LISTE DES FIGURES

Liste des figures

Figure 1 : Structure et aspect microscopique des Enterobacteriaceae ……………….4

Figure 2 : Mécanismes d’action des antibiotiques…………………………………...14
Figure 3 : Sites de prélèvements dans oued Boumerzoug...........................................26
Figure 4 : Aspect des colonies sur BCP.......................................................................36
Figure 5 : Aspect des colonies sur milieu SS...............................................................37
Figure 6 : Aspect des colonies sur milieu DCL……………………………………...37
Figure 7 : Révélation du test d’oxydase……………………………………………...38
Figure 8 : Résultat du test de catalase….....................................................................38
Figure 9 : Aspects des colonies testées sur le milieu KIA…………………………...39
Figure 10 : Aspect sur milieu citrate de Simmons…………………………………...39
Figure 11 : Aspect du milieu Mannitol-Mobilité…………………………………….40
Figure 12 : Résultat du test de l’uréase………………………………………………40
Figure 13 : Aspect du test de l’indole…………………………..……………………41
Figure 14 : Aspect du test de la TDA…………………………..……………………41
Figure 15 : Test du rouge de méthyle (RM)…………………………………………41
Figure 16 : Résultats du test d’ONPG……………………………………………….42
Figure 17 : Résultat de la galerie API 20 E de la souche 1…………………………..43
Figure 18 : Résultat de la galerie API 20 E de la souche 2…………………………..43
Figure 19 : Résultat de la galerie API 20 E de la souche 3……………….………….44
Figure 20 : Résultat de la galerie API 20 E de la souche 4………..…………………44
Figure 21 : Résultat de la galerie API 20 E de la souche 5…………………………..45
Figure 22 : Résultat de la galerie API 20 E de la souche 6…………..………………45
Figure 23 : Résultat de la galerie API 20 E de la souche 7…. ………………………46
Figure 24 : Résultat de la galerie API 20 E de la souche 8……….………………….46
Figure 25 : Profils électrophorétiques de l’ADN des souches……………………….47

vi
 LISTE DES TABLEAUX

Liste des tableaux

Tableau 1 : Les caractères d’identification biochimiques des genres les plus fréquemment
rencontrés………………………………………………………………………………………5

Tableau 2 : Classification d’entérobactéries courantes et rares……………………………….7

Tableau 3 : Principales maladies d’origine hydrique et les bactéries pathogènes associées...20

Tableau 4 : Périodes de prélèvements des échantillons……………………………...............27

Tableau 5 : Valeurs moyennes en UFC/ml du dénombrement sur PCA….…………………36

Tableau 6 : Résultats de la galerie API 20 E de la souche 1…………...……………………42

Tableau 7 : Résultats de la galerie API 20 E de la souche 2…………...……………………43

Tableau 8 : Résultats de la galerie API 20 E de la souche 3…………...……………………43

Tableau 9 : Résultats de la galerie API 20 E de la souche 4.........................................……..44

Tableau 10 : Résultats de la galerie API 20 E de la souche 5………………………….……44

Tableau 11 : Résultats de la galerie API 20 E de la souche 6……………………….………45

Tableau 12 : Résultats de la galerie API 20 E de la souche 7……………………………….45

Tableau 13 : Résultats de la galerie API 20 E de la souche 8………………………….……46

vii
 LISTE DES ORGANIGRAMMES

Liste des organigrammes

Organigramme 1 : Etapes pour l’évaluation de la FTAM…………………………………28

viii
INTRODUCTION
 INTRODUCTION

Introduction

Les entérobactéries sont des bactéries Gram négatif, aéro-anaérobies facultatifs,

retrouvés partout dans le sol dans l’eau et surtout dans l’intestin de l’homme et des animaux.
Elles comprennent un nombre très élevé de genres et d’espèces. Leur abondance dans
l’intestin, leur mobilité, la rapidité de leur multiplication, l’acquisition fréquente de
mécanisme de résistance aux antibiotiques expliquent qu’elles soient les bactéries les plus
impliquées en pathologie infectieuse humaine surtout en milieu hospitalier. [1]

Les eaux usées représentent à la fois une ressource et un danger. Les eaux usées non
traitées renferment divers organismes excrétés, y compris les agents pathogènes, dont le type
et le nombre dépendent des niveaux de fond des infections correspondantes dans la
population. Les flambées épidémiques provoquent une augmentation des concentrations
d’agents causals dans les eaux usées et les excréta. Les types et les concentrations d’agents
pathogènes pouvant être très variables. [2]

Ces organismes peuvent contaminer les cultures, les sols, les eaux de surface, les eaux
souterraines. Les eaux usées représentent un important véhicule d’agents biologiques et
chimiques issus de l’activité humaine et/ou industrielle. Les agents pathogènes peuvent être
transmis à l’homme lors du contact direct avec les eaux usées ou indirectement par la
consommation de cultures irriguées avec ces eaux usées, ou encore par des produits d’origine
animale. [3]

Parmi les problématiques les plus répandues et qui s’écoulent actuellement dans le
monde, on cite celle de la réutilisation des eaux brutes surtout en agriculture qui consomme
plus de 80% des ressources hydriques exploitées et aussi l’utilisation pour la consommation.
[3]

Nous nous sommes intéressés aux eaux usées d’oued Boumerzoug de Constantine dans
le but de récolter des données locales pour évaluer la présence de pathogènes et des
indicateurs de contamination fécale tels qu’E. coli.

L’objectif de notre travail est l’isolement et l’étude de quelques entérobactéries

pathogènes spécifiquement E. coli, Salmonella spp., Shigella spp. et Yersinia enterocolitica

1
 INTRODUCTION

dans les eaux usées d’Oued Boumerzoug, un écosystème constituant une niche
écologique.

Pour développer ces aspects, nous avons adopté la méthodologie suivante :

- Evaluation de la flore totale aérobie mésophile (FTAM) de ces eaux

- Isolement et identification de ces entérobactéries pathogènes
- Extraction et visualisation de l’ADN total des souches identifiées.

2
BIBLIOGRAPHIE
 Chapitre I :
Généralités sur les
entérobactéries
 BIBLIOGRAPHIE

Chapitre I : Généralités sur les entérobactéries

1. Définition et caractéristiques générales

Les entérobactéries constituent une famille bactérienne hétérogène regroupant un grand

nombre d’espèces. Au niveau phénotypique, ce sont des bacilles Gram négatif droits ; mobiles
par flagelles péritriches, ou immobiles (Figure1) ; non sporulés ; aérobies facultatifs,
produisant de l’acide à partir du glucose ; pas de besoin en sodium, ni de stimulation ; catalase
positive ; oxydase négative ; réduisent habituellement les nitrates en nitrite (pas en N 2) ;
ARNr 16S de gamma-protéobactéries. [4] [5]

Les différences entre les nombreux genres et espèces viennent de critères plus
précis (Tableau 1), comme la fermentation des différents sucres, la production ou non de
sulfure, la production d'indole, la production d’uréase, la présence ou l’absence
d’enzymes du métabolisme (désaminases, décarboxylases)…etc. [6]

Leur principale particularité commune est d’être présente dans la flore digestive de
l’homme et des animaux à sang chaud. Leur distribution dans la nature est néanmoins plus
large, puisqu’on les retrouve notamment chez les végétaux et dans l’environnement (sol et
eau). Par leur particularité métabolique, certaines entérobactéries participent au cycle naturel
des matières organiques, d’autres peuvent coloniser et dégrader des produits agroalimentaires
ou encore provoquer des maladies parfois graves chez l’homme ou chez l’animal. [4]

La famille présente une grande facilité de culture : les milieux les plus simples (gélose
ordinaire) suffisent et le substrat énergétique de base (glucose) est également suffisant. La
température optimale de développement se situe entre 24 et 37°C (germes mésophiles). [4]

Toutes les entérobactéries possèdent des antigènes de paroi (somatiques) ou antigènes

O qui correspondent aux polyosides fixés sur les lipopolysaccharides (LPS) et qui
constituent les endotoxines des bactéries à Gram négatif. Les espèces mobiles possèdent en
plus des antigènes de flagelles ou antigènes H de nature protéique, constitués de
flagellines. Certaines souches possèdent en plus un antigène K qui masque l’antigène
O, et qui correspond à une enveloppe polyosidique constituant une véritable capsule et
donnant un aspect muqueux. [6]

3
 BIBLIOGRAPHIE

Figure 1 : Structure et aspect microscopique des Enterobacteriaceae. [7]

4
 BIBLIOGRAPHIE

Tableau 1 : Les caractères d’identification biochimiques des genres les plus fréquemment
rencontrés. [8]

Klebsiella pneumoniae

Yersinia enterocolitica
Enterobacter cloaceae

Serratia marcescens

Pseudotuberculosis
Citrobacter freudii

Proteus morganii
Proteus mirabilis
Escherichia coli

Proteus vulgaris

Proteus rettgeri
Hafnia alvei

Providencia
Salmonella

Yersinia
Shigella
Levinea

Mobilité + + + + - - + +* + + + + + + + +

Lactose - + ou (+) - + ou (+) - + + - - - - - - - -

ONPG - + + + d + + + + - - - - - + +
H2S + + - - - - - - - + + - - - - -
LDC + - - d - + - + - + + - - - - -
ODC + - + d d - + + + - + + - - + -
ADH - - d d d - + - - - - - - - - -
Uréase - - - - - +* - - - + + + + - + +
TDA, PDA - - - - - - - - - + + + + + - -
Indole - - + + d - - - - + - + + D -
Citrate de Simmons + + + - - + + d* + D d - + + - -
Malonate - - d - - + + d - - - - - - - -
VP - - - - - + - +* + - d - - - d* -
Gélatinase - - - - - - + - + + + - - - - -
Gaz/glucose + + + + - + + + - + + + d d - -
Mannitol + + + d d + + + + - - - + d + +
Rhamnose + + + d d + + + - - - - d - - +
Saccharose - d d d - + + - + + d d - d + -
Arabinose + + + + d + + + - - - - - - + d
Inositol d - - - - + d - d - - - + d - -
Aldonitol - - d - - + d - d - - - + d - -
Galacturonate - + + + d + + + + - - - - - + d

+ : Résultat positif - : Résultat négatif

d : différents types biochimiques +* et d* : positif à 22°C, négatif à 37°C

+* : positif lent (uréase+ en 18-24 heures) (+) : positif en 3 à 7 jours

5
 BIBLIOGRAPHIE

2. Position taxonomique

Les entérobactéries constituent un grand groupe de bactéries ayant une forte similitude. La
création de ce groupe a été proposée par Rahn en 1937 qu’il dénomma Enterobacteriaceae. Si
le nom de famille est toujours maintenu, en revanche le classement (Tableau 2) des bactéries
dans la famille a beaucoup évolué. [9]

Actuellement, les entérobactéries sont classées sur la base du séquençage des ARNr 5S et
16S dans :

Domaine : Eubacteria.
Phylum XII : Proteobacteria.
Classe : Gammaproteobacteria.
Ordre : Enterobacteriales.
Famille : Enterobacteriaceae.

44 genres dont les genres récents Alterococcus, Arsenophorus, Brenneria,

Pectobacterium, Raoultella, Samsonia, Sodalis. [10]

Les genres de cette famille sont regroupés en cinq tribus, d’après leurs propriétés
fermentatives: Escherichiae, Klebsielleae, Proteae, Yersiniae et Erwiniae. [11]

6
 BIBLIOGRAPHIE

Tableau 2 : Classification d’entérobactéries courantes et rares. [10]

Genres Espèces
Escherichia Six espèces: Escherichia coli…
Salmonella Salmonella bongori, S. enterica, S. subterranean…
Shigella Quatre espèces : Shigella dysenteriae, S. flexneri, S.
sonnei, S. boydii.
Citrobacter Douze espèces : Citrobacter freundii, C. youngae,
C. braakii, C. koseri…
Klebsiella Quatre espèces : Klebsiella pneumoniae,
K. pneumoniae subsp. ozaenae…
Entérobactéries Enterobacter Quatorze espèces : Enterobacter aerogenes,
Courantes E. cloacae, E. sakazakii…
Hafnia Espèce unique : Hafnia alvei
Serratia Onze espèces : Serratia marcescens subsp.
marcescens, S. odorifera, S. rubidaea…
Proteus Six espèces : Proteus vulgaris, P. mirabilis,
P. penneri…
Morganella Une espèce : Morganella morganii subsp. Morganii
Providencia Cinq espèces : Providencia alcalifaciens, P. stuartii,
P. rettgeri...
Yersinia Onze espèces : Yersinia pestis, Y. enterocolitica
subsp. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis…
Erwinia Onze espèces
Cedecea
Ewingella
Pantoea
Rahnella
Budvicia
Buttiauxella
Entérobactéries Kluyvera
rare ou
Leclercia
récemment
décrites Moellerella
Trabulsiella
Yokenella
Edwardsiella
Leminorella
Obesumbacterium
Pragia
Photorhabdus
Tatumella
Xenorhabdus

7
 BIBLIOGRAPHIE

3. Etudes de quelques genres et espèces particuliers

3.1. Escherichia coli

Le genre Escherichia comprend cinq espèces : E. coli, E. albertii, E. fergusonii, E.

hermanii, E. vulneris, E. blattae. Cependant, au sein de ce genre, l’espece [Link] représente la
quasi-totalité des isolats humains. L’espèce E. coli présente une grande diversité sur le plan
génétique et sur le plan pouvoir pathogène. [7]

Isolée pour la première fois par Escherich en 1885, Escherichia coli est l'espèce
bactérienne qui a été la plus étudiée par les fondamentalistes pour des travaux de
physiologie et de génétique. [12]

3.1.1. Habitat

Les E. coli sont des hôtes normaux du tube digestif, de la partie distale de l’iléon et du
colon de l’homme et de la plupart des animaux à sang qu’ils colonisent dès les premières
heures de la naissance. [8]

La présence de cette bactérie dans le sol, l’eau et/ou les aliments témoigne d’une
contamination fécale et suggère la possibilité que d’autres bactéries ou virus d’origine
digestive s’y trouvent. On considère que leur présence rend l’eau ou les aliments impropres à
l’utilisation ou à la consommation. [4]

3.1.2. Mode de transmission

Les études d’épidémiologie analytique et les investigations d’épidémies ont

permis d’améliorer les connaissances sur les modes de transmission et les sources de
contamination des Shiga Toxin Escherichia coli (STEC). A l’heure actuelle, les quatre
principales voies d’infection à EHEC sont l’ingestion d’aliments, la transmission
hydrique (eau de boisson ou de baignade), la transmission interhumaine et le contact
avec les animaux de ferme et leur environnement. [13]

La majorité des infections est le résultat d’une transmission alimentaire. En effet,

un grand nombre des infections à E. coli O157:H7 a été relié épidémiologiquement à la
consommation de denrées animales. La viande de bœuf constitue la source majeure
de contamination suite principalement à une cuisson insuffisante. [14] [15]

8
 BIBLIOGRAPHIE

Les épidémies d’origine hydrique sont généralement associées à la consommation

d’eau de boisson ou à l’ingestion accidentelle d’eau lors de baignades. [13]
Le portage sain humain de STEC existe mais semble rare et transitoire. La majorité des
cas résulte d’une contamination indirecte mise en évidence chez les personnes en
contact avec les malades. [16] [17]
La transmission d’E. coli O157:H7 à l’homme, par contact direct ou indirect avec
des animaux de ferme ou leurs déjections, a été décrite lors de cas sporadiques mais
aussi lors d’épidémies. [13]

3.1.3. Pouvoir pathogène

Les colibacilles, hôtes normaux de l'intestin, ne provoquent normalement pas de

maladie. Cependant ils possèdent un potentiel pathogène qu'ils expriment dans certaines
circonstances (pathogènes opportunistes). Les infections à E. coli sont de deux types :
infections intestinales à type de diarrhée et infections extra-intestinales. [18] [7]

Les E. coli entériques ou intestinaux sont responsables de gastro-entérites infantiles ou de

diarrhée des voyageurs. [4]

On distingue six pathovars entérovirulents :

Les ECEP : E. coli entéropathogènes responsables de gastro-entérites infantiles. Elles

ne sont ni invasives ni toxiniques mais peuvent adhérer aux membranes des
entérocytes et provoquer la destruction de leurs microvillosités. S’ensuit une diarrhée
aqueuse importante mais autolimitée. [7] [4]
Les ECET : E. coli entérotoxinogènes sont une cause fréquente de diarrhée chez les
enfants dans les pays en voie de développement. Ils sont aussi régulièrement
responsables de la diarrhée du voyageur. [19]
Les EIEC : E. coli entéro-invasifs encore appelés Escherichia coli shigella-like,
responsables de syndromes dysentériques avec invasion de la muqueuse intestinale.
[20]
Les EHEC : E. coli entérohémorragiques responsables d’épidémies de diarrhées
sanglantes d’origine alimentaire pouvant se compliquer de syndrome hémolytique et
urémique (SHU) chez l’enfant par production de Shiga toxines. [7]

9
 BIBLIOGRAPHIE

Les ECEA : E. coli entéroaggrégatifs provoquent une diarrhée persistante chez les
enfants, particulièrement dans les pays en voie de développement. [19]

Les ECAD : E. coli à adhésion diffuse qui seraient responsables de diarrhées aqueuses
chez l’enfant. [7]

Les E. coli extradigestifs (extra-intestinaux), sont responsables d’infections urinaires

(E. coli uropathogènes), de septicémies, prostatites, méningites… Ces germes ne produisent
pas d’entérotoxines et n’entrainent pas l’apparition de diarrhées. [4]

3.2. Shigella

Ces bactéries furent décrites la première fois par Chantemesse et Widal en 1888. Ils
avaient isolé des selles de malades présentant un syndrome dysentérique. [8]

Nommé Shigella en l'honneur du bactériologiste japonais Kiyoshi SHIGA qui a

découvert le bacille de la dysenterie en 1897. [21]

Bien que faisant partie sur le plan génétique de l’espèce Escherichia coli, le genre Shigella
a été conservé dans la taxonomie pour des raisons médicales. Ce genre comprend quatre
« espèces » ou sous-groupes A, B, C, D pouvant comporter un ou plusieurs serotypes : groupe
A, S. dysenteriae avec 15 serotypes ; groupe B, S. flexneri avec 6 serotypes ; groupe C,
S. boydii avec 18 serotypes ; et groupe D, S. sonnei avec un seul serotype. [7]

3.2.1. Habitat

Les shigelles sont des bactéries strictement humaines. Elles ne font pas partie de la flore
intestinale normale. On ne les retrouve que chez les malades, les convalescents et les rares
porteurs sains. [22]

Ils peuvent survivre relativement longtemps dans le milieu externe : 10-11 jours dans les
matières fécales, 8 jours sur les vêtements des malades et 2-3 jours dans l’eau. [4]

3.2.2. Mode de transmission

La transmission est directe ou indirecte par voie fécale-orale à partir d'un malade ou d'un
porteur. Les mauvaises pratiques d'hygiène contribuent à propager l'infection de façon
directe, par contact physique, ou de façon indirecte, par contamination des aliments.

10
 BIBLIOGRAPHIE

La transmission par l'eau, le lait, les blattes et les mouches peut survenir par suite de la
contamination fécale directe. La dose infectante est généralement comprise entre 10 et 100
bactéries. [21] [4]

3.2.3. Pouvoir pathogène

S. dysenteriae type 1 ou bacille de Shiga est l’agent de la dysenterie bacillaire stricto

sensu. [7]

Les autres sérotypes provoquent des colites infectieuses chez l’adulte et des
gastroentérites chez l’enfant. Les Shigella provoquent des ulcérations de la muqueuse
intestinale et une réaction inflammatoire. En conséquence, les selles sont sanglantes avec des
leucocytes, des glaires et des fausses membranes, douleurs abdominales, épreintes et ténesme
caractérisent le syndrome dysentérique. Les localisations extra-digestives sont peu fréquentes.
Les moins rares sont les infections urinaires. On observe parfois des formes bactériémiques,
des arthrites, des méningites. [23]

3.3. Salmonella

Les salmonelles sont des entérobactéries, pour la plupart pathogènes pour l’homme, agent
de nombreuses infections comme les fièvres typhoïdes et paratyphoïdes, de gastro-entérites et
de toxi-infections alimentaires parfois collectives. Ces maladies sont à déclaration obligatoire.
[4]

Les hybridations ADN/ADN ont démontré que toutes les souches de salmonelles
appartenaient à deux espèces, Salmonella enterica et Salmonella bongorii, qui est
exceptionnellement isolée chez l’homme. L’espèce S. enterica est divisée en six sous-espèces.
[7]

3.3.1. Habitat

Le réservoir naturel est constitué par le tube digestif des espèces contaminées :
mammifères (y compris l’homme), volailles, reptiles, escargots, grenouilles, animaux de
compagnie (chiens et chats)… Les déjections de ces espèces peuvent contaminer le sol et/ou
l’eau. Si elles ne peuvent s’y multiplier de manière significative, elles peuvent y survivre, en
particulier dans le sol, pendant plusieurs semaines ou même plusieurs mois si les conditions
de température, de pH et d’humidité sont favorables. [4] [8]

11
 BIBLIOGRAPHIE

3.3.2. Mode de transmission

Les salmonelles sont éliminées par les matières fécales, et de manière inconstante par les
urines. La maladie est contractée par absorption d’eau ou d’aliments contaminés, directement
ou indirectement, par des excréments. [8]

3.3.3. Pouvoir pathogène

Du point de vue médical, il convient de distinguer deux grands groupes à l’intérieur du

genre Salmonella :

Les salmonelles majeures, agents des fièvres typhoïdes et paratyphoïdes – S. typhi,

S. paratyphi A, S. paratyphi B, S. paratyphi C. Ces sérovars sont responsables de
septicémies à point de départ lymphatique par envahissement des ganglions
mésentériques.
Les autres sérovars « mineurs » habituellement responsable de toxi-infections
alimentaires qui se manifestent par des gastro-entérites avec diarrhées et
vomissements survenant dans les 8 à 10 heures suivant l’injection de l’aliment
contaminant et dont l’évolution est en règle spontanément favorable dans quelques
jours. [7]

3.4. Yersinia enterocolitica

Y. enterocolitica s’imposa en 1962, par la vague épizootique qui détruisit les élevages de
chinchillas d’Europe occidentale. Elle atteignit ensuite les lièvres puis les porcs. A partir de
1964, les cas humains apparaissent et, les années suivantes, la liste des espèces atteintes et
celle des infectés ne cessent de s’accroitre. Par la suite, la découverte de souches gardées en
collection, isolées aux Etats-Unis dès 1939 ou en Suisse en 1949, montra qu’en fait cette
espèce attendait seulement les conditions nécessaires à sa diffusion. [8]

3.4.1. Habitat

Y. enterocolitica a un réservoir très vaste : environnement (eaux, sols,), ou animaux

(rongeurs, porcs, etc.), avec souches adaptées ou non à des espèces animales voire à l’homme.
Ainsi, les biovars 4 (Sérogroupe O : 3), 3 (O : 5) et 2 (O : 9) sont les plus fréquent chez
l’homme en Europe. [7]

12
 BIBLIOGRAPHIE

3.4.2. Mode de transmission

La transmission par voie féco-orale est la plus importante; elle se fait par l’ingestion
d’aliments ou d’eaux contaminées, ou par un contact avec des animaux ou des personnes
infectés. [24]

Des cas de transmissions nosocomiales et de transmission par des produits sanguins

infectés ont été signalés. [25]

3.4.3. Pouvoir pathogène

Y. enterocolitica est responsable d'entérocolite chez le jeune enfant, d'adénite

mésentérique chez l'adolescent et l'adulte jeune. Les formes septicémiques sont plus rares et
surviennent sur un terrain fragilisé, immunodéprimé, et des manifestations cliniques
variées ont été décrites (abcès profonds, endocardite, méningite, etc.). [7]

4. Bases moléculaires de l’antibiorésistance chez les entérobactéries

La connaissance des bases moléculaires de la résistance naturelle et acquise

(caractéristiques et variété des supports génétiques, multiplicité des mécanismes impliqués,
différents modes de transfert des déterminants de la résistance entre bactéries) est
indispensable pour comprendre comment l’utilisation des antibiotiques exerce une pression de
sélection sur les micro-organismes et influence leur état de résistance. [26]

4.1. Antibiotiques
4.1.1. Définition

Les antibiotiques sont des molécules chimiques ou de synthèses capables de détruire les
micro-organismes ou du moins de limiter de manière significative leur multiplication. Ce
terme est généralement réservé aux molécules dont l’action est antibactérienne (bactéricides
ou bactériostatiques). [4]

Ils agissant spécifiquement sur des cibles moléculaires perturbant une étape essentielle du
métabolisme des bactéries (synthèse protéique, synthèse des acides nucléiques, réplication,
transcription, transport transmembranaire…) [27]

13
 BIBLIOGRAPHIE

4.1.2. Mécanisme d’action des antibiotiques

Les antibiotiques, contrairement aux antiseptiques, agissent sur les bactéries en inhibant
des fonctions physiologiques précises (Figure 2) telles que la synthèse de la paroi ( -
lactamines, glycopeptides, fosfomycine), la réplication/transcription de l’ADN (4-quinolones,
rifampicine, sulfamides, triméthoprime), la synthèse protéique (aminosides, tétracycline,
macrolides et apparentés, chloramphénicol) ou encore la respiration cellulaire (polymyxines,
daptomycine).

Pour exercer leur action, ils doivent se lier à des cibles moléculaires spécifiques le plus
souvent intracellulaires. [28]

Les antibiotiques les plus utilisés pour lutter contre les infections humaines interfèrent avec
les réactions structurales ou physiologiques qui sont particulières aux pathogènes infectieux.
Ceci est possible car les bactéries sont physiologiquement très différentes des eucaryotes. Par
conséquent, les antibiotiques antibactériens peuvent exploiter ces différences et détruire les
« envahisseurs » sans dommages significatifs à l’hôte humain. [29].

Figure 2 : Mécanismes d’action des antibiotiques. [30]

14
 BIBLIOGRAPHIE

4.2. Résistance aux antibiotiques

La résistance bactérienne se définit comme la capacité de continuer à croitre ou à survivre

en présence de l'antibiotique. Les conditions d’activité d’un antibiotique sont de
posséder une cible spécifique, de demeurer sous forme active, d’accéder à la cible et
d’interagir efficacement avec elle en la désactivant.

Il existe de nombreux mécanismes aboutissant à l’expression de la résistance et suivant son

caractère inné ou acquis : la résistance naturelle et la résistance acquise.

La résistance naturelle est programmée sur le génome et constante à l'intérieur du taxon ;

elle constitue un critère d'identification stable d’une espèce. Les résistances acquises sont
quant à elles consécutives à des modifications de l'équipement génétique. [31]

4.2.1. Résistance naturelle

La résistance naturelle est un caractère présent chez toutes les souches appartenant à la
même espèce. Ce type de résistance est détecté dès les premières études réalisées afin
de déterminer l’activité d’un antibiotique et contribue à définir son spectre
antibactérien. Elle peut être due à l’inaccessibilité de la cible pour l’antibiotique qui est
une conséquence des différences existant entre les structures pariétales bactériennes, à une
faible affinité de la cible pour l’antibiotique, ou encore à l’absence de la cible. [32]

La résistance naturelle est stable, transmise à la descendance mais pas ou peu

transmissible sur un mode horizontal. La résistance naturelle a pour support génétique
le chromosome bactérien. [33]

Ainsi, les membres de la tribu des Proteae sont naturellement résistants aux
nitrofuranes et à la colistine. Concernant la sensibilité aux -lactamines, les entérobactéries
sont classiquement divisées en quatre classes :

Celles qui ne produisent pas naturellement de -lactamase comme Salmonella et

Proteus mirabilis ou produisent une céphalosporinase à très bas niveau comme
Escherichia coli et Shigella (classe 1) ;
Celles qui produisent naturellement une pénicillinase comme Klebsiella, Citrobacter
diversus, Citrobacter amalo-naticus et Escherichia hermanni (classe 2) ;

15
 BIBLIOGRAPHIE

Celles (les plus nombreuses) qui produisent naturellement une céphalosporinase

(classe 3) ; et
Celles qui produisent à la fois une pénicillinase et une céphalosporinase comme
Yersinia enterocolitica (classe 4).

D'autres enzymes particulières ne rentrent pas dans cette classification : céfuroximase

de Proteus vulgaris et Proteus penneri ou -lactamase à spectre étendue (BLSE)
chromosomique de Kluyvera , Rahnella , Citrobacter sedlakii et Erwinia persicina. [7]

4.2.2. Résistance acquise

Ce terme est utilisé pour désigner le résultat d’un processus permettant à des bactéries
d’une espèce originellement sensible de devenir résistante à un ou plusieurs antibiotiques.
[31]

La résistance bactérienne acquise n’apparaît que chez quelques souches d’une espèce
donnée normalement sensible, elle est due à l’emploi en thérapeutique des antibiotiques. [32]

Sur le plan génétique, la résistance peut être acquise par deux voies totalement
distinctes, soit des mutations affectant des gènes présents sur le chromosome, soit
l’acquisition de gènes étrangers. Ces gènes peuvent provenir du chromosome
d’espèces différentes ou être véhiculés par des éléments génétiques mobiles pouvant être
transférés d’une bactérie à l’autre, on parle alors de transmission. [34]

16
 Chapitre II :
Généralités sur les
eaux usées
 BIBLIOGRAPHIE

Chapitre II : Généralités sur les eaux usées

En parlant des eaux usées, il semble important d’avoir une idée sur leur définition, leurs
origines et caractéristiques ainsi que les maladies qu’elles peuvent véhiculées.

1. Définition des eaux usées

Selon Rejsek, les eaux résiduaires urbaines (ERU), ou eaux usées, sont des eaux chargées
de polluants, solubles ou non, provenant essentiellement de l’activité humaine. [35]
Les activités humaines, domestiques, agricoles et industrielles produisent toutes sortes
de déchets et de souillures qui sont transportés par voie liquide. Ils sont susceptibles
d’engendrer différentes sortes de pollution et de nuisance dans le milieu récepteur. Cet
ensemble d’eau rejetée et de déchet constitue ce qu’on appelle les eaux usées. [36]
Donc sous la terminologie d’eau résiduaire, on groupe des eaux d’origines très diverses qui
ont perdu leurs puretés ; c'est-à-dire leurs propriétés naturelles par l’effet des polluants après
avoir été utilisées dans des activités humaines (domestiques, industrielles ou agricoles).

2. Origines des eaux usées

Selon Demers, on distingue trois catégories d’eaux usées [37]:

Les eaux domestiques, provenant des usages résidentiels tels la lessive, l’eau de
vaisselle, la cuisine, les toilettes et les douches. Les eaux domestiques peuvent être
traitées collectivement (eaux municipales) ou individuellement (système autonome tel
qu’une fosse septique) ;
Les eaux industrielles, qui sont les rejets des procédés industriels qui utilisent de l’eau
dans la composition, la fabrication et le nettoyage d’un produit ;
Et les eaux pluviales sont celles qui proviennent des précipitations
atmosphériques. Sont assimilées à des eaux pluviales celles provenant des eaux
d’arrosage et de lavage des voies publiques et privées, des jardins, des cours
d’immeubles, des eaux de vidange de bassins de natation. Ce sont donc
essentiellement des eaux de ruissellement de surface. [38]
L’urbanisation et le développement de l’industrie ont passablement changé ce qu’on
appelle les eaux usées. En plus de la matière organique, on y retrouve des résidus de produits
nettoyants domestiques et des rejets industriels et commerciaux variés. [37]

17
 BIBLIOGRAPHIE

3. Bactéries pathogènes des eaux usées

Les bactéries sont les plus fréquentes des agents pathogènes microbiens présents dans les
eaux usées. Il existe une large gamme d'agents pathogènes bactériens et des agents pathogènes
opportunistes qui peuvent être détectés dans les eaux usées. Les eaux usées contiennent en
moyenne 107 à 108 bactéries/l. La concentration en bactéries pathogènes est de l’ordre
de 104 /l. Le nombre de germes peut être multiplié par 1 000 dans les eaux de rivières
après un rejet urbain. [39] [40]

Les bactéries des eaux usées ont été caractérisées et appartiennent aux groupes suivants :

Bactéries Gram négatives anaérobies facultatives : par exemple, Aeromonas,

Plesiomonas, Vibrio, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, et Shigella.
Bactéries aérobies à Gram négatif : par exemple, Pseudomonas, Alcaligenes,
Flavobacterium, Acinetobacter.
Bactéries sporulantes Gram positif : par exemple, Bacillus spp.
Bactéries non sporulantes Gram positif : par exemple, Arthrobacter,
Corynebacterium, Rhodococcus. [41]
Beaucoup d’agents pathogènes bactériens sont d’origine entérique, cependant, les agents
pathogènes qui causent des maladies non entériques (par exemple, Legionella spp.
Mycobacterium spp. et Leptospira) ont également été détectées dans les eaux usées. [39]

Les infections gastro-intestinales sont parmi les maladies les plus courantes causées par des
pathogènes bactériens des eaux usées. Celles-ci comprennent la diarrhée, les exemples les
plus connus sont le choléra causé par Vibrio cholerae et les salmonelloses causées par un
certain nombre d'espèces de Salmonella ; et la dysenterie causée par diverses espèces de
Shigella, ainsi que des espèces de Salmonella. [39]

Campylobacter, Helicobacter et Arcobacter sont attribués au fait d'être les principales

causes de l'entérite aiguë humaine. [39]

Les maladies bactériennes non entériques qui peuvent être transmises par des agents
pathogènes présents dans les eaux usées comprennent la légionellose (maladie du
Légionnaire) une pneumonie potentiellement mortelle causée par les espèces de Legionella; la
leptospirose, une infection zoonotique causant une maladie fébrile causée par Leptospira

18
 BIBLIOGRAPHIE

interrogans et la mélioïdose, une maladie semblable à la pneumonie causée par Pseudomonas

pseudomallei. [39]

En plus des agents pathogènes établis, un certain nombre d’agents pathogènes

opportunistes (micro-organismes qui provoquent des infections et des maladies sous des
conditions optimales, généralement chez les très jeunes, les personnes âgées et immuno-
deprimeés) peuvent être trouvés dans les eaux usées non traitées et traitées. Ces agents
pathogènes opportunistes comprennent des espèces de Pseudomonas, Streptococcus,
Flavobacterium et Aeromonas. [39]

Une compilation des bactéries les plus importantes qui peuvent être pathogènes pour
l'homme et qui peuvent être transmises directement ou indirectement par le biais de l’eau est
représenté sur le tableau suivant (tableau 3) :

19
 BIBLIOGRAPHIE

Tableau 3 : Principales maladies d’origine hydrique et les bactéries pathogènes associées.

[42]

Maladies Bactéries Dose Caractéristiques

infectante
Choléra Vibrio cholerae 106 Diarrhée sévère,
déshydrations
Diarrhée aqueuse souvent
Salmonelloses Salmonella spp. avec des crampes
abdominales, des nausées,
des vomissements
fièvre et frissons
Fatigue, maux de tête, des
Fièvre typhoïde Salmonella typhi <1000 douleurs abdominales, une
température élevée. taux de
mortalité Environ 4%
Diarrhée aqueuse souvent
Gastroentérite ou Campylobacter <500 avec des crampes
Campylobactériose jejuni abdominales, des nausées,
des vomissements
fièvre et frissons
Diarrhée sanglante, des
crampes abdominales, des
douleurs rectales. La plupart
Dysenterie ou shigellose Shigella spp. 10 des espèces virulentes,
[Link], produit une
toxine causant le syndrome
hémo-urémique
Etat grave, condition
Colite hémorragique et Escherichia coli systémique qui se produit
syndrome hémolytique O157 :H7 Inconnu principalement chez les
et urémique enfants de moins de 10 ans
Fièvre, infection rénale
pouvant entraîner une
Leptospirose Leptosira spp. Inconnu insuffisance rénale. Dans
certains cas, il y a une
hémorragie interne, y
compris hémorragie
pulmonaire
Legionella Pneumonie aiguë, une forte
Légionellose pneumophila Inconnu fièvre, des maux de tête, de la
toux, des expectorations peu
Ulcère gastro-duodénal Helicobacter Plaie ou trou dans la paroi de
et cancer de l'estomac pylori Inconnu l'estomac ou du duodénum.
Cancer

20
 BIBLIOGRAPHIE

Les bactéries pathogènes d’origine hydrique sont responsables de la mort de 3 à 10

millions de personnes par an dans le monde. Et les pays industrialisés ne sont pas
épargnés : ainsi, une inondation au Canada qui avait fait déborder les égouts et souillé
le réservoir d’eau potable d’une ville, diffusant alors des bactéries de contamination fécale, a
provoqué 400 intoxications dont 5 cas mortels. [40]

21
 Chapitre III :
Analyse de l’ADN
bactérien
 BIBLIOGRAPHIE

Chapitre III Analyse de l’ADN bactérien

1. Extraction et purification

L’extraction et la purification des acides nucléiques sont les premières étapes dans la plupart
des études de biologie moléculaire. [43]

1.1. Extraction de l’ADN

L’extraction d’acides nucléiques d’un matériau biologique requiert la lyse cellulaire,

l’inactivation des nucléases cellulaires et la séparation de l’acide nucléique souhaité de débris
cellulaires. La procédure de lyse idéale est souvent un compromis de techniques et doit être
suffisamment rigoureuse pour briser le matériau de départ complexe (par exemple, le tissu),
mais suffisamment douce pour préserver l’acide nucléique cible. Les procédures de lyse
courantes sont les suivantes :

la rupture mécanique (ex. : broyage ou lyse hypotonique),

le traitement chimique (ex.: lyse détergente, agents chaotropiques, réduction des
thiols)
et la digestion enzymatique (ex.: protéinase K).

La rupture de la membrane et l’inactivation des nucléases intracellulaires peuvent être

combinées. À titre d’exemple, une solution simple peut contenir des détergents pour
solubiliser les membranes cellulaires et des sels chaotropiques puissants pour inactiver les
enzymes intracellulaires. Après la lyse cellulaire et l’inactivation du nucléase, les débris
cellulaires peuvent être aisément retirés par filtrage ou par précipitation. [43]

1.2. Méthodes de purification

Les méthodes de purification des acides nucléiques issus d’extraits cellulaires sont
généralement des combinaisons de deux ou plusieurs des techniques suivantes :

Extraction/précipitation,
Chromatographie,
Centrifugation et
Séparation par affinité. [43]

22
 BIBLIOGRAPHIE

Il existe aujourd’hui des kits commerciaux permettant de réaliser rapidement l’extraction et la

purification à l’aide de réactifs prêt à l’emploi. [44]

2. Electrophorèse : Analyses de fragments d’acides nucléiques

Les acides nucléiques sont des macromolécules polyanioniques uniformément chargées à

pH 8 qui vont pouvoir migrer sous l'effet d'un champ électrique: ils migrent vers le pôle
positif (anode). [44]
La vitesse de migration d'une molécule d'acide nucléique sera fonction de :
- sa masse moléculaire donc du nombre de bases (ou de paires de bases). Plus une
molécule sera de faible masse moléculaire, plus sa vitesse de migration sera grande.
- la concentration d'agarose ou d'acrylamide du gel.
La migration est inversement proportionnelle au logarithme de la masse molaire exprimée
en général en nombre de bases ou paires de bases. Le gel est étalonné avec des fragments
d’ADN ou d’ARN de taille connue. [44]
Choix du support:
- le gel d'agarose est le support le plus utilisé. Les tailles de fragments qu'il est possible
de séparer sont comprises entre 0,1 et 30 kb. La migration s’effectue en position
horizontale.
- le gel de polyacrylamide est utilisé pour la séparation des petits fragments de moins
de 0,1kb = 100 pb. Le gel est coulé entre deux plaques de verre à l'abri de l'oxygène.
La Migration est verticale. L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide est une
méthode d’analyse plus résolutive car on peut séparer les fragments d’ADN à une
base près. L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide est utilisée dans la méthode de
séquençage de l’ADN
Visualisation des acides nucléiques:
Les acides nucléiques sont visualisés par coloration du gel au bromure d'éthidium
(BEt) qui est un agent s'intercalant entre les plateaux de paires de bases et émettant
une fluorescence orange lorsqu'il est éclairé par des UV courts (200-300nm).

Le seuil de détection est de l'ordre de quelques nano grammes : 2 à 3 ng/ bande.

L'électrophorèse permet aussi de séparer des molécules d'acides nucléiques suivant
leur structure, par exemple les différentes formes d'un plasmide. [44]

23
MATERIEL ET
METHODES
 MATERIEL ET METHODES

Matériel et méthodes

1. Cadre d’étude

Notre travail se porte sur l’isolement et l’identification de quelques espèces

d’entérobactéries pathogènes isolées au niveau des eaux usées d’oued Boumerzoug dans la
ville de Constantine.

Dans notre étude nous avons utilisé des méthodes d’isolement classiques connues pour la
recherche de ces germes et ce travail a eu lieu au niveau du laboratoire de Microbiologie
(Laboratoire 11) de la Faculté SNV (Université Frères Mentouri Constantine) qui s’est étalée
sur une période allant du mois de Février au mois de Mai 2016.

2. Matériel
2.1. Matériel de prélèvements

Le matériel de prélèvement est constitué :

- Des flacons stérilisés au préalable pour les prélèvements des échantillons;

- D’un sac isotherme pour le transport des échantillons;
- D’un marqueur pour identifier les flacons.
- Des gants

2.2. Matériel de laboratoire

- Matériel de stérilisation : Four Pasteur, bec Bunsen, autoclave;

- Matériel de pesée : Balance de précision;
- Matériel d’incubation : étuves à 30°C, 37°C et 44°C;
- Matériel divers : pipettes, micro-pipettes, béchers, porte-tubes, boîtes de Pétri,
pipettes Pasteur, flacons, vortex, réfrigérateur; pince, microscope optique, lames et
lamelles, compteur de colonies, cuve à électrophorèse, tubes d’eppendorf, imageur.
- Milieux de culture et réactifs (Annexe 2 et 3) :
Gélose PCA Plate Count Agar (Institut Pasteur d’Alger)
Gélose nutritive ordinaire (GN) (Institut Pasteur d’Alger)
Gélose lactosée au pourpre de bromocrésol (BCP) (Institut Pasteur d’Alger)
Gélose salmonella-Shigella (SS) (Institut Pasteur d’Alger)

24
 MATERIEL ET METHODES

Gélose désoxycholate citrate lactosée (DCL) (Institut Pasteur d’Alger)

Bouillon nutritif (Institut Pasteur d’Alger)
Bouillon nitraté (Institut Pasteur d’Alger)
Milieu Kligler-Hajna (KIA) (Institut Pasteur d’Alger)
Milieu Triple Sugar Iron Agar (TSI) (Institut Pasteur d’Alger)
Milieu Mannitol-Mobilité (Institut Pasteur d’Alger)
Milieu Citrate de Simmons (Institut Pasteur d’Alger)
Milieu Urée –indole (Institut Pasteur d’Alger)
Galerie API 20E (BioMerieux)
Eau peptonée exempte d’indole (EPEI) (Institut Pasteur d’Alger)
Bouillon Sélénite F Broth (SFB) (Institut Pasteur d’Alger)
Eau distillé stérile,
Eau oxygénée (10V),
Réactif de Kovacs,
Réactif VP I Alpha naphtol à 6%,
Réactif VP II KOH à 40%,
Nitrate réductase I acide sulfanilique (en solution à 8 0/00 en acide acétique 5N),
Nitrate réductase II Naphtylamine (en solution à 6 0/00 en acide acétique 5N),
Réactif TDA (Tryptophane désaminase) solution de per chlorure de fer,
Poudre de zinc,
Disques d’ONPG (2-NitrophenylB-D-galactopyranoside) (Fluka),
Disques d’oxydase (Fluka)
Huile de paraffine et de vaseline
Tris Borate EDTA à 10X(Sigma)
Protéinase K (Gene On)
Solution de bromure d’éthidium (BET) 10 mg/ml (Promega)
Marqueur de taille (DNA ladder) 1kb (Biomatik)
Tampon de charge (DNA loading buffer) (Biomatik)
Tris HCl à 5 mM (pH 8.2)
Gel d’agarose à 1% (Promega)

25
 MATERIEL ET METHODES

3. Méthodes

Les Enterobacteriaceae comprennent un nombre très élevé de genres et d’espèces. Ainsi

nous avons jeté notre dévolu sur la recherche de ces quatre entérobactéries: Escherichia coli,
Salmonella spp., Shigella spp. et Yersinia enterocolitica.

3.1. Prélèvement
3.1.1. Lieu de prélèvement

Les prélèvements ont été faits à partir des eaux usées au niveau d’Oued Boumerzoug
(Figure 3) à Chaâbat Erssas et l’ancienne gare SNTV à Constantine à des périodes
différentes.

Figure 3 : Sites de prélèvements dans oued Boumerzoug

3.1.2. Période de prélèvement

Deux sorties ont été faites à 2 stations différentes et à des périodes différentes avec des
échantillons de 200 ml dans des flacons stérilisés au préalable (Tableau 4).

26
 MATERIEL ET METHODES

Tableau 4 : Périodes de prélèvements des échantillons.

Sites de prélèvement (Stations) Périodes de prélèvement

Chaâbat Erras (1) 23/02/2016
Gare SNTV 23/02/2016
Chaâbat Erras (2) 11/04/2016

3.1.3. Technique de prélèvement

- Se désinfecter les mains

- Sortir le flacon stérile de son emballage et le plonger à l’horizontale. Le redresser
jusqu'à ce que le volume d’eau recueillie soit suffisant tout en gardant un volume
d’air dans le flacon pour permettre une agitation correcte avant l’analyse.
- Toutes les informations concernant le prélèvement (site, lieu, date, heure…) sont
mentionnées.

3.1.4. Transport des échantillons

Le transport des échantillons au laboratoire a été effectué dans un sac isotherme qui
permet de maintenir la température des prélèvements.

3.2. Recherche des germes

Les germes recherchés dans la présente étude sont Escherichia coli, Salmonella spp.,
Shigella spp. et Yersinia enterocolitica.

3.2.1. Dénombrement de la flore totale aérobie mésophile (FTAM)

Préparation des échantillons

Les échantillons étudiés ont été dilués avec de l'eau physiologique jusqu'à la dilution
10-6.

27
 MATERIEL ET METHODES

Dénombrement et Isolement

-4 -5
A partir des dilutions 10 ,10 et 10 -6, l'ensemencement a été effectué dans la masse sur
gélose PCA. Les boites ensemencées sont incubées à 30°C pendant 24 heures.

L'organigramme suivant représente le mode opératoire adopté:

Dilutions décimales 10-4,10-5 et 10-6

1 ml

Ensemencement dans la masse

sur PCA

Dénombrement de la FTAM
Incubation à 30°C/24h

Organigramme 1 : Etapes pour l’évaluation de la FTAM

3.2.2. Pré-enrichissement, enrichissement, isolement et identification

La recherche de ces germes est souvent compliquée par leur faible concentration dans
l’échantillon à analyser. Une première solution consiste en un enrichissement mécanique ou
physico-chimique lorsque cela est possible (centrifugation, précipitation au lait d’alumine).
Une deuxième solution plus fréquemment pratiquée consiste à utiliser des milieux
d’enrichissement (et parfois de pré-enrichissement) liquides qui permettent la multiplication
des germes avant leur isolement et identification. [45]

Pré-enrichissement

Le pré-enrichissement est destiné à revivifier les cellules de façon à faciliter la culture dans
les bouillons d’enrichissement. [45]

28
 MATERIEL ET METHODES

Cette étape concerne la recherche de Salmonella. Il est réalisé à l’aide de divers milieux,
par exemple le bouillon au mannitol ou le milieu eau peptonée tamponnée.

- Placer 1 ml de l’échantillon dans un volume adapté d’eau peptonée exempte d’indole

- Incuber à 37°C durant 18 à 24 heures.

Enrichissement

L’enrichissement en vue de l’isolement et de l’identification s’effectue sur des milieux

sélectifs, soit directement à partir du produit ou des dilutions, soit le plus souvent à partir du
milieu de pré-enrichissement.

- L’enrichissement des Shigella est réalisé conjointement avec celui des Salmonella.
Ainsi 1 ml du bouillon de pré-enrichissement (eau peptonée exempte d’indole) est
prélevé et placé dans un volume adapté de bouillon SFB et incubé à 37°C durant 16 à
20 heures.
- L’enrichissement des Yersinia est réalisé à 4°C pendant 7 à 15 jours en 1 ml de
l’échantillon mère dans un tube d’eau peptonée exempte d’indole.

Isolement

Les entérobactéries pathogènes peuvent être directement recherchées sur des milieux
sélectifs en boite de Pétri, soit directement, ce qui permet leur numération, soit après
enrichissement.

- E. coli

La recherche des souches d’E. coli se fait directement sans un enrichissement au préalable.
Ainsi à l’aide d’une anse de platine, une öse de l’échantillon mère bien agité est prélevée et
déposée sur le milieu BCP par des techniques de stries puis le tout est incubé pendant 24h à
37°C et à 44°C vu la thermotolérance de certaines souches d’E. coli.

29
 MATERIEL ET METHODES

- Salmonella et Shigella

La gélose Salmonella-Shigella (SS) est fréquemment utilisée dans la recherche de ces

germes. Ainsi une öse du bouillon d’enrichissement (SFB) est déposée par des stries sur la
gélose SS au préalable coulé dans des boites de Pétri puis incubé à 37°C pendant 24h.

- Yersinia enterocolitica

On réalise un isolement à partir du bouillon d’enrichissement sur gélose Mac Conkey ou

sur gélose DCL et incubation à 37°C pendant 24 heures.

Décontamination par KOH à 5% : On prend également 1ml du bouillon d’enrichissement

qu’on rajoute à 5ml de solution de KOH à 5%, on laisse pendant quelques secondes et on
isole sur gélose Mac Conkey ou DCL, et incubation à 37°C pendant 24 à 48 heures.

Examen macroscopique

L’observation de l’aspect macroscopique des colonies permet d’effectuer une première

caractérisation, avec une orientation possible des résultats au cours de l’identification.

D’après Joffin et Leyral, les éléments d’identifications macroscopiques sont:

- la forme des colonies : rondes, irrégulières,…etc.,

- la taille des colonies par la mesure du diamètre,
- la couleur de la colonie,
- l’élévation : convexe, concave, plate,
- l’opacité : opaque, translucide ou transparente,
- la surface : lisse, rugueuse, sèche, dentelée,…etc. [46]

Examen microscopique

L’observation microscopique consiste à observer les cellules bactériennes après une

coloration de Gram (Annexe 1) qui permet de connaitre la forme, la pureté ainsi que la nature
biochimique de la paroi des cellules purifiées.

30
 MATERIEL ET METHODES

Identification biochimique

L’identification et la classification des entérobactéries sont basées essentiellement sur

l’étude des caractères suivants, dont les principaux concernent la mobilité, l’utilisation des
sucres (dont particulièrement le lactose) et les caractères : indole, rouge de méthyle, Voges-
Proskauer, inositol (abandonné), citrate. [45]

Recherche de l’oxydase

Le disque de papier filtre imprégnés de réactif : l’oxalate de N-dimethyl paraphenylène

diamine, qui est incolore sous forme réduite et rouge-violet sous forme oxydée a été utilisé.

Déposer, sur une lame porte-objet propre, un disque « Ox » et l’imbiber avec une goutte
d’eau distillée ou d’eau physiologique stérile. Prélever une partie de la colonie à l’aide d’une
pipette Pasteur boutonnée stérile et l’étaler sur le disque. [10]

Recherche de la catalase

La catalase est une enzyme qui catalyse la dégradation du peroxyde d’hydrogène (H2O2),
produit toxique du métabolisme aérobie de nombreuses bactéries en H2O et ½ O2.

H2O2 H2O + ½ O2

Prendre une lame porte-objet propre. Déposer sur celle-ci une goutte d’eau oxygénée à 10
volumes et émulsionner un peu de la colonie suspecte ou de la culture obtenue sur gélose. [10]

Test de nitrate réductase

Le bouillon nitraté est un bouillon de culture permettant la recherche de l’utilisation de

l’ion nitrate par certains micro-organismes, notamment par respiration nitrate.

On met une ou deux gouttes dans du bouillon nitraté cultivé pendant 24 h à 37°C.
S’ils sont présents, ils donnent une coloration rose en présence d’acide sulfanilique et
d’ -Naphtylamine. Ces réactifs portent le nom de réactifs de Griess.

31
 MATERIEL ET METHODES

Recherche de l’utilisation du glucose, lactose, production de gaz et H2S sur

le milieu KIA ou TSI

Le milieu KIA ou TSI est utilisé principalement pour orienter l’identification des
entérobactéries (bacilles à Gram-). Il permet de permettre en 24 heures les fermentations du
glucose, du lactose et du saccharose (pour TSI), la production d’hydrogène sulfuré (H2S) et de
gaz provenant de la fermentation du glucose.

Ensemencer le culot du milieu par piqûre centrale et la pente en stries serrées, afin d’avoir
une culture en nappe avec la souche bactérienne à tester. Ne pas revisser à fond le bouchon du
tube. Incuber à 37°C pendant 24 heures.

Recherche de l’utilisation du citrate

Le milieu citrate de Simmons est un milieu solide qui permet de mettre en évidence
l’utilisation du citrate comme seule source de carbone et d’énergie. Seules les bactéries
possédant une citrate perméase seront capables de se développer sur ce milieu.

La pente du milieu est ensemencée par des stries sur toute la surface et incubé à 37°C,
pendant 24 heures. En cas de réaction négative, prolonger l’incubation de 24 heures.

Test de Mannitol Mobilité

Le milieu mannitol mobilité est un milieu semi solide qui permet d’étudier simultanément
la dégradation du mannitol (la dégradation en anaérobiose conduit à la formation de fructose
qui est un produit de dégradation du mannose) et la mobilité.

L’ensemencement du milieu s’est fait par piqûre centrale jusqu’au fond du tube avec la
souche à tester à l’aide d’une anse de platine (fil droit sans boucle). Incubation à
37C° durant 24 heures.

Recherche de l’indole et mise en évidence de l’uréase et de la TDA

Le milieu urée-tryptophane, improprement appelé urée-indole est un milieu de culture

synthétique utilisé en bactériologie permettant la mise en évidence simultanée :

- De la production de l’indole (par hydrolyse du tryptophane par la tryptophanase)

- De l’hydrolyse de l’urée (par une uréase)

32
 MATERIEL ET METHODES

- De la désamination du tryptophane par le tryptophane désaminase

Ensemencer abondamment un milieu urée-indole avec quelques colonies de la souche à

étudier et incuber 24 heures à 37°C.

Test du Rouge de Méthyle (RM) et du Voges-Proskauer (VP)

Le milieu Clark et Lubs permet de rechercher les voies fermentaires des entérobactéries et
de différencier la fermentation « acides mixtes » et la fermentation « butylène glycolique ».

- Le test RM : permet la mise en évidence grâce au rouge de méthyle, de la fermentation

acide mixte par acidification du milieu glucosé après fermentation du glucose
- Le test VP : permet la mise en évidence de la production d’acetoïne (ou 3-hydroxy-
butanone) au cours de la fermentation butylène glycolique en présence d’une base
forte (soude ou potasse) et d’ -naphtol, l’acetoïne donne une coloration rouge en
milieu très oxygéné.

Ensemencer un milieu Clark et Lubs avec quelques gouttes de la suspension bactérienne et

étuver 24 à 48 heures à 37°C.

Après incubation le milieu est partagé en deux tubes pour réaliser les tests.

Recherche de la -galactosidase : test ONPG

Il s’agit d’une recherche particulière dans le cadre de l’étude de la dégradation du lactose,

dans le cas de bactéries lactose négatif (dans le but de préciser l’origine de l’incapacité à
utiliser le lactose).

Le test ONPG consiste à rechercher la présence de -galactosidase. On utilise comme

substrat, non pas le lactose, mais un autre -galactoside : l’ortho-nitro-phenyl-galactoside
(ONPG) qui présente l’avantage d’être hydrolysé en un produit coloré (l’orthonitrophenol
ONP). Ceci est possible car la -galactosidase n’est pas spécifique du lactose, mais des -
galactosides.

- Prélever une anse complète d’une culture bactérienne sur un milieu lactosé gélosé
(pente du milieu Kligler) et faire une suspension dense dans 0.5 ml d’eau distillée
stérile. La réaction est d’autant plus rapide qu’il y a plus de bactéries, donc plus
d’enzymes.

33
 MATERIEL ET METHODES

- Ajouter un disque ONPG (papier filtre stérile imprégné de tampon et d’ONPG

- Incuber au bain-marie à 37°C pendant un temps variant entre 15 à 30 minutes et
jusqu’à 24 heures au maximum, en raison de réactions tardives positives avec
certaines bactéries.

Galerie API 20E

L’identification est ensuite complétée par ensemencement sur galerie API 20E
(Appareillage et Procédé d’Identification) : la galerie API 20 E comporte 20 microtubes
qui contiennent chacun un milieu déshydraté différent.

On prélève une colonie bien isolée sur gélose nutritive et on réalise une
suspension homogène dans 5 ml de medium ou d’eau distillée. On inocule la galerie
selon la méthodologie recommandée par la notice technique (Annexe 4) . Les réactions
produites pendant la période d’incubation (24h à 48h à une température de 37°C) se
traduisent par des virages colorées spontanées ou révélés par l’addition des réactifs. On
fait la lecture et on interprète en se référant au catalogue analytique API (Annexe 4 ).

3.2.3 Profil électrophorétique de l’ADN total

Les souches ainsi identifiées vont subir une dernière caractérisation qui consiste à
l’établissement du profil électrophorétique de leur ADN total.

Extraction de l’ADN

L’extraction de l’ADN total a été réalisée à partir des colonies bactériennes cultivées sur
gélose nutritive. Les cellules ont été traitées à la protéinase K. L’équivalent d’environ 10 µl
de cellules (un öse métallique pleine) est mis en suspension dans 200 µl de tris HCl à 5mM
(pH 8.2) auquel est ajouté 10 µl de protéinase K à 1.3 mg/ml et le tout est centrifugé pendant
10 s à 13000 rpm. Ce mélange est incubé à 55°C pendant toute la nuit, puis la protéinase K est
dénaturée à 100°C pendant 10 min. A partir du surnageant contenant l’ADN, nous avons
effectué l’électrophorèse. [47]

Electrophorèse d’ADN sur gel d’agarose

Afin de vérifier la qualité de la réaction d’extraction, 6µl du surnageant additionné de 2µl

de tampon de charge ont été séparés par électrophorèse horizontale sur gel d’agarose

34
 MATERIEL ET METHODES

(Promega U.S.A) à 1 % dans lequel ont été ajouté 4µl de BET (10mg/ml-Promega). Ce gel a
été placé dans la cuve d’électrophorèse à 100 V pendant 20 min dans une solution de tampon
TBE (Tris-Borate EDTA 1X) préparé à partir de TBE 10X. La DNA ladder (Biomatik) a été
utilisé comme marqueur de poids moléculaire.

La visualisation a été faite sous UV à l’aide d’un imageur relié à une imprimante. La
présence de l’ADN est révélée grâce à la fluorescence du BET piégé entre les molécules.

35
RESULTATS ET
DISCUSSION
 RESULTATS ET DISCUSSION

Résultats
1. Dénombrement de la FTAM

Le dénombrement sur milieu PCA a été effectué à partir des dilutions 10 -4, 10-5 et 10-6. A
l’aide d’un compteur, seules les colonies dont le nombre compris entre 30 et 300 ont été prises
en compte.

Le nombre a été déterminé selon la formule suivante :

Nc = Nombre de colonies
Nc
N= avec V = Volume de l’inoculum V= 1ml
V× Fd Fd = Facteur de dilution

Les résultats sont donnés en UFC/ml dans le tableau suivant :

Tableau 5 : Valeurs moyennes en UFC/ml du dénombrement sur PCA

Echantillons Chaâbat Erssas 1 Chaâbat Erssas 2 SNTV

UFC/ml 1.14 106 13.8 106 5.54 106

2. Aspects culturaux
2.1. Examen macroscopique
Sur milieu BCP, plusieurs colonies de tailles variables entre 1- 4mm de diamètre se sont
formées, de couleurs violette et jaune présentant des aspects différents (rugueuses,
lisses, contour régulier) aussi bien à 37°C qu’à 44°C.

Colonies jaunes
lactose +

Figure 4 : Aspect des colonies sur BCP

36
 RESULTATS ET DISCUSSION

Sur milieu SS, des colonies transparentes (incolores), de taille comprise entre 1-3 mm
de diamètre présentant différents aspects ont été observées.

Colonies transparentes
lactose -

Figure 5 : Aspect des colonies sur milieu SS

Sur milieu DCL, les colonies observées avaient les aspects suivants :
- Colonies transparentes de petites tailles (1mm)
- Colonies transparentes de taille comprise entre 2-3 mm avec un centre noir
- Colonies roses brillantes de 2-3 mm de diamètre

Colonies transparentes
lactose -

Figure 6 : Aspect des colonies sur milieu DCL

Sur Mac Conkey, des colonies roses, incolores, de tailles variables présentant divers
aspects ont été observées.

A partir de chaque colonie présomptive, nous avons réalisé une coloration de Gram, des tests
de l’oxydase et de la catalase.

37
 RESULTATS ET DISCUSSION

2.2. Examen microscopique

L’examen microscopique après coloration de Gram, nous a permis d’observer différents

aspects de bacilles colorés en rose. Ce sont des bactéries Gram négatif.

3. Test de l’oxydase

L’absence de la coloration violette révèle un résultat négatif sur les disques d’oxydase.

Figure 7 : Révélation du test d’oxydase

4. Test de catalase

Toutes les colonies testées sont catalase positives dont la présence se manifeste par un
dégagement de bulles d’air dès leur contact avec l’eau oxygénée.

Figure 8 : Résultat du test de catalase

5. Test de nitrate réductase

Après l’ajout des réactifs Nit1 et Nit2, nous avons pu observer une coloration rouge du
milieu.

6. Recherche de l’utilisation du glucose, du lactose, de la production de gaz et H2S sur

milieu KIA et TSI

Après incubation du milieu KIA, nos souches ont présenté différents aspects.

38
 RESULTATS ET DISCUSSION

- L’utilisation du glucose se traduit par un virage au jaune du culot

- L’utilisation de lactose de traduit par un virage au jaune de la pente. Une pente rouge
désigne la non utilisation du lactose
- Une déformation de la gelosé désigne une production de gaz
- La production de H2S se traduit par un noircissement du milieu

Glu+ Glu+ Glu+

Lac- Lac+
Lac+
H2S+ H2S-
H2S-
Gaz- Gaz-
Gaz+

Figure 9 : Aspects des colonies testées sur le milieu KIA

7. Recherche de l’utilisation du citrate

L’utilisation du citrate se traduit par un virage au bleu du milieu. Certaines souches sont
citrate +, d’autres par contre sont citrate- donc pas d’utilisation du citrate (coloration verte).

CITRATE CITRATE
- +

Figure 10 : Aspect sur milieu citrate de Simmons

39
 RESULTATS ET DISCUSSION

8. Test du mannitol mobilité

Le virage de l’indicateur coloré rouge de phénol du rouge au jaune témoigne d’une

utilisation du mannitol. De plus la mobilité des souches est avérée par la formation de voiles
autour de la piqûre centrale avec un trouble du milieu. Les colonies testées présentaient divers
aspects. Certaines sont Mobilité + et mannitol+, Mobilité – et mannitol +, Mannitol –
mobilité – et d’autres mannitol – et mobilité +.

Mannitol Mannitol
+ –

Figure 11 : Aspect du milieu Mannitol-Mobilité

9. Recherche de l’indole et mise en évidence de l’uréase et de la TDA

La présence de l’uréase se traduit par virage au rouge du milieu urée-indole. Certaines

souches possèdent une uréase positive (coloration rouge), d’autres par contre n’en
possèdent pas (uréase –).

Figure 12 : Résultat du test de l’uréase

La présence de l’indole est révélée après ajout du réactif de Kovacs dans le milieu
urée-indole. La formation d’un anneau rouge témoigne de sa présence et un anneau
jaune son absence.

40
 RESULTATS ET DISCUSSION

Anneau rouge

Aspect négatif Aspect positif

Figure 13 : Aspect du test de l’indole

La TDA est mise en évidence après ajout du réactif de la TDA. Une coloration rouge
brun témoigne de la désamination du tryptophane.

Figure 14 : Aspect du test de la TDA

10. Le test de RM et du VP
La voie des acides mixtes est mise en évidence après ajout du réactif de RM dans le
milieu. Une coloration rouge désigne un RM+ c’est-à-dire une fermentation acide
mixte. Une coloration jaune est un résultat négatif. La plupart des colonies testées
étaient RM+. Par contre quelques-unes étaient RM-

RM + RM -

Figure 15 : Test du rouge de méthyle (RM)

41
 RESULTATS ET DISCUSSION

La voie du butylène glycolique est mise en évidence après ajout des réactifs VP I et
VP II. Une coloration rouge témoigne d’un VP+ et la réaction négative est révélée
par l’absence de la coloration rouge.

Les colonies que nous avons testées avaient les profils suivantes : (RM+ ; VP-), (RM- ;
VP+) et (RM- ; VP-).

11. Recherche de la B-galactosidase : test ONPG

Après incubation, les résultats sont négatifs pour les tubes incolores ONPG- et positif pour
les tubes jaunes ONPG+.

Figure 16 : Résultats du test d’ONPG

12. Galerie API 20 E

La galerie API 20 E, nous a permis d’affiner nos résultats dans l’identification des souches.
Au total 8 souches présomptives ont été retenues.

Les résultats obtenus après incubation sont les suivants :

Souche 1

Tableau 6 : Résultats de la galerie API 20 E de la souche 1

Tests ONPG ADH LDC ODC CIT H2 S URE TDA IND VP

Résultats + - + + - - - - + -
Tests GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA
Résultats + - + - + - - - - -

42
 RESULTATS ET DISCUSSION

A partir du catalogue analytique, il s’avère que la souche 1 correspond à Escherichia coli

Figure 17: Résultat de la galerie API 20 E de la souche 1

Souche 2

Tableau 7 : Résultats de la galerie API 20 E de la souche 2

Tests ONPG ADH LDC ODC CIT H2 S URE TDA IND VP

Résultats + - + + - - - - + -
Tests GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA
Résultats - + + - + + + + - +

A partir du catalogue analytique, il s’avère que la souche 2 correspond à Escherichia coli.

Figure18 : Résultat de la galerie API 20 E de la souche 2

Souche 3

Tableau 8 : Résultats de la galerie API 20 E de la souche 3

Tests ONPG ADH LDC ODC CIT H2 S URE TDA IND VP

Résultats + - + - - - - - + -
Tests GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA
Résultats - + + - + + - + - +

43
 RESULTATS ET DISCUSSION

La souche 3 correspond à Escherichia coli à 75% ODC + d’après le catalogue analytique.

Figure 19 : Résultat de la galerie API 20 E de la souche 3

Souche 4

Tableau 9 : Résultats de la galerie API 20 E de la souche 4

Tests ONPG ADH LDC ODC CIT H2 S URE TDA IND VP

Résultats + - - - + - - - - +
Tests GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA
Résultats - + + - + + + + + +

Avec son caractère IND-, SAC+, la souche 4 correspond beaucoup plus à Enterobacter
agglomerans.

Figure 20 : Résultat de la galerie API 20 E de la souche 4

Souche 5

Tableau 10 : Résultats de la galerie API 20 E de la souche 1

Tests ONPG ADH LDC ODC CIT H2 S URE TDA IND VP

Résultats - - - + + - + + - -
Tests GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA
Résultats + + - - - - - - - -

44
 RESULTATS ET DISCUSSION

A partir du catalogue, nous avons pu correspondre la souche 5 à la souche Proteus mirabilis.

Figure 21 : Résultat de la galerie API 20 E de la souche 5

Souche 6

Tableau 11 : Résultats de la galerie API 20 E de la souche 1

Tests ONPG ADH LDC ODC CIT H2 S URE TDA IND VP

Résultats - - - + + - + + - -
Tests GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA
Résultats + + - - - - - - - -

A partir du catalogue, nous avons pu correspondre la souche 6 à la souche Proteus mirabilis.

Figure 22 : Résultat de la galerie API 20 E de la souche 6

Souche 7

Tableau 12 : Résultats de la galerie API 20 E de la souche 7

Tests ONPG ADH LDC ODC CIT H2 S URE TDA IND VP

Résultats - - - + - - + + - -
Tests GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA
Résultats - + - - - - - - - -

45
 RESULTATS ET DISCUSSION

Avec un résultat positif à ODC, URE, TDA et GLU, nous avons pu correspondre la souche à
Proteus morganii à 97% IND+.

Figure 23 : Résultat de la galerie API 20 E de la souche 7

Souche 8

Tableau 13 : Résultats de la galerie API 20 E de la souche 8

Tests ONPG ODC ADH LDC CIT H2 S URE TDA IND VP

Résultats - - - - - - - - - -
Tests GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA
Résultats - - - - - - - - + -

Les résultats de la souche 8 de la galerie API 20 E ne nous permet pas de la faire

correspondre à aucune souche du catalogue analytique vu les résultats négatifs obtenus sur les
différents tests.

Figure 24: Résultat de la galerie API 20 E de la souche 8

En marge de la galerie API 20 E nous avons pu correspondre une colonie présomptive à

une souche de Pseudomonas spp. après isolement sur gélose nutritive et obtention d’un
pigment verdâtre.

46
 RESULTATS ET DISCUSSION

13. Profils électrophorétiques de l’ADN

L’électrophorèse du surnageant contenant l’ADN nous a permis d’établir les profils

électrophorétiques de 7 souches identifiées (Figure 25).

S1 S2 S3 M S4 S5 S6 S7

Figure 25: Profils électrophorétiques de l’ADN des souches

S1: E. coli S4: Enterobacter agglomerans

S2: E. coli S5 : Proteus mirabilis

S3: E. coli S6 : Proteus mirabilis

M: Marqueur de taille S7 : Proteus morganii

47
 RESULTATS ET DISCUSSION

Discussion
1. Dénombrement de la FTAM

Notre étude avait pour but principale, l’isolement et la caractérisation de certaines espèces
d’entérobactéries isolées à partir des eaux usées. Afin de procéder à notre isolement, une
étude au préalable a été faite pour évaluer la flore totale aérobie mésophile (FTAM) de nos
échantillons (eaux usées). Les résultats de la FTAM se situent entre 1.14 106 UFC/ml à 13.8
106 UFC/ml. Cela montre que les eaux usées sont chargées en bactéries. Nos résultats tendent
vers ceux de Baumont [40] qui trouva que les eaux usées contiennent en moyenne 107 à 108
bactéries/l. Il rajouta également que le nombre de germes pathogènes avoisinait les 104
bactéries/l. De plus, une étude réalisée en 2011 par Lezzar [48] sur les eaux usées d’oued
Rhumel qui a comme principal affluent oued Boumerzoug a fait état d’une FTAM avoisinant
les 1.8 105 UFC/ml. Cette charge élevée de bactéries pourrait sans doute s’expliquer par la
teneur en matière organique qui favorise la prolifération des bactéries mais aussi par la
contamination continue de ces eaux (rejets domestiques...) qui apporte à chaque fois une
nouvelle communauté de bactéries. Baumont [40] révèle que le nombre de germes peut être
multiplié par 1 000 dans les eaux de rivières après un rejet urbain.

2. Isolement et identification

Les milieux d’isolement spécifiques BCP, SS, DCL et Mac Conkey ont présenté une
sélectivité plus ou moins efficace qui a permis à de nombreuses colonies suspectes de cultiver
mais aussi plusieurs autres colonies ont pu croitre sur ces milieux.

L’isolement sur ces milieux spécifiques, nous a permis de tester les colonies présomptives
prélevées sur ces milieux. Ainsi la plupart des colonies testées présentaient une oxydase
négative, une catalase positive, une nitrate réductase positive et aussi la coloration de Gram
nous a montré des bacilles Gram négatif. Ces tests sont donc fondamentaux pour orienter le
diagnostic et classer les souches dans la famille des entérobactéries.

La fermentation du glucose sur milieu KIA est aussi un élément important qui définit les
entérobactéries et les différentie des autres bacilles Gram- non fermentaire. Ainsi toutes nos
souches testées fermentaient le glucose.

48
 RESULTATS ET DISCUSSION

Les résultats de l’identification biochimique par la galerie classique des souches

présomptives montrent qu’elles sont des bacilles à Gram négatif, oxydase négative,
catalase positive avec des variations concernant la mobilité, l’utilisation des sucres (dont
particulièrement le lactose) et les caractères : indole, rouge de méthyle, Voges-Proskauer,
citrate.

Ces tests nous ont permis de sélectionner 8 souches présomptives dont l’identification a
révélé sur galerie API 20 E : 3 souches d’Escherichia coli qui diffèrent par l’utilisation des
sucres (RHA, SAC, MEL, AMY, ARA), 1 souche d’Enterobacter agglomerans, 2 souches de
Proteus mirabilis et 1 souche de Proteus morganii. La dernière souche n’a pas pu être
identifiée.

De plus des espèces de Pseudomonas spp. ont également été trouvées présentant une
oxydase positive ainsi qu’une pigmentation verdâtre sur gélose nutritive. Elles ont été aussi
retrouvées en 2015 par Pierre [30] dans leurs travaux sur la recherche de Vibrio dans les eaux
usées d’oued Boumerzoug.

Parmi les germes recherchés seules les Escherichia coli se sont révélés présentes vu leurs
caractères ubiquitaire ainsi que leur facilité de culture.

L’absence des Salmonella spp., Shigella spp. et Yersinia enterocolitica dans notre
recherche ne signifie en aucun cas leur inexistence. Bien au contraire la présence de ses
germes a été confirmée par les travaux de El Ouali [49] en 2014 ainsi que Bitton [41]

L’absence des salmonelles a été observée également par les mêmes travaux de El Ouali
[49] sur le contrôle microbiologique des eaux usées domestiques et industriels de la ville de
Fès au Maroc dans certains points de prélèvements.

Les données bibliographiques relatives à ce sujet sont très variées car la concentration de
ces bactéries pathogènes dans les eaux usées dépend des conditions épidémiologiques et
environnementales des régions où sont réalisées les études. [49]

49
 RESULTATS ET DISCUSSION

Ainsi l’absence de ces germes pourrait s’expliquer par un certain nombre d’hypothèses :

- Une fois rejetées dans le milieu naturel, ces bactéries se trouvent confrontées à des
conditions défavorables telles que la limitation en nutriments, le stress osmotique, de
faibles températures et des variations de pH ainsi que face à de multiples prédateurs.
Une partie de ces bactéries peuvent survivre à ces conditions défavorables en entrant
dans l’état VBNC [50]. En effet, de nombreuses publications montrent qu’après leur
introduction dans un milieu aquatique naturel, les bactéries fécales perdent assez
rapidement leur faculté de croître dans/sur les milieux spécifiques utilisés pour
leur dénombrement mais conservent beaucoup plus longtemps certaines activités
métaboliques.[50] [51] [52] [53]
- Elle peut s’expliquer également par le caractère instantané des prélèvements,
l’absence de porteurs de germe. En effet, la survie des bactéries d'origine
anthropique dans l'environnement ne dépend pas uniquement de la qualité du milieu
récepteur, mais également de leur historique avant rejet. [49]

Les autres espèces que nous avons identifiées à savoir Enterobacter agglomerans, Proteus
mirabilis et Proteus morganii font également partie des espèces isolées souvent dans les eaux
usées et sont fréquemment diagnostiquées en pathologie infectieuse humaine.

3. Profils électrophorétiques

L’extraction d’ADN des souches ainsi que leur électrophorèse sur gel d’agarose a permis
d’obtenir des bandes fluorescentes après observation sous UV. Cette fluorescence témoigne
donc de l’efficacité de la méthode d’extraction qui fut utilisée chez les bactéries nodulantes
Rhizobium dans les travaux de Laguerre [47].

Ces profils ainsi obtenus ne nous permettent de tirer d’avantages d’information concernant
certains aspects de nos souches comme le poids moléculaire. Néanmoins, cela reste une
initiative à l’indentification des bactéries par les techniques de biologie moléculaire qui vont
leur apparition ces dernières années dans ce domaine.

50
CONCLUSION
 CONCLUSION

Conclusion
Les entérobactéries sont des bacilles à Gram négatif qui constituent une part importante
des bactéries isolées lors du diagnostic bactériologique des infections humaines. Leur
abondance dans l’intestin, leur mobilité, leur rapidité de multiplication, leur fréquente
résistance aux antibiotiques expliquent qu’elles soient les bactéries les plus impliquées
en pathologie infectieuse humaine.

Les eaux usées constituent un milieu aquatique rassemblant l’essentiel des rejets
domestiques. Par leur richesse en matière organique, ils constituent un environnement
favorable pour la prolifération des bactéries.

La presente étude s’est intéressée à la recherche et la caractérisation de quelques

entérobactéries pathogènes dans les eaux usées d’oued Boumerzoug.

Il ressort de cette étude après évaluation de la FTAM que ces eaux usées sont une véritable
niche écologique pour les bactéries vu la charge très élevée de ces dernières.

Parmi les germes recherchés, seules les souches d’E. coli se sont révélées présentes et les
plus fréquentes. L’absence des Salmonella spp., Shigella spp. et Yersinia enterocolitica dans
notre recherche ne signifie en aucun cas leur inexistence. Leur absence pourrait s’expliquer
par un certain nombre d’hypothèse parmi elle, le faible nombre de nos échantillons.

Outre les germes recherchés, nous avons pu mettre en évidence la présence d’autres souches
d’entérobactéries qui pourraient s’avérer pathogènes.

Une initiation à l’étude moléculaire nous a permis également de réaliser une extraction
ainsi que des profils électrophorétiques de l’ADN total des souches isolées.

Les résultats préliminaires obtenus dans le cadre de cette étude nous permettront de penser
aux perspectives suivantes :

- Etaler notre étude sur une large zone (plusieurs sites) pendant une période
longue avec plusieurs prélèvements.
- Déterminer les sérotypes
- Etudier l’antibiorésistance des germes recherchés
- Réaliser une étude moléculaire variée (PCR, RLFP, Profils de restriction…)
- Comparer les souches avec celles isolées dans les milieux hospitaliers.

51
 REFERENCES
BIBLIOGRAPHIQUES
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ANNEXES
 ANNEXES

ANNEXE 1 : Coloration de Gram

1. Prélèvement
A partir d’une culture liquide : prélever un aliquote de suspension à l’anse (ou à la
pipette stérile) après avoir homogénéisée le milieu
A partir d’un milieu solide : réaliser une suspension en eau physiologique à partir
d’une culture jeune et prélever un aliquote de suspension à l’anse de platine (ou à
la pipette stérile)
A partir de produits alimentaires ou biologiques : prélever un aliquote du produit
(dilué ou non) à l’anse (ou à la pipette stérile) après avoir homogénéisée le milieu

2. Réalisation du frottis

Etaler sur 1 à 2 cm par un mouvement circulaire en partant du centre de la lame.

Le frottis réalisé doit être :

- MINCE et HOMOGENE, étendu sur la lame sans toucher les bords
- Réalisé sur une lame propre et dégraissée, une goutte d'eau déposée en surface
doit s'y étaler complètement.

3. Séchage
- à la température du laboratoire, si possible
- ou bien à chaleur douce : platine chauffante à 37° ou au-dessus de la veilleuse du
bec bunsen, à hauteur suffisante. NE JAMAIS CHAUFFER BRUTALEMENT

4. Fixation
But : tuer les bactéries, fixer leur structure cytologique, et les faire adhérer à la lame.

Fixation par la chaleur :

- à utiliser seulement pour les frottis effectués à partir de cultures bactériennes
- passer la lame-frottis situé sur le dessus dans la flamme chauffante,
LENTEMENT et 3 à 4 fois de suite (attention de bien tenir la lame avec une pince) et
laisser refroidir.

Fixation par l'alcool : employé quel que soit le produit traité.

 ANNEXES

- recouvrir la lame pendant 5 min avec de l’alcool puis rincer à l’eau déminéralisé et
égoutter le frottis avant coloration.

5. Coloration

Principe: La coloration permet de distinguer les bactéries GRAM + des GRAM – grâce à
leurs différences de nature de paroi.

ETAPES MODE OPERATOIRE TEMPS PRINCIPE

- Recouvrir la lame de cristal violet ou Le colorant violet pénètre dans
COLORATION violet de gentiane les cellules bactériennes
PRIMAIRE - Rincer à l’eau distillée et récupérer le
cristal violet dans un bêcher (ne pas le 1 minute
jeter dans le bac à coloration)

- Recouvrir de Lugol Il se forme un complexe chimique

MORDANÇAGE - Rincer à l’eau distillée et l’égoutter entre le violet et le Lugol qui fixe
1 minute le violet et colore le cytoplasme
de toutes les bactéries en violet.

-Tenir la lame inclinée et faire couler L'alcool dissout le violet de

pendant quelques secondes de l'alcool à gentiane, si la paroi bactérienne
95° jusqu'à écoulement incolore. est perméable à l'alcool (les
DECOLORATIO lipides sont dissous par l’alcool),
- Rincer immédiatement à l’eau celui-ci pénètre dans les
N
distillée et égoutter 5 secondes bactéries et décolore leur
environ cytoplasme : les bactéries
deviennent incolores.
Si les bactéries ont une paroi
imperméable à l'alcool (épaisse et
sans lipides), elles restent colorées
en violet et elles sont dites
GRAM + ou positif.
- Recouvrir la lame de fuschine La fuschine recolore en rose les
COLORATION bactéries précédemment
SECONDAIRE - Rincer à l’eau distillée 1 minute décolorées : les bactéries Gram –
ou négatif.

SECHAGE - Egoutter entre 2 morceaux de papier-

filtre et laisser sécher
 ANNEXES

ANNEXE 2: Milieux de Culture

Milieu Gélose Plate Count Agar (PCA)

Tryptone………………………………………………………….5 g/l
Extrait autolytique de levure………………………………….….2.5 g/l
Glucose……………………………………….…………………..1g/l
Agar agar…………………………………………………………15g/l
pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C: 7,0 +/- 0,2.

Milieu Eau peptonée exempte d’indole

Tryptone …………………………….……………………….. 10g/l

Chlorure de sodium ………………….……………………….. 5g/l
pH final à 25°C : 7,3 0,2

Milieu Gélose nutritive

Extrait de viande …………..……………..………………… 1,0 g/l

Extrait de levure ……………………………………………… 2.5 g/l
Peptone ………………………………………….…….… 5,0 g/l
Chlorure de sodium …………………………………………… 5,0 g/l
Agar …………………………………………………….... 15, 0 g/l
pH ……………………………………………..………… 7, 0

Milieu Gélose lactosée au pourpre de bromocrésol (BCP)

Peptone........................................................................................5g/l
Extrait de viande.........................................................................3g/l
Lactose……................................................................................10g/l
BCP ...........................................................................................0,025g/l
Agar .....................................................................................15g/l
pH final = 7
 ANNEXES

Milieu Gélose Désoxycholate Citrate Lactose (DCL)

Extrait de viande .....................................................................5 g/l

Peptone bactériologique...........................................................5 g/l
Désoxycholate de sodium ......................................................5 g/l
Thiosulfate de sodium ...........................................................5,4 g/l
Citrate ferrique.…………………………...………………….1 g/l
Citrate de sodium.....................................................................8,5 g/l
Lactose....................................................................................10 g/l
Rouge neutre...........................................................................0,02 g/l
Agar……................................................................................12 g/l
pH final = 7,3

Milieu Gélose Salmonella-Shigella (SS)

Extrait de viande de bœuf .....................................................5g/l

Polypeptone...........................................................................5g/l
Sels biliaires ........................................................................8,5g/l
Thiosulfate de sodium ........................................................8,5g/l
Citrate ferrique……………………………………….......... 1g/l
Citrate de sodium .................................................................10g/l
Lactose ..................................................................................10g/l
Vert brillant ……………………..……………………….…0,00033g/l
Rouge neutre …………………………………………..…..0,025g/l
Agar ……..............................................................................13,5g/l
pH final = 7,0

Milieu Gélose T S I

Mélange de peptones ………………………………………….18g/l

Extrait de levure …………………………………………….3 g/l
Extrait de viande……………………………………………… 4 g/l
Lactose………………………………………………………….10g/l
Saccharose ……………………………………………………..10g/l
D-glucose...……………………………………………………. 1g/l
Chlorure de sodium ………………………………………….. 5g/l
 ANNEXES

Citrate d’ammonium ferrique ……………………………..0.3g/l

Thiosulfate de sodium………………………………………… 0.3g/l
Rouge de phénol ….……………………………………………0.025g/l
Agar ……………………………………………………………14g/l
pH final : 7,4 ± 0,2

Milieu Kligler-Hajna

Extrait de viande de bœuf............................................................3 g/l

Extrait de levure...........................................................................3 g/l
Peptone........................................................................................20 g/l
NaCl............................................................................................5 g/l
Citrate ferrique............................................................................0,3 g/l
Thiosulfate de sodium.................................................................0,3 g/l
Lactose........................................................................................10 g/l
Glucose........................................................................................1 g/l
Rouge de phénol..........................................................................0,05 g/l
Agar............................................................................................12 g/l
pH = 7,4

Milieu Mannitol-Mobilité

Peptone …………………………………………………… 20g/l

Nitrate de Potassium ………………..…………………….. 1g/l
Mannitol …………………………..……………………… 2 g/l
Rouge de Phénol à 1% …………….. …………………..… 4ml
Agar ……………………………….…………………….. 4 g/l
pH=8, 1

Milieu Citrate de Simmons

Sulfate de Magnésium ………………………….……….. 0,2g/l

Phosphate mono ammoniaque …………………………… 1g/l
Phosphate dipotassique ………………….………………. 1g/l
 ANNEXES

Citrate de Sodium …………………..………………… 2g/l

NaCl .....................................................................…... 5g/l
Bleu de bromothymol ………………..………………. 80mg/l
Agar …………………………………………………. 12g/l
pH=6,8

Milieu Urée-indole

L-tryptophane ………………………..…………….... 3g/l

Phosphate monopotassique ……………...…………... 1g/l
Phosphate bipotassique ………………...……………. 1g/l
NaCl ………………………………………...……..… 5 g/l
Urée …………………………………..……………... 20 g/l
Alcool 95° ………………………………….………… 10ml
Rouge de phénol ………………………..…………... 25ml
pH=6,7

Milieu Clark et Lubs

Peptone trypsique......................................…………....5 à 7g/l

Glucose………………...………………….……….…5g/l
Phosphate bipotassique…………………………….…5g/l
pH = 7

Bouillon Nitraté

Infusion cœur-cervelle………………..…………….. 25,0g/l

Nitrate de sodium……………….…………..………10, g/l
pH = 7,2
 ANNEXES

ANNEXE 3 : Réactifs utilisés

Réactif de la recherche de l’oxydase

Disques imprégnés d’une solution à 1% de chlorhydrate de

Tétraméthylparaphénylènediamine.

Réactif de Kovacs

P-dimethyl aminobenzaidéhyde…………………………..…………… 7g/l

Alcool amylique…………………………………………………………75ml
Acide chlorhydrique concentré ………………………………………20ml

Réactif de Voges-Proskauer

VP I
Hydroxyde de Potassium……………………………………………….40g/l
Eau………………………………………………………………………100ml

VP II
-naphtol …………………………..………………………………… 6 g/l
Ethanol ……………………………………..……………………… 100ml

Réactif TDA

Perchlorure de fer ….……………………………………………….. 3,4g/l

Eau distillée stérile ……………………………………………… 100ml

Réactif pour la recherche de la Nitrate réductase (NR)

Réactif I
Acide sulfanilique……………..……………………………………..0,8g/l
Acide Acétique 5N………………………………………………… 100ml

Réactif II
 ANNEXES

Naphtylamine………………………………………………………. 0,5 g/l

Acide acétique 5N …………………………………………………..100ml

Solution de l’eau oxygénée à 10 % :

Eau oxygénée à 10 V….………………………………………………0,5ml

Eau distillée ...…………………………………………………………14,5ml

Composition de la solution tampon Tris – Borate – EDTA

TRIS (89 mM)…………………………………………….10,78 g

Acide borique (89 mM)……………………………………5,50 g

EDTA (2 mM)……………………………………………..0,58 g

Eau distillée………………………………………………..1000ml

pH = 8 ,2

Gel d’agarose

Tampon TBE………………………………………………100ml

Agarose…………………………….………………………0,8 g
 ANNEXES

ANNEXE 4 : Galerie API 20 E

Inoculation de la galerie API 20 E

- Avec la suspension bactérienne et la pipette ayant servi au prélèvement, remplir tubes

et cupules des tests
CTI VP GEL

- Remplir uniquement les tubes (et non les cupules) des autres tests.

- Créer une anaérobiose dans les tests ADH, LCD, ODC, URE, H2S en remplissant leur
cupule d’huile de paraffine.

- Refermer la boîte d’incubation et la placer dans l’étuve à 35 - 37° C pendant 18 à 24

heures
 ANNEXES

Tableau d’identification de la galerie API 20 E

REACTIONS
TUBE POSITIVE NEGATIVE COMMENTAIRES
Une teinte jaune pâle est souvent
ONPG Jaune Incolore obtenue, la considérer comme une
réaction négative.
ADH Rouge ou Jaune Jaune
LDC Rouge ou Jaune Jaune
ODC Rouge ou Jaune Jaune
CIT Turquoise ou bleu Vert pâle ou jaune La lecture se fait dans la partie
foncé supérieure de la cupule (en aérobie)
H2 S Dépôt noir Aucun dépôt noir
URE Rouge ou Jaune Jaune
TDA Brun-rouge Jaune Ajouter 1 goutte de chlorure de fer
à 10%. Lire immédiatement la
réaction
IND Anneau rouge Jaune Ajouter 1 goutte du réactif de
James. Lire la réaction
immédiatement
VP Rose foncé ou Incolore ou rose Ajouter 1 goutte de KOH à 40%
rouge pale puis 1 goutte d’alpha-naphtol à 6%.
Lire la réaction après 10 minutes.
GEL Diffuse du pigment Aucune diffusion, La répartition des particules solides
incolore à travers la cupule doit être
considérée comme une réaction
négative.
GLU La fermentation des sucres
MAN commence dans la partie la plus
INO anaérobique du microtube (partie
SOR Jaune Bleu ou bleu-vert inferieure). Il faut lire ces réactions
RHA à partir de la base de la cupule vers
SAC le haut. Une couleur jaune au fond
MEL indique une réaction positive
AMY
ARA
 Année universitaire : 2015/2016 Présenté par : SAVADOGO Mahamadi
BOUBKEIR Youssouf

Isolement et Etude de quelques Entérobactéries pathogènes dans

les eaux usées d’Oued Boumerzoug à Constantine

Mémoire en vue de l’obtention du diplôme :

Master en Microbiologie Générale et Biologie Moléculaire des Microorganismes
Résumé
Les eaux usées sont susceptibles de renfermer et de véhiculer une grande variété d’agents pathogènes
pour l’homme. Les organismes pathogènes présents dans les eaux usées d’une collectivité, en reflètent l’état
sanitaire.
Les entérobactéries représentent une des principales familles de bacilles à Gram négatif se retrouvant
partout y compris les eaux usées. Ce sont les plus impliquées en pathologie infectieuse humaine surtout en
milieu hospitalier.
Notre travail s’inscrit dans le cadre de la recherche et l’étude de quelques entérobactéries pathogènes
dans les eaux usées d’oued Boumerzoug. Ainsi une évaluation préalable de la FTAM a été effectuée sur nos
échantillons avant de procéder à des isolements sur milieux spécifiques ainsi qu’une identification par des
méthodes microbiologiques standardisées puis une réalisation de profils électrophorétiques de l’ADN total
des souches identifiées.
Sur trois échantillons étudiés, les résultats de la FTAM varient entre 1.14 106 et 13.8 106 UFC/ml qui
témoignent d’une charge microbienne importante des eaux usées. Quant à l’isolement, sur un total de quatre
germes recherchés, nous avons pu isoler et identifier 3 souches d’E. coli et une absence de Salmonella spp. ,
Shigella spp. et Yersinia enterocolitica a été observée. Par contre d’autres germes ont été isolés comme
Proteus mirabilis, Proteus morganii, Enterobacter agglomerans et Pseudomonas sp. . Les profils
électrophorétiques de l’ADN total des souches identifiées ont été aussi obtenus.
La presente étude nous a permis de récolter des données locales relatives à la présence de pathogènes et
des indicateurs de contamination fécale tels qu’E. coli. et une contribution à l’extraction de l’ADN total
des souches isolées.

Mots clés : Entérobactéries, eaux usées, Oued Boumerzoug, FTAM, isolement

Laboratoire de recherche : Laboratoire de Microbiologie (Laboratoire 11) de la FSNV (UFM-C)

Jury d’évaluation :
Présidente du jury : Mme BOUBEKRI K. (MCA - UFM Constantine)
Rapporteur : Mme BOUZERAIB L. (MAA - UFM Constantine)
Examinatrice : Melle MEZIANI M. (MAA - UFM Constantine)

Date de soutenance : 28/06/2016