CENTRE UNIVERSITAIRE DE NAAMA

INSTITUT DES SCIENCES ET TECHNOLOGIES

DÉPARTEMENT DE SCIENCES DE LA NATURE ET
DE LA VIE

2eme ANNEE BIOLOGIE

SEMESTRE 02
UNITÉ D’ENSEIGNEMENT : MÉTHODOLOGIE
SCIENTIFIQUE

ENSEIGNANT :KEBDANI MOHAMMED

Chapitre II (1ere partie)

II- Etude de la composition biochimique des cellules

II-1- Extraction et séparation des différents constituants de la cellule (les

matériels cellulaires)

II-1-1- Broyats cellulaires ou homogénats cellulaires

Il est très fréquent qu'on veuille séparer des organites ou des molécules de
tissus ou de cellules, soit pour en mesurer la concentration ou en étudier les
caractéristiques ou le fonctionnement.

Cette extraction requiert évidemment qu'on brise le matériel biologique en

question pour en libérer les substances ou structures désirées. Il s'agit d'une
étape initiale à beaucoup de procédures expérimentales en biochimie. Elle
s'appelle homogénéisation.

Plusieurs types de dispositifs peuvent servir à briser les cellules.

Habituellement, on fait cette opération dans un milieu liquide dans lequel

le tissu baigne. Les composantes cellulaires se retrouvent donc libérées dans un
solvant, généralement aqueux.

Le mélange résultant du matériel biologique ainsi brisé et du solvant est

appelé homogénat.
 Divers dispositifs sont utilisés pour homogénéiser le matériel biologique,
voici les principaux :

II-1-1-1-Techniques mécaniques

Cette approche se prête mal au matériel

biologique, particulièrement si on doit
homogénéiser en milieu liquide.

 Système de mortiers et pilons (broyeur):

Des appareils répondant mieux aux besoins des biochimistes ont donc été
conçus. Le mortier a pris la forme d'une éprouvette, plus ou moins élargie à
l'embouchure, mieux adaptée à la rétention des liquides. Le pilon, ou "piston",
consiste en une tige munie d'un renflement à sa base. Ce dernier a un diamètre à
peine inférieur à celui de l'intérieur du mortier. En faisant glisser le pilon
jusqu'au fond du mortier, on force donc le matériel à passer dans l'espace très
réduit entre le renflement du pilon et la paroi interne du mortier, le cisaillant et
le brisant. Après quelques cycles de compression, le matériel est homogénéisé.

Pour obtenir une bonne homogénéisation, la distance entre la surface du

piston et la paroi interne du mortier, le jeu ("clearance"), doit être très faible,
inférieure au dixième de millimètre.

Le pilon (piston) est souvent attaché à un moteur pour lui imprimer un

mouvement de rotation. Cette rotation produit plus de force de cisaillement pour
rompre les tissus.
N.B : En effet, il faut parfois éviter un excès de bris mécanique, ce qui
endommagerait les structures qu'on veut garder intactes.

Il existe plusieurs variantes de ces appareils. Les plus répandus sont :

Broyeur de type Potter-Eveljhem

Il s'agit d'un pilon composé d'une tige d'acier et

un renflement de teflon ainsi que d'un mortier de verre
épais. Ce système est très solide et est habituellement
utilisé avec un moteur. Il convient habituellement à des
tissus très fibreux comme le foie, le muscle, etc.

Broyeur de type Dounce

Il ressemble à une éprouvette dans laquelle

s’enfonce un piston serré (Fig.). Lerenflement du
piston et la zone de broyage du mortier sont souvent
en verre fritté. Le passage

 Déchiquetage mécanique

L'homogénéisation peut aussi se faire avec des appareils qui coupent et

cisaillent les tissus avec des lames rotatives tournant à grande vitesse. On peut
quelque fois utiliser des mélangeurs mécaniques couramment utilisés en cuisine.

Des appareils plus adaptés au travail en laboratoire de biochimie ont aussi

été développés tel que :

Le Polytron

Le cisaillement est occasionné essentiellement

par la cavitation engendrée par la rotation du rotor à
l'intérieur du stator.
N.B :

Cette méthode est très destructrice pour les tissus, peu d'organites sortent
intactes de tels traitements. Cette approche est particulièrement utilisée lorsqu'on
travaille avec des tissus trop fibreux, difficiles à homogénéiser autrement. Une
autre application est la réduction en poudre de matériel solide (feuilles, graines,
etc.). Si on veut isoler des organites plus ou moins intactes, par exemple des
chloroplastes, il faut réduire au minimum le temps et l'intensité du traitement.

 Les billes de verre

L’appareil utilisé pour cet

est rempli de petites billes de
verre sur lesquelles on verse la
suspension de cellules. La
suspension se répartit entre les
billes. Le tout est alors scellé
(bien fermé) et on lance la
machine, qui fait tourbilloner les
billes de verre.

Ce type de broyage dégage beaucoup de chaleur. Il est donc nécessaire de

travailler à froid (dans un bain de glace).

Séparer les billes du lysat est très facile parce que les billes coulent au
fond dès que l'agitation cesse.

 Vibrateur ultrasonique
Cet appareil émet des ultrasons dont on peut
régler la fréquence et l'intensité en fonction du
matériel cellulaire étudié. La membrane plasmique
se rompt sous l'effet des vibrations engendrées par la
II-1-1-2- Techniques chimiques et enzymatique :

 Le choc osmotique :
On place les cellules dans un milieu hypotonique (Une faible
pression osmotique ).
Le milieu intracellulaire étant plus concentré qu'à l'extérieur, l'eau entre de façon
massive à l'intérieur des cellules sous l'effet de l'osmose. Le volume cellulaire
augmentant, la membrane plasmique n'y résiste pas et la cellule éclate.
Lorsque les cellules sont délimitées par une paroi, celle-ci peut protéger les
cellules de la lyse.
Pour éviter ce problème, on la digère au préalable en plaçant les cellules
dans une solution isotonique tamponnée contenant des enzymes capables
d'hydrolyser les constituants de la paroi :
-cellulases et pectinases pour les cellules végétales :
-lysozyme pour les cellules bactériennes ;
-chitinase pour levures et moisissures.

N.B :
1/Pour l’ensemble des techniques citées On met l'échantillon biologique dans
une solution isotonique ou légèrement hypertonique (sauf pour la technique du
choc osmotique). Pour ne pas pas altérer les structures cellulaires.
2/La préparation d'homogénats cellulaires est donc réalisée en chambre froide ou
bien on place le récipient contenant l'échantillon biologique dans un bain de
glace pilée afin d'empêcher tout fonctionnement enzymatique qui peut catalyser
certaines dégradations indésirables

1- Fractionnement cellulaire
Si on veut connaitre la composition biochimique des organites cellulaires,
il faut les isoler les uns des autres. La purification d'organite passe par
l'obtention de fractions cellulaires. On parle d’un ensemble de Si l'on veut
connaitre la composition biochimique des organites cellulaires, il faut les isoler
les uns des autres. La purification d'organite passe par l'obtention de fractions
cellulaires. On parle de techniques de fractionnement cellulaire = isolement
d'organites cellulaires..
La technique centrifugation différentielle :
Les différentes classes d’organites se distinguent par leur taille, leur
forme et leur densité; les variations des deux premiers paramètres peuvent
être très grandes (les noyaux atteignent 10 μm de diamètre tandis que les
ribosomes mesurent 15- 20 nm).
 Alors que celles relatives à la densité restent faibles (de 1,1 environ pour
les mitochondries, les lysosomes ou les peroxysomes, à 1,6 pour les ribosomes).

Le principe de cette technique est comme suit :

Dans le champ de gravité terrestre, ces organites ou structures restent

spontanément en suspension au sein de l’homogénat et on n’obtient aucune
séparation en fractions (phase ou partie) distinctes. Si l’on augmente
artificiellement la valeur de ce champ par centrifugation, ces particules se
sédimentent (‫ب‬999‫ )تترس‬avec une vitesse accrue et différente selon leurs
caractéristiques hydrodynamiques (leurs comportement quand ils sont en
mouvement), de sorte que l’on peut fractionner (séparer ou diviser en partie)
l’homogénat.

Le principal paramètre déterminant la vitesse utile pour la

sédimentation est la masse, de sorte que les particules les plus grosses et les
plus denses de l’homogénat forment le premier sédiment (ou culot) rassemblé
au fond du tube à centrifuger, le liquide surnageant contenant les plus petites
et les pluslégères. Le surnageant et le culot sont séparés par décantation.

 La décantation : c’est une opération de séparation mécanique, par

différence de gravité de phases non-miscibles, On peut séparer des phases
liquides, une phase solide en suspension dans une phase liquide.

Si on laisse reposer une suspension solide dans une phase liquide, on

observe que les particules sous l'action de la gravité terrestre, tendent à tomber
vers le fond ou à remonter à la surface selon leur densité et leur taille. Cette
décantation peut cependant être relativement lente pour les très fines particules
(sensibles à l'agitation) et les liquides visqueux.
 Le culot Le surnageant

La technique ultracentrifugation en gradient de densité :

Cette technique utilise, dans le tube à centrifuger, une variation de la

concentration d’un composé (une solution) dont la densité diminue
régulièrement du bas vers le haut.

La solution constituant ce gradient est à base de saccharose, et

l’échantillon à analyser, est déposé â la surface du liquide.

Diminution du gradient de la
solution à base de saccharose
de densité du bas vers le haut

Le principe de cette technique est comme suit :Au cours de la

centrifugation une particule à une densité donnée se sédimente jusqu’à
atteindre le niveau du gradient où le liquide ( la solution à base de saccharose)
a exactement sa densité, et elles forment une bande avec l’ensemble des
particules ayant la même densité.

L’échantillon
à analyser, est
déposé â la
surface du CENTRIFUGATION Répartition
liquide des
différents
constituants
de
l’échantillon
selon leurs
densités

La récolte du matériel se fait en perçant le fond du tube et en récupérant

goutte à goutte le gradient dans une série de tubes.

Cette technique nécessite l’ultracentrifugeuse qui est une machines très

sophistiquée par rapport aux centrifugeuses classiques ; son rotor peut tourner
jusqu’à 80 000 tours par minute, et elles fournissent des champs de gravité
atteignant 500 000 fois la gravité terrestre.

Utilisations:

-purification des bras (court et long) des phages.

Seront -sélection des fragments d'ADN de tailles correctes compte tenu du

détaillés vecteur utilisé lors de la constitution des banques génomiques.
dans la
-isolement des polysomes
partie TD
-fractionner des ARN (séparer des ARN 28S, 18S,5S,ARNt et
ARNm)