Université Mouloud Mammeri de Tizi-Ouzou

Faculté des Sciences Biologiques et des Science Agronomiques

Département de Biochimie-Microbiologie

Spécialité : Biochimie appliquée

Module : Biochimie appliquée aux industries agroalimentaires

TP n °03 : extraction du l’invertase et

dosage des sucres réducteurs

Réalisé par : Chargé du TP :

 MEHANI Lynda  Mme ZENNIA

 BENYAHIA Hiba
 BOUAZIZ Hassina

Année universitaire : 2024/2025

Introduction général :
L'invertase, découverte en 1833, est une enzyme glycoprotéique de haut poids moléculaire qui
joue un rôle crucial dans l'hydrolyse du saccharose, un disaccharide composé de glucose et de
fructose, en ses deux composants simples. Ce processus, connu sous le nom d'inversion, est
fondamental dans divers secteurs, notamment l'industrie alimentaire, où l'invertase est
largement utilisée pour produire des sirops sucrés. Le mélange de glucose et de fructose
obtenu est non seulement plus sucré que le saccharose, mais il offre également une meilleure
stabilité et une plus grande résistance à la cristallisation, ce qui en fait un ingrédient de choix
dans la fabrication de bonbons et de confiseries. En boulangerie, l'invertase améliore la texture
des pains et pâtisseries tout en prolongeant leur durée de conservation. Naturellement
présente dans certaines plantes, comme les raisins et les melons, ainsi que dans des espèces de
levures telles que Saccharomyces cerevisiae, qui la produisent lors de la fermentation des
sucres, l'invertase existe sous plusieurs formes (acides et neutres) et est inhibée aux pH alcalins.
Bien que son utilisation soit généralement considérée comme sûre, il est essentiel de respecter
les réglementations en matière de sécurité alimentaire pour garantir un usage approprié et
éviter toute contamination, faisant ainsi de l'invertase un acteur clé dans la transformation des
aliments et l'innovation dans le secteur agroalimentaire. Par quelle méthode on peut extraire
l’invertase à partir de la levure de boulangère et déterminer les paramètres cinétiques qui
influencent la vitesse de la conversion du saccharose en sucres réducteurs ?

Objectif du TP :
Extraction et purification de l'invertase à partir de levure boulangère et d'étudier son activité
en mesurant la quantité de sucres réducteurs (fructose + glucose) formés au cours de la
réaction ainsi que d'analyser les paramètres cinétiques qui influencent cette réaction.

Principe du TP :
La levure Saccharomyces cerevisiae, communément désignée comme levure de boulanger, est
particulièrement performante dans la production d'invertase. Cette espèce produit l'enzyme
sous deux formes : l'une intra cytoplasmique et l'autre extracellulaire.
 Une invertase externe (située dans la paroi). C'est la forme prédominante. Sa masse
molaire est de l'ordre de 270 000 [Link]-1 constituée de 50 % de protéine et de 50 % de
mannane. La partie glucidique n'est pas indispensable à l'activité catalytique, mais elle
augmente la stabilité.
 Une invertase interne (vacuole). Elle représente un faible pourcentage de l'invertase
totale. Ella a les mêmes caractéristiques cinétiques que l'invertase externe. Sa masse
molaire est de l'ordre de 135 000 [Link]-1 (il n'y a pas de partie glucidique).

L’invertase ou -D-fructosidase ou encore -D-Fructofuranoside Fructohydrolase (EC : [Link])

ou a-D-Fructofuranosidase est une hydrolase qui agit sur des glucides comme substrat .Le
saccharose (disaccharide non réducteur) qui est
le (a-glucopyranosyl 1 – 2-D-Fructofuranoside)
reste le substrat idéal de l'invertase. En
l'hydrolysant l’enzyme produit un mélange
équimolaire de glucose (B-D-Glucopyranose) et
Fructose (B-D-Fructofuranose), à goût très
sucré, appelé sucre inverti, car, il en résulte une
inversion du pouvoir rotatoire de la solution
d’où le nom d’invertase. La solution de
saccharose étant dextrogyre alors que le
mélange (Glucose +Fructose) est lévogyre.

Le dosage des sucres réducteurs par la méthode de Fehling repose sur la capacité de ces
sucres à réduire des composés chimiques en milieu alcalin. Dans ce contexte, l'acide 3,5-
dinitrosalycilique, qui est initialement de couleur jaune, est réduit en acide 3-amino-5-
nitrosalicylique, un produit qui présente une coloration rouge orangé à reflets pourpres. Cette
transformation chimique se produit lorsque les sucres réducteurs présents dans l'échantillon
réagissent avec l'acide 3,5-dinitrosalycilique, entraînant l'oxydation des glucides et la formation
des produits d'oxydation correspondants. La réaction est facilitée par le chauffage et
l'environnement alcalin, qui favorisent la réduction du composé. La mesure de la concentration
de l'acide 3-amino-5-nitrosalicylique formé peut être réalisée par spectrophotométrie à une
longueur d'onde de 530 nm, permettant ainsi de quantifier les sucres réducteurs présents dans
l'échantillon en fonction de l'intensité de la couleur développée. Cette méthode est largement
utilisée en biochimie pour l'analyse des glucides, car elle offre une approche simple et efficace
pour déterminer la présence et la concentration de sucres réducteurs dans divers échantillons.

Matériels et méthodes
Matériels :
Solution Verrerie Appareils Autres
_Solution de _Éprouvette _La balance _Tube a centrifuge
saccharose _Bêcher _Spectrophotomètre _Pissette
_Solution de glucose _Pipette gradué 1ml (UV-Visible) _Spatule
_Réactif (3,5 DNS) _Pipette gradué 10ml _ Centrifugeuse _Micropipette
_Eau distillée _Tube à essai _Bain marie (1000µl)
_Eau de robinet _ le vortex _Embout
_Cuve de spectro
_portoirs
 Méthodes :
1. Extraction de l'invertase de la levure de boulangerie :
 Pesez 0,5 g de levure boulangère puis ajoutez 20 ml d'eau distillée froide.
 Agitez de façon à obtenir une suspension homogène (5min).
 Centrifugez cette suspension à 4000 pendant 20 min.
 Récupérer le surnageant contenant de l'invertase.
2. préparation des solutions de substrat (saccharose):
À partir d'une solution mère de saccharose à 100g/L (342g/mol), préparer deux solutions de
saccharose dilué à 1/100 et 1/1000
 Dans un tube à essai, mettre 9ml d'eau distillée et 1ml de la solution mère de
saccharose à concentration connue (100g/L) --> Solution A (10-¹).
 Dans un autre tube, prendre 1ml de la solution A et ajouter 9ml d'eau distillée-->
Solution B (10-²).
 Dans le 3eme tube, prendrez 1ml de la solution B et ajouter 9ml d'eau distillée -->
Solution C (10-³).
3.
 Dans deux tubes a essais, introduire 0.5ml de chaque solution de saccharose diluée B, C
 Ajouter 0.5ml de surnageant contenant de l'invertase dans chacun de ces 2 tubes
 Mélanger les tubes et les porter à la température optimale de l'enzyme de 37°C pendant
10min (au bain -marie)
 Plonger ensuite les 2 tubes dans un bain marie bouillant (100°C) pendant 10min afin
d'arrêter la réaction enzymatique.
4. Dosage des sucres réducteurs :
a. Gamme étalon :
 On prépare tous d'abord une gamme d'étalonnage
 On prépare 6 tubes à essai avec la solution mère de glucose à 1g/l deux tubes pour les
échantillons inconnus (dilutions) comme indique le tableau suivant :

N° du tube 01 02 03 04 05 06 Ech1 (10-²) Ech 2(10-³)

Solution de glucose (ml) 0 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,5 0,5

Eau distillée 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0

Réactif DNS (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2

[Link] opératoire :
A tous les tubes (gamme d'étalonnage+ dilutions (10-² et10-³)
 Ajouter 2ml du réactif (3,5 DNS).
 Placer les tubes au bain marie bouillant pendant 5 min.
 Récupérer les tubes et Refroidir par écoulement d'eau sous le robinet.
 Ajouter 7 ml d'eau distillée et homogénéiser.
 Laisser reposer pendant 15 min à température ambiante.
 Passer au spectrophotomètre pour faire la lecture à 530 nm.
 Passer tous d'abord le blanc ensuite appuyer sur le zéro ensuite fait passer les autres
tubes.

Résultats et discussion :
-Apparition d’une couleur rouge-orange lors de l'ajout du réactif de DNS (dinitrosalicylique) aux
tubes qui continent la solution du glucose ainsi que les tubes qui continent les solutions de
saccharose diluée à 1/100 et 1/1000 est due à une réaction chimique entre le réactif et les
sucres réducteurs présents dans ces solutions.
Explication: Les sucres réducteurs, comme le glucose et le fructose, possèdent un groupe
carbonyle (C=O) qui peut être oxydé. Lorsqu'ils sont chauffés avec le réactif de DNS, ce groupe
carbonyle réagit avec le DNS.
Donc: La réaction conduit à l'oxydation des sucres et à la réduction du DNS, ce qui entraîne la
formation d'un composé coloré, typiquement de couleur rouge-orange. Cette couleur provient
de la formation d'un dérivé de l'acide aminé, résultant de l'interaction entre le DNS et les
produits d'oxydation du sucre.
-L'intensité de la couleur formée est proportionnelle à la concentration de sucres réducteurs
(glucose et fructose) dans la solution. Plus, il y a de sucres réducteurs, plus la couleur sera
intense.

 DO obtenues:

Numéro 01 02 03 04 05 06 éch éch

du tube 01 (10-²) 02(10-³)
DO 0 0.098 0.225 0.369 0.509 0.631 0.441 0.081
  La courbe étalon DO= f (concentration en glucose):
- On calcule d’abord la concentration en glucose:
Exemple :
1g/l de glucose ------------- > 01 ml de la solution mère 0.2 x 1

X ------------- > 0.2 ml de glucose --------- = 0.2 g/l

Numéro du tube 01 02 03 04 05 06
Concentration 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
du glucose (g/l)

DO
0.7

0.6 f(x) = 0.621272727272727 x

R² = 0.998317119396797
0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

DO= f (concentration en glucose)

-Le graphe présente une courbe d'étalonnage de la densité optique (DO) en fonction de la
concentration d'une solution de glucose (g/l), où la DO est proportionnelle à la concentration
(DO augmente avec l'augmentation de la concentration de la solution de glucose).
-La droite d'étalonnage permet de déterminer la concentration d'échantillons (sucre réducteur)
dont on connaît l'absorbance.
 - Le coefficient de corrélation R²=0,9951 est proche de 1 celà signifie que la droite (la Courbe
d'étalonnage) passe presque par tout les points de distribution (signifie que l'équation de la
droite de régression est capable de déterminer 100% de la distribution des points).
 Calcul des différentes concentrations en sucres réducteurs obtenues pour chaque
dilution:
Pour l’échantillon 01(10-²):

DO 0.441
DO= a x C C= = = 0.709 x 100 = 70,90 g/l
a 0.6213

-Soit en mol/l:

70.9
C= = 0.393mol/l
180

Pour l’échantillon 01(10-³):

DO 0.081
DO= a x C C= = = 0.130 x 1000 = 130 g/l
a 0.6213

-Soit en mol/l:

130
C= = 0.722mol/l
180

 Calcul de la vitesse:

dp
Vi=
dt

Pour l’échantillon 01(10-²):

0.393
Vi= = 6,55x 10^-4 mol/l/s
600
Pour l’échantillon 01(10-³):

0.722
Vi= = 1.203x 10^-3 mol/l/s
600

 La courbe V=F((concetration de produit)):

Conclusion :
L'invertase joue un rôle essentiel dans le métabolisme des glucides, en particulier dans la
conversion du saccharose en glucose et fructose. Sa présence dans des organismes comme
Saccharomyces cerevisiae souligne son importance pour la croissance et la fermentation,
permettant à la levure de tirer parti des sucres disponibles comme source d'énergie. Les deux
formes de l'enzyme, intracytoplasmique et extracellulaire, illustrent la complexité de son
fonctionnement et son adaptation à divers environnements. En comprenant les mécanismes et
les conditions d'activité de l'invertase, on peut mieux apprécier son application dans l'industrie
alimentaire et biotechnologique, notamment dans la production de sucres invertis, ce qui met
en évidence le lien entre biologie fondamentale et applications pratiques.
Références :

[Link]

[Link]

Extraction and Partial Kinetic Properties of Invertase from Schizosaccharomyces pombe, Amna et al
(2014)

[Link]